CN105407924B - 包含胶原和透明质酸钠的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含胶原和透明质酸且任选地包含银的药物组合物。所述组合物可以为水凝胶、垫或干粉喷雾剂形式。本发明还涉及所述垫形式的组合物的制备方法。最后，本发明涉及所述化合物在治疗皮肤损伤中的用途。

Description

包含胶原和透明质酸钠的药物组合物

发明领域

本发明涉及包含胶原和透明质酸钠和任选的银的药物组合物，其为水 凝胶、垫(pad)或干粉喷雾剂(dry spray)形式，可用于治疗皮肤损伤。

本发明还涉及垫形式的组合物的制备方法。

现有技术

透明质酸(HA)一般是最广泛应用于伤口和损害敷料领域中的聚合物 之一；它是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺的交替残基组成的杂多 糖。

它是具有50,000-13x10⁶Da分子量的直链聚合物，视其得到它的来源 和所用的制备方法而定。

实际上它存在于细胞外周凝胶、脊椎动物结缔组织基质(其中它是主要 成分之一)、关节滑液、玻璃体液和脐带中。

HA在许多结缔组织中起关键作用，控制它们的含水量和机械性能。

因此，HA在生物组织中起重要作用，尤其是作为许多组织如皮肤、腱、 肌肉和软骨的细胞的支持物。

还已知，HA通过其CD44膜受体调节涉及细胞生理学和生物学的许多 不同过程，例如细胞增殖、迁移、分化和血管发生，并且还执行其它功能， 例如水化组织和润滑关节。

已经证实，HA在组织修复过程中起关键作用，无论在结构方面(胞外 基质组织化及其水化调节中)还是作为刺激直接和间接牵涉的广泛过程(血 块形成、吞噬细胞活性、成纤维细胞增殖、新生血管形成、上皮再形成 (re-epitheliasation)等)的物质(Weigel P.等人,J Theoretical Biol,1986： 219-234；Abatangelo G.等人,J Surg Res,1983,35：410-416；Goa K.等人, Drugs,1994,47：536-566)。

这些公认的特性长期以来被利用于制备敷料，所述敷料用于不同来源 的伤口、溃疡和皮肤损害的护理，以及得益于加速上皮再形成的所有皮肤 损害。

基于胶原——属于硬蛋白族且以大量存在于多细胞生物体中作为组织 如腱、皮肤、软骨、骨等的基础成分的高度特征化纤维状蛋白——的敷料 是本领域状态中已知的。这种蛋白质具有约285kDa的分子量。其在细胞 中的合成的特征在于盘绕在一起形成超螺旋的三个氨基酸链的形成；在细 胞外部，所述链被组装成刚性聚合物结构，称作原纤维和纤维，产生特征 在于弹性、强度和硬度的包含它们的组织。

一般使用的胶原来自于牛。

最终，银通常用于局部组合物，这归因于其抗菌作用，这种抗菌作用 在其氧化成金属离子后出现；该过程易于在接触施用它的潮湿伤口环境时 进行。银易于以盐、胶体金属(即结合改善其稳定性的小蛋白质)的形式或 最终以微粉化金属形式在市场上得到。后者通常是优选的，因为它不会污 染皮肤或衣物，尤其是在暴露于日光下后，在存在渗出物时不会将伤口染 成棕色，其更易于在一些期望的药物形式(例如喷雾剂)的制备阶段控制。银作为抗菌剂起作用，与其初始形式无关。

生成促进伤口愈合和上皮再形成的三维装置的HA和胶原的组合是本 领域已知的；例如，已知包含与化学修饰的HA衍生物键合的胶原的装置 (US6737072、US5939323)。

