CN109745582A - 一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法，包括：(1)白芨多糖的制备；(2)氧化魔芋葡甘聚糖的制备；(3)取白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖加入蒸馏水中，加热搅拌混合均匀，充分溶解，然后在4℃下静至过夜除气泡，预冻，冷冻真空干燥，得到白芨多糖复合细胞支架。本发明通过白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖共混得到空隙率可控、网络力学性能优良的细胞支架，可有效解决目前细胞支架材料来源单一、孔隙率不均一，不可控的问题；且本发明所提供的芨多糖复合细胞支架具有良好的生物相容性、组织诱导性和网络力学性，在组织工程领用有良好的市场前景，有助于干细胞、血管内皮细胞等迁移、增殖及血管生长。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞支架的制备方法，具体涉及一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法。
背景技术
白芨为白芨兰科属，又称莲及草、白根、雪如末等，千百年来一直作为传统中药使用，其主要功能是抗菌消炎、祛腐生肌、收敛疮口等，且无毒副作用、安全舒适、可降解、无污染，生物相容性好。它是一种良好的天然生物工程材料，可作为药物辅料应用于药物制剂。白芨鳞茎中含大量的水溶性白芨多糖，是白芨的主要功能性成分。现代研究分析表明，白芨中含有的大量的植物性多糖，在干燥的鳞茎组织中含量约为40％～50％，这些多糖主要由β-1，4-甘露糖、β-1，4-葡萄糖和β-1，6-葡萄糖残基组成，属中性杂多糖。在生物医用材料中白芨多糖得到了广泛的应用。
组织工程是应用细胞生物学、生物材料和工程学原理开发生物替代品，用以修复或再造组织或器官功能的技术。种子细胞、生长因子和细胞支架是组织工程的三大要素。其中，细胞支架是组织工程中非常重要的一个组成部分。支架可以为细胞的附着、迁移和增殖提供理想的环境，并引导其生长，最终形成所需的三维组织结构。
用作细胞支架的材料应具有高孔隙率、高比表面积和相互贯通的几何结构以及独特的三维形状。现有技术中的许多制备细胞支架的材料不能实现对细胞支架微观孔道结构的调控，导致材料内部孔道结构不均匀而且尺寸不可调控。细胞支架的孔径大小会影响组织或器官的生成：过大的孔不利于细胞的粘附，过小的孔不利于细胞的迁移和繁殖，而且不同细胞生长所需的最适孔径大小也不同。目前细胞支架孔道结构不可控的缺陷，严重影响其在组织工程中的应用。
本发明采用白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖制备得到了孔径均匀且尺寸可控的细胞支架。细胞支架均匀的微观孔道结构有利于细胞的增值分化，可控的孔道尺寸可以针对不同的细胞进行调整，优化支架在组织工程的应用。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、按重量份，取15～25份白芨粉末加入600～800份蒸馏水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第一次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入500～650蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第二次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入500～650蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第三次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将三次所得上清液合并，并进行旋蒸，旋蒸上清液至80～120份，然后在旋蒸后的上清液中在搅拌下加入2～4倍体积的无水乙醇中进行醇沉1～3h，以3000r/min离心10min后弃去上清液，预冻，冷冻真空干燥，以10000r/min粉碎3min得到白芨多糖；
步骤二、按重量份，取魔芋精粉8～12份，在搅拌状态下分别倒入40～60份质量分数分别为20％、30％、50％乙醇溶液，搅拌洗涤各一次，真空泵抽滤，再用80％乙醇和无水乙醇脱水，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到魔芋葡甘聚糖；取干燥的魔芋葡甘聚糖8～12份，加入16～24份异丙醇，调节pH至7，使用蠕动泵以1rpm的速度匀速滴定体积分数为3％的H2O2溶液，1h滴完，在45℃下搅拌4h，加入亚硫酸钠终止反应，无水乙醇洗涤3次，真空泵抽滤，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到氧化魔芋葡甘聚糖；
步骤三、取重量比为1～3：1～4的白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖，按固液比20：1加入蒸馏水中，加热搅拌混合均匀，充分溶解，然后在4℃下静至过夜除气泡，预冻，冷冻真空干燥，得到白芨多糖复合细胞支架。
