CN104922734B - 促进心肌修复的可注射壳聚糖复合水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进心肌修复的可注射壳聚糖/角蛋白复合水凝胶及其制备方法，由壳聚糖、β‑甘油磷酸钠、京尼平和角蛋白4种溶液按体积比为10：(1～5)：(1～3)：(0.1～0.5)组成。制备过程包括：1)利用过氧乙酸和Tris碱从人的头发中提取角蛋白；2)用β‑甘油磷酸钠调节水溶性壳聚糖溶液的pH值，使其接近人体内微环境；3)引入交联剂京尼平，通过改变京尼平的用量控制水凝胶溶液的成胶时间，达到混合溶液注射机体后能够在原位迅速成胶的目的。经过实验证实该复合水凝胶生物相容性良好，能显著促进心肌细胞的生长；材料来源广泛，成本低廉，在组织工程修复领域有广阔的应用前景。

Description

促进心肌修复的可注射壳聚糖复合水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种促进心肌修复的可注射壳聚糖复合水凝胶及其制备方法，属于组织工程领域。

背景技术

水凝胶是一种聚合的网络结构，在聚合物中有亲水的基团或区域，能够在一定条件下水合产生凝胶结构。水凝胶在组织工程领域可发挥多重作用。例如作为填塞止血材料、生物活性分子的载体以及作为三维支架负载细胞并引导组织的形态发生和重塑。但水凝胶的机械性能一般较弱，难以消毒并且很难在负载药物和细胞后进行体外交联而不影响其活性。

可注射且能原位成型支架的水凝胶在注射前是黏度相对较低的水溶液，注射后会在生理条件下快速转变成水凝胶。可注射水凝胶与各种药物、细胞、活性因子等复合后直接或通过微创手术注射入患者体内能够避免较大创伤的外科手术，降低给病人带来的不适和并发症。同时，可注射水凝胶几乎能填充任意形状的组织缺损，可简化组织工程中支架设计等问题。

壳聚糖水凝胶能够明显改善心功能。壳聚糖及其产物具有较强的抗氧化性，在心梗缺血的微环境中能够有效地抵抗过多的活性氧自由基。但是壳聚糖的抗氧化性随着分子量的增加而降低，而低分子量的壳聚糖在制作材料时成型困难且力学性能低。所以对高分子量壳聚糖进行化学修饰以提高其抗氧化能力是必要的。

角蛋白属于中间丝蛋白类，除了头发纤维、角和指甲，角蛋白已被证明存在于几乎所有已分化细胞的细胞核和细胞质中。角蛋白能增强细胞增殖和迁移，角蛋白本身及其降解产物能诱导细胞合成TGF等因子，能够最大化的减少纤维化的形成，减少不良心脏结构的重构，对心梗修复有着不可忽视的作用。

综上，将壳聚糖和角蛋白综合利用制备可注射水凝胶的研究是该技术领域的重点研究方向，具体广阔的应用前景和研究价值。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种促进心肌修复的可注射壳聚糖复合水凝胶及其制备方法，该产品能够通过注射的方法将材料注入心脏缺损或梗死组织并在原位迅速形成与缺损部位形状互补的三维支架，同时能够促进受损部位心肌细胞的生长，达到修复的目的；该产品能够解决当前可注射水凝胶生物相容性差和力学性能差的技术问题。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种促进心肌修复的可注射壳聚糖复合水凝胶，包括壳聚糖、β-甘油磷酸钠、京尼平和角蛋白4种溶液，所述各溶液组分按体积比为10：(1～5)：(1～3)：(0.1～0.5)。

进一步的，在本发明中，所述壳聚糖溶液是用超纯水配制成2％质量浓度的溶液，所述β-甘油磷酸钠溶液是用超纯水配置成11.5％～23％质量浓度的溶液，所述京尼平溶液是用10mM HEPES配制成0.8％～0.9％质量浓度的溶液，所述角蛋白溶液是将角蛋白粉末溶于超纯水配制成6％质量浓度的溶液。