这些一般是制剂，所述制剂中以极大量存在的HA通过化学交联反应与 胶原基质结合，以便使HA分子与胶原纤维键合，实际上生成新的化学实体。

交联由此增加装置的紧密性和强度。交联使用称作交联剂的特定化学 物质进行，这能够在选择的聚合物之间形成“链”，使得它们以共价键结合。 交联剂的特征在于它们具有高度反应性官能团，通常能够特异性地键合存 在于蛋白质、肽类和聚合物骨架上的其它基团。最常用的交联剂是碳二亚 胺衍生物、二乙烯基砜和BDDE(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)，它们因其反应 性而存在一些毒性(例如二乙烯基砜：http： //www.sciencelab.com/msds.php？msdsId＝9925422；BDDE：https： //www.spectrumchemical.com/MSDS/TCI-B0964.pdf)。因为它们主动地牵 涉聚合物之间链形成的化学过程，并且可以作为间隔基保留(例如在BDDE 的情况中)在形成的新化学实体中，最终的制剂可以保留用于化学交联反应 的化学物质的残基，由此干扰精细的伤口愈合过程。还可能在装置施用后 在生理学上经历的酶降解阶段过程中释放交联剂残基。还可以使用在键合 起始分子并且用UV光照射时聚合的光敏物质进行交联，生成网状结构。必 须在所有这些情况中评价终产物中存在的反应产物的毒性水平。在交联剂 的情况中，例如，可能释放的残基仍然具有高度反应性且可能干扰装置所 施用的伤口愈合的精细平衡。当使用这些物质时，对于终产物，实际上通常进行大量洗涤阶段，一方面提高产物的安全性，但也使制备过程复杂化， 从而降低了其有效性且更为昂贵。

近年来已经生产了大量医疗装置来满足对于更为安全、快速伤口愈合 和组织修复的不断增长的需求。

其中，基于胶原的垫的研发毫无疑义地在保证组织再生骨架的最佳材 料、更加多孔的细胞迁移基质和对于宿主组织更好的过敏耐受性中起关键 作用。通常，所述装置由三维骨架组成，设计它是为了模拟胞外基质引导 和包囊迁移细胞的能力。

胞外基质提供对于所有动物结缔组织的一类结构支持，其以高度水化 的多糖和纤维状蛋白凝胶填充间质细胞空间。

这种基础结构能够使得结缔组织有效地抵抗因环境应激和/或温度变 化导致的膨胀或压缩。

如果胞外基质因烧伤、褥疮或慢性退行性骨关节炎而改变，则将基于 胶原的敷料施用于受损的表皮区域或结缔组织将有助于恢复原始的天然情 况。

同时，它减轻炎症并且提供对感染的有效屏障。

通常，胶原制剂必须满足许多条件。假体(prosthetic)胶原必须被愈合 伤口组织吸收且可能被宿主酶系统降解。

基于胶原的制剂的其它优点是其吸收任何排出的流体、湿润组织和改 善宿主成纤维细胞新合成胶原产生的能力。

对于鉴定治疗皮肤病损的可替代药物组合物仍然存在需求，所述药物 组合物在安全性(不存在可能的毒性残基)、效能(更好的伤口愈合)和最终的 工业化便利性方面具有优于目前已知的那些组合物的特征。

本发明使用下述制剂解决了本领域存在的问题，所述制剂通过易于进 行的方法得到且不使用任何促进HA-胶原组合稳定性的物质。

附图描述

附图显示了与仅包含胶原的垫相比、胶原和透明质酸钠垫上成纤维细 胞的生长。成纤维细胞生长预示针对伤口进展的上皮再形成过程。

发明详述

本发明涉及包含胶原和钠盐形式的透明质酸的药物组合物，其任选地 包含银。

所述组合物可以是水凝胶、垫或干粉喷雾剂的形式。

所述垫具有多孔结构，其可以切割和成形以适合于伤口层，且不使用 如下所述的化学交联剂制备。

所用的胶原为I型，来源于马。其三链螺旋结构与组织胶原类似，使其 特别适合于本发明的用途。

水凝胶和干粉喷雾剂形式的组合物中，胶原可以以微粉化粉末形式使 用；在垫形式的组合物中，它可以以在包含有机酸、优选乙酸的水性载体 中1％w/w凝胶的形式使用，通过从马腱中提取且随后纯化的方法得到。

所述药物组合物还包含钠盐形式的透明质酸，其浓度为0.1-4％w/w， 优选2-3％w/w，甚至更优选2.5％w/w。

用于本发明的透明质酸可以衍生自任意来源；例如，可以通过从雄鸡 冠(roostercombs)中提取(EP 138572B1)、通过发酵(来自马链球菌 (Streptococcus equi)或兽疫链球菌(zooepidemicus))或通过生物合成(从芽孢 杆菌属(Bacillus)，WO2012032154、WO201232153)得到。