优选的是，所述步骤一中，白芨粉末的制备方法为：将白芨块茎放入冷冻室内，控制在温度-15℃～-20℃之间，冷冻4～6小时；粉碎白芨块茎，粉碎时温度在-15℃～-20℃之间，压力控制在0.1MPa～0.3MPa，得到白芨粉末；采用旋风收集器，负压收集白芨粉末；采用喷雾干燥的方式，对白芨粉末进行干燥，然后过80目筛，得到白芨粉末。
优选的是，所述步骤二中，将得到的魔芋葡甘聚糖进行预处理，其过程为：按重量份，取3～5份魔芋葡甘聚糖加入120～150份水中，搅拌30～60min，得到魔芋葡甘聚糖溶液，采用激光器对魔芋葡甘聚糖溶液进行激光处理，然后用乙醇沉淀，烘干，得到预处理魔芋葡甘聚糖。
优选的是，所述激光器为Nd:YAG固体激光器；所述Nd:YAG固体激光器的波长为532nm或1064nm，重复频率为5～25Hz、脉冲宽度为10～20ns、功率为50～150mJ/pulse、光斑直径1～2mm，采用Nd:YAG固体激光器进行激光处理的时间为1～3min。
优选的是，所述步骤三中，还包括在白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖中加入纳米纤维；所述纳米纤维与白芨多糖的重量比为1：3～5；所述纳米纤维的制备方法为：采用菊粉和水配制质量分数为3～5％的菊粉溶液；配制质量分数为5～10％的高分子聚合物溶液，再将菊粉溶液和高分子聚合物溶液按重量比为1:6～10的比例混合均匀，制得纺丝溶液；用注射器抽取纺丝溶液，将注射器固定于静电纺丝装置上，开启高压电源进行静电纺丝，结束后将纤维膜取下，干燥即得纳米纤维。
优选的是，所述的高分子聚合物溶液为聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮溶液中的一种或几种混合。
优选的是，所述静电纺丝的参数为：控制高压电源电压为12～25kV、静电纺丝溶液流速为0.5～1.5mL/h、注射器针头的喷丝口与收集屏之间的距离为10～15cm、纺丝环境温度为45～65℃。
优选的是，所述菊粉进行预处理，其过程为：按重量份，取5～10份菊粉和80～120份0.02～0.08mol/L的乙酸溶液，置于带搅拌的密封容器中，向其中通入氮气使氮气饱和，然后将该密封容器置于1.5MeV、30mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，然后乙醇沉淀，干燥得到预处理菊粉；所述辐照采用的辐照剂量率为100～200kGy/h，辐照剂量为200～400kGy，搅拌速度为120r/min。
本发明至少包括以下有益效果：本发明通过白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖共混得到空隙率可控、网络力学性能优良的细胞支架，可有效解决目前细胞支架材料来源单一、孔隙率不均一，不可控的问题。本发明提供的细胞支架还将中药白芨的消肿生肌的药用性和载体性进行了深度挖掘，故本发明所提供的白芨多糖复合细胞支架具有良好的生物相容性、组织诱导性和网络力学性，在组织工程领用有良好的市场前景，有助于干细胞、血管内皮细胞等迁移、增殖及血管生长。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明：
图1为本发明实施例1制备的白芨多糖复合细胞支架的实物照片；
图2为本发明实施例1制备的白芨多糖复合细胞支架的SEM图(1.00KX)；
图3为本发明实施例1制备的白芨多糖复合细胞支架的SEM图(2.00KX)；
图4为本发明实施例1制备的白芨多糖复合细胞支架的SEM图(5.00KX)。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1：
一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将白芨块茎放入冷冻室内，控制在温度-15℃之间，冷冻4小时；粉碎白芨块茎，粉碎时温度在-15℃之间，压力控制在0.1MPa，得到白芨粉末；采用旋风收集器，负压收集白芨粉末；采用喷雾干燥的方式，对白芨粉末进行干燥，然后过80目筛，得到白芨粉末；按重量份，取20份白芨粉末加入800份蒸馏水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第一次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第二次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第三次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将三次所得上清液合并，并进行旋蒸，旋蒸上清液至100份，然后在旋蒸后的上清液中在搅拌下加入3倍体积的无水乙醇中进行醇沉2h，以3000r/min离心10min后弃去上清液，预冻，冷冻真空干燥，以10000r/min粉碎3min得到白芨多糖；
