CN116271252A

CN116271252A - 一种抗氧化可注射水凝胶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116271252A
Application number: CN202310046707.5A
Authority: CN
Inventors: 高亚男; 胡雪; 冯世权; 于佳岐; 刘艳; 董德峤; 张鹏威
Original assignee: Hainan Medical College
Current assignee: Hainan Medical College
Priority date: 2023-01-31
Filing date: 2023-01-31
Publication date: 2023-06-23

Abstract

本发明涉及一种抗氧化可注射水凝胶，具体是维生素C‑柠檬酸‑壳聚糖水凝胶。本发明还提供了维生素C‑柠檬酸‑壳聚糖水凝胶的制备方法。先分别制备柠檬酸‑壳聚糖和维生素C‑壳聚糖；然后将柠檬酸‑壳聚糖、维生素C‑壳聚糖再与β甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素水溶液反应制备得到维生素C‑柠檬酸‑壳聚糖水凝胶。本发明制备得到的维生素C‑柠檬酸‑壳聚糖水凝胶，是一种抗氧化可注射可降解的壳聚糖水凝胶，应用于可注射性心肌组织工程中细胞移植的支架材料，其对心肌原代细胞具有良好的黏附性，提高移植细胞的滞留率，能够有效对抗梗死部位的氧化应激环境，清除移植部位的活性氧自由基，可支持心肌细胞在其内部的存活。

Description

一种抗氧化可注射水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及水凝胶及其制备和应用领域，特别是涉及一种抗氧化可注射的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

心肌梗死等心脏疾病严重威胁着人类的生命安全与健康，其发病率和死亡率在全球范围内处于逐年上升的势态，现有的治疗手段均存在着一定缺陷。随着组织工程学研究的不断深入，运用心肌细胞移植技术为受损心脏的细胞重建提供了一种全新的治疗方法。然而，由于梗死处局部缺血造成的活性氧自由基堆积等不适微环境，致使细胞移植后成活率和滞留率较低。

可注射心肌组织工程是指将可注射性支架材料与细胞和/或生长因子复合后，注射到受损部位进行心肌修复的一种方法，该方法可以提供一个三维的生长空间，从而提高细胞的存活率，由于其创伤小已成为心肌组织工程研究的热点之一。细胞支架不仅可以代替或修复受损伤的细胞外基质，还可以调节心肌梗死发生时心脏的微环境，满足细胞生长的环境要求。

可注射水凝胶是一种理想的传递细胞的支架材料，高水含量赋予其与组织相似的杨氏模量和离子电导率，它可以模拟心肌细胞外基质，降低左心室壁压力，抑制心肌梗死后左心室的重构，提供适合细胞生存的微环境，使被移植的细胞黏附、成活、募集、增殖和成熟，进而修复心肌功能。

壳聚糖是一种天然的阳离子聚合物，也是天然多糖中唯一的碱性多糖。壳聚糖作为一种天然生物材料，具有生物相容性、生物黏附性、生物降解特性及抗氧化活性等，常作为可注射支架材料广泛应用于组织工程等领域。一般来说，壳聚糖的抗氧化活性强弱与其分子量有关，分子量越高其抗氧化活性越弱，然而，高分子量的壳聚糖形成凝胶的能力强，因此，如何提高高分子壳聚糖的抗氧化能力是壳聚糖类水凝胶应用于可注射性心肌组织工程所面对的一大难题。

无水柠檬酸外观为白色的颗粒或白色结晶状粉末，可溶于水、醇和乙醚。其价格低廉，易于购买，是一种三元羧酸，羧基具有很好的反应活性，可以与壳聚糖上的氨基发生酰化反应。柠檬酸是机体三羧酸循环的组成部分，存在于所有动物组织中，作为氧化代谢的媒介物质。柠檬酸的羧基可以螯合金属离子，进而减少自由基的产生，有望应用于组织工程领域，另外，也可作为自来水中金属离子的吸附剂应用。

维生素C又名抗坏血酸(Ascorbic Acid)是一种天然的水溶性抗氧化剂，VC具有参与人体内胶原蛋白的生成，促进伤口的愈合；提高人体免疫力；预防牙龈出血、动脉硬化及作为抗氧化剂应用等生理功能。另外，VC在羟基化反应和清除活性氧自由基反应中可起到辅助的作用。VC可保护细胞免受氧化应激的损害。VC可通过还原作用清除有害氧自由基，是血浆中最有效的抗氧化剂。

