CN112812324A - 一种聚阳离子-透明质酸复合水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种聚阳离子‑透明质酸复合水凝胶及其制备方法与应用。本发明的复合水凝胶的制备方法包括如下步骤：(1)制备阳离子聚合物DDP；(2)制备高巯基化透明质酸HA‑SH；(3)将所述阳离子聚合物DDP和所述高巯基化透明质酸制备成溶液制备成溶液，混匀，即得到聚阳离子‑透明质酸复合水凝胶DDP‑HA。本发明的复合水凝胶兼顾可注射性、广谱抗菌性、生物相容性，可作为一种新型生物材料在细胞、组织工程、药物递送等生物医学领域广泛应用；制备方法温和、结构稳定、成胶快以及性能可控。

Description

一种聚阳离子-透明质酸复合水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物高分子材料技术领域，特别涉及一种聚阳离子-透明质酸复合水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
透明质酸(HA)是一种线性多糖，是细胞外基质的重要组成部分，其结构和生物学性质决定其具有调节细胞信号、组织修复和形态重建等功能[1；2]。透明质酸具有特殊生物学上的活性，且拥有无毒、低免疫反应、高生物相容性、生物降解以及人体可吸收等特性，所以在眼睛外科手术、关节内注射液、伤口愈合、外科手术防黏剂等临床医学领域有广泛应用[3]。天然透明质酸存在半衰期较短(小于一周)、稳定性差、亲水性过强和易降解等缺点，在体内作用时间短，限制了HA的广泛应用[4]。因此，在医学的许多应用的情况下，所施用的HA为包含通过交联稳定的HA可注射水凝胶，交联给出显著增加该多糖在体内的作用时间，并因此增加注射效果。然而，由于纯的HA水凝胶缺乏细胞黏附性能，不利于细胞的贴附和生长，严重限制了HA水凝胶载荷生物活性分子及细胞以促进血管生成、上皮细胞迀移等在组织工程上的应用[5]。为了改善HA的物理化学性质，以获得具有更理想性能的透明质酸生物医学材料，人们通常对其进行化学改性，或与其他原料以共价键交联从而形成复合材料。比如，通过化学接枝手段，用层粘连蛋白(laminin,LN)、多聚赖氨酸(PDL)、多聚左旋赖氨酸(PLL)等基团或根据需要选择其它多肽、抗体等对透明质酸进行改性，以增强细胞贴附性和相容性，并为细胞提供合适的生长微环境[6]。
公开号为CN101367884A的中国专利公开了一种半胱胺修饰的巯基化透明质酸偶合物及其制备方法和应用。透明质酸溶液中加入1－乙基－3－(3－二甲氨基丙基)－碳二亚胺盐酸盐(EDAC)及N－羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化其羧基，加入半胱胺盐酸盐，使其氨基与透明质酸的羧基形成酰胺键，调节各物质的配比及反应条件，获得不同巯基含量的巯基化透明质酸偶合物。该专利扩展了该巯基化反应的应用范围，偶合物黏膜黏附性及生物相容性较好，具有较强的原位凝胶性质，为非注射制剂及组织工程等提供优良的生物黏附性材料。公开号为CN103613686A的中国专利公开了一种巯基化透明质酸的制备方法和应用。以透明质酸为原料，以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)活化羧基，加入带二硫键的化合物，使其与透明质酸的羧基反应，再用二硫苏糖醇(DTT)或β- 巯基乙醇还原二硫键成巯基，制得巯基化透明质酸。公开号为CN1131241C的中国专利公开了一种交联的透明质酸的制备方法和它在医药方面的应用。交联的透明质酸由提取的或生物合成的天然的线型状透明质酸的中活化了的羧基与多胺，尤其是烷基二胺反应而制得的。该发明的交联透明质酸可用作滑膜液、玻璃体体液的替代品，可作为控制释放基质形成药物，可作为愈合和抗粘剂，并可用于血管假体的制备、生物合成器官、愈合装置、眼科和耳科组合物、假体、植入物和医疗装置。公开号为CN101316864A的中国专利公开了一种能够与透明质酸等阴离子性材料形成聚离子络合物的、更接近于人体成分的阳离子性高分子。该发明的阳离子化的特征在于：透明质酸的羟基的氢原子的至少一部分被具有季铵阳离子基团的基团取代。该阳离子化透明质酸可以通过使缩水甘油基三烷基卤化铵等阳离子化剂与透明质酸反应来合成。该发明的透明质酸在水共存下与透明质酸等形成聚离子络合物。公开号为CN102226009A的中国专利公开了一种交联透明质酸凝胶的制备方法，二乙烯基砜先与聚乙二醇结合成新的交联剂，再与透明质酸分子发生反应而成交联透明质酸凝胶。该方法制备得到的交联透明质酸钠凝胶具有良好的生物相容性及较长的半衰期，且颗粒细小均匀，适合整形美容，组织填充，骨关节润滑或药物缓释制剂等。
