CN103007358B - 一种软骨组织工程纤维支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种软骨组织工程纤维支架材料及其制备方法，该方法采用生物相容性好的可降解生物材料魔芋葡甘聚糖、透明质酸钠与纳米羟基磷灰石为基本原料，三者混合制备成混合溶胶，通过乳酸溶液改性和微波工艺制得改性溶胶，然后进行湿法纺丝，借助于可编程的二维移动平台制备出魔芋葡甘聚糖/透明质酸钠/纳米羟基磷灰石复合软骨组织再生修复的可降解纤维支架，该支架具有制备工艺简单、降解速率可调、成本低廉、组织相容性优良等优势，前期细胞试验和动物实验表明：该支架可以在体内（软骨缺损病变部位等）普遍使用，是一种促进软骨缺损修复的，抗菌的，在体内降解速率可调的多功能复合材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种软骨组织工程纤维支架材料及其制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术
关节软骨一旦遭到破坏便很难得到修复，这是因为关节软骨中纤维含量少，基质的主要化学成分是蛋白质多糖，其不同于血管化的组织，由于没有血供，且软骨细胞埋于稠厚的细胞外基质中，无法移动到损伤部位参与修复，亦缺乏细胞分化所必须的母细胞及细胞迁徙所必须的理想环境，这样就使得即使是极小的软骨缺损也难于自然修复。因此，直到现在，关节软骨缺损的修复一直是临床面临的难题。目前临床上传统的治疗方法主要有微骨折术、软骨下骨钻孔术、软骨下磨削术、自体软骨移植和自体软骨细胞移植术等。但是，研究结果显示，这些修复方法只能暂时的缓解疼痛等症状，其修复部位主要由纤维软骨填充而不是透明软骨，其最终结果还是修复部位软骨的退化坏死。软骨组织工程技术的兴起和快速发展为软骨缺损的修复提供了崭新的思路。
现今有多种支架材料被用于软骨组织工程，按其来源不同大体可分为天然的和人工合成的两种。目前用于软骨组织工程的人工合成材料主要有：聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸一羟基乙酸、聚乙二醇、丙交酯乙交酯共聚酯、嵌段共聚物，D—磷酸三钙、聚乙烯醇等；天然支架主要有：透明质酸、胶原、几丁质、藻酸、小肠黏膜下层、纤维蛋白原等。人工合成的支架材料因其来源广泛、易加工成所需的形状等优势近年来得到了广泛的发展，相比于天然支架材料，它具有极好的生物力学性能，并且可以根据需要调整其理化特性和生物降解速率，但因其较弱的组织亲合性和一定程度的细胞毒性作用限制了它的临床应用。天然支架材料具有理想的生物降解性，良好的生物相容性及优异的组织亲和性，其有利于细胞的粘附和增殖被视为细胞生长的天然载体。但天然支架材料的缺点是力学性能较差，降解速度快、大量制备困难，不同批次质量差异波动较大，且因其来自于天然生物体，处理不当尚有传播疾病的危险。综合分析研究者研究成果表明，目前还没有一种支架材料是公认的最佳组织工程软骨支架材料，因此支架材料的研究与选取，仍是软骨组织工程学科研究的重点与难点方向。
魔芋葡甘聚糖（Konjac glucomannan，KGM）是一种提取自魔芋块茎的pH值敏感性多糖，可以通过调节系统的pH值来控制魔芋葡甘聚糖的凝胶产生时间和凝胶度，这种特性对控制支架材料的力学性能、生物降解性能及其与其他材料的复合非常有利。此外，由于魔芋葡甘聚糖良好的生物相容性。上述性能使得魔芋葡甘聚糖成为一种理想的生物支架材料和药物控释材料。