制备所述的促进心肌修复的可注射壳聚糖复合水凝胶的方法，包括以下步骤：

1)人发角蛋白的提取

利用过氧乙酸和Tris碱从人发中提取角蛋白；

2)各组分溶液的制备

按照相应质量浓度分别配置壳聚糖、β-甘油磷酸钠、京尼平和角蛋白4种溶液；

3)壳聚糖/角蛋白复合水凝胶的制备

将所述壳聚糖、β-甘油磷酸钠、京尼平和角蛋白4种溶液按照相应比例混合，注入模具，制备壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。

进一步的，在本发明中，所述步骤1)中，人发角蛋白的提取的具体方法为：

称取人发，剪碎，用质量浓度2％的过氧乙酸处理24h，再用100mM的Tris溶液处理2h，过滤保留滤液；离心除去不溶物，透析并浓缩提取液，冷冻干燥后研磨制成角蛋白粉末。

进一步的，在本发明中，所述步骤1)中，人发角蛋白的提取的具体方法为：

称取人发，剪碎，用质量浓度2％的过氧乙酸处理24h，再用100mM的Tris溶液处理2h，过滤保留滤液；离心除去不溶物，提取液进行超滤，冷冻干燥后研磨制成角蛋白粉末。

进一步的，在本发明中，所述步骤3)中，壳聚糖/角蛋白复合水凝胶的制备的具体方法为：

3-1)将所述壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液按体积比10：(1～5)的比例混合均匀，得一次混合溶液；

3-2)在所述一次混合溶液中加入角蛋白溶液，混合均匀，得到壳聚糖溶液、β-甘油磷酸钠溶液和角蛋白溶液的体积比为10：(1～5)：(0.1～0.5)的二次混合溶液；

3-3)在所述二次混合液中加入京尼平溶液，混合均匀，得到最终体积比为壳聚糖溶液、β-甘油磷酸钠溶液、京尼平溶液及角蛋白溶液的体积比为10：(1～5)：(1～3)：(0.1～0.5)的三次混合溶液。

进一步的，在本发明中，所述步骤3)中，壳聚糖/角蛋白复合水凝胶的制备的具体方法为：

3-1-1)将所述β-甘油磷酸钠溶液和角蛋白溶液按相应体积比例混合均匀；

3-1-2)在经步骤3-1-1)所得的混合溶液中加入壳聚糖溶液，混合均匀；

3-1-3)在经步骤3-1-2)所得的混合溶液中加入京尼平溶液，混合均匀，得到最终的混合溶液。

溶液添加顺序有两种：一种可以先混合β-甘油磷酸钠溶液和角蛋白溶液，再加入壳聚糖溶液中混合均匀，最后加入京尼平溶液；或者先将壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠溶液混合均匀后，加入角蛋白溶液再混合均匀，最后加入京尼平溶液。

如果将角蛋白直接加入壳聚糖溶液中会导致沉淀，因为壳聚糖溶液偏酸，黏度大，所以需要添加β-甘油磷酸钠调节水溶性壳聚糖溶液的pH值；而京尼平要最后加入，否则会导致交联反应提前。

本发明先采用β-甘油磷酸钠调节水溶性壳聚糖溶液的pH值至6～7，β-甘油磷酸钠为弱碱性化合物，存在羟基和磷酸根负离子，可以夺取壳聚糖NH₃ ⁺上的质子，使其接近人体内微环境；再引入交联剂京尼平，在酸性和中性条件下，壳聚糖上的氨基基团亲和攻击京尼平C-3位的烯碳原子，二氢吡哺环打开，形成杂环胺，这样可以形成由短链京尼平为交联桥的网状结构聚合物。通过改变京尼平的用量控制水凝胶溶液的成胶时间，达到混合溶液注射机体后能够在原位迅速成胶的目的。

进一步的，在本发明中，所述步骤2)制备的各组分溶液均经0.22μm滤器过滤。

进一步的，在本发明中，成胶时间为2～10min。

有益效果：本发明提供的促进心肌修复的可注射壳聚糖复合水凝胶及其制备方法，用简便易行的方法获得了可降解的三维水凝胶支架；同时，经过实验证实，该复合水凝胶生物相容性良好，能显著促进心肌细胞的生长；该方法操作方便、可重复性好；材料表现出良好的生物相容性，在动物实验中无免疫排斥反应；材料可直接注射到组织缺损部位并快速形成凝胶，水凝胶软硬度可控，可模拟组织微环境，能促进血管生成和缺损组织的修复。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面结合实施例对本发明作进一步详述。