从以上的专利文献可以看出，尽管目前涉及透明质酸水凝胶制备方法的发明已有很多，在控制药物释放和伤口愈合领域已报道了各种合成的可注射HA 水凝胶[7；8]，但兼顾可注射性、广谱抗菌性、生物相容性以及促血管化功能[9；10]，且成胶条件温和、结构稳定、成胶时间以及性能可控的多功能HA复合水凝胶的制备技术尚未见报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种聚阳离子-透明质酸复合水凝胶。
本发明的另一目的在于提供上述聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备阳离子聚合物(DDP)
以多巴胺甲基丙酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯为共聚单体，加入阳离子单体N- (3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在溶剂中进行RAFT聚合反应，提纯，干燥，得到阳离子聚合物DDP；
(2)制备高巯基化透明质酸(HA-SH)
将透明质酸、丙酰肼以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 混合于溶剂中，搅拌反应，加入二硫苏糖醇(DTT)，再次搅拌反应，调节pH至 4.0-7.0，透析，冷冻干燥，得到高巯基化透明质酸HA-SH；
(3)制备聚阳离子-透明质酸复合水凝胶
将步骤(1)中所述阳离子聚合物DDP和步骤(2)中所述高巯基化透明质酸HA-SH制备成溶液，混匀，即得到聚阳离子-透明质酸复合水凝胶DDP-HA。
步骤(1)中所述溶剂优选为二甲基甲酰胺。
步骤(1)中所述多巴胺甲基丙酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、阳离子单体N- (3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺和AIBN的摩尔比为(20-40)：(20-50)：(10-50)： (1-2)；优选摩尔比为10：40：50：1。
步骤(1)中所述聚乙二醇二丙烯酸酯的数均分子量为575。
步骤(1)中所述RAFT聚合反应为60-80℃下反应6-9h；优选为70℃下反应7h。
步骤(1)中所述提纯为采用乙醚提纯。
所述的乙醚的用量为适量；优选为阳离子聚合物DDP体积的5-10倍。
步骤(1)中所述干燥为真空干燥18-24h。
步骤(2)中所述透明质酸、丙酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二硫苏糖醇的摩尔比为1：(1-5)：(1-5)：(1-5)；优选为摩尔比1：(1-5)： (1-5)：2。
步骤(2)中所述溶剂为去离子水。
步骤(2)中所述搅拌反应的时间为1-5h；优选为2h。
步骤(2)中所述再次搅拌反应的时间为18-24h；优选为24h。
步骤(2)中所述调节pH采用HCl，其浓度为1.0M。
步骤(2)中所述透析为采用3500D透析袋和0.1M HCl溶液透析。
所述HCl溶液中含有体积比1％(v/v)NaCl。
步骤(2)中所述冷冻干燥为-10℃至-50℃下冷冻干燥18-24h。
步骤(3)中所述制备成溶液是分别将所述阳离子聚合物DDP采用氢氧化钠溶液、所述高巯基化透明质酸HA-SH采用1×PBS溶液制备成DDP溶液和 HA-SH溶液。
所述氢氧化钠溶液的浓度为1.0M。
所述DDP溶液浓度为质量体积比10-30％；优选为质量体积比20％。
所述HA-SH溶液浓度为质量体积比2-8％；优选为质量体积比6％。
所述DDP溶液与所述HA-SH溶液的用量为体积比1：(1-5)。
步骤(3)中所述聚阳离子-透明质酸复合水凝胶采用注射器注射到模具中，之后使用。
一种聚阳离子-透明质酸复合水凝胶，通过上述制备方法制备得到。
上述聚阳离子-透明质酸复合水凝胶在制备抗菌生物材料中的应用。
