CN112190763B - 透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种透明质酸/ε‑聚赖氨酸抗菌水凝胶及其制备方法和应用，制备方法包括先用三羟甲基氨基甲烷修饰透明质酸后，引入甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰三羟甲基氨基甲烷改性过的透明质酸并与光引发剂溶液混合，经紫外光照射后浸泡在没食子酸修饰ε‑聚赖氨酸/Fe3+的溶液中，即得。本发明首先利用甲基丙烯酸缩水甘油酯的碳碳双键通过紫外光照射产生自由基，发生聚合；其次利用聚赖氨酸与透明质酸产生静电吸引，附着在光交联水凝胶表面；最后利用Fe3+的螯合作用，增加交联密度，形成抗菌水凝胶，并具有性能可控、韧性优异、生物相容性好、可生物降解、光照成型等优点，制备条件温和可控，可应用于软骨组织工程材料等生物医用材料领域。

Description

透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种高韧性光交联的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶支架及其制备方法和在组织工程中的应用。
背景技术
水凝胶是一种高含水的三维网状结构的高聚物，可以通过改变高聚物材料的交联密度来调控三维网状结构中孔径的大小，做到程序化控制凝胶材料的含水量，使其在水中维持溶胀但不溶解的状态。由于这种三维网状结构可以很好的模拟细胞外基质，对软体组织进行有针对性地修复与重建，这为组织工程领域提供了新的思路。此外，由于拥有仿似细胞外基质的水凝胶可以维持正常细胞的增殖和分化，并拥有高度匹配缺损部位的能力，其被视为一种比较理想的软组织替代材料，广泛地应用于组织工程领域，如：药物载体、创面修复和组织工程支架等。
透明质酸(HA)是一种天然高分子黏性多糖，由D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖重复单元聚合而成，其分子主链含有大量羧基和羟基等化学可修饰基团，分子量5kDa～20000kDa不等，因具有高含水量以及组织相容性，其被广泛用于组织工程领域的研究。另一种天然高聚物材料ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种水溶性多肽，由于其特有的氨基阳离子，是一种天然防腐剂，具有抗菌谱广、可生物降解等优点，可通过生物发酵法获得，在生物医学领域被视为一种潜力较大的生物材料。
目前，水凝胶支架的制备方法主要以化学交联、物理交联、光引发聚合以及酶促交联等交联方式为主。但现有方法在制备过程中常出现批次不稳定，抗菌性能研究较少，且机械性能差等问题。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷问题，本发明提供一种高韧性光交联的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶及其制备方法和应用。本发明通过光引发自由基聚合、分子间静电吸引、分子间氢键以及Fe3+的配位化学，将天然高分子透明质酸/ε-聚赖氨酸交联，固化形成水凝胶，该水凝胶合成工艺简单、机械强度优异、生物相容性良好以及广谱抗菌等，可以广泛的应用组织工程材料等领域。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)向透明质酸的水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)后活化；之后加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)，反应得到三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物，记为HAT；
(2)向HAT的丙酮-水溶液中加入三乙胺进行反应；之后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)反应，得到甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物，记为HAT-GMA；
(3)将HAT-GMA加入到含有光引发剂的溶液中，得到原液A；将所述原液A于紫外光下照射，得到光交联的透明质酸水凝胶；
(4)向含有没食子酸的乙醇-水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)后活化；之后加入ε-聚赖氨酸(ε-PL)反应，得到没食子酸修饰ε-聚赖氨酸的聚合物，记为ε-PL-PA；
(5)将ε-PL-PA加入到含有Fe3+和ε-聚赖氨酸的溶液中，得到原液B；将所述光交联的透明质酸水凝胶浸泡于原液B中后，水洗即得所述透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶。
优选的，步骤(1)所述的反应的时间为12～48h。
优选的，步骤(1)所述透明质酸的分子量为100万～400万道尔顿。
优选的，步骤(1)所述透明质酸的水溶液的浓度为1～10g/L。
优选的，步骤(1)所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2:1～1:3；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与透明质酸中羧基的摩尔比为3:1～1:3；透明质酸的羧基和三羟甲基氨基甲烷的摩尔比为1:1～1:10。
优选的，步骤(1)所述的透明质酸的水溶液的pH为4.5～5.5。
优选的，步骤(1)所述的活化的时间为15～60min。
优选的，步骤(1)所述的活化的温度为0～30℃。
优选的，步骤(1)还包括反应后透析并冷冻干燥的步骤。
优选的，所述的透析的时间为1～7天。
优选的，步骤(2)中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯后的反应的时间为12～48h。
