TWI541352B - 以抗壞血酸衍生物刺激玻尿酸生成之方法及其配方 - Google Patents

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Description

以抗壞血酸衍生物刺激玻尿酸生成之方法及其配方
本發明係關於一種刺激玻尿酸生成的方法，特別是關於一種使用抗壞血酸衍生物來刺激玻尿酸生成的方法及其配方。
玻尿酸(Hyaluronic Acid；HA)，也可稱為透明質酸(Hyaluronan)或玻尿酸鈉(sodium hyaluronate)，是一種天然物，且可高度水解成為具有重複二糖(disaccaride)單元D-葡萄糖醛酸-beta-1,3-N-乙醯葡糖胺-beta-1,4(D-glucuronic acid-beta-1,3-N-acetylglucosamine-beta-1,4)之線性聚合物。玻尿酸的分子量範圍約1000KDa-10000KDa。通常可在細胞之間的流動充填空間(fluid-filled space)的細胞外基質(extracellular matrix；ECM)中發現高濃度的玻尿酸。玻尿酸最大的功能是可以將水分鎖在ECM中，並膠原蛋白(collagen)與彈性蛋白(elastin)，以呈現出青春活力的外貌。
玻尿酸可廣泛地作為治療與美容等方面之應用。目 前市面上最常見的玻尿酸來源有以下幾種：動物組織的萃取、微生物發酵、以及化學合成等。這些方法所取得的玻尿酸對人體而言都是外來的補充而非自本體所產生，所以，不僅難以在人體內維持較長的時間，也可能會對人體有潛在毒性的危險性。
有鑑於此，如何開發一種可有效產生高產量的玻尿酸，且兼具高度人體安全性的刺激玻尿酸生成之方法及其配方，是一項極具產業價值的課題。
鑒於上述之背景中，為了符合產業上的需求，本新型提供一種促進玻尿酸生成的方法及其配方，上述促進玻尿酸生成的方法及其配方不僅可以有效促進高產率之玻尿酸生成，更可兼顧對人體的安全性。
本發明之一目的係提供一種促進玻尿酸生成之方法及其配方，藉由在人體內自體產出的方式，可大幅提昇所產生之玻尿酸的安全性，且有效避免過程中對人體造成不希望的傷害。
本發明之另一目的係提供一種促進玻尿酸生成之方法及其配方，藉由直接促進標的區域之纖維母細胞(fibroblast cell)生成玻尿酸的數量，此一方式可更有效地增進使用玻尿酸來進行治療或美容之效果。
根據前述目的，本說明書提供一促進玻尿酸生成之方法，前述促進玻尿酸生成之方法包含使纖維母細胞與抗壞血酸 衍生物(ascorbic acid derivatives)反應之步驟。藉由抗壞血酸衍生物的刺激，可有效且安全地促進玻尿酸的生成量。更好的是，根據本說明書，可藉由少量的抗壞血酸衍生物即可達到有效刺激纖維母細胞產出玻尿酸的效果。
在根據本說明書之一實施例中，上述促進玻尿酸生成之方法可以藉由使用具有下列結構式之抗壞血酸衍生物來刺激纖維母細胞，以達到玻尿酸增生的效果。
在根據本說明書之一實施例中，上述促進玻尿酸生成之方法可以藉由使用濃度為7500ppm-1.25ppm的抗壞血酸衍生物來刺激纖維母細胞，以達到玻尿酸增生的效果。
在根據本說明書之一實施例中，上述促進玻尿酸生成之方法可以藉由使用3-O-烷基-抗壞血酸來刺激纖維母細胞，以達到玻尿酸增生的效果。
在根據本說明書之一實施例中，上述促進玻尿酸生成之方法可以藉由使用3-O-乙基-抗壞血酸來刺激纖維母細胞，以達到玻尿酸增生的效果。
本說明書同時揭露了一種，促進玻尿酸生成之配 方。上述配方包含一抗壞血酸衍生物。藉由使用上述抗壞血酸衍生物與纖維母細胞反應，可有效刺激纖維母細胞產出玻尿酸。上述抗壞血酸衍生物具有下列結構式：
在根據本說明書之一實施例中，上述促進玻尿酸生成之配方中的抗壞血酸衍生物濃度範圍約為7500ppm-1.25ppm。