所述抗菌生物材料用于细胞工程、组织工程、药物递送。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明的复合水凝胶以具有丰富双键和儿茶酚基团的超支化聚阳离子 DDP为底物，与高巯基化透明质酸(HA-SH)原位交联制备得到[7；8]。通过对 HA的巯基修饰可以改善其对生长因子的亲和力，可以实现对生长因子的稳定作用及持续可控释放的功能；DDP聚阳离子引入儿茶酚基团，促进细胞的贴附和生长，也赋予水凝胶接触增强的杀菌活性。复合水凝胶的制备过程中，对DDP 的双键含量以及HA的巯基含量均有较高要求，因此，本发明通过丙酰肼法制备巯基化透明质酸，具有更高产率(产率为98.5％)和更高巯基含量(取代度为62.96％)；采用一锅化RAFT可控聚合方法合成含有丰富双键以及儿茶酚基团的 DDP。
2、本发明的复合水凝胶兼顾可注射性、广谱抗菌性、生物相容性。可作为一种新型生物材料在细胞、组织工程、药物递送等生物医学领域广泛应用。特别是可用于控制释放基质形成药物，并可用于血管假体的制备、生物合成器官、皮肤伤口愈合、眼科和耳科组合物、植入物和医疗装置等。
3、本发明的复合水凝胶成胶条件温和，无需复杂制备工序；结构稳定，拥有理想的压缩性能，不易降解；可体内注射，使其满足体内支架和载药释放的要求；成胶时间在1-5分钟，使其注射到体内可较快与伤口贴合，发挥释药作用；性能可控，可根据伤口类型和程度调节水凝胶用量及时间。
附图说明
图1是本发明实施例1中DDP的核磁共振氢谱(1H NMR)图。
图2是本发明实施例2中HA-SH的Ellman标准曲线。
图3是本发明实施例3中DDP与两种方法制备的HA-SH水凝胶图；其中， A为采用丙酰肼法制备的HA-SH为原料的30DDP-HA水凝胶，B为半胱胺法制备的HA-SH为原料的30DDP-HA水凝胶。
图4是本发明实施例3制备的水凝胶(DDP-HA)的压缩应力-应变图。
图5是本发明实施例3制备的水凝胶(DDP-HA)对大肠杆菌(E.coil)的抗菌效果图；其中，A为对照组，B为DP组、C为DDP2组、D为10DDP-HA组， E为20DDP-HA组，F为30DDP-HA组。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1阳离子聚合物DDP的制备
将3.3g多巴胺甲基丙烯酰胺溶于10mL二甲基甲酰胺中，加入5.75g聚乙二醇二丙烯酸酯(分子量为575)至完全溶解。再加入0.02g AIBN充分混匀，并在 70℃下反应7h。然后将产物滴加到100mL乙醚中，将沉淀物真空干燥24小时，即得到聚合物DP(多巴胺甲基丙酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯和AIBN的摩尔比为 60:40:1)。
将0.55g多巴胺甲基丙烯酰胺溶于10mL二甲基甲酰胺中，加入2.1g抗菌阳离子单体N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺，赋予多功能聚合物较强的抗菌性。再加入5.75g聚乙二醇二丙烯酸酯(分子量为575)至完全溶解。最后加入 0.02g AIBN，充分混匀，并在70℃油浴条件电磁搅拌7小时。将产物滴加到100mL 乙醚中，将沉淀物真空干燥24小时，即可得到阳离子聚合物DDP1(多巴胺甲基丙酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、阳离子单体N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺和AIBN的摩尔比为10:40:50:1)。
将1.1g多巴胺甲基丙烯酰胺溶于10mL二甲基甲酰胺中，加入1.68g抗菌阳离子单体N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺，赋予多功能聚合物较强的抗菌性。再加入5.75g聚乙二醇二丙烯酸酯(分子量为575)至完全溶解。最后加入 0.02g AIBN充分混匀，并在70℃油浴条件电磁搅拌7小时。将产物滴加到100mL 乙醚中，将沉淀物真空干燥24小时，即可得到阳离子聚合物DDP2(多巴胺甲基丙酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、阳离子单体N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺和AIBN的摩尔比为20:40:40:1)。
利用核磁共振氢谱(1H NMR)测定DDP1的结构。首先称取实施例1制备的DDP1样品8mg置于离心管中，加入0.55mL D2O，电磁搅拌混匀，使DDP1 样品完全溶解。再将溶解的样品加入到核磁管中，进行核磁共振氢谱分析，取数据做1H NMR图。结果如图1所示。从图1可知，在DDP1结构中可看到在 6.4ppm、5.9ppm、2.3ppm附近有明显吸收峰，分别表示多巴胺、双键和阳离子上的氢的特征峰。各个峰的积分值与DDP1结构相对应，因此证明阳离子聚合物DDP1已经成功合成。