步骤二、按重量份，取魔芋精粉10份，在搅拌状态下分别倒入50份质量分数分别为20％、30％、50％乙醇溶液，搅拌洗涤各一次，真空泵抽滤，再用80％乙醇和无水乙醇脱水，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到魔芋葡甘聚糖；取干燥的魔芋葡甘聚糖10份，加入20份异丙醇，调节pH至7，使用蠕动泵以1rpm的速度匀速滴定体积分数为3％的H2O2溶液，1h滴完，在45℃下搅拌4h，加入亚硫酸钠终止反应，无水乙醇洗涤3次，真空泵抽滤，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到氧化魔芋葡甘聚糖；
步骤三、取重量比为2：1的白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖，按固液比20：1加入蒸馏水中，加热搅拌混合均匀，充分溶解，然后在4℃下静至过夜除气泡，预冻，冷冻真空干燥，得到白芨多糖复合细胞支架。
该实施例制备的白芨多糖复合细胞支架的空隙率为55％，孔径分布0.5～5um。
实施例2：
一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将白芨块茎放入冷冻室内，控制在温度-20℃之间，冷冻6小时；粉碎白芨块茎，粉碎时温度在-20℃之间，压力控制在0.3MPa，得到白芨粉末；采用旋风收集器，负压收集白芨粉末；采用喷雾干燥的方式，对白芨粉末进行干燥，然后过80目筛，得到白芨粉末；按重量份，取15份白芨粉末加入800份蒸馏水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第一次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入650蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第二次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入500蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第三次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将三次所得上清液合并，并进行旋蒸，旋蒸上清液至120份，然后在旋蒸后的上清液中在搅拌下加入4倍体积的无水乙醇中进行醇沉2h，以3000r/min离心10min后弃去上清液，预冻，冷冻真空干燥，以10000r/min粉碎3min得到白芨多糖；
步骤二、按重量份，取魔芋精粉12份，在搅拌状态下分别倒入60份质量分数分别为20％、30％、50％乙醇溶液，搅拌洗涤各一次，真空泵抽滤，再用80％乙醇和无水乙醇脱水，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到魔芋葡甘聚糖；取干燥的魔芋葡甘聚糖8份，加入24份异丙醇，调节pH至7，使用蠕动泵以1rpm的速度匀速滴定体积分数为3％的H2O2溶液，1h滴完，在45℃下搅拌4h，加入亚硫酸钠终止反应，无水乙醇洗涤3次，真空泵抽滤，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到氧化魔芋葡甘聚糖；
步骤三、取重量比为3：2的白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖，按固液比20：1加入蒸馏水中，加热搅拌混合均匀，充分溶解，然后在4℃下静至过夜除气泡，预冻，冷冻真空干燥，得到白芨多糖复合细胞支架。
该实施例制备的白芨多糖复合细胞支架的空隙率为56％，孔径分布0.5～5um。
实施例3：
一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将白芨块茎放入冷冻室内，控制在温度-15℃之间，冷冻4小时；粉碎白芨块茎，粉碎时温度在-15℃之间，压力控制在0.1MPa，得到白芨粉末；采用旋风收集器，负压收集白芨粉末；采用喷雾干燥的方式，对白芨粉末进行干燥，然后过80目筛，得到白芨粉末；按重量份，取20份白芨粉末加入800份蒸馏水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第一次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第二次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第三次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将三次所得上清液合并，并进行旋蒸，旋蒸上清液至100份，然后在旋蒸后的上清液中在搅拌下加入3倍体积的无水乙醇中进行醇沉2h，以3000r/min离心10min后弃去上清液，预冻，冷冻真空干燥，以10000r/min粉碎3min得到白芨多糖；
