CN108066819B - 一种高强度的天然高分子水凝胶薄膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高强度的天然高分子水凝胶薄膜，由卡拉胶和壳聚糖通过离子键、氢键键合形成，该水凝胶薄膜的最大断裂应力不小于6.7MPa，最大伸长量不小于120％。本发明还公开了上述高强度的天然高分子水凝胶薄膜的制备方法，包括：将卡拉胶和壳聚糖的稀醋酸溶液室温下混合均匀，得到白色的混合溶液体系；再将混合溶液转移至平底容器中，70～90℃真空干燥，得到干态薄膜；再将该干态薄膜浸泡在去离子水中，达到溶胀平衡，即得到了卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜。本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜透明、均匀、韧性好、抗细胞黏附性能强，可以作为生物隔膜材料应用于医学领域。

Description

一种高强度的天然高分子水凝胶薄膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物高分子领域，具体涉及一种高强度的天然高分子水凝胶薄膜及其制备方法。
背景技术
人体器官和组织周围分布有大量生物薄膜，比如硬脑膜、骨膜和筋膜等，除去生物学上的功能，这些薄膜通常具有优异的机械性能，比如硬脑膜的断裂强度为4～6MPa，断裂应变约为110％；在生物材料领域，研发具有和人体自身薄膜匹配的力学性能的替代材料，以修复自身组织的损伤，是一个重要且具有实际意义的课题。
目前，在外科手术中硬脑膜的替代材料主要为牛心包膜和自体薄膜。然而牛心包膜不透明，且在处理的过程中会使用到化学试剂；自体组织薄膜的取用会导致二次伤害，且来源有限。在人体组织中，生物薄膜往往处于凝胶状态，采用高强度水凝胶薄膜作为硬脑膜等组织的替代材料或者手术的防粘连材料具有重大的应用价值。在过去20年间，高强度水凝胶得到了快速发展；通过设计水凝胶的网络结构并引入特定的能量耗散机制，研究者们开发出了多种与软骨等生物组织相匹配的高强度水凝胶。但是，大部分强韧性水凝胶中都包含了大量合成聚合物，导致较差的生物相容性及降解性能，限制其潜在应用。
相比于合成聚合物，天然高分子在生物相容性和降解性能上具有独特的优势，但是由于天然高分子水凝胶的网络结构可设计性不高，其力学强度通常较差。近年来，该领域取得了一些进展，现有报道中，Zhang等人(Zhao,D.；Huang,J.；Zhong,Y.；Li,K.；Zhang,L.；Cai,J.Adv.Funct.Mater.2016,26,6279–6287.)通过连续的物理交联和化学交联构筑了双交联的纤维素凝胶，凝胶的强度达到2.7MPa，断裂伸长率为80％；但凝胶制备过程中需要添加化学交联剂，具有潜在毒害性。Costa等(Costa,R.R.；Costa,A.M.S.；Caridade,S.G.；Mano,J.F.Chem.Mater.2015,27,7490–7502.)制备了壳聚糖/海藻酸钠凝胶，整个过程只用到了两种天然高分子，力学强度达到1.9MPa，断裂伸长率也达到80％。但是和人体中的生物膜(如硬脑膜)相比，力学强度仍有较大差距。
发明内容
为了克服以上现有技术中存在的问题，本发明提供了一种高强度的天然高分子水凝胶薄膜，该薄膜透明、均匀、韧性好、抗细胞黏附性能强。
一种高强度的天然高分子水凝胶薄膜，包括通过离子键、氢键键合的卡拉胶和壳聚糖，该水凝胶薄膜的最大断裂应力不小于6.7MPa，且最大伸长量不小于120％。
本发明还提供了上述高强度的天然高分子水凝胶薄膜的制备方法，条件温和、简单易行，包括如下步骤：
(1)将天然高分子卡拉胶和壳聚糖分别溶解于稀醋酸溶液中，配制浓度为0.4～3.6mg/mL卡拉胶溶液和浓度为0.4～3.6mg/mL的壳聚糖溶液；
(2)强烈搅拌条件下，将步骤(1)得到的卡拉胶溶液和壳聚糖溶液同时滴加到稀醋酸溶液中，得到白色的悬浮溶液；
(3)将步骤(2)得到的悬浮溶液转移到平底容器中，真空干燥，得到干态的凝胶薄膜，再将该干态凝胶薄膜浸泡在大量去离子水中，除去未挥发的稀醋酸，凝胶溶胀，达到平衡状态，即得到高强度的天然高分子水凝胶薄膜。
所述的卡拉胶为κ型卡拉胶、ι型卡拉胶或λ型卡拉胶，分别带有1个、2个和3个磺酸根离子，其溶液呈负电性；
所述的壳聚糖为甲壳素经脱乙酰化后壳聚糖，其脱乙酰化程度为55％～99％，质子化壳聚糖带有铵根离子，其溶液呈正电性；
卡拉胶链上的磺酸根离子和质子化壳聚糖的铵根离子能够形成离子键，将卡拉胶和壳聚糖溶解在稀醋酸溶液中，再进行络合，可以大大提高卡拉胶中的磺酸根离子和质子化壳聚糖的铵根离子之间络合效果，而且通过改变两种天然高分子的比例可以调控混合物的络合程度；此外，在该水凝胶薄膜中，过量的卡拉胶形成双螺旋结构，而多余的壳聚糖主要形成纤维状结构；大分子间的离子键和内部的氢键之间的协同作用，使得该水凝胶薄膜具有强韧性；作为优选，所述的卡拉胶与壳聚糖的质量比为1:9～9:1。
所述的稀醋酸溶液中醋酸的质量分数为1～10％。
步骤(2)中，所述的卡拉胶溶液、壳聚糖溶液和稀醋酸溶液的体积关系没有特定的要求，可根据实际需要进行调整，而在制备过程中，向稀醋酸中，同时滴加卡拉胶溶液和壳聚糖溶液，有利于形成均匀的络合物，最后形成的凝胶薄膜比较均匀。
步骤(3)中，所述的真空干燥温度为70～90℃。温度达到70℃时，卡拉胶的分子链解螺旋，与壳聚糖形成致密的结构；采用70～90℃这个温度区间，因为适当升温对溶剂蒸发有加速作用，减少成膜的时间，而对凝胶的性能没有太多的影响。
本发明通过卡拉胶和质子化壳聚糖之间的离子键以及自身主链之间的氢键相互作用构建一类具有优异力学性能，且具有抗细胞黏附的聚多糖基水凝胶薄膜。
本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜透明、均匀、力学性能优异：断裂应力最高达到6.7MPa，且伸长量最大能达到120％；这是由于在整个体系之中，卡拉胶和壳聚糖大分子间形成键合作用强的离子键，同时，残余的未完全络合的卡拉胶或壳聚糖主链之间的氢键作用及疏水相互作用也在体系中起到优化薄膜力学性能的作用。