实施例2：高巯基化透明质酸(HA-SH)的合成
丙酰肼法：称取2.0g透明质酸(分子量为20万；天津希恩思奥普德科技有限公司)溶解于2.0L去离子水，再加入2.0g丙酰肼、1.9g的1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温条件电磁搅拌反应2小时。再加入10.0g二硫苏糖醇(DTT)到混合液中，充分混匀并电磁搅拌24小时。加入1.0M盐酸调节混合液的pH至4.0-7.0，再将混合液转移到3500D透析袋中，并用含有1％ (v/v)NaCl的0.1M HCl透析。最后收集透析袋内的溶液，冷冻干燥24小时，即得到1.97g HA-SH，产率为98.5％。(专利CN103613686A冻干后仅得到1.85gHA-SH)
半胱胺法：称取2.0g透明质酸(分子量为20万；天津希恩思奥普德科技有限公司)溶解于0.5L去离子水，得0.4％(m/v)透明质酸溶液，分别加入终浓度为0.96％(m/v)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)－碳二亚胺盐酸盐(EDAC) 和终浓度为0.58％(m/v)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解后调pH至5.5，搅拌45min；加入4g半胱胺盐酸盐(CYS)，调节反应液pH至4.75，避光反应 5h。再将混合液转移到3500D透析袋中，并依次用HCI溶液(pH4)、含1％(v/v) NaCl的HCI溶液(pH4)、HCI溶液(pH4)透析。最后将透析液冷冻干燥，得半胱胺修饰的巯基化透明质酸。
利用紫外分光光度法(Ellman试剂法)测定两种方法制备的透明质酸的 HA-SH含量。精确称取两种HA-SH样品10mg每组三个置于标记好的离心管中，加入Tris-HCl缓冲液定容到5mL，取出1mL加到DTNB分析溶液中，测定412nm 处的吸光度值。最后根据标准曲线计算样品游离巯基含量，结果以每1g HA-SH 含巯基的量(μmol)表示(μmol/g)。
由图2可知，将实施例2制备的HA-SH采用Ellman试剂法测定HA末端巯基含量，半胱氨酸标准曲线线性回归方程为A＝0.2936C－0.0352(R2＝0.99618)，表明半胱氨酸浓度与吸光度的线性关系良好，可用于巯基含量的测定。通过测定HA-SH样品的吸光度，计算得到其取代度为(62.96±0.72)％，说明HA末端成功进行了巯基化修饰。经过计算可知丙酰肼法得到的透明质酸中巯基含量为 600μmol/g。(专利CN101367884A中半胱胺法得到的透明质酸中巯基含量只有 210μmol/g)。
实施例3：聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备(DDP-HA)
(1)DDP溶液的制备：将实施例1制备的阳离子聚合物DDP1分别称取 0.1g、0.2g、0.3g置于玻璃瓶中，加入1mL 1.0M氢氧化钠溶液，分别制备成10％、 20％、30％(m/v)的DDP溶液，标记为10DDP、20DDP、30DDP。
(2)HA-SH溶液的制备：将实施例2丙酰肼法制备的高巯基化透明质酸称取0.02-0.08g置于玻璃瓶中，并加入1mL 1×PBS溶液，制备成2-8％(m/v)的 HA-SH溶液。将实施例2半胱胺法制备的巯基化透明质酸采用同样方法制成 HA-SH溶液。
(3)DDP-HA水凝胶的制备：首先分别取1mL步骤(1)中制备的DDP 溶液于离心管中，然后分别取1mL步骤(2)制备的两种HA-SH溶液置于玻璃瓶中。再将DDP和HA-SH溶液各取0.5mL，按照体积比1:1混合，电磁搅拌充分混匀。最后通过医用注射器吸取并注射到模具中，即得到水凝胶。
结果表明，本发明利用丙酰肼法制备的HA-SH与三种浓度的DDP均可以快速成胶，且水凝胶状态稳定，弹性较好。利用半胱胺法制备的HA-SH因巯基含量过低，无法与DDP成胶。两种水凝胶效果如图3所示(A为丙酰肼法制备的 30DDP-HA水凝胶，B为半胱胺法制备的30DDP-HA凝胶)。
实施例4：聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的力学性能测试