优选的，步骤(2)所述的丙酮-水溶液中丙酮与水的体积比是1:1。
优选的，步骤(2)所述含有HAT和三乙胺的丙酮-水溶液中HAT的浓度为1～10g/L。
优选的，步骤(2)所述三乙胺与HAT中羟基的摩尔比为2:1～1:2；HAT中羟基与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为2:1～1:5。
优选的，步骤(2)中HAT与三乙胺的反应的时间为60～180min。
优选的，步骤(2)中HAT与三乙胺的反应的温度为30～40℃。
优选的，步骤(2)还包括反应后将反应液经丙酮沉淀、浓缩、透析并冻干的步骤。
优选的，所述的丙酮沉淀，所需丙酮的体积为反应液的10-20倍。
优选的，透析的时间为1～7天。
优选的，步骤(3)所述的光引发剂为I2959。
优选的，步骤(3)所述的含有光引发剂的溶液为水溶液，光引发剂的质量分数为0.5％。
优选的，步骤(3)中，所述原液A中，HAT-GMA的质量浓度为3％～5％。
优选的，步骤(3)所述的照射的时间为60s～300s。在紫外光照射的条件下混合制备原液，最短可在60s内快速固化成胶。
优选的，步骤(4)所述的反应的时间为18～48h。
优选的，步骤(4)所述的乙醇-水体溶液中乙醇与水的体积比是5:1～1:2。
优选的，步骤(4)所述ε-聚赖氨酸是溶解于水中的，浓度为5～15g/L。
优选的，步骤(4)所述ε-聚赖氨酸的分子量为1000～4000道尔顿。
优选的，步骤(4)所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2:1～1:3；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与没食子酸中羧基的摩尔比为1:1～1:5；没食子酸和ε-聚赖氨酸氨基的摩尔比为5:1～1:3。
优选的，步骤(4)所述的含有没食子酸的乙醇-水溶液的pH为4.5～5.5。
优选的，步骤(4)所述的活化的时间为15～60min。
优选的，步骤(4)所述的活化的温度为0～30℃。
优选的，步骤(4)还包括反应后透析并冷冻干燥的步骤。优选的，透析的时间为1～7天。
优选的，步骤(5)所述的含有Fe3+和ε-聚赖氨酸的溶液为含有FeCl3的ε-聚赖氨酸的水溶液，Fe3+的浓度为1～10g/L，ε-聚赖氨酸的质量分数为5％～15％。
优选的，步骤(5)所述的浸泡的时间为6～12h。
优选的，步骤(5)所述的水洗的时间为3～12h。
本发明还提供由上述方法制得的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶。
本发明还提供由上述方法制得的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶在生物医用材料领域中的应用。
所述应用包括：制备医用敷料、软骨组织工程材料或细胞支架。
本发明的有益效果在于：
光引发自由基聚合反应可以根据任意形状，在任意位置通过紫外光照射固化成胶，操作简单且不会产生毒害产物；其次，引入聚赖氨酸并通过静电作用吸附在水凝胶表面形成抗菌层，可达到天然广谱抗菌效果；最后通过Fe3+的配位化学螯合带负电的羧基以及酚羟基，提高水凝胶材料的机械强度，是理想的固化手段。
本发明采用可生物降解且安全可靠的细胞外基质的主要成分透明质酸，以及天然防腐剂聚赖氨酸为主体材料，分别在其分子侧链修饰三羟甲基氨基甲烷、甲基丙烯酸缩水甘油酯以及没食子酸等小分子基团，利用简单可控的光引发自由基聚合反应、正负电荷之间的静电吸附以及Fe3+与游离羧基、酚羟基基团之间的物理交联，可以任意匹配复受损部位；同时三羟甲基氨基甲烷作为一种三羟基结构，可以与体系中的化学基团形成较多的氢键，提高体系的化学稳定性并增强体系的机械性能，以匹配软骨等生物组织的承压性能。此外天然聚赖氨酸作为一种天然光谱抗菌生物材料，在修饰没食子酸之后，显著性的提高了水凝胶材料的抗菌性能，使其在操作过程中可以避免细菌滋生，缺损部位的修复与重建。该水凝胶材料有效解决了单纯的天然高分子材料交联形成的水凝胶机械能力差的缺陷，且具有一定的生物相容性好、生物可降解性等优点，在医用敷料、细胞支架、组织工程等领域具有广阔的应用基础。
此法成胶方式温和可控，合成工艺简单，通过多糖/聚肽体系，更好的模拟细胞外基质，更好的诱导组织再生与修复。
附图说明
图1是本发明所制得的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶经压缩和回复后的照片对比图。
图2是本发明所制得的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶的细胞毒性试验结果对比图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详述的本发明。
实施例1
(1)将透明质酸(HA，分子量为100万道尔顿)溶解于去离子水中，HA的质量浓度为5g/L，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝4.6，在30℃条件下搅拌活化30分钟。加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)，30℃搅拌反应24小时；各物质的摩尔比如下，EDC:HA中羧基＝1.5:1，EDC:NHS＝2:1，HA中羧基:Tris＝1:3。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析2天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)。
(2)将三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)溶解在体积比1:1的丙酮-水体系中，HAT的质量浓度为5g/L，加入三乙胺30℃反应2小时后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，30℃搅拌反应24小时；各物质的摩尔比如下，三乙胺:HAT的羟基＝1:1，HAT的羟基:GMA＝1:1。反应结束后，将反应液缓慢导入10倍体积的丙酮溶液中，待沉淀完全后复溶，并转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)。