步骤二、按重量份，取魔芋精粉10份，在搅拌状态下分别倒入50份质量分数分别为20％、30％、50％乙醇溶液，搅拌洗涤各一次，真空泵抽滤，再用80％乙醇和无水乙醇脱水，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到魔芋葡甘聚糖，按重量份，取5份魔芋葡甘聚糖加入150份水中，搅拌60min，得到魔芋葡甘聚糖溶液，采用激光器对魔芋葡甘聚糖溶液进行激光处理，然后用乙醇沉淀，烘干，得到预处理魔芋葡甘聚糖；所述激光器为Nd:YAG固体激光器；所述Nd:YAG固体激光器的波长为1064nm，重复频率为5Hz、脉冲宽度为12ns、功率为100mJ/pulse、光斑直径2mm，采用Nd:YAG固体激光器进行激光处理的时间为1min；取干燥的预处理魔芋葡甘聚糖10份，加入20份异丙醇，调节pH至7，使用蠕动泵以1rpm的速度匀速滴定体积分数为3％的H2O2溶液，1h滴完，在45℃下搅拌4h，加入亚硫酸钠终止反应，无水乙醇洗涤3次，真空泵抽滤，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到氧化魔芋葡甘聚糖；
步骤三、取重量比为2：1的白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖，按固液比20：1加入蒸馏水中，加热搅拌混合均匀，充分溶解，然后在4℃下静至过夜除气泡，预冻，冷冻真空干燥，得到白芨多糖复合细胞支架。
该实施例制备的白芨多糖复合细胞支架的空隙率为66％，孔径分布0.8～3.5um。
实施例4：
一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将白芨块茎放入冷冻室内，控制在温度-15℃之间，冷冻4小时；粉碎白芨块茎，粉碎时温度在-15℃之间，压力控制在0.1MPa，得到白芨粉末；采用旋风收集器，负压收集白芨粉末；采用喷雾干燥的方式，对白芨粉末进行干燥，然后过80目筛，得到白芨粉末；按重量份，取20份白芨粉末加入800份蒸馏水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第一次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第二次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第三次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将三次所得上清液合并，并进行旋蒸，旋蒸上清液至100份，然后在旋蒸后的上清液中在搅拌下加入3倍体积的无水乙醇中进行醇沉2h，以3000r/min离心10min后弃去上清液，预冻，冷冻真空干燥，以10000r/min粉碎3min得到白芨多糖；
步骤二、按重量份，取魔芋精粉10份，在搅拌状态下分别倒入50份质量分数分别为20％、30％、50％乙醇溶液，搅拌洗涤各一次，真空泵抽滤，再用80％乙醇和无水乙醇脱水，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到魔芋葡甘聚糖，按重量份，取3份魔芋葡甘聚糖加入120份水中，搅拌60min，得到魔芋葡甘聚糖溶液，采用激光器对魔芋葡甘聚糖溶液进行激光处理，然后用乙醇沉淀，烘干，得到预处理魔芋葡甘聚糖；所述激光器为Nd:YAG固体激光器；所述Nd:YAG固体激光器的波长为532nm，重复频率为5Hz、脉冲宽度为20ns、功率为80mJ/pulse、光斑直径2mm，采用Nd:YAG固体激光器进行激光处理的时间为2min；取干燥的预处理魔芋葡甘聚糖10份，加入20份异丙醇，调节pH至7，使用蠕动泵以1rpm的速度匀速滴定体积分数为3％的H2O2溶液，1h滴完，在45℃下搅拌4h，加入亚硫酸钠终止反应，无水乙醇洗涤3次，真空泵抽滤，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到氧化魔芋葡甘聚糖；
步骤三、取重量比为2：1的白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖，按固液比20：1加入蒸馏水中，加热搅拌混合均匀，充分溶解，然后在4℃下静至过夜除气泡，预冻，冷冻真空干燥，得到白芨多糖复合细胞支架。
该实施例制备的白芨多糖复合细胞支架的空隙率为68％，孔径分布0.7～3.2um。
实施例5：
一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将白芨块茎放入冷冻室内，控制在温度-15℃之间，冷冻4小时；粉碎白芨块茎，粉碎时温度在-15℃之间，压力控制在0.1MPa，得到白芨粉末；采用旋风收集器，负压收集白芨粉末；采用喷雾干燥的方式，对白芨粉末进行干燥，然后过80目筛，得到白芨粉末；按重量份，取20份白芨粉末加入800份蒸馏水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第一次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第二次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第三次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将三次所得上清液合并，并进行旋蒸，旋蒸上清液至100份，然后在旋蒸后的上清液中在搅拌下加入3倍体积的无水乙醇中进行醇沉2h，以3000r/min离心10min后弃去上清液，预冻，冷冻真空干燥，以10000r/min粉碎3min得到白芨多糖；