将实施例3中3种浓度的DDP溶液制备的DDP-HA水凝胶样品
Figure BDA0002889497690000071
(n＝3)分别置于万能试验机上(型号为ELF3220)，以 2mm/min的压缩速度进行压缩试验，水凝胶压缩量为60％。保存数据做应力-应变图。结果如图4所示。
由图4可知，本发明制备的20DDP-HA水凝胶弹性模量和压缩模量均强于其他两组水凝胶，其中压缩模量可高达45KPa，为10DDP-HA水凝胶的5倍，约为30DDP-HA水凝胶的2倍。因此可得出并非DDP浓度越大压缩性能越好， 20DDP-HA水凝胶反而拥有理想的压缩性能。水凝胶的力学性能测试也为水凝胶的筛选提供了依据，较理想的力学性能为水凝胶的体内注射提供支撑，使其满足体内支架和载药释放的要求。
实施例5：聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的抗菌性能测试
将实施例1制备的DP、DDP2两种水凝胶、实施例3制备得到的三种 DDP-HA水凝胶进行抗菌性能测试(平板菌落计数法)：以不加水凝胶为阴性对照组，DDP-HA水凝胶为实验组。每个阴性对照组和实验组均设三个平行样。测试采用的两种细菌(广东环凯微生物科技有限公司)分别为革兰氏阴性菌-大肠杆菌(E.coil，ATCC25922)与革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌(S.aureus编号为 ATCC6538)。具体实验步骤如下：
(1)按比例制备LB琼脂和LB肉汤培养基(BR级，Sigma-Aldrich公司)，在121℃条件下对培养基进行湿热灭菌20分钟。复苏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，传代两次并制备菌悬液，将浓度稀释至108cfu/mL；
(2)制备直径6mm、厚度1.5mm的DP、DDP2、10DDP-HA、20DDP-HA、 30DDP-HA五种水凝胶样品，每组三个平行样，分别在紫外照射下灭菌3小时；
(3)将DP、DDP2、10DDP-HA、20DDP-HA、30DDP-HA五种水凝胶分别浸泡在200μL108cfu/mL的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液中，在37℃条件下孵育4小时；然后吸出菌悬液，用适量1×PBS缓冲液冲洗水凝胶3次，去除胶表面未黏附的细菌。再加入0.5mL 1×PBS缓冲液浸没水凝胶并且超声 8min，把粘附在胶表面上的细菌超声到缓冲液中。对照组为不加DDP-HA水凝胶的菌悬液。
(4)将超声得到的缓冲液稀释至104cfu/mL，取100μL加入到琼脂板上，均匀涂布，并在37℃细菌培养箱培养18小时，取出拍照计数。水凝胶对大肠杆菌的抗菌效果结果如图5所示(A为对照组，B为DP水凝胶、C为DDP2水凝胶、D为10DDP-HA组，E为20DDP-HA组，F为30DDP-HA组)。
由图5可知，与对照组相比，10DDP-HA、20DDP-HA、30DDP-HA水凝胶均有较为理想的抗菌效果，其中30DDP-HA水凝胶对大肠杆菌抗菌效果最强，菌落数量最少。3种浓度的DDP-HA水凝胶对金黄色葡萄球菌同样具有良好的抗菌效果。未引入聚阳离子得到的DP水凝胶无抗菌特性，而抗菌阳离子的引入使得DDP2水凝胶具有良好抗菌性。对于抗菌阳离子的用量经过实验筛选得出含量为2.1g时(即摩尔比10:40:50:1)，抗菌效果最佳。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (10)

1.一种聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备阳离子聚合物DDP
以多巴胺甲基丙酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯为共聚单体，加入阳离子单体N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺，偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，在溶剂中进行RAFT聚合反应，提纯，干燥，得到阳离子聚合物DDP；
(2)制备高巯基化透明质酸HA-SH
将透明质酸、丙酰肼以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC混合于溶剂中，搅拌反应，加入二硫苏糖醇DTT，再次搅拌反应，调节pH至4.0-7.0，透析，冷冻干燥，得到高巯基化透明质酸HA-SH；