维生素C-柠檬酸-壳聚糖可以改善壳聚糖的溶解度，提高了维生素C的稳定性，在一定范围内提高了壳聚糖的抗氧化性活性。维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶性质稳定，可生物降解，能对抗细胞移植处的氧化应激状态，为细胞移植提供一种适宜的生存环境，可作为心肌组织工程中细胞移植支架材料。

目前仅有柠檬酸-壳聚糖水凝胶的报道及应用，如中国专利“一种柠檬酸接枝壳聚糖水凝胶的制备方法”(公布号：CN103992501B)制备的柠檬酸接枝壳聚糖水凝胶主要提供了一种易溶于水并具有高强度的壳聚糖水凝胶。而中国专利“一种柠檬酸交联壳聚糖水凝胶及其制备方法”(公布号：CN108341977B)制备的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶主要应用于脊髓损伤的修复。目前，尚未有报道维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶及其制备方法和在心肌组织工程中细胞移植支架材料中的应用。

目前，柠檬酸-壳聚糖的制备方法多为物理交联法，如中国专利“一种柠檬酸接枝壳聚糖水凝胶的制备方法”(公布号：CN103992501B)，就是壳聚糖与柠檬酸通过氨基与羧基之间的静电吸引而形成物理交联制得。这种方法反应结合力较弱，柠檬酸易于掉落，形成的复合物的稳定性差，易受离子、pH等因素的影响而发生性质的变化。另一件中国专利“一种柠檬酸交联壳聚糖水凝胶及其制备方法”(公布号：CN108341977B)是通过交联剂EDC/NHS、京尼平或戊二醛溶液将壳聚糖交联，这种方法易导致壳聚糖分子间的氨基发生交联结合，形成更大分子量的壳聚糖聚合物，不能够保证柠檬酸与壳聚糖之间单分子连接，进而形成的产物均一性差。

本发明克服了上述柠檬酸-壳聚糖制备方法的弊端，将柠檬酸形成酸酐、再将其与壳聚糖的氨基连接，保证了两者之间的单分子交联，柠檬酸的整体结构不被破坏，保留其金属离子螯合特性，同时保证壳聚糖不形成多分子聚合物，得到一种性质稳定的柠檬酸-壳聚糖。

发明内容

鉴以此，本发明目的是提供一种抗氧化可注射水凝胶，即维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。

本发明另一个目的是提供一种维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶的制备方法。

步骤一，柠檬酸-壳聚糖的制备：

通过两步合成法制备柠檬酸-壳聚糖，首先制备柠檬酸酐，再将壳聚糖与柠檬酸酐反应，制备柠檬酸-壳聚糖，具体步骤如下：

(1)将无水柠檬酸、乙酸酐、冰乙酸置于茄型瓶中，安装回流冷凝管和氯化钙干燥管，在一定温度下搅拌直至柠檬酸全部溶解后继续保温搅拌一定时间；减压蒸馏除去乙酸，向剩余的介质中加入一定量的热三氯甲烷，继续搅拌直至有白色沉淀析出，抽滤，用三氯甲烷反复洗涤，产物真空干燥24h，得到柠檬酸酐，密封保存。

(2)将壳聚糖溶解于一定浓度的醋酸溶液中，搅拌过夜，用甲醇稀释，取步骤(1)中制备的柠檬酸酐溶解于甲醇中，将壳聚糖溶液和柠檬酸酐溶液混合并置于茄型瓶中，在一定温度下搅拌反应数小时，反应结束后冷却至室温，向混合溶液中加入丙酮，搅拌，抽滤，分别用丙酮、乙醚各洗涤三次，将得到的产物用透析袋(截留分子量为MW：8000-14000Da)以去离子水为透析介质透析48h，产物冷冻干燥48h，得到柠檬酸-壳聚糖。

步骤二：维生素C-壳聚糖的制备：

将壳聚糖和异丙醇置于茄形瓶中，瓶中通氮气并搅拌数小时，加入维生素C水溶液，避光搅拌，加入异丙醇和水的混合溶液，在一定温度下反应，过滤，先后用异丙醇和水的混合溶液、异丙醇洗涤，得到的固体溶于水过滤，透析，冷冻干燥得到维生素C-壳聚糖。