步骤二、按重量份，取魔芋精粉10份，在搅拌状态下分别倒入50份质量分数分别为20％、30％、50％乙醇溶液，搅拌洗涤各一次，真空泵抽滤，再用80％乙醇和无水乙醇脱水，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到魔芋葡甘聚糖；取干燥的魔芋葡甘聚糖10份，加入20份异丙醇，调节pH至7，使用蠕动泵以1rpm的速度匀速滴定体积分数为3％的H2O2溶液，1h滴完，在45℃下搅拌4h，加入亚硫酸钠终止反应，无水乙醇洗涤3次，真空泵抽滤，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到氧化魔芋葡甘聚糖；
步骤三、取重量比为2：1的白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖，以及纳米纤维，按固液比20：1加入蒸馏水中，加热搅拌混合均匀，充分溶解，然后在4℃下静至过夜除气泡，预冻，冷冻真空干燥，得到白芨多糖复合细胞支架；
所述纳米纤维与白芨多糖的重量比为1：3；所述纳米纤维的制备方法为：采用菊粉和水配制质量分数为5％的菊粉溶液；配制质量分数为10％的高分子聚合物溶液，再将菊粉溶液和高分子聚合物溶液按重量比为1:8的比例混合均匀，制得纺丝溶液；用注射器抽取纺丝溶液，将注射器固定于静电纺丝装置上，开启高压电源进行静电纺丝，结束后将纤维膜取下，干燥即得纳米纤维；所述的高分子聚合物溶液为聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述静电纺丝的参数为：控制高压电源电压为20kV、静电纺丝溶液流速为1mL/h、注射器针头的喷丝口与收集屏之间的距离为10cm、纺丝环境温度为50℃；所述菊粉进行预处理，其过程为：按重量份，取10份菊粉和120份0.05mol/L的乙酸溶液，置于带搅拌的密封容器中，向其中通入氮气使氮气饱和，然后将该密封容器置于1.5MeV、30mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，然后乙醇沉淀，干燥得到预处理菊粉；所述辐照采用的辐照剂量率为200kGy/h，辐照剂量为400kGy，搅拌速度为120r/min；本发明采用纳米纤维与白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖液混合，可以调控细胞支架的孔隙率，改善细胞的亲和性与支架的生物相容性。
该实施例制备的白芨多糖复合细胞支架的空隙率为72％，孔径分布1～3um。
实施例6：
一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将白芨块茎放入冷冻室内，控制在温度-15℃之间，冷冻4小时；粉碎白芨块茎，粉碎时温度在-15℃之间，压力控制在0.1MPa，得到白芨粉末；采用旋风收集器，负压收集白芨粉末；采用喷雾干燥的方式，对白芨粉末进行干燥，然后过80目筛，得到白芨粉末；按重量份，取20份白芨粉末加入800份蒸馏水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第一次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第二次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第三次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将三次所得上清液合并，并进行旋蒸，旋蒸上清液至100份，然后在旋蒸后的上清液中在搅拌下加入3倍体积的无水乙醇中进行醇沉2h，以3000r/min离心10min后弃去上清液，预冻，冷冻真空干燥，以10000r/min粉碎3min得到白芨多糖；
步骤二、按重量份，取魔芋精粉10份，在搅拌状态下分别倒入50份质量分数分别为20％、30％、50％乙醇溶液，搅拌洗涤各一次，真空泵抽滤，再用80％乙醇和无水乙醇脱水，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到魔芋葡甘聚糖；取干燥的魔芋葡甘聚糖10份，加入20份异丙醇，调节pH至7，使用蠕动泵以1rpm的速度匀速滴定体积分数为3％的H2O2溶液，1h滴完，在45℃下搅拌4h，加入亚硫酸钠终止反应，无水乙醇洗涤3次，真空泵抽滤，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到氧化魔芋葡甘聚糖；
步骤三、取重量比为2：1的白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖，以及纳米纤维，按固液比20：1加入蒸馏水中，加热搅拌混合均匀，充分溶解，然后在4℃下静至过夜除气泡，预冻，冷冻真空干燥，得到白芨多糖复合细胞支架；