(3)将甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)加入到光引发剂I2959溶液中得到原液A；原液A中HAT-GMA的质量浓度为3％；光引发剂溶液中I2959的质量浓度为0.5％；将所述原液A经紫外光照射130s固化成型，得到光交联的透明质酸水凝胶。
(4)将没食子酸(PA)溶解在体积比1:1的乙醇-水体系中，充分搅拌并溶解均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝4.6，在30℃条件下搅拌活化30分钟。加入ε-聚赖氨酸水溶液(ε-PL，分子量为1500道尔顿)，ε-PL的质量浓度为5g/L，30℃搅拌反应24小时；各物质的摩尔比如下，EDC:PA的羧基＝1:1，EDC:NHS＝2:1，PA:ε-PL的氨基＝1:1。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析2天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到没食子酸修饰ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)。
(5)将ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)溶解到FeCl3的水溶液中得到原液B；原液B中ε-PL-PA的质量浓度为5％；Fe3+的质量浓度为1g/L，将所述光交联的透明质酸水凝胶浸泡于原液B中6小时，用水洗3小时后即得所述透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶。
实施例2
(1)将透明质酸(HA，分子量为200万道尔顿)溶解于去离子水中，HA的质量浓度为10g/L，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝4.5，在4℃条件下搅拌活化30分钟。加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)，30℃搅拌反应12小时；各物质的摩尔比如下，EDC:HA中羧基＝2:1，EDC:NHS＝1:1，HA中羧基:Tris＝1:5。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析1天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)。
(2)将三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)溶解在体积比1:1的丙酮-水体系中，HAT的质量浓度为5g/L，加入三乙胺35℃反应2小时后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，30℃搅拌反应36小时；各物质的摩尔比如下，三乙胺:HAT的羟基＝1:1，HAT的羟基:GMA＝1:3。反应结束后，将反应液缓慢导入20倍体积的丙酮溶液中，待沉淀完全后复溶，并转移至透析袋中，置于去离子水中透析2天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)，HAT-GMA的接枝率为13％。
(3)将甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)加入到光引发剂I2959溶液中得到原液A；原液A中HAT-GMA的质量浓度为5％；光引发剂溶液中I2959的质量浓度为0.5％；将所述原液A经紫外光照射300s固化成型，得到光交联的透明质酸水凝胶。
(4)将没食子酸(PA)溶解在体积比2:1的乙醇-水体系中，充分搅拌并溶解均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝4.5，在4℃条件下搅拌活化30分钟。加入ε-聚赖氨酸水溶液(ε-PL，分子量为2000道尔顿)，ε-PL的质量浓度为10g/L，30℃搅拌反应24小时；各物质的摩尔比如下，EDC:PA的羧基＝1:5，EDC:NHS＝1:1，PA:ε-PL的氨基＝2:1。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析2天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到没食子酸修饰ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)。
(5)将ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)溶解到FeCl3的水溶液中得到原液B；原液B中ε-PL-PA的质量浓度为10％；Fe3+的质量浓度为1g/L，将所述光交联的透明质酸水凝胶浸泡于原液B中9小时，用水洗6小时后即得所述透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶。
实施例3
(1)将透明质酸(HA，分子量为200万道尔顿)溶解于去离子水中，HA的质量浓度为5g/L，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝4.7，在4℃条件下搅拌活化60分钟。加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)，30℃搅拌反应36小时；各物质的摩尔比如下，EDC:HA中羧基＝3:1，EDC:NHS＝1:1.5，HA中羧基:Tris＝1:3。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)。