透明质酸（Haluronic acid，HA）又名玻璃酸，是一种酸性粘多糖，广泛分布于人体的结缔组织中，在眼玻璃体、关节腔中几乎以纯态形式存在。它以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如：润滑关节；调节血管壁的通透性；调节蛋白质、水、电解质扩散及运转，促进创伤愈合；同时透明质酸作为软骨基质中重要的蛋白多糖，在维持软骨细胞表型、促进软骨基质分泌等方面也发挥着重要的作用。由于透明质酸易分解，故商品化的透明质酸一般为其钠盐，即透明质酸钠（Sodium Hyaluronate，SH）。透明质酸钠在医药方面已得到广泛应用，如用于人工晶体植入手术的粘弹剂，用于药物释放的载体等。但是大量的研究表明，透明质酸钠在直接植入或与生理系统结合使用时的用量不宜过多，故其用作组织工程材料的成分时需要与其它高分子材料复合。
羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2，HAP)，其Ca/P比为1.67，其水溶液呈弱碱性(pH=7~9)，是骨组织的主要无机成分，已广泛应用于骨组织修复，在本发明中加入纳米羟基磷灰石可提高材料的生物相容性和生物活性。
本发明采用生物相容性好的可降解生物材料魔芋葡甘聚糖、透明质酸钠与纳米羟基磷灰石为基本原料，制备出一种用于软骨修复的魔芋葡甘聚糖/透明质酸钠/纳米羟基磷灰石纤维支架，为软骨组织工程领域的发展提供了一种新的极具应用前景的选择。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种由魔芋葡甘聚糖、透明质酸钠与纳米羟基磷灰石制成的软骨组织工程纤维支架材料及其制备方法，解决现有软骨组织工程支架材料性能不理想，成本高等问题。
本发明涉及的软骨组织工程纤维支架材料的制备方法如下所示：
（1）将透明质酸钠加入乳酸溶液中搅拌使其充分溶解，制得透明质酸钠溶液，其中乳酸溶液是乳酸和蒸馏水按体积比1:200～400的比例制备得到，乳酸与透明质酸钠的混合比例为1ml乳酸与0.01～4.5g透明质酸钠混合；
（2）在质酸钠溶液中加入纳米羟基磷石灰，混匀后，加入魔芋葡甘聚糖，充分搅拌，得到混合胶液，其中魔芋葡甘聚糖、透明质酸钠与纳米羟基磷灰石的质量比为1：0.01～1：0.01～0.5；
（3）将混合胶液微波（功率500W-900W）加热处理5～15min，搅拌冷却至室温后，过滤，滤液置于400～760毫米汞柱的负压下脱泡10～15小时，然后将脱泡溶液借助于可编程的二维移动平台进行湿法纺丝，在喷丝凝固液中成型，制得纤维支架；
（4）将步骤（3）制得的纤维支架浸泡到交联液中处理5～48小时后，采用蒸馏水漂洗6～8次，经干燥后即得软骨组织工程纤维支架材料。
本发明中所述过滤采用200目不锈钢网。
本发明中所述喷丝凝固液为丙三醇和乙醇的混合液，丙三醇和乙醇的体积比为1：20～1：5。
本发明中所述交联液为由5wt%～25wt%浓度氨水和75wt%～99.7wt%乙醇按体积比1:1～1：5混合配制而成。
本发明中所述软骨组织工程纤维支架材料的干燥温度为25～75℃。
本发明另一目的是提供一种软骨组织工程纤维支架材料，其是具有一定编制规则的、孔隙大小和孔隙率可调的纤维膜材料，孔隙大小10～500μm，孔隙率50%～90%。
本发明涉及的软骨组织工程纤维支架材料及制备方法所依据的原理是：魔芋葡甘聚糖与透明质酸钠的微观结构、理化性质十分相似，所以能够很好的复合。纳米羟基磷灰石粉的加入提高了材料的生物相容性和生物活性。另外单纯的透明质酸钠降解速度太快，且难于成型，故很难满足软骨组织工程支架材料的要求。魔芋葡甘聚糖的通过脱乙酰作用形成交联的三维网络状结构，在交联剂中交联的时间越长，交联的程度越大，纤维材料的降解就越慢。所以通过和魔芋葡甘聚糖共混可以通过控制魔芋葡甘聚糖的交联程度来控制纤维支架材料的降解速率，其降解时间在1-3个月内可调。
本发明将用魔芋葡甘聚糖、透明质酸钠和纳米羟基磷灰石三种材料借助于可编程的二维移动平台通过湿法纺丝的方法制备魔芋葡甘聚糖/透明质酸钠/纳米羟基磷灰石纤维支架材料，其中的魔芋葡甘聚糖，通过脱乙酰基交联形成三维网络结构，和透明质酸钠，通过氢键等方式结合，纳米羟基磷灰石的加入提高了材料的生物相容性和生物活性，三者共同形成了此纤维支架材料，不仅降低了透明质酸钠支架材料的成本，而且具备了魔芋葡甘聚糖、纳米羟基磷灰石和透明质酸钠支架材料三者的共同特点，具有以下优势：