步骤三：维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶的制备：

将1.5％(w/v)的柠檬酸-壳聚糖溶液(以0.1mol/L醋酸为介质)、1.5％(w/v)的维生素C-壳聚糖溶液(以水为介质)、11.5％的β甘油磷酸钠水溶液和2.25％羟乙基纤维素水溶液放入4℃恒温0.5h，将β-GP溶液于冰水浴和磁力搅拌下加入柠檬酸-壳聚糖溶液和维生素C-壳聚糖溶液的混合液中，继续搅拌15～30min，在低温搅拌的条件下加入羟乙基纤维素溶液，获得维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。

优选的，步骤一中，其中(1)中无水柠檬酸、乙酸酐、冰乙酸的比例为1:(0.8～1.2):(0.5～0.8)。

优选的，步骤一中，其中(1)中搅拌温度为35～40℃，搅拌时间为18～24h。

优选的，步骤一中，其中(1)中热三氯甲烷的温度为40～50℃，用三氯甲烷洗涤次数为3～5次。

优选的，步骤一中，其中(2)中壳聚糖醋酸溶液中，壳聚糖溶液的浓度为3～5％；用于溶解壳聚糖的醋酸溶液的醋酸浓度为8～12％；用甲醇稀释，稀释倍数为4～8倍；壳聚糖与柠檬酸酐的质量比为1:(0.6～1.0)。

优选的，步骤一中，其中(2)中反应温度为70～100℃，反应时间为10～15h；向混合溶液中加入丙酮的量为体系原体积的1.2～1.5倍。

优选的，步骤二中，壳聚糖、维生素C、异丙醇的比例为1:(0.8～1.2):(8～12)。

优选的，步骤三中柠檬酸-壳聚糖溶液、维生素C-壳聚糖溶液、β甘油磷酸钠溶液和羟乙基纤维素溶液的质量比为(9～11):(9～11):(3～5):(2～4)，进一步优选质量比为10:10:4:3。

本发明第三个目的是，维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶在心肌组织工程中细胞移植支架材料中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一种抗氧化可注射可降解的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶，应用于可注射性心肌组织工程中细胞移植的支架材料，其对心肌原代细胞具有良好的黏附性，提高移植细胞的滞留率，能够有效对抗心肌梗死部位的氧化应激环境，清除移植部位的活性氧自由基，可支持心肌细胞在其内部的存活。

2.本发明提供了一种维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶的制备方法，该方法将柠檬酸先形成酸酐、再将其与壳聚糖的氨基连接，保证了两者之间的单分子交联，柠檬酸的整体结构不被破坏，保留其金属离子螯合特性，提高了维生素C的稳定性，同时保证壳聚糖不形成多分子聚合物，从而得到一种性质稳定的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。

附图说明

图1是壳聚糖和柠檬酸壳聚糖的红外光谱图，其中CS代表壳聚糖，CSCA代表柠檬酸壳聚糖。

图2是壳聚糖、柠檬酸和柠檬酸壳聚糖的核磁共振氢谱图，其中(A)为柠檬酸；(B)为壳聚糖；(C)为柠檬酸-壳聚糖。

图3是壳聚糖和维生素C-壳聚糖的红外光谱图，其中CS代表壳聚糖，CS-VC代表维生素C-壳聚糖。

图4是壳聚糖、维生素C和维生素C-壳聚糖的核磁共振氢谱图，其中(A)为壳聚糖；(B)为维生素C；(C)为维生素C-壳聚糖。

图5是本发明效果实施例1中DPPH自由基清除活性测定结果，其中◆代表CS；▲代表CCA即维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。

图6是本发明效果实施例2中ABTS自由基清除活性的测定结果，其中■代表CS；▲代表CCA即维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。

图7是本发明效果实施例3中H₂O₂处理后培养在水凝胶中的心肌细胞Live/Dead染色图，其中(A)代表CS水凝胶即壳聚糖水凝胶；(B)代表CCA水凝胶即维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。

图8是本发明效果实施例4中H₂O₂处理后培养在水凝胶中的心肌细胞DCFH-DA染色图，其中(A)代表CS水凝胶即壳聚糖水凝胶；(B)代表CCA水凝胶即维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。

实施例1

(1)柠檬酸-壳聚糖制备：

称取无水柠檬酸2.0g，量取乙酸酐1700μL(1.8479g)，冰乙酸1192μL(1.2516)，置于100mL带有回流冷凝管和氯化钙干燥管的茄型瓶中，在37℃下搅拌直至柠檬酸全部溶解，时间约18-20h。减压蒸馏出乙酸，剩余溶液在搅拌的条件下加入适量的热氯仿(45℃)，白色浑浊转变为油性物质，继续搅拌直至有白色沉淀析出，抽滤，用氯仿反复洗涤4次，产物真空干燥24h，得到柠檬酸酐，密封保存。