(2)将三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)溶解在体积比1:1的丙酮-水体系中，HAT的质量浓度为1g/L，加入三乙胺40℃反应1.5小时后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，30℃搅拌反应36小时；各物质的摩尔比如下，三乙胺:HAT的羟基＝1:2，HAT的羟基:GMA＝1:5。反应结束后，将反应液缓慢导入15倍体积的丙酮溶液中，待沉淀完全后复溶，并转移至透析袋中，置于去离子水中透析7天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)。
(3)将甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)加入到光引发剂I2959溶液中得到原液A；原液A中HAT-GMA的质量浓度为4％；光引发剂溶液中I2959的质量浓度为0.5％；将所述原液A经紫外光照射150s固化成型，得到光交联的透明质酸水凝胶。
(4)将没食子酸(PA)溶解在体积比1:2的乙醇-水体系中，充分搅拌并溶解均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝4.8，在30℃条件下搅拌活化15分钟。加入ε-聚赖氨酸水溶液(ε-PL，分子量为4000道尔顿)，ε-PL的质量浓度为15g/L，30℃搅拌反应36小时；各物质的摩尔比如下，EDC:PA的羧基＝1:1，EDC:NHS＝1:1.2，PA:ε-PL的氨基＝1:3。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到没食子酸修饰ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)。
(5)将ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)溶解到FeCl3的水溶液中得到原液B；原液B中ε-PL-PA的质量浓度为15％；Fe3+的质量浓度为1g/L，将所述光交联的透明质酸水凝胶浸泡于原液B中12小时，用水洗6小时后即得所述高韧性光交联的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶。
实施例4
(1)将透明质酸(HA，分子量为400万道尔顿)溶解于去离子水中，HA的质量浓度为1g/L，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝4.7，在0℃条件下搅拌活化30分钟。加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)，30℃搅拌反应24小时；各物质的摩尔比如下，EDC:HA中羧基＝1:3，EDC:NHS＝1:2，HA中羧基:Tris＝1:10。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)，HAT的接枝率为16％。
(2)将三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)溶解在体积比1:1的丙酮-水体系中，HAT的质量浓度为5g/L，加入三乙胺30℃反应2.5小时后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，30℃搅拌反应12小时；各物质的摩尔比如下，三乙胺:HAT的羟基＝1:1.5，HAT的羟基:GMA＝1:2。反应结束后，将反应液缓慢导入20倍体积的丙酮溶液中，待沉淀完全后复溶，并转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)。
(3)将甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)加入到光引发剂I2959溶液中得到原液A；原液A中HAT-GMA的质量浓度为5％；光引发剂溶液中I2959的质量浓度为0.5％；将所述原液A经紫外光照射90s固化成型，得到光交联的透明质酸水凝胶。
(4)将没食子酸(PA)溶解在体积比3:1的乙醇-水体系中，充分搅拌并溶解均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝4.8，在30℃条件下搅拌活化30分钟。加入ε-聚赖氨酸水溶液(ε-PL，分子量为2000道尔顿)，ε-PL的质量浓度为15g/L，30℃搅拌反应48小时；各物质的摩尔比如下，EDC:PA的羧基＝1:1，EDC:NHS＝1:1.2，PA:ε-PL＝3:1。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析1天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到没食子酸修饰ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)。
(5)将ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)溶解到FeCl3的水溶液中得到原液B；原液B中ε-PL-PA的质量浓度为15％；Fe3+的质量浓度为5g/L，将所述光交联的透明质酸水凝胶浸泡于原液B中12小时，用水洗6小时后即得所述高韧性光交联的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶。
实施例5
(1)将透明质酸(HA，分子量为400万道尔顿)溶解于去离子水中，HA的质量浓度为1g/L，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝5.5，在4℃条件下搅拌活化30分钟。加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)，30℃搅拌反应24小时；各物质的摩尔比如下，EDC:HA中羧基＝1:3，EDC:NHS＝1:2，HA中羧基:Tris＝1:5。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)。