本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜力学性能可调控范围大：由于卡拉胶和壳聚糖自身就可以形成凝胶，所以该体系中卡拉胶和壳聚糖的浓度比例调控范围较大，可以从1:9变化到9:1，以上比例范围内均可以制备力学性能良好的凝胶薄膜。
本发明还提供了上述高强度的天然高分子水凝胶薄膜作为生物隔膜材料在医学领域的应用，可以使用在需要防止细胞黏附的组织及结构中，比如可以作为硬脑膜修复材料、腹腔手术防粘连隔膜以及在骨修复过程中避免成纤维细胞生长固定骨关节等。
本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜具有良好的生物相容性以及抗细胞粘附性能。通过细胞毒性测试，细胞存活率大于90％，表明该凝胶薄膜的细胞相容性好；同时通过细胞粘附性能的测试，发现凝胶表面几乎没有铺展成纤维细胞，仅存的若干细胞也是保持圆球状，并没有铺展开，表明该凝胶薄膜具有良好的抗细胞粘附性能。
本发明提供的制备方法安全、条件温和、简单易行、而且可以通过改变溶液浓度调控水凝胶薄膜的力学性能。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜透明、均匀、断裂应力最高达到6.7MPa，且伸长量最大能达到120％，与生物薄膜机械性能接近，较目前其他纯天然高分子制备的凝胶更具优势。
2、本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜具有良好的生物相容性以及抗细胞粘附性能。
3、本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜机械性能调控范围较大。
4、本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶制备方法安全，简单。在整个凝胶的制备过程中除了稀醋酸之外，并没有使用其它有毒的化学试剂，整个过程比较安全，同时通过简单的络合两种带相反电荷的天然高分子，溶剂蒸发，干膜溶胀达到平衡即可以制备凝胶薄膜，制备方法简单。
附图说明
图1为本发明实施例3所制备的卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜的SEM图；
图2为本发明实施例6所制备的卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜的SEM图；
图3(a)为本发明对比例1所制备的卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜的应力应变曲线图；
图3(b)为本发明对比例2所制备的卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜的应力应变曲线图；
图4为本发明性能测试1中卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜的含水量柱状对比图；
图5为本发明性能测试2中卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜的应力应变曲线图；
图6为本发明性能测试3中卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜的自回复性能曲线图，其中(a)为30％应变下，不同等待时间的循环拉伸曲线；(b)为对应水凝胶薄膜的滞后性及残余应变变化率；
图7为本发明性能测试4中卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜的抗细胞黏附实验的荧光显微镜照片；
图8为本发明性能测试5中卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜的细胞活性柱状对比图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种高强度的天然高分子水凝胶薄膜及其制备方法进行具体描述，但本发明并不限于这些实施例。该领域熟练技术人员根据本发明核心思想指导下所做的非本质改变，仍然属于本发明的保护范围。
实施例1
将0.04gκ型卡拉胶溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.36g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的1wt％稀醋酸的分别滴加配置好的0.4mg/mL的卡拉胶溶液和3.6mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到半透明的均匀溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，达到平衡态时，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝1:9。
实施例2
将0.08gκ型卡拉胶溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL，混合均匀后静置；将0.32g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL，混合均匀后静置；往盛有50mL的1wt％稀醋酸的分别滴加配置好的0.8mg/mL的卡拉胶溶液和3.2mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到均匀的半透明的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，达到平衡态时，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝2:8。
实施例3