在根據本說明書之一實施例中，上述促進玻尿酸生成之配方包含3-O-烷基-抗壞血酸。
第一圖係以Echelon試劑盒來檢測根據本說明書的老鼠纖維母細胞(3T3)受到刺激而分泌出玻尿酸的數量變化分析圖。
第二圖係以Echelon試劑盒來檢測根據本說明書的人類纖維母細胞(HS68)受到刺激而分泌出玻尿酸的數量變化分析圖。
第三圖係以R&D試劑盒來檢測根據本說明書的老鼠纖維母細胞(3T3)受到刺激而分泌出玻尿酸的數量變化分析圖。
第四圖係以R&D試劑盒來檢測根據本說明書的人類纖維母細胞(HS68)受到刺激而分泌出玻尿酸的數量變化分析圖。
第五圖係以R&D試劑盒來檢測根據本說明書的老鼠纖維母細胞(3T3)受到抗壞血酸(AA)刺激而分泌出玻尿酸的數量變化分析圖。
本發明在此所探討的方向為一種促進玻尿酸生成之方法及其配方。為了能徹底地瞭解本發明，將在下列的描述中提出詳盡的製程步驟或組成結構。顯然地，本發明的施行並未限定於該領域之技藝者所熟習的特殊細節。另一方面，眾所周知的組成或製程步驟並未描述於細節中，以避免造成本發明不必要之限制。本發明的較佳體系會詳細描述如下，然而除了這些詳細描述之外，本發明還可以廣泛地施行在其他的體系中，且本發明的範圍不受限定，以其之後的專利範圍為準。
本發明之一實施例揭露一種促進玻尿酸生成之方法。上述促進玻尿酸生成之方法包含使纖維母細胞與抗壞血酸衍生物(ascorbic acid derivatives)反應之步驟。上述抗壞血酸衍生物之結構通式如下：
在上述的結構通式中，R1與R2可以是獨立選自下列族群中之一者：氫原子(H atom)、C1-C20烷基(alkyl group)、C3-C20環烷基(cycloalkyl group)、C1-C20雜環烷基(heterocycloalkyl group)、C1-C20烷氧基(alkoxy group)、C2-C20醯基(acyl group)、C6-C20芳香基(aryl group)、C1-C20雜環芳香基(heterocyclic aromatic group)、C3-C20環烯基(cycloalkenyl group)。根據本實施例，上述之R1與R2不同時為氫原子。在根據本實施例之一較佳範例中，上述抗壞血酸衍生物可以是3-O-烷基-抗壞血酸(3-O-alkyl-ascorbic acid)。更好的是，在該範例中，上述3-O-烷基-抗壞血酸的烷基可以是C2-C10烷基。在根據本實施例之一較佳範例中，上述抗壞血酸衍生物的濃度範圍約為7500ppm-1.25ppm。在根據本實施例之另一較佳範例中，上述抗壞血酸衍生物的濃度範圍約為2500ppm-1.25ppm。
本發明之另一實施例揭露一種促進玻尿酸生成之配方。上述促進玻尿酸生成之配方包含一抗壞血酸衍生物(ascorbic acid derivatives)。上述抗壞血酸衍生物之結構通式如下：
在上述的結構通式中，R1與R2可以是獨立選自下列族群中之一者：氫原子(H atom)、C1-C20烷基(alkyl group)、C3-C20環烷基(cycloalkyl group)、C1-C20雜環烷基(heterocycloalkyl group)、C1-C20烷氧基(alkoxy group)、C2-C20醯基(acyl group)、C6-C20芳香基(aryl group)、C1-C20雜環芳香基(heterocyclic aromatic group)、C3-C20環烯基(cycloalkenyl group)。根據本實施例，上述之R1與R2不同時為氫原子。在根據本實施例之一較佳範例中，上述抗壞血酸衍生物可以是3-O-烷基-抗壞血酸(3-O-alkyl-ascorbic acid)。更好的是，在該範例中，上述3-O-烷基-抗壞血酸的烷基可以是C2-C10烷基。