(2)将三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)溶解在体积比1:1的丙酮-水体系中，HAT的质量浓度为10g/L，加入三乙胺30℃反应1小时后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，30℃搅拌反应24小时；各物质的摩尔比如下，三乙胺:HAT的羟基＝1:1.5，HAT的羟基:GMA＝2:1。反应结束后，将反应液缓慢导入20倍体积的丙酮溶液中，待沉淀完全后复溶，并转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)。
(3)将甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)加入到光引发剂I2959溶液中得到原液A；原液A中HAT-GMA的质量浓度为5％；光引发剂溶液中I2959的质量浓度为0.5％；将所述原液A经紫外光照射60s固化成型，得到光交联的透明质酸水凝胶。
(4)将没食子酸(PA)溶解在体积比5:1的乙醇-水体系中，充分搅拌并溶解均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝4.8，在0℃条件下搅拌活化45分钟。加入ε-聚赖氨酸水溶液(ε-PL，分子量为1000道尔顿)，ε-PL的质量浓度为5g/L，30℃搅拌反应24小时；各物质的摩尔比如下，EDC:PA的羧基＝1:3，EDC:NHS＝1:2，PA:ε-PL＝5:1。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析7天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到没食子酸修饰ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)。
(5)将ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)溶解到Fe3+的水溶液中得到原液B；原液B中ε-PL-PA的质量浓度为15％；Fe3+的质量浓度为1g/L，将所述光交联的透明质酸水凝胶浸泡于原液B中12小时，用水洗9小时后即得所述高韧性光交联的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶。
实施例6
(1)将透明质酸(HA，分子量为200万道尔顿)溶解于去离子水中，HA的质量浓度为1g/L，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝5.0，在10℃条件下搅拌活化50分钟。加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)，30℃搅拌反应30小时；各物质的摩尔比如下，EDC:HA中羧基＝1:1.5，EDC:NHS＝1:2，HA中羧基:Tris＝1:7。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析5天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)。
(2)将三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)溶解在体积比1:1的丙酮-水体系中，HAT的质量浓度为5g/L，加入三乙胺30℃反应3小时后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，30℃搅拌反应30小时；各物质的摩尔比如下，三乙胺:HAT的羟基＝1:2，HAT的羟基:GMA＝1:3。反应结束后，将反应液缓慢导入20倍体积的丙酮溶液中，待沉淀完全后复溶，并转移至透析袋中，置于去离子水中透析1天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)。
(3)将甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)加入到光引发剂I2959溶液中得到原液A；原液A中HAT-GMA的质量浓度为4％；光引发剂溶液中I2959的质量浓度为0.5％；将所述原液A经紫外光照射110s固化成型，得到光交联的透明质酸水凝胶。
(4)将没食子酸(PA)溶解在体积比5:1的乙醇-水体系中，充分搅拌并溶解均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝5.5，在4℃条件下搅拌活化60分钟。加入ε-聚赖氨酸水溶液(ε-PL，分子量为3000道尔顿)，ε-PL的质量浓度为5g/L，30℃搅拌反应18小时；各物质的摩尔比如下，EDC:PA的羧基＝1:3，EDC:NHS＝1:3，PA:ε-PL＝5:1。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析5天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到没食子酸修饰ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)。
(5)将ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)溶解到FeCl3的水溶液中得到原液B；原液B中ε-PL-PA的质量浓度为15％；Fe3+的质量浓度为10g/L，将所述光交联的透明质酸水凝胶浸泡于原液B中12小时，用水洗12小时后即得所述透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶。
实施例7
