CN116655825A - 一种透明质酸铜及其制备方法和应用 - Google Patents

一种透明质酸铜及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及有机高分子化合物领域，尤其涉及C08L5/08领域，更具体的涉及一种透明质酸铜的制备方法。本发明所述的透明质酸铜的制备方法包括：将透明质酸钠高温下分散于多元醇中；再加入铜盐，一定温度下搅拌反应，即生成不溶于多元醇的透明质酸铜，透明质酸铜会聚集析出。本发明提供的制备方法操作简单，成本低廉的，填补了现有技术中以多元醇为介质的制备透明质酸铜的技术空白，而且制备方法绿色环保，原子经济性高，制备得到的透明质酸铜盐也能应用在化妆品中，起到紧致抗皱和舒缓的功效。

Description

一种透明质酸铜及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及有机高分子化合物领域，尤其涉及C08L5/08领域，更具体的涉及一种透明质酸铜及其制备方法和应用。
背景技术
透明质酸是结缔组织的细胞外基质主要成分，是一种无毒、无免疫原性的生物材料，具有良好的生物降解性和生物相容性；具有细胞粘合、渗透压调节等生理功能。透明质酸目前最常见的衍生物为透明质酸钠。透明质酸钠广泛用于各种复杂的眼科手术及骨关节炎治疗的同时，在化妆品和保健食品领域中也有应用；在化妆品领域透明质酸钠是一种多糖，起到保湿、抗衰老的作用。铜是身体的基本元素之一，铜离子在人体内起到重要的作用，属于一种必需的微量元素，是蛋白质以及酶的重要组成部分，可以存在于红细胞的内外，对铁传递蛋白起到重要作用，还能够催化血红蛋白的合成；一定量的铜离子也能起到杀菌消毒的作用，但是铜离子浓度过高的话进入人体后会使体内的蛋白质结构发生变化，从而失去活性，影响正常的使用功能，另外还会影响人体的新陈代谢，使身体免疫力出现下降的情况。透明质酸铜能够用在化妆品中起到一定的美容功效。目前现有技术中关于高效制备透明质酸铜的报道较少。
现有技术CN110755618A公开了一种透明质酸-铜(II)复合纳米粒子及其制备方法，该铜(II)复合纳米粒子是通过二乙撑三胺桥联修饰的透明质酸与2价铜盐为原料制备的。该制备方法操作简单、方便，通过透明质酸修饰的2价铜复合纳米粒子，对癌细胞具有靶向性、生物相容性好，具有较低的毒副作用，并最大吸收波长出现在近红外区域，有着良好的应用前景，但是二乙撑三胺在透明质酸铜体系中较难完全去除，残留的二乙撑三胺，其蒸气或雾对鼻、喉和粘膜有腐蚀性，可引起支气管炎、化学性肺炎或肺水肿。皮肤接触可造成灼伤；对皮肤有致敏性。口服灼伤口腔和消化道，出现剧烈腹痛、恶心、呕吐和虚脱。慢性影响有明显的致敏作用。其安全性不适合用于化妆品。
现有技术CN102834417A公开了一种透明质酸金属盐的制造方法、包含透明质酸金属盐的化妆品的制造方法以及透明质酸锌及其制造方法。该发明的制备方法为将透明质酸和/或其盐分散于包含金属化合物的含水介质中，水介质可为水、乙醇、甲醇、丙酮中的至少一种；再进行一定的干燥处理，处理过程中乙醇属于易燃物质，甲醇，丙酮属于有毒物质，对环境产生不良影响，其残余物质也属于化妆品控制的风险物质，因此不利于在化妆品中使用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种透明质酸铜的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、将透明质酸钠高温下分散于多元醇中；
S2、再加入铜盐，一定温度下搅拌反应，即生成不溶于多元醇的透明质酸铜，收集固体物料即得。
优选的，所述的透明质酸钠的分子量范围为5000-220万道尔顿。
作为一种可实施的案例，所述的透明质酸钠的分子量可以包括：3-5万道尔顿、20-40万道尔顿、130万道尔顿、180-250万道尔顿。
优选的，所述的透明质酸钠和铜盐的质量比为(2-50)：1。
优选的，所述的S1步骤中的高温温度不高于100℃。
进一步优选的，所述的S1步骤的高温温度为60-100℃。
作为一种可实施的案例，所述的S1步骤的高温温度可以包括70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃。
优选的，所述的S2步骤中的反应温度不高于100℃。
进一步优选的，所述的S2步骤的反应温度为60-100℃。
作为一种可实施的案例，所述的S2步骤的高温温度可以包括65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃。
优选的，所述的S2步骤中搅拌转速为100-300rpm。