根據本實施例，上述抗壞血酸衍生物係與纖維母細胞反應，以刺激纖維母細胞產出玻尿酸。在根據本實施例之一較佳範例中，上述促進玻尿酸生成之配方中的抗壞血酸衍生物的濃度範圍約為7500ppm-1.25ppm。在根據本實施例之另一較佳範例中，上述促進玻尿酸生成之配方中的抗壞血酸衍生物的濃度範圍約為2500ppm-1.25ppm。
為了進一步說明本說明書之技術內容，以下將敘明根據本說明書之促進玻尿酸生成之方法與促進玻尿酸生成之配方的較佳範例。在以下範例中，上述促進玻尿酸生成之方法及其配方將分別應用於老鼠細胞(mouse cell)與人類細胞(human cell)。然而，本說明書之範圍應以其後的申請專利範圍為準，而不應以下列實施範例為限。
範例1. 對老鼠細胞進行促進玻尿酸生成之方法的一般步驟：[在此係以3-O-乙基-抗壞血酸(3-O-ethyl-ascorbic acid)作為說明代表，本說明書之範圍不應以此為限]
材料：細胞株(cell line)：3T3(BCRC，購自生物資源保存及研究中心)
淋洗緩衝劑(rinse buffer)：滅菌的D-PBS(Dulbecco的磷酸鹽緩衝鹽水)(Sterile D-PBS,Dulbecco’s phosphate buffered saline，購自Corning Incoperated及Caisson Labs)
完全培養基(Complete Medium)(作為正控制組，positive control)：具有10%牛血清的DMEM培養基(DMEM medium with 10% Bovine Serum,DMEM購自Corning Incoperated及Caisson Labs；BS購自Corning Incoperated)
飢饉培養基(Starvation Medium)(作為負控制組， negative control)：具有0.1%牛血清的DMEM培養基(DMEM購自Corning Incoperated及Caisson Labs；BS購自Corning Incoperated)
實驗材料(testing material)：3-O-乙基-抗壞血酸(3-O-ethyl-ascorbic acid)
透明質酸酵素鏈結免疫檢測試劑盒(Hyaluronan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit)(HA-ELISA)(購入品牌：Echelon/Cat No：K-1200)
細胞接種(cell seeding)：完全培養基係用於細胞接種的階段。匯集的3T3細胞先以滅菌的D-PBS淋洗後，將淋洗緩衝劑移除。對所有細胞進行胰蛋白酶消化(trypsinize)與細胞計數(cell counting)。然後，將細胞密度稀釋至4E+04/mL，並分別接種0.5mL的細胞液(等同於2E+04細胞)至24孔盤(24well plates)的每一孔(well)之中。使上述的3T3細胞在37℃、5% CO2的環境下培養24小時。
控制組/實驗材料的處理：上述的飢饉培養基係應用於本階段。以滅菌的D-PBS對經過24小時人工培養的3T3細胞淋洗後，將淋洗緩衝劑移除。分別將不同濃度的控制組與實驗材料加至上述24孔盤中的3T3細胞。然後，使上述的3T3細胞在37℃、5% CO2的環境下培養72小時。
玻尿酸的定量(Quantitation of Hyaluronic Acid)：在經過72小時的人工培養後，分別以可調式微量分 注器(pipettman)提取部分上清液(supernatant)的細胞樣本至新的容器，其中，上述細胞樣本已使用控制組或實驗材料加工過。將上述提取出的上清液細胞樣本以2000rpm的轉速離心約5-10分鐘。經過離心後的上清液細胞樣本中的玻尿酸含量可藉由將透明質酸酵素鏈結免疫檢測試劑盒測得之資料帶入以方程式1來計算出。