以下实施例所用主要原材料：

壳聚糖(脱乙酰度87.5％，分子量15万)，购自山东奥康生物科技有限公司；

β-甘油磷酸钠，购自阿拉丁公司；

京尼平，购自之信生物科技有限公司；

角蛋白，自制。

实施例1

(1)人发角蛋白的提取

a)称取2g人头发试验样品(理发店购得)，剪成2cm左右的片段，置于400mL锥形瓶中；

b)加入100mL质量浓度2％的过氧乙酸，在37℃摇床上150rpm转速震荡24h；

c)用350μm孔径的筛网过滤，超纯水冲洗头发试验样品，除去多余氧化剂；

d)用200mL 100mM Tris溶液在37℃转速150rpm摇床上处理2h，350μm筛网过滤，保留滤液，200mL超纯水继续处理1.5h，350μm筛网过滤，保留滤液；

e)两次滤液合并，6000rpm转速离心10min去除不溶物，接着用滤纸过滤；

f)用透析袋(截留分子量3K)透析24h，浓缩溶液，冷冻干燥；冻干物用研钵研磨成粉，得到角蛋白粉末，-80℃保存。

在本发明中，采用过氧乙酸代替巯基乙醇，极大的降低了毒性，降低安全风险。

(2)壳聚糖/角蛋白复合水凝胶的制备

a)称取0.2g水溶性壳聚糖粉末，溶于10mL超纯水中，37℃水浴直至完全溶解，高压蒸汽灭菌，制得质量浓度2％的壳聚糖溶液；

b)称取1.15gβ-甘油磷酸钠粉末，溶于10mL超纯水中，搅拌至完全溶解，0.22μm滤器过滤，制得质量浓度11.5％的β-甘油磷酸钠溶液；

c)称取90mg京尼平粉末，溶于10mL浓度为10mM的pH＝7.4的HEPES缓冲液中，37℃水浴溶解12h，0.22μm滤器过滤，制得质量浓度0.9％的京尼平溶液；

d)称取0.6g上述步骤(1)制得的角蛋白粉末，溶于10mL超纯水，搅拌至完全溶解，0.22μm滤器过滤，制得质量浓度6％的角蛋白溶液；

e)取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入10μL角蛋白溶液，混合均匀后加入到1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊；再加入0.1mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置注入准备好的模具中，即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。

本实施例凝胶时间为6min。

本实施例将制得的混合溶液用注射器注射入大鼠心肌梗死区域，壳聚糖会与京尼平发生化学交联形成不溶于水的水凝胶，填补了心肌缺损部位，同时能促进缺损部位的心肌细胞增殖，是用于心梗修复的可注射水凝胶材料。

实施例2

本实施例与实施例1不同的是：取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入10μL角蛋白溶液，混合均匀后加入1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊。加入0.3mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为2min。

实施例3

本实施例与实施例1不同的是：取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入20μL角蛋白溶液，混合均匀后加入1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊。加入0.1mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为6min。

实施例4

本实施例与实施例1不同的是：取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入20μL角蛋白溶液，混合均匀后加入1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊。加入0.3mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为2min。

实施例5

本实施例与实施例1不同的是：取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入50μL角蛋白溶液，混合均匀后加入1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊。加入0.1mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为6.5min。

实施例6

本实施例与实施例1不同的是：取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入50μL角蛋白溶液，混合均匀后加入1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊。加入0.3mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为3min。

实施例7

本实施例与实施例1不同的是：b)称取2.3gβ-甘油磷酸钠溶于10mL超纯水，制得质量浓度23％的β-甘油磷酸钠溶液。e)取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入10μL角蛋白溶液，混合均匀后加入1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊。加入0.1mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为6min。

实施例8

本实施例与实施例1不同的是：b)称取2.3gβ-甘油磷酸钠溶于10mL超纯水，制得质量浓度23％的β-甘油磷酸钠溶液。e)取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入10μL角蛋白溶液，混合均匀后加入1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊。加入0.3mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为3min。