进一步优选的，所述的S2步骤中搅拌转速为200rpm。
优选的，所述的多元醇包括乙二醇、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇、1,4-丁二醇、1,2-丙二醇、双丙甘醇、1,6-己二醇、新戊二醇、三羟甲基丙烷中的一种。
进一步优选的，所述的多元醇包括1,4-丁二醇、1,2-丙二醇、甘油、二丙二醇中的一种。
优选的，所述的铜盐中的铜为二价铜离子。
优选的，所述的铜盐至少包括氯化铜、硝酸铜、硫酸铜、碱式碳酸铜、碱式硫酸铜、葡萄糖酸铜、醋酸铜中的一种。
进一步优选的，所述的铜盐至少包括氯化铜、葡萄糖酸铜中的一种。
优选的，所述的S1步骤中高温下溶解时间不超过120min。
进一步优选的，所述的S1步骤中高温下溶解时间为30min。
优选的，所述的S2步骤中的反应时间不超过120min。
进一步优选的，所述的S2步骤中的反应时间为30min。
本发明提供了一种高产率，步骤简单，成本低廉的透明质酸铜制备方法，填补了现有技术中以多元醇为介质的制备透明质酸铜的技术空白，仅需将透明质酸钠和铜盐在多元醇体系中以一定的投料顺序进行加热溶解搅拌反应，反应完全后即可聚集析出得到高产率的透明质酸钠。本发明中控制透明质酸钠和铜盐的质量比为(2-50)：1，可以保证体系中的铜盐中的二价铜离子被透明质酸钠完全络合，透明质酸钠的过量可以保证铜的原子利用率较高，有一定的的原子经济性。另外本制备方法控制反应温度为60-100℃，可以保证制备体系反应快速进行，若反应温度高于100℃则可能会影响透明质酸钠的稳定性导致产率较低，若反应温度低于60℃，则会使反应时间明显增长，造成制备效率变低，制备成本变高。本发明体系中的各制备原料来源较广，各化合物的经济成本也较低，制备过程无需使用复杂的仪器，反应也不需要氮气保护或者外加高压等反应条件，使得整个制备体系安全，可以适合中试或者工业放大生产。另外本制备体系反应完全后只需要进行简单的过滤后处理，甚至不需要保证透明质酸铜的纯度非常高就可以正常使用，主要是由于残留的透明质酸钠可以和透明质酸铜一起应用到化妆品中，二者都可以使化妆品有更好的性能，另外本体系中使用的溶剂多元醇，即使加量过多也无需进一步后处理，当和透明质酸铜一起应用到化妆品中时，合适的多元醇还可以充当保湿剂，协同透明质酸铜，使得化妆品有更好的保湿护肤功效。
本发明第二方面提供了一种透明质酸铜。
本发明第三方面提供了一种透明质酸铜的应用，其特征在于，透明质酸铜可应用于化妆品领域。
有益效果
(一)本发明中控制制备原料透明质酸钠和铜盐的质量比为(2-50)：1，可以保证体系中的铜盐中的二价铜离子被透明质酸钠高效络合，透明质酸钠的过量可以保证铜的原子利用率较高，有一定的原子经济性。
(二)本发明中的制备方法控制反应温度为60-100℃，可以保证制备体系中的反应快速进行，若反应温度高于100℃则可能会影响透明质酸钠的稳定性导致反应产率较低，若反应温度低于60℃，则会使反应时间明显增长，造成制备效率变低，制备成本变高。
(三)本发明体系中的各制备原料来源较广，成本也较低，制备过程无需使用复杂的仪器，反应条件也不需要氮气保护或者高温高压，整个制备体系安全无污染，可以适合中试或者工业放大生产。
(四)本发明中，制备得到的透明质酸铜具有抗氧化、提高I型和III型胶原蛋白含量以及抑制炎症因子的作用，在抗衰、紧致、抗皱、舒缓的化妆品上应用前景广泛。
(五)本发明中，残留的透明质酸钠可以和透明质酸铜，一起应用到化妆品中，二者都可以使化妆品有更好的性能，另外本体系中使用的多元醇，即使加量过多也无需进一步后处理，当和透明质酸铜一起应用到化妆品中时，多元醇还可以充当保湿剂，协同透明质酸铜，使得化妆品有更好的保湿护肤功效。
(六)本发明提供了一种高产率，制备方法简单，成本低廉的透明质酸铜制备方法，填补了现有技术中以多元醇为介质的制备透明质酸铜的技术空白，而且制备方法绿色环保。
附图说明
图1为实施例4、5、6得到的透明质酸铜的DPPH自由基清除率趋势图。
图2为实施例4、5、6得到的透明质酸铜对HDF细胞活率趋势图。
图3为实施例4、5、6得到的透明质酸铜HDF细胞I型胶原蛋白含量影响结果图。
图4为实施例4、5、6得到的透明质酸铜HDF细胞III型胶原蛋白含量影响结果图。
图5为实施例4、5、6得到的透明质酸铜对RAW264.7细胞活率测试结果图。
图6为实施例4、5、6得到的透明质酸铜RAW264.7细胞进行培养的TNF-α含量图。
具体实施方式
实施例1
本实施例第一方面提供了一种透明质酸铜的制备方法，为以下步骤：
S1、将20g透明质酸钠溶解于80℃的100g甘油(CAS：56-81-5)中，溶解时间为30min；