上述實驗步驟經過多次重複試驗而得的結果整理如下表1所示。參見表1，相較於負控制組，2500ppm的3-O-乙基-抗壞血酸促進玻尿酸生成的量最高可達到230.6%。當3-O-乙基-抗壞血酸的濃度為10-5000ppm，具有促進生成的玻尿酸數量之能力。換言之，根據本說明書的揭露技術，藉由使用少量的抗壞血酸衍生物即可達到有效促進玻尿酸生成之效果。
當3-O-乙基-抗壞血酸的濃度大於7500ppm，由於上述細胞的存活能力可能會被3-O-乙基-抗壞血酸所抑制，3-O-乙基-抗壞血酸可能在上述促進玻尿酸生成的過程中已經對細胞產生了細胞毒性(cytotoxicity)，故不具有刺激玻尿酸生成的效果。
第一圖可呈現出表1所述之老鼠纖維母細胞(3T3)受到刺激而分泌出玻尿酸的數量變化。由第一圖可明顯看出，抗壞血酸衍生物確實具有刺激玻尿酸數量增加之能力。
範例2. 對人類細胞進行促進玻尿酸生成之方法的一般步驟：(在此係以3-O-乙基-抗壞血酸(3-O-ethyl-ascorbic acid)作為說明代表，然而，本說明書之範圍不應以此為限)
材料：細胞株(cell line)：Hs68(BCRC 60038，購自生物資源保存及研究中心)
淋洗緩衝劑(rinse buffer)：滅菌的D-PBS(Dulbecco的磷酸鹽緩衝鹽水)(Sterile D-PBS,Dulbecco’s phosphate buffered saline，購自Corning Incoperated及Caisson Labs)
完全培養基(Complete Medium)(作為正控制組， positive control)：具有10%胎牛血清的DMEM培養基(DMEM medium with 10% Fetal Bovine Serum,DMEM購自Corning Incoperated及Caisson Labs；FBS購自Caisson Labs)
飢饉培養基(Starvation Medium)(作為負控制組，negative control)：具有0.1%胎牛血清的DMEM培養基(DMEM medium with 0.1% Fetal Bovine Serum,DMEM購自Corning Incoperated及Caisson Labs；FBS購自Caisson Labs)
實驗材料(testing material)：3-O-乙基-抗壞血酸(3-O-ethyl-ascorbic acid)
透明質酸酵素鏈結免疫檢測試劑盒(Hyaluronan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit)(HA-ELISA)(購入品牌：Echelon/Cat No：K-1200)
細胞接種(cell seeding)：完全培養基係使用於細胞接種的階段。匯集的Hs68細胞先以滅菌的D-PBS淋洗後，對所有細胞進行胰蛋白酶消化(trypsinize)與細胞計數(cell counting)。然後，將細胞密度稀釋至4E+04/mL，並分別接種0.5mL的細胞液(等同於2E+04細胞)至24孔盤(24well plates)的每一孔(well)之中。使上述的Hs68細胞在37℃、5% CO2的環境下培養24小時。
控制組/實驗材料的處理：上述的飢饉培養基係應用於本階段。以滅菌的D-PBS對經過24小時人工培養的Hs68細胞淋洗後，將淋洗緩衝劑移除。分別將不同濃度的控制組與實驗材料加至上述24孔盤中的Hs68細胞。然後，使上述的Hs68細胞在37℃、5% CO2的環 境下培養72小時。