(1)将透明质酸(HA，分子量为400万道尔顿)溶解于去离子水中，HA的质量浓度为1g/L，充分搅拌均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝4.7，在30℃条件下搅拌活化15分钟。加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)，30℃搅拌反应48小时；各物质的摩尔比如下，EDC:HA中羧基＝1:3，EDC:NHS＝1:3，HA中羧基:Tris＝1:1。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析7天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)。
(2)将三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物Ⅰ(HAT)溶解在体积比1:1的丙酮-水体系中，HAT的质量浓度为5g/L，加入三乙胺30℃反应1.5小时后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，30℃搅拌反应48小时；各物质的摩尔比如下，三乙胺:HAT的羟基＝1:2，HAT的羟基:GMA＝1:2。反应结束后，将反应液缓慢导入10倍体积的丙酮溶液中，待沉淀完全后复溶，并转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)。
(3)将甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物Ⅱ(HAT-GMA)加入到光引发剂I2959溶液中得到原液A；原液A中HAT-GMA的质量浓度为3％；光引发剂溶液中I2959的质量浓度为0.5％；将所述原液A经紫外光照射180s固化成型，得到光交联的透明质酸水凝胶。
(4)将没食子酸(PA)溶解在体积比5:1的乙醇-水体系中，充分搅拌并溶解均匀后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调pH＝4.5，在4℃条件下搅拌活化30分钟。加入ε-聚赖氨酸水溶液(ε-PL，分子量为3000道尔顿)，ε-PL的质量浓度为10g/L，30℃搅拌反应12小时；各物质的摩尔比如下，EDC:PA的羧基＝1:2，EDC:NHS＝1:1，PA:ε-PL的氨基＝1:1。反应得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将透析后的溶液，冷冻干燥得到没食子酸修饰ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)。
(5)将ε-聚赖氨酸的聚合物(ε-PL-PA)溶解到FeCl3的水溶液中得到原液B；原液B中ε-PL-PA的质量浓度为10％；Fe3+的质量浓度为1g/L，将所述光交联的透明质酸水凝胶浸泡于原液B中12小时，用水洗6小时后即得所述透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶。
实施例8：机械性能评价
采用CMT2103型万能试验机(美国美特斯MTS公司)对高韧性光交联的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶的压缩性能进行评价，即以压缩性能表征其机械能能。具体实验步骤为：(1)制备压缩性能测试样品(直径9.5mm，高度6cm的圆柱体)，压缩速度为10mm/min，结果如表1所示。另外，为了更形象的表观水凝胶的机械性能，用图1展示水凝胶的压缩性能(图1是将烧杯倒置，把水凝胶放置在烧杯底部，使其承受总重量700克的砝码，结果显示其仍能回复原来的形状)。
表1不同单体比例的水凝胶机械性能评价
样品(wt％) 应变(％)
3％HA-GMA 51±1.6
3％HAT-GMA 63±2.4
4％HAT-GMA 72±0.6
5％HAT-GMA 78±3.2
5％HAT-GMA/5％ε-PL-PA 79±4.6
5％HAT-GMA/10％ε-PL-PA 81±1.6
5％HAT-GMA/15％ε-PL-PA 83±0.4
5％HAT-GMA/5％ε-PL-PA/5％Fe<sup>3+</sup> 85±3.3
5％HAT-GMA/10％ε-PL-PA/10％Fe<sup>3+</sup> 89±1.7
5％HAT-GMA/15％ε-PL-PA/15％Fe<sup>3+</sup> 93±2.1
实施例9：细胞毒性评价实验
采用死活染色评价高韧性光交联的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶的细胞相容性，实验对象为小鼠胚胎细胞(NTH3T3)。具体实验操作步骤为：(1)将NTH3T3细胞培养在含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5％的CO2培养箱中直到细胞汇合率达80％以上，用胰蛋白酶消化后离心，并用培养基调整细胞密度为2×105cell/mL的细胞悬液；(2)然后将NTH3T3细胞接种到24孔板中，每孔200μL，置于细胞培养箱中，过夜培养至完全贴壁；吸出原有的培养液，分别加入1mL的透明质酸/ε-聚赖氨酸水凝胶的浸提液、空白对照液(即新鲜完全培养基)以及相同浓度的GelMA水凝胶的浸提液，每组共3个平行样本；(4)分别在24h，48h，72h三个时间点每孔按照每毫升加入40μL的比例加入AO/EB染液染色工作液，37℃恒温培养箱中放置5分钟后于荧光倒置显微镜下观察荧光染色的细胞(见图2)。染色后的细胞在荧光显微镜下，观察细胞形态，活细胞呈现出绿色正常结构；死细胞呈现出橘红色固缩状或圆珠状结构。
注：染色工作液配置：将吖啶橙(AO)溶液和溴化乙锭(EB)溶液按1:1的体积比混合成工作液，现用现配。本实验AO、EB溶液浓度分别为100μg/ml，所含稳定剂不影响实验效果。
实施例10：抗菌性能评价