所述纳米纤维与白芨多糖的重量比为1：5；所述纳米纤维的制备方法为：采用菊粉和水配制质量分数为3％的菊粉溶液；配制质量分数为8％的高分子聚合物溶液，再将菊粉溶液和高分子聚合物溶液按重量比为1:10的比例混合均匀，制得纺丝溶液；用注射器抽取纺丝溶液，将注射器固定于静电纺丝装置上，开启高压电源进行静电纺丝，结束后将纤维膜取下，干燥即得纳米纤维；所述的高分子聚合物溶液为聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述静电纺丝的参数为：控制高压电源电压为18kV、静电纺丝溶液流速为0.8mL/h、注射器针头的喷丝口与收集屏之间的距离为12cm、纺丝环境温度为55℃；所述菊粉进行预处理，其过程为：按重量份，取8份菊粉和100份0.08mol/L的乙酸溶液，置于带搅拌的密封容器中，向其中通入氮气使氮气饱和，然后将该密封容器置于1.5MeV、30mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，然后乙醇沉淀，干燥得到预处理菊粉；所述辐照采用的辐照剂量率为100kGy/h，辐照剂量为200kGy，搅拌速度为120r/min。
该实施例制备的白芨多糖复合细胞支架的空隙率为74％，孔径分布0.8～2.8um。
实施例7：
一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将白芨块茎放入冷冻室内，控制在温度-15℃之间，冷冻4小时；粉碎白芨块茎，粉碎时温度在-15℃之间，压力控制在0.1MPa，得到白芨粉末；采用旋风收集器，负压收集白芨粉末；采用喷雾干燥的方式，对白芨粉末进行干燥，然后过80目筛，得到白芨粉末；按重量份，取20份白芨粉末加入800份蒸馏水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第一次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第二次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第三次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将三次所得上清液合并，并进行旋蒸，旋蒸上清液至100份，然后在旋蒸后的上清液中在搅拌下加入3倍体积的无水乙醇中进行醇沉2h，以3000r/min离心10min后弃去上清液，预冻，冷冻真空干燥，以10000r/min粉碎3min得到白芨多糖；
步骤二、按重量份，取魔芋精粉10份，在搅拌状态下分别倒入50份质量分数分别为20％、30％、50％乙醇溶液，搅拌洗涤各一次，真空泵抽滤，再用80％乙醇和无水乙醇脱水，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到魔芋葡甘聚糖，按重量份，取5份魔芋葡甘聚糖加入150份水中，搅拌60min，得到魔芋葡甘聚糖溶液，采用激光器对魔芋葡甘聚糖溶液进行激光处理，然后用乙醇沉淀，烘干，得到预处理魔芋葡甘聚糖；所述激光器为Nd:YAG固体激光器；所述Nd:YAG固体激光器的波长为1064nm，重复频率为5Hz、脉冲宽度为12ns、功率为100mJ/pulse、光斑直径2mm，采用Nd:YAG固体激光器进行激光处理的时间为1min；取干燥的预处理魔芋葡甘聚糖10份，加入20份异丙醇，调节pH至7，使用蠕动泵以1rpm的速度匀速滴定体积分数为3％的H2O2溶液，1h滴完，在45℃下搅拌4h，加入亚硫酸钠终止反应，无水乙醇洗涤3次，真空泵抽滤，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到氧化魔芋葡甘聚糖；
步骤三、取重量比为2：1的白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖，以及纳米纤维，按固液比20：1加入蒸馏水中，加热搅拌混合均匀，充分溶解，然后在4℃下静至过夜除气泡，预冻，冷冻真空干燥，得到白芨多糖复合细胞支架；
所述纳米纤维与白芨多糖的重量比为1：3；所述纳米纤维的制备方法为：采用菊粉和水配制质量分数为5％的菊粉溶液；配制质量分数为10％的高分子聚合物溶液，再将菊粉溶液和高分子聚合物溶液按重量比为1:8的比例混合均匀，制得纺丝溶液；用注射器抽取纺丝溶液，将注射器固定于静电纺丝装置上，开启高压电源进行静电纺丝，结束后将纤维膜取下，干燥即得纳米纤维；所述的高分子聚合物溶液为聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述静电纺丝的参数为：控制高压电源电压为20kV、静电纺丝溶液流速为1mL/h、注射器针头的喷丝口与收集屏之间的距离为10cm、纺丝环境温度为50℃；所述菊粉进行预处理，其过程为：按重量份，取10份菊粉和120份0.05mol/L的乙酸溶液，置于带搅拌的密封容器中，向其中通入氮气使氮气饱和，然后将该密封容器置于1.5MeV、30mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，然后乙醇沉淀，干燥得到预处理菊粉；所述辐照采用的辐照剂量率为200kGy/h，辐照剂量为400kGy，搅拌速度为120r/min。