实施例9

本实施例与实施例1不同的是：b)称取1.8gβ-甘油磷酸钠溶于10mL超纯水，制得质量浓度18％的β-甘油磷酸钠溶液。e)取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入10μL角蛋白溶液，混合均匀后加入1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊。加入0.1mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为6min。

实施例10

本实施例与实施例1不同的是：b)称取1.8gβ-甘油磷酸钠溶于10mL超纯水，制得质量浓度18％的β-甘油磷酸钠溶液。e)取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入10μL角蛋白溶液，混合均匀后加入1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊。加入0.3mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为2min。

实施例11

本实施例与实施例1不同的是：c)称取80mg京尼平粉末，溶于10mL浓度为10mM的pH＝7.4的HEPES缓冲液中，37℃水浴溶解12h，0.22μm滤器过滤，制得质量浓度0.8％的京尼平溶液；e)取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入10μL角蛋白溶液，混合均匀后加入1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊。加入0.1mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为7min。

实施例12

本实施例与实施例1不同的是：c)称取80mg京尼平粉末，溶于10mL浓度为10mM的pH＝7.4的HEPES缓冲液中，37℃水浴溶解12h，0.22μm滤器过滤，制得质量浓度0.8％的京尼平溶液；e)取0.1mLβ-甘油磷酸钠溶液，加入10μL角蛋白溶液，混合均匀后加入1mL壳聚糖溶液中，搅拌均匀至溶液清亮无浑浊。加入0.3mL京尼平溶液，搅拌均匀，静置即得到壳聚糖/角蛋白复合水凝胶。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为3min。

实施例13

本实施例与实施例1不同的是：步骤(1)人发角蛋白的提取的方法中f)用超滤管(截留分子量10K)离心滤液，4600rpm转速离心20min，取滤膜上液体进行冷冻干燥；冻干物用研钵研磨成粉，得到角蛋白粉末，-80℃保存。其他与实施例1相同。本实施例凝胶时间为6min。本发明实施例利用超滤管纯化浓缩滤液，代替透析袋和吸水试剂等，简化了实验操作，避免角蛋白被透析袋吸附而降低提取量。注：超滤管具有同时分离纯化和浓缩溶液的功能。该方法角蛋白提取率可达到30％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种促进心肌修复的可注射壳聚糖复合水凝胶的制备方法，其特征在于：通过以下步骤制备：

1)人发角蛋白的提取：利用过氧乙酸和Tris碱从人发中提取角蛋白；

2)各组分溶液的制备：壳聚糖溶液是用超纯水配制成2％质量浓度的溶液；β-甘油磷酸钠溶液是用超纯水配置成11.5％～23％质量浓度的溶液；京尼平溶液是用10mMHEPES配制成0.8％～0.9％质量浓度的溶液；角蛋白溶液是将角蛋白粉末溶于超纯水配制成6％质量浓度的溶液；

3)壳聚糖/角蛋白复合水凝胶的制备：将所述壳聚糖、β-甘油磷酸钠、京尼平和角蛋白4种溶液在室温下按照相应比例混合，注入模具，制备壳聚糖/角蛋白复合水凝胶；其中壳聚糖、β-甘油磷酸钠、京尼平和角蛋白4种溶液体积比为10：(1～5)：(1～3)：(0.1～0.5)；壳聚糖/角蛋白复合水凝胶的制备的具体方法为：

3-1-1)将所述β-甘油磷酸钠溶液和角蛋白溶液按相应体积比例混合均匀；

3-1-2)在经步骤3-1-1)所得的混合溶液中加入壳聚糖溶液，混合均匀；

3-1-3)在经步骤3-1-2)所得的混合溶液中加入京尼平溶液，混合均匀，得到最终的混合溶液。

2.根据权利要求1所述的促进心肌修复的可注射壳聚糖复合水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，人发角蛋白的提取的具体方法为：

称取人发，剪碎，用质量浓度2％的过氧乙酸处理24h，再用100mM的Tris溶液处理2h，过滤保留滤液；离心除去不溶物，提取液进行超滤或透析浓缩，冷冻干燥后研磨制成角蛋白粉末。