称取0.50g的4％壳聚糖溶解于10mL 10％的醋酸溶液中，搅拌过夜，用50mL甲醇稀释。称取自制的柠檬酸酐0.040g溶解于10mL甲醇中，然后加入到壳聚糖溶液中并连接冷凝回流装置，在80℃的油浴中反应12h。反应结束后冷却至室温，向混合溶液中加入丙酮100mL，搅拌，抽滤，分别用丙酮、乙醚各洗涤三次。将得到的产物用透析袋(截留分子量为MW：8000-14000Da)以去离子水为透析介质透析48h，产物冷冻干燥48h，得到柠檬酸-壳聚糖。

(2)维生素C-壳聚糖的制备：

茄形瓶中装入壳聚糖1g和10mL异丙醇，瓶中通入氮气并搅拌1h，加入含VC 1.1g的水溶液4mL，避光搅拌30min，加入异丙醇和水(v/v＝3∶1)的混合溶液，在37℃条件下反应2h，过滤，使用异丙醇和水的混合溶液(v/v＝3∶1)洗涤一次，再加入异丙醇洗涤一次。将得到的固体溶于水过滤，透析以除去异丙醇和未反应的抗坏血酸，冷冻干燥得到纯净产物，即得维生素C-壳聚糖复合物。

(3)维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶的制备：

将1.5％(w/v)的柠檬酸-壳聚糖溶液(以0.1mol/L醋酸为介质)、1.5％(w/v)的维生素C-壳聚糖溶液(以水为介质)、11.5％的β甘油磷酸钠水溶液和2.25％羟乙基纤维素水溶液放入4℃恒温0.5h，将β-GP溶液于冰水浴和磁力搅拌下加入柠檬酸-壳聚糖溶液和维生素C-壳聚糖溶液的混合液中，继续搅拌15～30min，在低温搅拌的条件下加入羟乙基纤维素溶液，获得维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。其中柠檬酸-壳聚糖溶液、维生素C-壳聚糖溶液、β甘油磷酸钠溶液和羟乙基纤维素溶液的质量比为10:10:4:3。

实施例2

(1)柠檬酸-壳聚糖制备：

称取无水柠檬酸2.0g，量取乙酸酐1500μL(1.6305g)，冰乙酸952μL(0.9996g)，置于100mL带有回流冷凝管和氯化钙干燥管的茄型瓶中，在35℃下搅拌直至柠檬酸全部溶解，时间约20-22h。减压蒸馏出乙酸，剩余溶液在搅拌的条件下加入适量的热氯仿(40℃)，白色浑浊转变为油性物质，继续搅拌直至有白色沉淀析出，抽滤，用氯仿反复洗涤3次，产物真空干燥24h，得到柠檬酸酐，密封保存。

称取0.50g的3％壳聚糖溶解于10mL8％的醋酸溶液中，搅拌过夜，用60mL甲醇稀释。称取自制的柠檬酸酐0.040g溶解于10mL甲醇中，然后加入到壳聚糖溶液中并连接冷凝回流装置，在70℃的油浴中反应15h。反应结束后冷却至室温，向混合溶液中加入丙酮100mL，搅拌，抽滤，分别用丙酮、乙醚各洗涤三次。将得到的产物用透析袋(截留分子量为MW：8000-14000Da)以去离子水为透析介质透析48h，产物冷冻干燥48h，得到柠檬酸-壳聚糖。

(2)维生素C-壳聚糖的制备：

(3)维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶的制备：

将1.5％(w/v)的柠檬酸-壳聚糖溶液(以0.1mol/L醋酸为介质)、1.5％(w/v)的维生素C-壳聚糖溶液(以水为介质)、11.5％的β甘油磷酸钠水溶液和2.25％羟乙基纤维素水溶液放入4℃恒温0.5h，将β-GP溶液于冰水浴和磁力搅拌下加入柠檬酸-壳聚糖溶液和维生素C-壳聚糖溶液的混合液中，继续搅拌15～30min，在低温搅拌的条件下加入羟乙基纤维素溶液，获得维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。其中柠檬酸-壳聚糖溶液、维生素C-壳聚糖溶液、β甘油磷酸钠溶液和羟乙基纤维素溶液的质量比为9:9:3:2。