玻尿酸的定量(Quantitation of Hyaluronic Acid)：在經過72小時的人工培養後，分別以可調式微量分注器(pipettman)提取部分上清液(supernatant)的細胞樣本至新的容器，其中，上述細胞樣本已使用控制組或實驗材料加工過。將上述提取出的上清液細胞樣本以2000rpm的轉速離心約5-10分鐘。藉由透明質酸酵素鏈結免疫檢測試劑盒，經過離心後的上清液細胞樣本中的玻尿酸含量可以方程式2來計算出。
上述實驗步驟經過多次重複試驗而得的結果整理如下表2所示。參見表2，相較於負控制組，1000ppm的3-O-乙基-抗壞血酸促進玻尿酸生成的量可達到205.4%。由表2亦可發現，當3-O-乙基-抗壞血酸的濃度為1000-10ppm，所促進生成的玻尿酸數量與抗壞血酸衍生物的用量間具有劑量依賴關係(dose-dependently)。此外，由表2亦可發現，根據本說明書的揭露技術，藉由使用少量的抗壞血酸衍生物即可達到有效促進玻尿酸生成之效果。
當3-O-乙基-抗壞血酸的濃度大於1000ppm時，由於上述細胞的存活能力可能會被3-O-乙基-抗壞血酸所抑制，在該組實驗中，抗壞血酸衍生物促進生成玻尿酸數量與抗壞血酸衍生物的用量之間的劑量依賴關係變得不明顯。甚至，10000ppm的3-O- 乙基-抗壞血酸可能在上述促進玻尿酸生成的過程中已經對細胞產生了細胞毒性(cytotoxicity)。
第二圖可呈現出表2所述之人類纖維母細胞受到刺激而分泌出玻尿酸的數量變化。由第二圖可明顯看出，在抗壞血酸衍生物的用量與因刺激而分泌出的玻尿酸數量之間存在著顯著地劑量依賴關係。
範例3. 對老鼠細胞進行促進玻尿酸生成之方法的測試：在本範例中，除了所使用的透明質酸酵素鏈結免疫檢測試劑盒(Hyaluronan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit)改採另一品牌(R&D；Cat No.DHYAL0)之試劑盒外，其他使用材料與實驗步驟皆與前述範例1相同。
經過多次重複試驗而得的結果整理如下表3所示。參見表3，相較於負控制組，5000ppm的3-O-乙基-抗壞血酸促進 玻尿酸生成的量可達到240.5%。當3-O-乙基-抗壞血酸的濃度為5000-5ppm，所促進生成的玻尿酸數量與抗壞血酸衍生物的用量間具有劑量依賴關係(dose-dependently)。由表3也可發現，根據本說明書的揭露技術，藉由使用少量的抗壞血酸衍生物即可達到有效促進玻尿酸生成之效果。
第三圖係呈現出表3中所述之老鼠纖維母細胞受到刺激而分泌出玻尿酸的數量變化。由第三圖可明顯看出，在抗壞血酸衍生物的用量與因刺激而分泌出的玻尿酸數量之間，即使是使用不同品牌的試劑盒，依然可看出兩者間存在著顯著地劑量依賴關係。
範例4. 對人類細胞進行促進玻尿酸生成之方法的測試：在本範例中，除了所使用的透明質酸酵素鏈結免疫檢測試劑盒(Hyaluronan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit)改採另一品牌(R&D；Cat No.DHYAL0)之試劑盒外，其他使用材料與實驗步驟皆與前述範例2相同。
經過多次重複試驗而得的結果整理如下表4所示。參見表4，相較於負控制組，在單次試驗中，濃度100ppm的3-O-乙基-抗壞血酸促進玻尿酸生成的量可達到174.9%。觀察多次試驗的平均值也可發現，當3-O-乙基-抗壞血酸控制在1000ppm、100ppm、7.5ppm等濃度時，所促進促進玻尿酸生成的量可分別達到133.9%、121.9%、134.0%。更好的是，當3-O-乙基-抗壞血酸的濃度降至2.5ppm時，所促進促進玻尿酸生成的量的平均值仍有達到136.7%之水準。我們也同時觀察到，當3-O-乙基-抗壞血酸的濃度為1000-10ppm時，所促進生成的玻尿酸數量與抗壞血酸衍生物的用量間具有劑量依賴關係(dose-dependently)。換言之，根據本說明書的揭露技術，藉由使用少量的抗壞血酸衍生物即可達到有效促進玻尿酸生成之效果。