S2、再加入5g氯化铜(CAS：7447-39-4)，加入氯化铜溶解后体系为黄绿色，80℃下搅拌转速为200rpm反应30min，即生成不溶于甘油的透明质酸铜，收集固体物料即得。
所述的透明质酸钠的分子量为3-5万道尔顿，型号为HA-TLM 3-5，购自华熙生物科技股份有限公司。
本实施例第二方面提供了一种透明质酸铜。
本实施例第三方面提供了一种透明质酸铜的应用，其特征在于，透明质酸铜可应用于化妆品领域。
实施例2
本实施例第一方面提供了一种透明质酸铜的制备方法，为以下步骤：
S1、将0.2g透明质酸钠溶解于80℃的100g甘油(CAS：56-81-5)中，溶解时间为30min；
S2、再加入0.1g氯化铜(CAS：7447-39-4)，加入氯化铜溶解后体系为黄绿色，80℃下搅拌转速为200rpm反应30min，即生成不溶于甘油的透明质酸铜，收集固体物料即得。
所述的透明质酸钠的分子量为20-40万道尔顿，型号为HA-TLM 20-40，购自华熙生物科技股份有限公司。
本实施例第二方面提供了一种透明质酸铜。
本实施例第三方面提供了一种透明质酸铜的应用，其特征在于，透明质酸铜可应用于化妆品领域。
实施例3
本实施例第一方面提供了一种透明质酸铜的制备方法，为以下步骤：
S1、将20g透明质酸钠溶解于80℃的100g甘油(CAS：56-81-5)中，溶解时间为30min；
S2、再加入0.4g氯化铜(CAS：7447-39-4)，加入氯化铜溶解后体系为黄绿色，80℃下搅拌转速为200rpm反应30min，即生成不溶于甘油的透明质酸铜，收集固体物料即得。
所述的透明质酸钠的分子量为130万道尔顿，型号为ProHA，购自安华生物。
本实施例第二方面提供了一种透明质酸铜。
本实施例第三方面提供了一种透明质酸铜的应用，其特征在于，透明质酸铜可应用于化妆品领域。
实施例4
本实施例第一方面提供了一种透明质酸铜的制备方法，为以下步骤：
S1、将20g透明质酸钠溶解于80℃的100g甘油(CAS：56-81-5)中，溶解时间为30min；
S2、再加入10g氯化铜(CAS：7447-39-4)，加入氯化铜溶解后体系为黄绿色，80℃下搅拌转速为200rpm反应30min，即生成不溶于甘油的透明质酸铜，收集固体物料即得。
所述的透明质酸钠的分子量为180-250万道尔顿，型号为HyaSource Care Max，购自天晟生物。
本实施例第二方面提供了一种透明质酸铜。
本实施例第三方面提供了一种透明质酸铜的应用，其特征在于，透明质酸铜可应用于化妆品领域。
实施例5
本实施例第一方面提供了一种透明质酸铜的制备方法，为以下步骤：
S1、将50g透明质酸钠溶解于80℃的100g甘油(CAS：56-81-5)中，溶解时间为30min；
S2、再加入5g氯化铜(CAS：7447-39-4)，加入氯化铜溶解后体系为黄绿色，80℃下搅拌转速为200rpm反应30min，即生成不溶于甘油的透明质酸铜，收集固体物料即得。
所述的透明质酸钠的分子量为20-40万道尔顿，型号为HA-TLM 20-40，购自华熙生物科技股份有限公司。
本实施例第二方面提供了一种透明质酸铜。
本实施例第三方面提供了一种透明质酸铜的应用，其特征在于，透明质酸铜可应用于化妆品领域。
实施例6
本实施例第一方面提供了一种透明质酸铜的制备方法，为以下步骤：
S1、将20g透明质酸钠分散于80℃的100g的1,2-丙二醇(CAS：57-55-6)中，溶解时间为30min；
S2、再加入5g氯化铜(CAS：7447-39-4)，加入氯化铜溶解后体系为黄绿色，80℃下搅拌转速为200rpm反应30min，即生成不溶于1,2-丙二醇的透明质酸铜，收集固体物料即得。
所述的透明质酸钠的分子量为130万道尔顿，型号为ProHA，购自安华生物。
本实施例第二方面提供了一种透明质酸铜。
本实施例第三方面提供了一种透明质酸铜的应用，其特征在于，透明质酸铜可应用于化妆品领域。
实施例7
本实施例第一方面提供了一种透明质酸铜的制备方法，为以下步骤：
S1、将20g透明质酸钠分散于80℃的100g的二丙二醇(CAS：110-98-5)中，溶解时间为30min；
S2、再加入5g氯化铜(CAS：7447-39-4)，加入氯化铜溶解后体系为黄绿色，80℃下搅拌转速为200rpm反应30min，即生成不溶于二丙二醇的透明质酸铜，收集固体物料即得。
所述的透明质酸钠的分子量为20-40万道尔顿，型号为HA-TLM 20-40，购自华熙生物科技股份有限公司。
本实施例第二方面提供了一种透明质酸铜。
本实施例第三方面提供了一种透明质酸铜的应用，其特征在于，透明质酸铜可应用于化妆品领域。
实施例8
本实施例第一方面提供了一种透明质酸铜的制备方法，为以下步骤：