实施例3

(1)柠檬酸-壳聚糖制备：

称取无水柠檬酸2.0g，量取乙酸酐2200μL(2.3914g)，冰乙酸1523μL(1.5991g)，置于100mL带有回流冷凝管和氯化钙干燥管的茄型瓶中，在40℃下搅拌直至柠檬酸全部溶解，时间约22-24h。减压蒸馏出乙酸，剩余溶液在搅拌的条件下加入适量的热氯仿(50℃)，白色浑浊转变为油性物质，继续搅拌直至有白色沉淀析出，抽滤，用氯仿反复洗涤5次，产物真空干燥24h，得到柠檬酸酐，密封保存。

称取0.50g的5％壳聚糖溶解于10mL 12％的醋酸溶液中，搅拌过夜，用80mL甲醇稀释。称取自制的柠檬酸酐0.040g溶解于10mL甲醇中，然后加入到壳聚糖溶液中并连接冷凝回流装置，在100℃的油浴中反应10h。反应结束后冷却至室温，向混合溶液中加入丙酮100mL，搅拌，抽滤，分别用丙酮、乙醚各洗涤三次。将得到的产物用透析袋(截留分子量为MW：8000-14000Da)以去离子水为透析介质透析48h，产物冷冻干燥48h，得到柠檬酸-壳聚糖。

(2)维生素C-壳聚糖的制备：

(3)维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶的制备：

将1.5％(w/v)的柠檬酸-壳聚糖溶液(以0.1mol/L醋酸为介质)、1.5％(w/v)的维生素C-壳聚糖溶液(以水为介质)、11.5％的β甘油磷酸钠水溶液和2.25％羟乙基纤维素水溶液放入4℃恒温0.5h，将β-GP溶液于冰水浴和磁力搅拌下加入柠檬酸-壳聚糖溶液和维生素C-壳聚糖溶液的混合液中，继续搅拌15～30min，在低温搅拌的条件下加入羟乙基纤维素溶液，获得维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。其中柠檬酸-壳聚糖溶液、维生素C-壳聚糖溶液、β甘油磷酸钠溶液和羟乙基纤维素溶液的质量比为11:11:5:4。

效果实施例1：体外抗氧化活性测定之一：DPPH自由基清除活性的测定

称取一定量的2，2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)溶于95％的乙醇中，配制浓度为0.1mol/L的工作液；配制质量浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0mg/mL的CS、CCA(维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶)样品分析溶液；将100μL DPPH工作液加入到150μL不同样品溶液中摇晃30min，波长517nm处测定其吸光度，按照以下公式计算复合物对DPPH自由基的清除能力。以乙醇溶液代替DPPH溶液作为空白组，其中A_control代表对照组的吸光度值，A_sample代表实验样品组的吸光度值，A_blank代表空白组的吸光度值。

CS、CCA对DPPH自由基清除活性的测定结果如附图5所示，CSCA对DPPH自由基清除活性均随着浓度的升高而升高，明显高于同浓度下CS的清除率。

效果实施例2：体外抗氧化活性测定之二：ABTS自由基清除活性的测定

将ABTS溶液(7.0mmol/L)与过硫酸钾溶液(4.95mmol/L)在室温、暗处下混合12h后制成ABTS自由基溶液。使用前，用PBS(0.2mol/L，pH 7.4)稀释至合适的浓度得到ABTS工作溶液。20μL样品和200μL工作液的混合溶液在734nm处测量其吸光度。根据以下公式计算清除活性，以水代替样品分析液作为空白组，以PBS代替ABTS溶液作为对照组。

CS、CCA对ABTS自由基清除活性的测定结果如附图6所示，CSCA对ABTS自由基清除活性均随着浓度的升高而升高，明显高于同浓度下CS的清除率。

效果实施例3：氧自由基微环境下心肌原代细胞在水凝胶中的存活

将新鲜分离的大鼠乳鼠心肌原代细胞接种于四种水凝胶内部后，用过氧化氢激发心肌细胞内的氧化应激微环境，用Live/Dead染色后观察细胞的存活情况，其中活细胞激发绿色荧光，死细胞激发红色荧光。结果附图7所示，视野中仅有少数细胞被染成了红色，且CCA组水凝胶中死细胞的数量明显少于CS组，证实CCA组水凝胶能明显改善细胞生存的氧化微环境，提高心肌细胞的生存率。