本发明采用营养肉汤稀释法考察了透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶的抗菌性能。首先将不同单体的水凝胶样品在75％的酒精中浸泡4小时进行彻底消毒,然后用无菌PBS清洗凝胶中的酒精，将水凝胶放入48孔板中，然后将200μL活化好的细菌悬液(大肠杆菌及细菌悬液)滴在凝胶表面培养24小时后，将细菌样品加入200μL的营养肉汤溶液中，使用紫外分光光度计测试600nm波长处的吸光度(OD)，实验结果以未处理的细菌溶液为对照组，利用计算公式为(对照组OD-实验组OD)/对照组OD×100％计算抑菌结果，每组实验进行3次，实验结果如表2所示。
表2不同单体比例的水凝胶抗菌性能评价
样品(wt％) 大肠杆菌(％) 金色葡萄球菌(％)
％HA-GMA 6.32±0.21 4.15±0.79
3％HAT-GMA 5.16±0.11 4.42±0.31
4％HAT-GMA 5.39±0.91 4.32±0.14
5％HAT-GMA 5.41±0.43 4.52±0.41
5％HAT-GMA/5％ε-PL-PA 36.52±1.94 42.46±3.65
5％HAT-GMA/10％ε-PL-PA 56.59±0.87 63.75±1.78
5％HAT-GMA/15％ε-PL-PA 89.61±0.98 83.36±3.14
5％HAT-GMA/5％ε-PL-PA/5％Fe<sup>3+</sup> 30.12±0.31 39.63±1.15
5％HAT-GMA/10％ε-PL-PA/10％Fe<sup>3+</sup> 48.82±1.21 69.38±4.27
5％HAT-GMA/15％ε-PL-PA/15％Fe<sup>3+</sup> 75.23±4.28 73.98±2.41
综上表明，我们提供了一种利用透明质酸/ε-聚赖氨酸通过光引发自由基聚合反应、静电络合反应以及铁离子之间的配位作用来模拟构建细胞外基质，不仅具有优异的机械韧性，也拥有优良的细胞相容性，并且具有一定的广谱抗菌性能，有望后期包载细胞用于组织工程支架的应用与研发为可替代生物应用材料的发展提供了新的思路。

Claims (11)

1.一种透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）向透明质酸的水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺后活化；之后加入三羟甲基氨基甲烷，反应得到三羟甲基氨基甲烷修饰的透明质酸聚合物，记为HAT；
（2）向HAT的丙酮-水溶液中加入三乙胺进行反应；之后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯反应，得到甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的改性透明质酸聚合物，记为HAT-GMA；
（3）将HAT-GMA加入到含有光引发剂的溶液中，得到原液A；将所述原液A于紫外光下照射，得到光交联的透明质酸水凝胶；
（4）向含有没食子酸的乙醇-水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺后活化；之后加入ε-聚赖氨酸反应，得到没食子酸修饰ε-聚赖氨酸的聚合物，记为ε-PL-PA；
（5）将ε-PL-PA加入到含有Fe3+和ε-聚赖氨酸的溶液中，得到原液B；将所述光交联的透明质酸水凝胶浸泡于原液B中后，水洗即得所述透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶。
2.根据权利要1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2:1~1:3；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与透明质酸中羧基的摩尔比为3:1~1:3；透明质酸的羧基和三羟甲基氨基甲烷的摩尔比为1:1-1:10。
3.根据权利要1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述三乙胺与HAT中羟基的摩尔比为2:1~1:2；HAT中羟基与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为2:1~1:5。
4.根据权利要1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的光引发剂为I2959。
5.根据权利要1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述原液A中，HAT-GMA的质量浓度为3%~5%。
6.根据权利要1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的照射的时间为60s~300s。
7.根据权利要1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述ε-聚赖氨酸的分子量为1000~4000道尔顿。
8.根据权利要1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2:1~1:3；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与没食子酸中羧基的摩尔比为1:1~1:5；没食子酸和ε-聚赖氨酸氨基的摩尔比为5:1~1:3。
9.根据权利要1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述的含有Fe3+和ε-聚赖氨酸的溶液为含有FeCl3的ε-聚赖氨酸的水溶液，Fe3+的浓度为1~10g/L，ε-聚赖氨酸的质量分数为5%-15%。
10.权利要求1-9任一所述制备方法制得的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶。
11.权利要求1-9任一所述制备方法制得的透明质酸/ε-聚赖氨酸抗菌水凝胶在制备生物医用材料中的应用。
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