S1、将20g透明质酸钠分散于80℃的100g的1,4-丁二醇(CAS：110-63-4)中，溶解时间为30min；
S2、再加入5g氯化铜(CAS：7447-39-4)，加入氯化铜溶解后体系为黄绿色，80℃下搅拌转速为200rpm反应30min，即生成不溶于1,4-丁二醇的透明质酸铜，收集固体物料即得。
所述的透明质酸钠的分子量为130万道尔顿，型号为ProHA，购自安华生物。
本实施例第二方面提供了一种透明质酸铜。
本实施例第三方面提供了一种透明质酸铜的应用，其特征在于，透明质酸铜可应用于化妆品领域。
实施例9
本实施例第一方面提供了一种透明质酸铜的制备方法，为以下步骤：
S1、将20g透明质酸钠分散于80℃的100g的1,4-丁二醇(CAS：110-63-4)中，溶解时间为30min；
S2、再加入5g葡萄糖酸铜(CAS：527-07-1)，加入葡萄糖酸铜溶解后体系为黄绿色，80℃下搅拌转速为200rpm反应30min，即生成不溶于1,4-丁二醇的透明质酸铜，收集固体物料即得。
所述的透明质酸钠的分子量为3-5万道尔顿，型号为HA-TLM 3-5，购自华熙生物科技股份有限公司。
本实施例第二方面提供了一种透明质酸铜。
本实施例第三方面提供了一种透明质酸铜的应用，其特征在于，透明质酸铜可应用于化妆品领域。
实施例10
本实施例第一方面提供了一种透明质酸铜的制备方法，为以下步骤：
S1、将20g透明质酸钠分散于80℃的100g甘油(CAS：56-81-5)中，溶解时间为30min；
S2、再加入5g氯化铜(CAS：7447-39-4)，加入氯化铜溶解后体系为黄绿色，50℃下搅拌转速为200rpm反应30min，即生成不溶于甘油的透明质酸铜，收集固体物料即得。
所述的透明质酸钠的分子量为20-40万道尔顿，型号为HA-TLM 20-40，购自华熙生物科技股份有限公司。
本实施例第二方面提供了一种透明质酸铜。
本实施例第三方面提供了一种透明质酸铜的应用，其特征在于，透明质酸铜可应用于化妆品领域。
性能评价
一、铜离子反应率测试
测试对象：实施例1-10提供的制备方法聚集析出，然后过滤得到的透明质酸铜。
收率计算方法：通过配方中氯化铜的添加量，计算出反应前溶液中的铜离子当量为M1，通过检测得到试验后铜离子当量M2，透明质酸投料量记为M3。计算铜离子反应率为(M1-M2)/M1*100％，总的透明质酸中铜当量为(M1-M2)/(M3+M1-M2)*100％，并将结果记入表1。
表1
铜离子反应率(％) 铜当量(％)
实施例1 76.7 16.1
实施例2 73.2 26.8
实施例3 81.1 1.6
实施例4 75.3 15.8
实施例5 84.5 7.8
实施例6 79.2 16.5
实施例7 80.8 16.7
实施例8 88.4 18.1
实施例9 68.7 14.7
实施例10 79.4 16.6
二、功效测试
将实施例4、5、6得到的透明质酸铜用作功效测试。
透明质酸铜溶液为称取过滤后的透明质酸铜络合物0.5g，加水99.5g，稀释为浓度0.5％溶液。
1.DPPH自由基清除率测试(抗氧化)
测试方法：参考团体标准T/SHRH006-2018《化妆品-自由基(DPPH)清除实验方法》实行，称取12mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼于烧杯中，加入10ml 95％乙醇，搅拌至溶解，转移至离心管中，混匀仪混匀5min，再稀释10倍作为工作液(0.12mg/ml)。将实施例4、5、6得到的透明质酸铜按体积分数稀释至25％、12.5％、6.25％三个浓度梯度进行测试，测试使用孔板为96孔板。具体加样方式如表2。
表2
T-样品孔 T0-样品本底 C-DPPH孔 C0-溶剂本底
样品溶液(μl) 50 50 - -
95％乙醇溶剂(μl) 100 100 150 150
95％乙醇(μl) - 50 - 50
DPPH乙醇溶液(μl) 50 - 50 -
平行次数 3/样 1/样 3/样 1/样
测试结果：本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜DPPH自由基清除测试结果如表3和图1所示。
表3
由表3及图1可知，本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜可以清除DPPH自由基，具有抗氧化功效。
2.人真皮成纤维细胞HDF I型及III型胶原蛋白含量测定(紧致、抗皱)
测试方法：参考团体标准TSHRH031-2020《化妆品紧致、抗皱功效测试-体外成纤维细胞I型胶原蛋白含量测定》实行。
2.1HDF细胞毒性测试：