第四圖係呈現出表4中所述之人類纖維母細胞受到刺激而分泌出玻尿酸的數量變化。由第四圖可明顯看出，即使是使用不同品牌的試劑盒，在抗壞血酸衍生物的用量與因刺激而分泌出的玻尿酸數量之間，依然具有劑量依賴關係。
範例5. 以抗壞血酸(AA)對老鼠細胞(3T3)進行促進玻尿酸生成之方法的測試結果：在本範例中，除了所使用的透明質酸酵素鏈結免疫檢測試劑盒(Hyaluronan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit)改採另一品牌(R&D；Cat No.DHYAL0)之試劑盒以及將實驗材料改為抗壞血酸(AA)外，其他使用材料與實驗步驟皆與前述範 例1相同。
經過多次重複試驗而得的結果整理如下表5所示。參見表5，相較於負控制組，使用2~100ppm抗壞血酸無法促進玻尿酸的增生，甚至可能造成玻尿酸數量的減少。換言之，相較於本說明書的揭露技術，以抗壞血酸來替換抗壞血酸衍生物並無促進玻尿酸生成之效果。
第五圖係呈現出表5中所述之老鼠纖維母細胞(3T3)受到抗壞血酸刺激而分泌出玻尿酸的數量變化。由第五圖可明顯看出，抗壞血酸並無刺激玻尿酸分泌量的能力。
綜合上述，本說明書揭露一種以抗壞血酸衍生物來促進玻尿酸生成的方法及其配方。根據本說明書，上述以抗壞血酸衍生物來促進玻尿酸生成的方法包含以抗壞血酸衍生物與纖維母細胞反應的步驟。本發明亦揭露一種促進玻尿酸生成的配方， 包含可促進玻尿酸生成的抗壞血酸衍生物，其中，藉由將上述抗壞血酸衍生物置入老鼠纖維母細胞或人類纖維母細胞可有效促進玻尿酸的產出。上述以抗壞血酸衍生物來促進玻尿酸生成的方法與配方在體外實驗(in vitro)中可有效刺激老鼠纖維母細胞或人類纖維母細胞產出更多的玻尿酸。更好的是，根據本發明，只需使用少量的抗壞血酸衍生物即可有效地刺激纖維母細胞產出更多玻尿酸。換言之，本發明提供了一種更安全且更有效的方法/配方來產出玻尿酸，且此一配方/方法很適合應用於臨床治療與美容方面的使用。
顯然地，依照上面體系中的描述，本發明可能有許多的修正與差異。因此需要在其附加的權利要求項之範圍內加以理解，除了上述詳細的描述外，本發明還可以廣泛地在其他的體系中施行。上述僅為本發明之較佳體系而已，並非用以限定本發明之申請專利範圍；凡其它未脫離本發明所揭示之精神下所完成的等效改變或修飾，均應包含在下述申請專利範圍內。

Claims (4)

  1. 一種促進玻尿酸生成之方法，其包含：使一纖維母細胞與抗壞血酸衍生物(ascorbic acid derivatives)在體外環境下反應之步驟，其中，上述抗壞血酸衍生物之結構如下： 其中，R2為氫原子，R1係乙基(ethyl group)，其中上述抗壞血酸衍生物與纖維母細胞反應之使用濃度範圍係7500ppm-1.25ppm。
  2. 根據申請專利範圍第1項之促進玻尿酸生成之方法，其中上述抗壞血酸衍生物之使用濃度範圍係2500ppm-1.25ppm。
  3. 一種抗壞血酸衍生物配方之用途，其係用於促進玻尿酸生成，該抗壞血酸衍生物配方包含：抗壞血酸衍生物(ascorbic acid derivatives)，上述抗壞血酸衍生物與纖維母細胞反應以刺激纖維母細胞產出玻尿酸，其中，上述抗壞血酸衍生物之結構如下： 其中，R2為氫原子，R1係乙基(ethyl group)，其中上述抗壞血酸衍生物與纖維母細胞反應之濃度範圍係7500ppm-1.25ppm。
  4. 根據申請專利範圍第3項之抗壞血酸衍生物配方之用途，其中上述抗壞血酸衍生物的濃度範圍為2500ppm-1.25ppm。
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