透明质酸具有400-3x10⁶Da、特别是1x10⁵Da-1x10⁶Da的平均分子量 (MW)。

用于本发明的透明质酸的平均MV优选130-500kDa，甚至更优选 160-230kDa；后者MW区间缩写为“平均MW 200kDa”。

关于本发明的分子量是指通过“特性粘度”方法(Terbojevich等人, CarbohydrRes,1986,363-377)计算的重均分子量。

根据本发明的一个优选方面，所述组合物还可以包括银以便得到抗菌 和抗微生物效果。

银可以以0.001-5％w/w、优选1-2％的量存在。

银可以是盐的形式，优选柠檬酸银，胶体金属形式或微粉化金属形式； 优选使用银的盐或胶体金属形式，因为它们是水溶性的。当制备干粉喷雾 剂时，还可以使用微粉化金属银，其易于配制且通常不产生阻塞喷嘴的问 题。

在水凝胶形式的组合物中，所用的载体是水。

水凝胶形式的组合物还可以包括赋形剂，例如具有胶凝作用的流变剂、 湿润剂、防腐剂、抗氧化剂、螯合剂、pH调节剂等。

干粉喷雾剂形式的组合物除本领域技术人员已知的赋形剂外还包含适 合的推进剂(例如正丁烷或异丁烷)。

本发明的另一个主题是用于制备所述垫形式的药物组合物的方法。

该方法包括如下阶段：

a)将来源于马的胶原在有机酸、优选乙酸的存在下匀化为1％w/w凝胶， 优选pH≈3.5；

b)制备透明质酸钠的水溶液，优选浓度为0.1－4％w/w，且有利地为2－3％ w/w；

c)将透明质酸钠的水溶液加入到匀化凝胶形式的来源于马的胶原中；

d)将得到的混合物维持在适度搅拌下，直至在无交联剂辅助下得到均匀混 合物；

e)任选地制备胶体金属银或银盐的水溶液，优选浓度为0.001－5％w/w， 更优选1－2％w/w；

f)将可能的胶体金属银或银盐的水溶液加入到上述得到的混合物中；

g)维持适度搅拌15-60分钟，优选约30分钟，直至得到凝胶；

h)将该凝胶在无搅拌下维持5-20分钟，优选约10分钟，以允许任何内含物 沉降；

i)通过改变温度，优选从-25℃至25℃且逐步达到60℃，冷冻干燥所述凝 胶，得到冷冻干燥的垫，其中消除了有机酸残留物；由此得到的垫包含不 低于90％w/w的量的胶原；

j)将冷冻干燥的垫切成期望的大小。

然后可以将根据本发明方法得到的垫插入到初级包装中，随后插入二 次包装。最终，可以将包装的产品灭菌。

垫形成显然无需任何化学试剂，因为胶原-透明质酸钠组合以创新方 式、通过利用两种聚合物的物化特征而得到。

将胶原增溶在酸性环境中、优选在乙酸的存在下；在这种特定情况下， 起始的胶原凝胶优选具有pH≈3.5。

将透明质酸钠在纯水中增溶，其具有pH≈5.5，高于透明质酸(≈3)的 pKa(解离常数)；这意味着在溶液中，HA羧基为COO-形式，实际上将透 明质酸盐转化为路易斯碱。当将透明质酸钠溶液与胶原凝胶混合时，这些 羧基在明显酸性的环境中与质子化的胶原的氨基发生相互作用，产生静电 相互作用，例如氢桥和范德瓦耳斯相互作用；结果是在不同分子之间形成 网状构造，其进一步被胶原和透明质酸盐的结构复杂性增强。因此，这是 无需任何化学助剂的物化相互作用。

在本发明中，透明质酸钠由此与胶原物理混合。由于不使用任意种类 的交联剂，无需随后的洗涤和干燥阶段来消除过量的交联剂，且如上所述， 终产品更为安全，因为它们完全不含所有这类污染物。因此，该制备方法 特别安全、简便、经济且具有工业便利性。

此外，在最终的冷冻干燥阶段过程中，优选的操作条件使得可以调整垫 的孔径。这是关键参数，因为该垫必须能够容纳存在于损害床中的成纤维细 胞，由此促进其存活和发育：如果孔过小，则细胞不能通过它们，但过大的 垫阻止垫粘附纤维，最终防止了随后的增殖。