将本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜配制成8个浓度梯度，测试其对人真皮成纤维细胞HDF的毒性，以用于后续功效测试。具体实验方法如下：
细胞复苏：将人真皮成纤维细胞进行复苏，按2×10^6/瓶接种到T75瓶，37℃，5％CO2培养箱培养3d。
铺板：培养至细胞融合率为90％左右，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，离心收集后用适量培养基重悬计数，取1个96孔板取4.8×10^6个细胞用12ml基础培养基重悬，按每100μl/孔含4×10^4个细胞铺板，每种测试浓度3个复孔，37℃，5％CO2培养箱培养24h。
实验分组：实验设置阴性对照、阳性对照、测试样品和空白对照。
配液：用完全培养基将本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜配制成不同浓度的样品，过滤除菌，测试样品浓度梯度按体积分数为5％、1.667％、0.556％、0.185％、0.062％、0.021％、0.007％、0.002％。
给药：待96孔板中的细胞融合率达到40％-60％时进行给药，吸弃原来培养基，阴性对照每孔加入100μl培养基；阳性对照每孔加入100μl含有10％二甲基亚砜(DMSO)的培养基；样品组每孔加入100μl含有相应浓度样品的培养基；空白对照无细胞接种，仅加入100μl培养基。给药完成后将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养20h。
检测：提前配制20ml MTT溶液：取20ml PBS溶解0.1g MTT粉末过滤除菌，终浓度为5mg/ml避光保存，备用。细胞培养20h后，96孔板加入20μl/孔MTT溶液，于37℃，5％ CO2培养箱继续培养4h。4h后取出细胞，小心吸弃上清，加入150μl/孔的DMSO吹打至充分混匀，室温避光放置30min。用移液器将细胞悬液再次吸打混匀，在酶联免疫检测仪OD 492nm处测量各孔的吸光值。
细胞相对活率计算：根据公式进行计算，细胞相对存活率％＝(样品OD-空白对照OD)/(阴性对照OD-空白对照OD)×100％。
HDF细胞毒性测试结果：本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜对HDF细胞毒性测试结果如表4和图2所示。
表4
由表4及图2可知，本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜在使用浓度为0.185％及其以下时对HDF细胞无毒性，可用来进行功效测试。
2.2I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量测定
2.2.1细胞培养及给药处理
根据HDF细胞毒性实验结果选择测试浓度，本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜以0.185％、0.062％及0.021％三个浓度样品作为受试物进行测试。
实验分组：空白对照组、阳性对照组和受试物组。具体实验方法如下：
细胞接种：HDF细胞按1×10^4个细胞/孔接种到96孔板，每种测试浓度3个复孔，每孔100μl，37℃，5％ CO2培养箱培养24±2h。
给药：24±2h后，吸弃96孔板中的培养基，受试物孔中加入含有受试物的培养基，阳性对照孔中加入含有100ng/ml TGF-β1的培养基，空白对照孔中加入正常的细胞培养基，每孔200μl。给药完毕后将96孔板放置在37℃，5％ CO2培养箱中继续培养72±2h。
收集上清：72±2h孵育培养结束后，每孔收集200μl细胞培养上清液于1.5ml无菌离心管中，置于-80℃超低温冰箱冷冻保存备用。
2.2.2ELISA试剂盒检测
ELISA检测根据人I型及III型胶原蛋白酶联免疫试剂盒的使用说明书进行检测。具体步骤如下：
标准品的加样：设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。
加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液(Sample diluent)40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释浓度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀。
加酶：每孔加入酶标试剂(HRP-Conjugate reagent)100μl，空白孔除外。
温育：用封板膜封板后置于37℃温育60分钟。