将0.12gκ型卡拉胶溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.28g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的1wt％稀醋酸的分别滴加配置好的1.2mg/mL的卡拉胶溶液和2.8mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到泛白的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，达到平衡态的时间，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝3:7，其SEM图如图1所示，由图可知，大量的纳米尺寸的粒子填充在凝胶基质当中，这些纳米尺寸的粒子是由于卡拉胶和壳聚糖分子之间的强离子相互作用，使得卡拉胶和壳聚糖分子聚集在一起形成的。
实施例4
将0.16gκ型卡拉胶溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.24g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的1wt％稀醋酸的分别滴加配置好的1.6mg/mL的卡拉胶溶液和2.4mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到白色的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，达到平衡态时，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝4:6。
实施例5
将0.20gκ型卡拉胶溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.20g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的1wt％稀醋酸的分别滴加配置好的2.0mg/mL的卡拉胶溶液和2.0mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到乳白色的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，达到平衡态时，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝5:5。
实施例6
将0.24gκ型卡拉胶溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.16g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的1wt％稀醋酸的分别滴加配置好的2.4mg/mL的卡拉胶溶液和1.6mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到泛白的乳白色溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，达到平衡态的时候，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝6:4，其SEM图如图2所示，由图可知，随着卡拉胶和壳聚糖两者比例越来越接近等电点，纳米尺寸的粒子越来越多。此外，在水凝胶薄膜中，过量的卡拉胶形成双螺旋结构，而多余的壳聚糖主要形成纤维状结构。大分子间的离子键和内部的氢键之间的协同作用，导致了该水凝胶薄膜具有强韧性。
实施例7
将0.28gκ型卡拉胶溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.12g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的1wt％稀醋酸的分别滴加配置好的2.8mg/mL的卡拉胶溶液和1.2mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到乳白色的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，达到平衡态的时候，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝7:3。
实施例8
将0.32gκ型卡拉胶溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.08g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的1wt％稀醋酸的分别滴加配置好的3.2mg/mL的卡拉胶溶液和0.8mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到泛白的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，达到平衡态时，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝8:2。
实施例9
将0.36gκ型卡拉胶溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.04g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在1wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的1wt％稀醋酸的分别滴加配置好的3.6mg/mL的卡拉胶溶液和0.4mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到泛白的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，达到平衡态时，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝9:1。