本发明的药物组合物可以用于治疗皮肤损伤和皮肤衰老，例如因对真 皮营养作用产生不良影响的代谢障碍、过度暴露于日光或年龄导致。

根据本发明的一个优选的方面，所述皮肤损伤可以是压力性溃疡 (pressureulcer)、动脉血管溃疡、静脉血管溃疡、血管炎性血管溃疡、糖 尿病足溃疡、手术和创伤性伤口和I度和II度烧伤。

所述损伤可以作为急性或慢性、从中度到高度渗出、在肉芽形成 (granulation)或上皮形成阶段存在。

胶原与透明质酸钠的组合使得垫强劲但柔软、改善了细胞粘附和随后 的成纤维细胞增殖，且通过新形成的胶原改善了伤口重塑。

除对垫所述的优点外，水凝胶还具有适合于施加于腔伤口的另外优点； 基于胶原和透明质酸钠的水凝胶的特征还在于极佳的铺展性且无味。最后， 干粉喷雾剂对于应用于具有特定锯齿边缘的伤口是理想的，因为它达到损 害的每一点。

下文给出的实施例进一步示例本发明。

实施例

实施例1

基于胶原(3％w/w)和透明质酸钠盐(2.5％w/w)的100g水凝胶的制备

将胶原和透明质酸钠在40℃搅拌下溶于水。向该混合物中依次加入丙 二醇、MP-Diol二元和Symdiol。然后将该混合物冷却至环境温度，在搅拌 下加入羟丙基纤维素，直至完全分散。将该混合物维持在环境温度，间或 混合至胶凝发生。向试管中填充由此得到的凝胶，用γ射线灭菌包装的产品。

实施例2

基于胶原(3％w/w)和透明质酸钠盐(2.5％w/w)的100g水凝胶的制备

将胶原和透明质酸钠在40℃搅拌下溶于水。向该混合物中加入 PHMB，直至溶解。将黄原胶在剧烈搅拌下分散于该混合物中，冷却至环 境温度，间或混合至凝胶形成。此时，在搅拌下掺入丙二醇，直至均匀。 向试管中填充由此得到的凝胶，用γ射线灭菌包装的产品。

实施例3

基于胶原(3％w/w)、透明质酸钠盐(2.5％w/w)和柠檬酸银(2％)的100g 水凝胶的制备

将胶原和透明质酸钠在40℃搅拌下溶于水，然后加入柠檬酸银。将黄 原胶在剧烈搅拌下分散于该混合物中，冷却至环境温度，间或混合至凝胶 形成。此时，在搅拌下掺入丙二醇，直至均匀。向试管中填充由此得到的 凝胶，用γ射线灭菌包装的产品。

实施例4

基于胶原(3％w/w)、透明质酸钠盐(2.5％w/w)和胶体金属银(2％)的 100g水凝胶的制备

将卡波姆在45℃搅拌下分散于水，溶解胶原和透明质酸钠。然后溶解 银，随后溶解PHMB和依地酸钠。然后在搅拌下加入氢氧化钠至pH 6，直 到得到凝胶，然后冷却至环境温度。最后，在搅拌下掺入丙二醇，直至均 匀。向试管中填充由此得到的凝胶，用γ射线灭菌包装的产品。

实施例5

基于胶原(3％w/w)、透明质酸钠盐(2.5％w/w)和微粉化金属银(1％)的 100g水凝胶的制备

将卡波姆在45℃搅拌下分散于水，然后溶解胶原和透明质酸钠。然后 溶解PHMB和依地酸钠。然后在搅拌下加入氢氧化钠至pH 6，直至得到凝 胶，然后冷却至环境温度。最后，在搅拌下掺入丙二醇和银，直至均匀。 向试管中填充由此得到的凝胶，用γ射线灭菌包装的产品。

实施例6

基于来源于马的胶原和透明质酸钠2.5％w/w制备5x5cm冷冻干燥的垫

1.组成：

-1000g 1％w/w来源于马的胶原的凝胶(等于10g胶原)

-透明质酸钠，平均MW 200kDa 0.25g.