效果实施例4：心肌原代细胞内ROS水平检测

2’,7’–二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的还原性二氯荧光素(DCFH)生成有强荧光的氧化型二氯荧光素(DCF)，其中绿色荧光的强度与ROS的水平成正比。将心肌原代细胞培养在水凝胶内部，用DCFH-DA染色，并检测其在488nm处的荧光强度，进而确定心肌细胞内的ROS水平。如附图8表明，培养在CCA水凝胶中的心肌原代细胞发出更强的蓝色荧光，这说明CCA水凝胶可能有助于抑制氧化应激微环境下心肌原代细胞内ROS的产生。

Claims

1.一种抗氧化可注射水凝胶，其特征在于，该水凝胶为维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。

2.根据权利要求1所述的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：柠檬酸-壳聚糖的制备：

(1)将无水柠檬酸、乙酸酐、冰乙酸置于茄型瓶中，在一定温度下搅拌直至柠檬酸全部溶解后继续保温搅拌一定时间，减压蒸馏除去乙酸，向剩余的介质中加入一定量的热三氯甲烷，继续搅拌直至有白色沉淀析出，抽滤，用三氯甲烷反复洗涤，产物真空干燥24h，得到柠檬酸酐，密封保存；

(2)将壳聚糖溶解于一定浓度的醋酸溶液中，搅拌过夜，用甲醇稀释，取步骤(1)中制备的柠檬酸酐溶解于甲醇中，将壳聚糖溶液和柠檬酸酐溶液混合并置于茄型瓶中，在一定温度下搅拌反应数小时，反应结束后冷却至室温，向混合溶液中加入丙酮，搅拌，抽滤，分别用丙酮、乙醚各洗涤三次，将得到的产物用透析袋透析48h，产物冷冻干燥48h，得到柠檬酸-壳聚糖；

步骤二：维生素C-壳聚糖的制备：

将壳聚糖和异丙醇置于茄形瓶中，瓶中通氮气并搅拌数小时，加入维生素C水溶液，避光搅拌，加入异丙醇和水的混合溶液，在一定温度下反应，过滤，先后用异丙醇和水的混合溶液、异丙醇洗涤，得到的固体溶于水过滤，透析，冷冻干燥得到维生素C-壳聚糖；

步骤三：维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶：

将β-GP溶液于冰水浴和磁力搅拌下加入柠檬酸-壳聚糖溶液和维生素C-壳聚糖溶液的混合液中，继续搅拌15～30min，在低温搅拌的条件下加入羟乙基纤维素溶液，获得维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶。

3.根据权利要求2所述的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶制备方法，其特征在于，步骤一中，其中(1)中无水柠檬酸、乙酸酐、冰乙酸的比例为1:(0.8～1.2):(0.5～0.8)。

4.根据权利要求2所述的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶制备方法，其特征在于，步骤一中，其中(1)中搅拌温度为35～40℃，搅拌时间为18～24h。

5.根据权利要求2所述的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶制备方法，其特征在于，步骤一中，其中(1)中热三氯甲烷的温度为40～50℃，用三氯甲烷洗涤次数为3～5次。

6.根据权利要求2所述的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶制备方法，其特征在于，步骤一中，其中(2)为：将3～5％壳聚糖溶解于8～12％醋酸溶液中，搅拌过夜，用甲醇稀释4～8倍，取步骤(1)中制备的柠檬酸酐溶解于甲醇中，将壳聚糖溶液和柠檬酸酐溶液混合并置于茄型瓶中，在70～100℃下搅拌反应10～15h，反应结束后冷却至室温，向混合溶液中加入丙酮，搅拌，抽滤，分别用丙酮、乙醚各洗涤三次，将得到的产物用透析袋透析48h，产物冷冻干燥48h。

7.根据权利要求6所述的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶制备方法，其特征在于，壳聚糖与柠檬酸酐的质量比为1:(0.6～1.0)。

8.根据权利要求2所述的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶制备方法，其特征在于，步骤二中壳聚糖、维生素C、异丙醇的比例为1:(0.8～1.2):(8～12)。

9.根据权利要求2所述的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶制备方法，其特征在于，步骤三中柠檬酸-壳聚糖溶液、维生素C-壳聚糖溶液、β甘油磷酸钠溶液和羟乙基纤维素溶液的质量比为(9～11):(9～11):(3～5):(2～4)。

10.根据权利要求1所述的维生素C-柠檬酸-壳聚糖水凝胶在心肌组织工程中细胞移植支架材料中的应用。