配液：将20倍浓缩洗涤液(20×Wash solution)用蒸馏水20倍稀释后备用。
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
显色：每孔先加入显色剂A(Chromogen Solution A)50μl，再加入显色剂B(Chromogen Solution B)50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
终止：每孔加终止液(Stop Solution)50μl，终止反应。
测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔吸光度(OD值)。
I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量测定结果：本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜对HDF细胞I型胶原蛋白含量影响结果如表5和图3，对HDF细胞III型胶原蛋白含量影响结果如表6和图4。
表5
表6
由表5及图3可知，将本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜以浓度0.185％、0.062％、0.021％加入到培养基中对HDF细胞进行培养，与空白组比较，均可显著提高细胞I型胶原蛋白的含量(P<0.05)，说明本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜对细胞合成I型胶原蛋白具有促进作用。此外，由表6及图4可知，除了提升I型胶原蛋白外，在浓度0.185％下，本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜还可提升III型胶原蛋白含量(P<0.05)。在人体皮肤中，胶原蛋白主要为I型和III型，I型胶原蛋白可以提供支撑和紧致的作用，能够使皮肤看起来更加紧致光滑。而III型胶原蛋白则可以提高皮肤的弹性和柔软性，能够让皮肤更加具有弹性，不易出现皱纹和松弛。本测试说明实施例4、5、6得到的透明质酸铜具有紧致抗皱功效。
3.小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)炎症因子TNF-α含量测定
测试方法：参考团体标准TSHRH033-2020《化妆品舒缓功效测试-体外TNF-α炎症因子含量测定脂多糖诱导巨噬细胞RAW264.7测试方法》实行。
3.1RAW264.7细胞毒性测试：
将本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜配制成8个浓度梯度，测试其对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)的毒性，以用于后续功效测试。具体实验方法如下：
细胞复苏：将RAW264.7细胞进行复苏，按8×10^6/瓶接种到T75瓶，37℃，5％CO2培养箱培养2d，每天换液。
铺板：培养至细胞融合率为90％左右，用细胞刮刀将培养瓶中细胞刮下，离心收集后用适量培养基重悬计数，取1个96孔板取3.6×10^6个细胞用12ml基础培养基重悬，按每100μl/孔含3×10^4个细胞铺板，每种测试浓度3个复孔，37℃，5％CO2培养箱培养24h。
实验分组：实验设置阴性对照、阳性对照、测试样品和空白对照。
配液：用完全培养基将本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜配制成不同浓度的样品，过滤除菌，测试样品浓度梯度按体积分数为5％、1.667％、0.556％、0.185％、0.062％、0.021％、0.007％、0.002％。
给药：待96孔板中的细胞融合率达到40％-60％时进行给药，吸弃原来培养基，阴性对照每孔加入100μl培养基；阳性对照每孔加入100μl含有10％二甲基亚砜(DMSO)的培养基；样品组每孔加入100μl含有相应浓度样品的培养基；空白对照无细胞接种，仅加入100μl培养基；所有组别加入终浓度为10μg/ml的LPS。给药完成后将96孔板置于37℃，5％ CO2培养箱中培养20h。
检测：提前配制20ml MTT溶液：取20ml PBS溶解0.1g MTT粉末过滤除菌，终浓度为5mg/ml避光保存，备用。细胞培养20h后，96孔板加入20μl/孔MTT溶液，于37℃，5％ CO2培养箱继续培养4h。4h后取出细胞，小心吸弃上清，加入150μl/孔的DMSO吹打至充分混匀，室温避光放置30min。用移液器将细胞悬液再次吸打混匀，在酶联免疫检测仪OD 492nm处测量各孔的吸光值。