2.散装产品(bulk product)的制备

在ISO 7净室中，向由AISI 316不锈钢制成的清洁容器中填充经计算用 量的来源于马的胶原的1％凝胶，使用搅拌系统开始匀化。在单独的容器中 将所需量的粉状透明质酸钠溶于纯水。当形成透明质酸钠溶液时，将其导 入包含凝胶形式的来源于马的胶原的容器。然后将该溶液适度搅拌30分钟。 再经过10分钟后，任何内含物将沉降。

在此阶段后，根据分析规范分析散装产品。

3.分布托盘

在ISO 7净室中，用蠕动泵将得到的凝胶分布在位于校准称重系统上的 平板上。

4.冷冻干燥操作

在ISO 7净室中，将分布在托盘上的散装产品在-35℃冷冻约4小时，然 后置于高度真空中约17小时。期间，当温度达到约25℃时，干燥开始；在 约16小时后，将托盘加热至60℃，将该温度维持约2小时，以除去来源于 马的胶原中包含的所有痕量的乙酸。整个冷冻干燥循环进行22小时。

终产品包含按重量计的97.5％马胶原和2.5％透明质酸钠。

5.5x5cm垫的生产和初级包装

然后将托盘中得到的冷冻干燥的垫使用适合的机器切成经测量为5x5 cm的垫；然后通过特定机器将其插入初级包装，即由一侧上PET或PVC层、 而另一侧上是有光泽的铝箔形成的泡罩包。对该泡罩包进行目视检查 (100％)。

6.二次包装

二次包装由卡纸纸盒组成。

7.灭菌

在包装后，用γ线灭菌法给最终结构的未灭菌终产品进行灭菌。

实施例7

基于来源于马的胶原、透明质酸钠2.5％w/w和胶体金属银2％w/w的 5x5cm冷冻干燥的垫的制备

1.组成：

-1000g 1％w/w来源于马的胶原的凝胶(等于10g胶原)

-透明质酸钠，平均MW 200kDa 0.25g

-胶体金属银 0.2g

2.散装产品的制备

在ISO 7净室中，向由AISI 316不锈钢制成的清洁容器中填充经计算用 量的来源于马的胶原的1％凝胶，使用搅拌系统开始匀化。在单独的容器中 将所需量的粉状透明质酸钠溶于纯水。当形成透明质酸钠溶液时，将其导 入包含凝胶形式的来源于马的胶原的容器。然后将该溶液适度搅拌30分钟。 将胶体金属银溶于水，将得到的溶液加入到来源于马的胶原和透明质酸钠 的混合物中，将得到的混合物适度搅拌30分钟。再经过10分钟后，任何内 含物沉降。

然后进行实施例6的3、4、5、6和7点中所述的步骤，得到终产品，其 包含按重量计95.5％马胶原、2.5％透明质酸钠和2％银。

实施例8

基于来源于马的胶原、透明质酸钠2.5％w/w和柠檬酸银1％w/w的5x5 cm冷冻干燥的垫的制备

1.组成：

-1000g 1％w/w来源于马的胶原的凝胶(等于10g胶原)

-透明质酸钠，平均MW 200kDa 0.25g

-柠檬酸银 0.1g

2.散装产品的制备

在ISO 7净室中，向由AISI 316不锈钢制成的清洁容器中填充经计算用 量的来源于马的胶原的1％凝胶，使用搅拌系统开始匀化。在单独的容器中 将所需量的粉状透明质酸钠溶于纯水。当形成透明质酸钠溶液时，将其导 入包含凝胶形式的来源于马的胶原的容器。然后将该溶液适度搅拌30分钟。 将柠檬酸银溶于水，将得到的溶液加入到来源于马的胶原和透明质酸钠的 混合物中，将该混合物适度搅拌30分钟。在无需搅拌下，再经过10分钟后， 任何内含物沉降。

然后进行实施例6的3、4、5、6和7点中所述的步骤，得到终产品，其 包含按重量计96.5％马胶原、2.5％透明质酸钠和1％银。

实施例9

通过实施例6中所述的方法制备待测的两种材料，第一种包含胶原和透 明质酸钠，第二种仅包含胶原。

将材料在无菌通风橱中切成1x1cm片，铺展在Multiwell-24上，用培养 基浸渍24小时，然后接种。该操作是必须的，以确保在每一样品上均一地 评价细胞粘附和生长。