该实施例制备的白芨多糖复合细胞支架的空隙率为89％，孔径分布0.8～2um。
实施例8：
一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将白芨块茎放入冷冻室内，控制在温度-15℃之间，冷冻4小时；粉碎白芨块茎，粉碎时温度在-15℃之间，压力控制在0.1MPa，得到白芨粉末；采用旋风收集器，负压收集白芨粉末；采用喷雾干燥的方式，对白芨粉末进行干燥，然后过80目筛，得到白芨粉末；按重量份，取20份白芨粉末加入800份蒸馏水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第一次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第二次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入600蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第三次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将三次所得上清液合并，并进行旋蒸，旋蒸上清液至100份，然后在旋蒸后的上清液中在搅拌下加入3倍体积的无水乙醇中进行醇沉2h，以3000r/min离心10min后弃去上清液，预冻，冷冻真空干燥，以10000r/min粉碎3min得到白芨多糖；
步骤二、按重量份，取魔芋精粉10份，在搅拌状态下分别倒入50份质量分数分别为20％、30％、50％乙醇溶液，搅拌洗涤各一次，真空泵抽滤，再用80％乙醇和无水乙醇脱水，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到魔芋葡甘聚糖，按重量份，取3份魔芋葡甘聚糖加入120份水中，搅拌60min，得到魔芋葡甘聚糖溶液，采用激光器对魔芋葡甘聚糖溶液进行激光处理，然后用乙醇沉淀，烘干，得到预处理魔芋葡甘聚糖；所述激光器为Nd:YAG固体激光器；所述Nd:YAG固体激光器的波长为532nm，重复频率为5Hz、脉冲宽度为20ns、功率为80mJ/pulse、光斑直径2mm，采用Nd:YAG固体激光器进行激光处理的时间为2min；取干燥的预处理魔芋葡甘聚糖10份，加入20份异丙醇，调节pH至7，使用蠕动泵以1rpm的速度匀速滴定体积分数为3％的H2O2溶液，1h滴完，在45℃下搅拌4h，加入亚硫酸钠终止反应，无水乙醇洗涤3次，真空泵抽滤，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到氧化魔芋葡甘聚糖；
步骤三、取重量比为2：1的白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖，以及纳米纤维，按固液比20：1加入蒸馏水中，加热搅拌混合均匀，充分溶解，然后在4℃下静至过夜除气泡，预冻，冷冻真空干燥，得到白芨多糖复合细胞支架；
所述纳米纤维与白芨多糖的重量比为1：5；所述纳米纤维的制备方法为：采用菊粉和水配制质量分数为3％的菊粉溶液；配制质量分数为8％的高分子聚合物溶液，再将菊粉溶液和高分子聚合物溶液按重量比为1:10的比例混合均匀，制得纺丝溶液；用注射器抽取纺丝溶液，将注射器固定于静电纺丝装置上，开启高压电源进行静电纺丝，结束后将纤维膜取下，干燥即得纳米纤维；所述的高分子聚合物溶液为聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述静电纺丝的参数为：控制高压电源电压为18kV、静电纺丝溶液流速为0.8mL/h、注射器针头的喷丝口与收集屏之间的距离为12cm、纺丝环境温度为55℃；所述菊粉进行预处理，其过程为：按重量份，取8份菊粉和100份0.08mol/L的乙酸溶液，置于带搅拌的密封容器中，向其中通入氮气使氮气饱和，然后将该密封容器置于1.5MeV、30mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，然后乙醇沉淀，干燥得到预处理菊粉；所述辐照采用的辐照剂量率为100kGy/h，辐照剂量为200kGy，搅拌速度为120r/min。
该实施例制备的白芨多糖复合细胞支架的空隙率为92％，孔径分布0.6～1.8um。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (8)