细胞相对活率计算：根据公式进行计算，细胞相对存活率％＝(样品OD-空白对照OD)/(阴性对照OD-空白对照OD)×100％。
RAW264.7细胞毒性测试结果：本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜对RAW264.7细胞毒性测试结果如表7和图5所示。
表7
由表7及图5可知，本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜在使用浓度为0.185％及其以下时对RAW264.7细胞无毒性，可用来进行功效测试。
3.2炎症因子TNF-α含量测定
3.2.1细胞培养及给药处理
根据RAW264.7细胞毒性实验结果选择测试浓度，本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜以0.185％、0.062％及0.021％三个浓度样品作为受试物进行测试。
实验分组：空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和受试物组。具体实验方法如下：
细胞接种：细胞按3×10^4个细胞/孔接种到96孔板，每种测试浓度3个复孔，每孔100μl，37℃，5％ CO2培养箱培养24±2h。
给药：24±2h后，吸弃96孔板中的培养基，受试物孔中加入含有受试物的培养基，阳性对照孔中加入含有100μg/ml地塞米松的培养基，阴性对照和空白对照孔中加入正常的完全细胞培养基，每孔200μl。给药完毕后将96孔板放置37℃，5％ CO2培养箱中预处理2h。LPS刺激：2h预处理结束后，除空白对照孔外，每孔加入终浓度为10μg/ml的LPS，37℃，5％CO2培养箱继续培养24h。
收集上清：72±2h孵育培养结束后，每孔收集200μl细胞培养上清液于1.5ml无菌离心管中，置于-80℃超低温冰箱冷冻保存备用。
3.2.2ELISA试剂盒检测
ELISA检测根据小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫试剂盒的使用说明书进行检测。具体步骤如下：
标准品的加样：设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。
加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液(Sample diluent)40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释浓度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀。
加酶：每孔加入酶标试剂(HRP-Conjugate reagent)100μl，空白孔除外。
温育：用封板膜封板后置于37℃温育60分钟。
配液：将20倍浓缩洗涤液(20×Wash solution)用蒸馏水20倍稀释后备用。
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
显色：每孔先加入显色剂A(Chromogen Solution A)50μl，再加入显色剂B(Chromogen Solution B)50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
终止：每孔加终止液(Stop Solution)50μl，终止反应。
测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔吸光度(OD值)。
TNF-α含量测定结果：本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜对LPS诱导后RAW264.7细胞TNF-α含量影响结果如表8和图6。
表8
LPS是革兰氏阴性菌的细胞壁主要组成成分，细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来。其毒性成分主要为类脂质A，能够引起哺乳动物细胞发生免疫反应，从而导致促炎因子的释放。由表8及图6可知，将本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜以浓度0.062％加入到培养基中对RAW264.7细胞进行培养，当再用LPS刺激时，与阴性对照组相比，均可显著降低炎症因子TNF-α的含量(P<0.05)，说明本发明实施例4、5、6得到的透明质酸铜对炎症因子TNF-α的产生具有抑制作用。本测试说明实施例4、5、6得到的透明质酸铜具有舒缓功效。