将混悬于其培养基中的100,000个成纤维细胞(3T3)接种在两种材料 上。

使用MTT测定法评价接种后1、3和5天时的细胞增殖。简言之，所述 测定法定量地测定培养的细胞中存在的琥珀酸脱氢酶活性；仅存在于活细 胞线粒体中的所述活性通常用作检查代谢活性、存活力和随后培养的细胞 生长的标记物。该测定法基于唑鎓(azolium)染料MTT(3-(4,5-二甲基噻唑 -2-基)2,5二苯基四唑鎓溴化物)被琥珀酸脱氢酶从黄色转化成蓝色。根据分 光光度法测定的蓝色染料(甲)的量与细胞培养物中存在的琥珀酸脱氢酶 成正比，且由此与活细胞数量成正比。

将细胞与0.5mg/ml MTT溶液一起温育3小时。在温育结束时，用提取 溶液(90％异丙醇、10％DMSO)从细胞中提取染料，并且在540/660nm波 长读取。

结果如附图中所示。

显然，与仅有胶原的支持物相比，钠盐形式的透明质酸的存在不仅导 致接种的细胞与材料更好地粘着(参见第1天数据)，而且加强了成纤维细胞 生长。在后面的情况中，光密度值保持基本稳定，证实成纤维细胞存活， 但不是增殖。

Claims (7)

1.冷冻干燥的垫形式的药物组合物，其由马来源的I型胶原和钠盐形式的透明质酸组成，其中透明质酸具有160-230kDa的分子量、平均MW200kDa和2.5％w/w的浓度，且胶原的存在量等于97.5％w/w，用于治疗皮肤衰老或皮肤损伤，其中所述垫不含交联剂，且通过包括以下步骤的方法制备，

a)将来源于马的胶原在乙酸存在下匀化为1％w/w凝胶，pH≈3.5；

b)制备透明质酸钠水溶液，浓度为2.5％w/w；

c)将透明质酸钠水溶液添加到匀化的凝胶形式的马来源的胶原中；

d)在无交联剂辅助下，将其维持在适度搅拌下，直至得到均匀混合物；

e)将得到的混合物维持适度搅拌30分钟，直至得到凝胶；

f)在无搅拌下将所述凝胶维持10分钟，以允许任何内含物沉降；

g)通过改变温度，使温度从-35℃至25℃并且逐步达到60℃，冷冻干燥所述凝胶，得到冷冻干燥的垫，其中消除了乙酸残余，所述垫的胶原含量为97.5％w/w；

h)将冷冻干燥的垫切成期望大小的垫。

2.权利要求1的药物组合物，其中所述皮肤损伤选自压力性溃疡、动脉血管溃疡、静脉血管溃疡、血管炎性血管溃疡、糖尿病足溃疡、手术和创伤性伤口和I度和II度烧伤。

3.制备冷冻干燥的垫形式的药物组合物的方法，所述垫包含马来源的I型胶原和钠盐形式的透明质酸，任选还包含1-2％w/w的银，其中透明质酸具有160-230kDa的分子量、平均MW200kDa和2％至3％w/w的浓度，且胶原的存在量不小于90％w/w，用于治疗皮肤衰老或皮肤损伤，其中所述垫不含交联剂，包括下列步骤：

a)将来源于马的胶原在有机酸存在下匀化为1％w/w凝胶，pH≈3.5；

b)制备透明质酸钠水溶液，浓度为2-3％w/w；

c)将透明质酸钠水溶液添加到匀化的凝胶形式的马来源的胶原中；

d)在无交联剂辅助下将其维持在适度搅拌下，直至得到均匀混合物；

e)任选地制备胶体金属银或银盐的水溶液；

f)将任选的胶体金属银或银盐水溶液添加到上述得到的混合物中；

g)将得到的混合物维持适度搅拌15-60分钟，直至得到凝胶；

h)在无搅拌下将所述凝胶维持5-20分钟，以允许任何内含物沉降；

i)通过改变温度，冷冻干燥所述凝胶，得到冷冻干燥的垫，其中消除了有机酸残留物，所得到的垫包含不低于90％w/w用量的胶原；

j)将冷冻干燥的垫切成期望大小的垫。

4.权利要求3的方法，其中步骤a)中的有机酸为乙酸。

5.权利要求3的方法，其中在步骤g)中将得到的混合物维持适度搅拌30分钟。

6.权利要求3的方法，其中在步骤h)中在无搅拌下将所述凝胶维持10分钟。

7.权利要求3的方法，其中在步骤i)中使温度从-35℃至25℃变化并且逐步达到60℃。