(3)制备聚阳离子-透明质酸复合水凝胶
将步骤(1)中所述阳离子聚合物DDP和步骤(2)中所述高巯基化透明质酸HA-SH制备成溶液，混匀，即得到聚阳离子-透明质酸复合水凝胶DDP-HA。
2.根据权利要求1所述的聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中所述多巴胺甲基丙酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、阳离子单体N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺和AIBN的摩尔比为(20-40)：(20-50)：(10-50)：(1-2)；
步骤(2)中所述透明质酸、丙酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二硫苏糖醇的摩尔比为1：(1-5)：(1-5)：(1-5)。
3.根据权利要求2所述的聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中所述多巴胺甲基丙酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、阳离子单体N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺和AIBN的摩尔比为10：40：50：1；
步骤(2)中所述透明质酸、丙酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二硫苏糖醇的摩尔比为1：(1-5)：(1-5)：2。
4.根据权利要求1所述的聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤(3)中所述制备成溶液是分别将所述阳离子聚合物DDP采用氢氧化钠溶液、所述高巯基化透明质酸HA-SH采用1×PBS溶液制备成DDP溶液和HA-SH溶液；
所述氢氧化钠溶液的浓度为1.0M；
所述DDP溶液浓度为质量体积比10-30％；
所述HA-SH溶液浓度为质量体积比2-8％；
所述DDP溶液与所述HA-SH溶液的用量为体积比1：(1-5)。
5.根据权利要求4所述的聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，
所述DDP溶液浓度为质量体积比20％；
所述HA-SH溶液浓度为质量体积比6％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中所述溶剂为二甲基甲酰胺；
步骤(1)中所述聚乙二醇二丙烯酸酯的数均分子量为575；
步骤(1)中所述提纯为采用乙醚提纯；
所述的乙醚的用量为适量；
步骤(2)中所述溶剂为去离子水；
步骤(2)中所述搅拌反应的时间为1-5h；
步骤(2)中所述再次搅拌反应的时间为18-24h；
步骤(2)中所述调节pH采用HCl，其浓度为1.0M；
步骤(2)中所述透析为采用3500D透析袋和0.1M HCl溶液透析。
7.根据权利要求6所述的聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中所述RAFT聚合反应为70℃下反应7h；
所述的乙醚的用量为阳离子聚合物DDP体积的5-10倍；
步骤(2)中所述搅拌反应的时间为2h；
步骤(2)中所述再次搅拌反应的时间为24h；
所述HCl溶液中含有体积比1％的NaCl。
8.根据权利要求1所述的聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中所述干燥为真空干燥18-24h；
步骤(2)中所述冷冻干燥为-10℃至-50℃下冷冻干燥18-24h；
步骤(3)中所述聚阳离子-透明质酸复合水凝胶采用注射器注射到模具中，之后使用。
9.一种聚阳离子-透明质酸复合水凝胶，其特征在于，通过权利要求1-8任一项所述的聚阳离子-透明质酸复合水凝胶的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的聚阳离子-透明质酸复合水凝胶在制备抗菌生物材料中的应用，其特征在于，所述抗菌生物材料用于细胞工程、组织工程、药物递送。
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