实施例10
将0.20gκ型卡拉胶溶解在3wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.20g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在3wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的3wt％稀醋酸的分别滴加配置好的2.0mg/mL的卡拉胶溶液和2.0mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到泛白的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，达到平衡态时，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝5:5。
实施例11
将0.20gι型卡拉胶溶解在5wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.20g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在5wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的5wt％稀醋酸的分别滴加配置好的2.0mg/mL的卡拉胶溶液和2.0mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到泛白的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，等到凝胶达到平衡态时，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝5:5。
实施例12
将0.20gλ型卡拉胶溶解在10wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.20g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在10wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的10wt％稀醋酸的分别滴加配置好的2.0mg/mL的卡拉胶溶液和2.0mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到泛白的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在大量的去离子水中，凝胶达到平衡态，即得到卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝5:5。
对比例1
将0.20gλ型卡拉胶溶解在10wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.20g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在10wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的10wt％稀醋酸的分别滴加配置好的2.0mg/mL的卡拉胶溶液和2.0mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到泛白的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在一定质量浓度的稀醋酸溶液中，水凝胶薄膜达到平衡态，即得到在酸溶液中平衡的卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝5:5。
力学性能如图3(a)所示，酸的引入，在一定程度上使得水凝胶薄膜内部残余的壳聚糖质子化，质子化的壳聚糖其分子链之间的氢键作用大大减弱，从而导致凝胶的力学性能变弱，在整个体系中主要是离子键在起主导作用。
对比例2
将0.20gλ型卡拉胶溶解在10wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；将0.20g脱乙酰化程度为85％的壳聚糖溶解在10wt％的稀醋酸溶液中，并定容到100mL；往盛有50mL的10wt％稀醋酸的分别滴加配置好的2.0mg/mL的卡拉胶溶液和2.0mg/mL的壳聚糖溶液，同时剧烈磁力搅拌，得到泛白的混合溶液；将上述混合溶液除去气泡之后，转移至直径为150mm的培养皿，同时在70℃环境下恒温蒸发溶剂，最终的到干态薄膜；将得到的干态薄膜浸泡在一定浓度的NaCl盐溶液中，水凝胶薄膜达到平衡态，即得到在盐溶液中平衡的卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜，其中卡拉胶/壳聚糖的质量比为wr＝5:5。
力学性能如图3(b)所示，盐的引入，屏蔽了离子键，从而减弱了卡拉胶和壳聚糖分子之间的相互作用，导致凝胶的力学性能变弱，但依旧保持了较好的力学性能。在整个体系中起主导作用转化为残余大分子之间的氢键相互作用。同时综合引入酸，提出可以使用酸或者盐来调节水凝胶薄膜的力学性能。
性能测试1
将本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜进行含水量测试实验：
在室温下，取干燥的表面皿并称重，质量记为m。之后取平衡态的水凝胶薄膜，用滤纸拭去表面的水分，放入表面皿中并称重，记为m1。将含有样品的表面皿放在107℃的烘箱中恒温干燥10h，取出并称重，记为m2。水凝胶薄膜的含水量可以通过以下公式计算得到：
EWC％＝(m1-m2)/(m1-m)×100％
本实验样品采用实施例1～9制备的天然高分子水凝胶薄膜，每组样品测3个平行样，其结果如图4所示，由图4可知，越接近卡拉胶和壳聚糖溶液的电荷平衡点，制备得到的水凝胶薄膜含水量越小；这说明水凝胶的含水量，和水凝胶的内部结构有关系，也与组成水凝胶组分的结构性质有关。