1.一种白芨多糖复合细胞支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、按重量份，取15～25份白芨粉末加入600～800份蒸馏水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第一次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入500～650蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第二次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将固体残渣加入500～650蒸馏份水中，在100℃下以500r/min搅拌60min进行第三次提取，以3000r/min离心10min，收集上清液，将三次所得上清液合并，并进行旋蒸，旋蒸上清液至80～120份，然后在旋蒸后的上清液中在搅拌下加入2～4倍体积的无水乙醇中进行醇沉1～3h，以3000r/min离心10min后弃去上清液，预冻，冷冻真空干燥，以10000r/min粉碎3min得到白芨多糖；
步骤二、按重量份，取魔芋精粉8～12份，在搅拌状态下分别倒入40～60份质量分数分别为20％、30％、50％乙醇溶液，搅拌洗涤各一次，真空泵抽滤，再用80％乙醇和无水乙醇脱水，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到魔芋葡甘聚糖；取干燥的魔芋葡甘聚糖8～12份，加入16～24份异丙醇，调节pH至7，使用蠕动泵以1rpm的速度匀速滴定体积分数为3％的H2O2溶液，1h滴完，在45℃下搅拌4h，加入亚硫酸钠终止反应，无水乙醇洗涤3次，真空泵抽滤，在电热恒温鼓风干燥机中干燥，得到氧化魔芋葡甘聚糖；
步骤三、取重量比为1～3：1～4的白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖，按固液比20：1加入蒸馏水中，加热搅拌混合均匀，充分溶解，然后在4℃下静至过夜除气泡，预冻，冷冻真空干燥，得到白芨多糖复合细胞支架。
2.如权利要求1所述的白芨多糖复合细胞支架的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，白芨粉末的制备方法为：将白芨块茎放入冷冻室内，控制在温度-15℃～-20℃之间，冷冻4～6小时；粉碎白芨块茎，粉碎时温度在-15℃～-20℃之间，压力控制在0.1MPa～0.3MPa，得到白芨粉末；采用旋风收集器，负压收集白芨粉末；采用喷雾干燥的方式，对白芨粉末进行干燥，然后过80目筛，得到白芨粉末。
3.如权利要求1所述的白芨多糖复合细胞支架的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，将得到的魔芋葡甘聚糖进行预处理，其过程为：按重量份，取3～5份魔芋葡甘聚糖加入120～150份水中，搅拌30～60min，得到魔芋葡甘聚糖溶液，采用激光器对魔芋葡甘聚糖溶液进行激光处理，然后用乙醇沉淀，烘干，得到预处理魔芋葡甘聚糖。
4.如权利要求3所述的白芨多糖复合细胞支架的制备方法，其特征在于，所述激光器为Nd:YAG固体激光器；所述Nd:YAG固体激光器的波长为532nm或1064nm，重复频率为5～25Hz、脉冲宽度为10～20ns、功率为50～150mJ/pulse、光斑直径1～2mm，采用Nd:YAG固体激光器进行激光处理的时间为1～3min。
5.如权利要求1所述的白芨多糖复合细胞支架的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，还包括在白芨多糖和氧化魔芋葡甘聚糖中加入纳米纤维；所述纳米纤维与白芨多糖的重量比为1：3～5；所述纳米纤维的制备方法为：采用菊粉和水配制质量分数为3～5％的菊粉溶液；配制质量分数为5～10％的高分子聚合物溶液，再将菊粉溶液和高分子聚合物溶液按重量比为1:6～10的比例混合均匀，制得纺丝溶液；用注射器抽取纺丝溶液，将注射器固定于静电纺丝装置上，开启高压电源进行静电纺丝，结束后将纤维膜取下，干燥即得纳米纤维。
6.如权利要求5所述的白芨多糖复合细胞支架的制备方法，其特征在于，所述的高分子聚合物溶液为聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮溶液中的一种或几种混合。
7.如权利要求5所述的白芨多糖复合细胞支架的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的参数为：控制高压电源电压为12～25kV、静电纺丝溶液流速为0.5～1.5mL/h、注射器针头的喷丝口与收集屏之间的距离为10～15cm、纺丝环境温度为45～65℃。
8.如权利要求5所述的白芨多糖复合细胞支架的制备方法，其特征在于，所述菊粉进行预处理，其过程为：按重量份，取5～10份菊粉和80～120份0.02～0.08mol/L的乙酸溶液，置于带搅拌的密封容器中，向其中通入氮气使氮气饱和，然后将该密封容器置于1.5MeV、30mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，然后乙醇沉淀，干燥得到预处理菊粉；所述辐照采用的辐照剂量率为100～200kGy/h，辐照剂量为200～400kGy，搅拌速度为120r/min。
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|---|---|
| CN109745582B (zh) | 2021-11-19 |
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