1、借助于可编程的二维移动平台，通过不同的编程可以使纤维支架材料的孔隙大小在10～500μm可调，适合营养物质的运输传送和细胞的移动生长，符合软骨组织工程的要求；
2、利用氨水和乙醇对纤维支架材料进行交联，通过控制氨水和乙醇的比例和交联时间可以使得纤维支架材料的降解时间在1～3个月可调，可以满足不同部位的软组织修复，满足软组织工程的要求；
3、魔芋葡甘聚糖的加入对支架材料起到增强、增韧作用，克服了透明质酸钠不易成型的不足，采用魔芋葡甘聚糖很好的成丝性，可以制得强度可调的纤维支架材料，另外纳米羟基磷灰石的加入提高了材料的生物相容性和生物活性。
4、该纤维支架材料的制备方法简单、对设备要求低、成本低廉，可应用与大规模工业化生产，从而满足软骨组织工程研究和临床治疗中对软骨损伤修复材料的需求。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方法作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1：本软骨组织工程纤维支架材料的制备方法，具体内容如下：
（1）将3g透明质酸钠加入乳酸溶液中搅拌使其充分溶解，制得透明质酸钠溶液，其中乳酸溶液是1ml乳酸和400ml蒸馏水混合制备得到，乳酸与透明质酸钠的混合比例为1ml乳酸与3g透明质酸钠混合；
（2）在透明质酸钠溶液中加入0.03g纳米羟基磷石灰，混匀后，加入3g魔芋葡甘聚糖，充分搅拌，得到混合胶液，其中魔芋葡甘聚糖、透明质酸钠与纳米羟基磷灰石的质量比为1：1：0.01；
（3）将混合胶液微波加热处理5min（微波功率为900w），搅拌冷却至室温后，经200目不锈钢网过滤，滤液置于400～760毫米汞柱的负压下脱泡10小时，然后将脱泡溶液借助于可编程的二维移动平台进行湿法纺丝，在喷丝凝固液（丙三醇和乙醇的体积比为1：20）中成型，制得纤维支架；
（4）将步骤（3）制得的纤维支架浸泡到交联液（25wt%浓度氨水和99.7wt%乙醇按体积比1:1混合配制而成）中处理5小时后，采用蒸馏水漂洗6次，经25℃干燥后即得软骨组织工程纤维支架材料，所得材料孔隙在10μm～500μm范围内，孔隙率为50%，降解时间1个月。
实施例2：本软骨组织工程纤维支架材料的制备方法，具体内容如下：
（1）将0.09g透明质酸钠加入乳酸溶液中搅拌使其充分溶解，制得透明质酸钠溶液，其中乳酸溶液是1.5ml乳酸和400ml蒸馏水混合制备得到，乳酸与透明质酸钠的混合比例为1ml乳酸与0.06g透明质酸钠混合；
（2）在质酸钠溶液中加入4.5g纳米羟基磷石灰，混匀后，加入9g魔芋葡甘聚糖，充分搅拌，得到混合胶液，其中魔芋葡甘聚糖、透明质酸钠与纳米羟基磷灰石的质量比为1：0.01：0.5；
（3）将混合胶液微波加热处理15min（微波功率为500w），搅拌冷却至室温后，经200目不锈钢网过滤，滤液置于400～760毫米汞柱的负压下脱泡15小时，然后将脱泡溶液借助于可编程的二维移动平台进行湿法纺丝，在喷丝凝固液（丙三醇和乙醇的体积比为1：5）中成型，制得纤维支架；
（4）将步骤（3）制得的纤维支架浸泡到交联液（25wt%浓度氨水和99.7wt%乙醇按体积比1:5混合配制而成）中处理24小时后，采用蒸馏水漂洗8次，经75℃干燥后即得软骨组织工程纤维支架材料，所得材料孔隙在10μm～500μm之间，孔隙率为70%，降解时间为2个月。
实施例3：本软骨组织工程纤维支架材料的制备方法，具体内容如下：
（1）将3g透明质酸钠加入乳酸溶液中搅拌使其充分溶解，制得透明质酸钠溶液，其中乳酸溶液是2ml乳酸和400ml蒸馏水混合制备得到，乳酸与透明质酸钠的混合比例为1ml乳酸与1.5g透明质酸钠混合；