性能测试2
将本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜进行力学性能测试实验：
在室温下，将平衡态的水凝胶薄膜切割成规格长度为12mm，宽度为2mm的哑铃型样条，水凝胶的薄膜的厚度使用光学显微镜(型号：Nikon，ECLIPSE LV100N POL)进行测量，将哑铃型样条置于Instron 3343万能试验机上进行测试，其中，拉伸速度设为10mm/min，最终得到水凝胶薄膜的断裂应力、应变以及杨氏模量。
本实验样品采用实施例2～8制备的天然高分子水凝胶薄膜，每组样品测3个平行样，其结果如图5所示，从图5可以看出卡拉胶和壳聚糖两者的质量比对水凝胶薄膜的力学性能有决定性的影响。当两者比例为5:5的时候，凝胶的断裂应力达到了6.7MPa，且伸长量最大能达到120％。在整个体系之中，多重非共价键和凝胶内部的网络结构协同作用，从而使得水凝胶薄膜具有很好的机械性能。
性能测试3
将本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜进行自回复性能测试实验：
在不同的等待时间之后，通过依次装载和卸载对样本进行循环拉伸测试。装载/卸载速率为10mm/min，最大应变为30％。滞后比通过具体等待时间下的拉伸测试与初始样品拉伸测试之间的面积比来计算。
其结果如图6所示，从图6中可以看出该水凝胶薄膜具有优异的回复性能，在等待120min后，其力学性能能够回复到90％以上。
性能测试4
将本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜进行细胞黏附实验：
将平衡态的水凝胶薄膜裁成直径为14mm的圆片并放在24孔板中或者将卡拉胶/壳聚糖的混合溶液直接装满24孔板，在70℃恒温蒸发，最后直接将得到的薄膜浸泡在水中达到溶胀平衡，水凝胶薄膜直接浇筑在24孔板底部，紧接着通过紫外光照射30min使孔板消毒。然后将密度为15000个细胞/cm2的成纤维细胞(NIH/3T3成纤维细胞)接种到水凝胶上。培养24小时后，将样品用PBS洗涤三次并用4％多聚甲醛的PBS溶液固定，并将样品在异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(FITC-鬼笔环肽，1：200，Sigma)中，使得细胞的F-肌动蛋白染色，同时细胞核用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma)复染，然后立即用荧光显微镜(Olympus DP72，日本)对样品进行成像，并用ImageJ软件(NIH，V1.44p)分析荧光图像。
结果如图7所示，TCPS为对照组，和对照组相比，卡拉胶和壳聚糖质量比(wr)为1:9样品上分布的细胞大量减少，在wr从2:8变化到9:1，细胞在水凝胶表面在水凝胶表面呈现圆形未铺展状态或者几乎没有细胞黏附；说明该水凝胶薄膜材料具有比较好的抗细胞黏附性能。
性能测试5
将本发明制备得到的高强度的天然高分子水凝胶薄膜进行MTT细胞毒性测试实验：
通过细胞MTT测试(MTT，商品名：噻唑蓝)来表征不同比例水凝胶的生物相容性。将卡拉胶/壳聚糖水凝胶薄膜覆盖在惰性玻璃片上，然后在水中达到平衡状态；将NIH/3T3成纤维细胞以30000个细胞/cm2的密度接种到24孔板中并使其生长24h；然后，将每个孔中的培养基换成新的培养基，并将覆盖有水凝胶薄膜的盖玻片用紫外光照射灭菌30min，并轻轻将具有水凝胶薄膜的那一侧盖在培养孔中；裸玻璃盖玻片也被放置在培养的细胞并用作对照。细胞进一步培养48h，然后用500μL培养基和100μL MTT(浓度为：5mg/mL，PBS溶液)的混合物在37℃处理3h。然后，除去培养基，每孔加入1mL二甲基亚砜(DMSO)。将平板在37℃孵育5min，然后通过酶标仪(MODEL 550，Bio Rad)测量570nm处的DMSO溶液的吸光度。相对细胞活力通过样品与对照的吸收比来计算。
结果如附图8所示，从图中可以得到，样品处理过的细胞活性都在90％以上，甚至有超过100％，表明样品在一定程度还促进细胞生长。

Claims (7)

1.一种高强度的天然高分子水凝胶薄膜，其特征在于，包括通过离子键、氢键键合的卡拉胶和壳聚糖，该水凝胶薄膜的断裂应力最高达到6.7MPa，且伸长量最大达到120%；
所述的高强度的天然高分子水凝胶薄膜的制备方法，包括如下步骤：
（1）将天然高分子卡拉胶和壳聚糖分别溶解于稀醋酸溶液中，配制浓度为0.4~3.6mg/mL卡拉胶溶液和浓度为0.4~3.6mg/mL的壳聚糖溶液；
（2）强烈搅拌条件下，将步骤（1）得到的卡拉胶溶液和壳聚糖溶液同时滴加到稀醋酸溶液中，得到白色的悬浮溶液；
（3）将步骤（2）得到的悬浮溶液转移到平底容器中，真空干燥，得到干态的凝胶薄膜，再将该干态凝胶薄膜浸泡在大量去离子水中，除去未挥发的稀醋酸，凝胶溶胀，达到平衡状态，即得到高强度的天然高分子水凝胶薄膜。
2.根据权利要求1所述的高强度的天然高分子水凝胶薄膜，其特征在于，所述的卡拉胶为κ型卡拉胶、ι型卡拉胶或λ型卡拉胶中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的高强度的天然高分子水凝胶薄膜，其特征在于，所述的壳聚糖为经甲壳素脱乙酰化后得到的壳聚糖，其脱乙酰化程度为55~99%。
4.根据权利要求1所述的高强度的天然高分子水凝胶薄膜，其特征在于，所述的卡拉胶与壳聚糖的质量比为1:9~9:1。
5.根据权利要求1所述的高强度的天然高分子水凝胶薄膜，其特征在于，所述的稀醋酸溶液中醋酸的质量分数为1~10%。
6.根据权利要求1所述的高强度的天然高分子水凝胶薄膜，其特征在于，步骤（3）中，所述的真空干燥温度为70~90℃。
7.根据权利要求1所述的高强度的天然高分子水凝胶薄膜在制备生物隔膜材料中的应用。
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