Claims (10)

1.一种透明质酸铜的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S1、将透明质酸钠高温下分散于多元醇中；
S2、再加入铜盐，一定温度下搅拌反应，即生成不溶于多元醇的透明质酸铜，收集固体物料即得。
2.根据权利要求1所述的一种透明质酸铜的制备方法，其特征在于：所述的透明质酸钠和铜盐的质量比为(2-50)：1。
3.根据权利要求1所述的一种透明质酸铜的制备方法，其特征在于：所述的透明质酸分子量范围为5000-220万道尔顿。
4.根据权利要求1所述的一种透明质酸铜的制备方法，其特征在于：所述的S1步骤中的高温温度不高于100℃。
5.根据权利要求1所述的一种透明质酸铜的制备方法，其特征在于：所述的S2步骤中的反应温度不高于100℃。
6.根据权利要求1所述的一种透明质酸铜的制备方法，其特征在于：所述的多元醇包括：乙二醇、三羟甲基乙烷、木糖醇、山梨醇、1,4-丁二醇、1,2-丙二醇、双丙甘醇、1,6-己二醇、新戊二醇、三羟甲基丙烷中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种透明质酸铜的制备方法，其特征在于：所述的铜盐包括氯化铜、硝酸铜、硫酸铜、碱式碳酸铜、碱式硫酸铜、葡萄糖酸铜、醋酸铜中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种透明质酸铜的制备方法，其特征在于：所述的S1步骤中高温下溶解时间不超过120min；所述的S2步骤中的反应时间不超过120min。
9.一种根据权利要求1-8任一项所述的透明质酸铜制备方法制备得到的透明质酸铜。
10.一种根据权利要求9所述的透明质酸铜的应用，其特征在于：所述的透明质酸铜可应用于化妆品领域。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102552309A (zh) * 2010-12-15 2012-07-11 北京理工大学 一种透明质酸金的用途及其制备方法
CN102834417A (zh) * 2010-04-14 2012-12-19 丘比株式会社 透明质酸金属盐的制造方法、包含透明质酸金属盐的化妆品的制造方法以及透明质酸锌及其制造方法
CN108635247A (zh) * 2018-06-27 2018-10-12 广州澳希亚实业有限公司 含透明质酸钠的化妆品用组合物
CN111773130A (zh) * 2020-07-17 2020-10-16 贝乐科(上海)生物科技有限公司 羟丙基四氢吡喃三醇复配物及其制备方法和用途
CN114146034A (zh) * 2021-12-10 2022-03-08 北京美丽臻颜化妆品有限公司 一种抗皱护肤品及其制备方法
CN115517997A (zh) * 2022-09-27 2022-12-27 浙江湃肽生物股份有限公司 一种化妆品组合物及其制备方法和用途
CN115737476A (zh) * 2022-12-27 2023-03-07 广东省科学院化工研究所 一种美白组合物及其制备和应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102834417A (zh) * 2010-04-14 2012-12-19 丘比株式会社 透明质酸金属盐的制造方法、包含透明质酸金属盐的化妆品的制造方法以及透明质酸锌及其制造方法
CN102552309A (zh) * 2010-12-15 2012-07-11 北京理工大学 一种透明质酸金的用途及其制备方法
CN108635247A (zh) * 2018-06-27 2018-10-12 广州澳希亚实业有限公司 含透明质酸钠的化妆品用组合物
CN111773130A (zh) * 2020-07-17 2020-10-16 贝乐科(上海)生物科技有限公司 羟丙基四氢吡喃三醇复配物及其制备方法和用途
CN114146034A (zh) * 2021-12-10 2022-03-08 北京美丽臻颜化妆品有限公司 一种抗皱护肤品及其制备方法
CN115517997A (zh) * 2022-09-27 2022-12-27 浙江湃肽生物股份有限公司 一种化妆品组合物及其制备方法和用途
CN115737476A (zh) * 2022-12-27 2023-03-07 广东省科学院化工研究所 一种美白组合物及其制备和应用

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