（2）在质酸钠溶液中加入0.6g纳米羟基磷石灰，混匀后，加入6g魔芋葡甘聚糖，充分搅拌，得到混合胶液，其中魔芋葡甘聚糖、透明质酸钠与纳米羟基磷灰石的质量比为1：0.5：0.1；
（3）将混合胶液微波加热处理10min（微波功率为600w），搅拌冷却至室温后，经200目不锈钢网过滤，滤液置于400～760毫米汞柱的负压下脱泡13小时，然后将脱泡溶液借助于可编程的二维移动平台进行湿法纺丝，在喷丝凝固液（丙三醇和乙醇的体积比为1：10）中成型，制得纤维支架；
（4）将步骤（3）制得的纤维支架浸泡到交联液（5wt%浓度氨水和75wt%乙醇按体积比1:3混合配制而成）中处理15小时后，采用蒸馏水漂洗7次，经55℃干燥后即得软骨组织工程纤维支架材料，所得材料孔隙在10μm～500μm之间，孔隙率为80%，降解时间为1个半月。
实施例4：本软骨组织工程纤维支架材料的制备方法，具体内容如下：
（1）将4.5g透明质酸钠加入乳酸溶液中搅拌使其充分溶解，制得透明质酸钠溶液，其中乳酸溶液是1ml乳酸和300ml蒸馏水混合制备得到，乳酸与透明质酸钠的混合比例为1ml乳酸与4.5g透明质酸钠混合；
（2）在质酸钠溶液中加入0.28g纳米羟基磷石灰，混匀后，加入5.6g魔芋葡甘聚糖，充分搅拌，得到混合胶液，其中魔芋葡甘聚糖、透明质酸钠与纳米羟基磷灰石的质量比为1：0.8：0.05；
（3）将混合胶液微波加热处理12min（微波功率为700w），搅拌冷却至室温后，经200目不锈钢网过滤，滤液置于400～760毫米汞柱的负压下脱泡12小时，然后将脱泡溶液借助于可编程的二维移动平台进行湿法纺丝，在喷丝凝固液（丙三醇和乙醇的体积比为1：15）中成型，制得纤维支架；
（4）将步骤（3）制得的纤维支架浸泡到交联液（10wt%浓度氨水和90wt%乙醇按体积比1:4混合配制而成）中处理48小时后，采用蒸馏水漂洗6次，经65℃干燥后即得软骨组织工程纤维支架材料，所得材料孔隙在10μm～500μm之间，孔隙率为90%，降解时间为3个月。
Claims (4)
1.一种软骨组织工程纤维支架材料的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）将透明质酸钠加入乳酸溶液中搅拌使其充分溶解，制得透明质酸钠溶液，其中乳酸溶液是乳酸和蒸馏水按体积比1:200～400的比例制备得到，乳酸与透明质酸钠的混合比例为1ml乳酸与0.01～4.5g透明质酸钠混合；
（2）在透明质酸钠溶液中加入纳米羟基磷石灰，混匀后，加入魔芋葡甘聚糖，充分搅拌，得到混合胶液，其中魔芋葡甘聚糖、透明质酸钠与纳米羟基磷灰石的质量比为1：0.01～1：0.01～0.5；
（3）将混合胶液微波加热处理5～15min，微波功率为500～900W，搅拌冷却至室温后，过滤，滤液置于400～760毫米汞柱的负压下脱泡10～15小时，然后将脱泡溶液借助于可编程的二维移动平台进行湿法纺丝，在喷丝凝固液中成型，制得纤维支架；
（4）将步骤（3）制得的纤维支架浸泡到交联液中处理5～48小时后，采用蒸馏水漂洗6～8次，经干燥后即得软骨组织工程纤维支架材料；
其中所述喷丝凝固液为丙三醇和乙醇的混合液，丙三醇和乙醇的体积比为1：5～1：20；
所述交联液为由5～25wt%浓度氨水和75～99.7wt%乙醇按体积比1：1～1：5混合配制而成。
2.根据权利要求1所述软骨组织工程纤维支架材料的制备方法，其特征在于：过滤采用200目不锈钢网。
3.根据权利要求1所述软骨组织工程纤维支架材料的制备方法，其特征在于：纤维支架材料的干燥温度为25～75℃。
4.权利要求1所述软骨组织工程纤维支架材料的制备方法制得的软骨组织工程纤维支架材料，其特征在于：软骨组织工程纤维支架材料的孔隙大小为10～500μm，孔隙率为50%～90%。
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