CN112876698B - 一种可逆可调控双功能水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可逆可调控双功能水凝胶及其制备方法与应用，属于高分子材料技术领域。本发明的可逆可调控双功能水凝胶包括ε‑聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚、巯基修饰的透明质酸和水溶性光引发剂；所述ε‑聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的结构式如式Ⅰ所示，式中，n和m均为整数，0＜n≤200，15≤m≤20。该双功能水凝胶具有低溶胀率，结构稳定，细胞相容性良好，可通过紫外光可逆调控凝胶力学性能和带有巯基的信号分子的结合和释放，能够作为可降解水凝胶、3D细胞培养平台和信号分子的结合和释放平台应用。
Figure DDA0002923031190000011

Description

一种可逆可调控双功能水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于高分子材料技术领域，具体涉及一种可逆可调控双功能水凝胶及其制备方法与应用，尤其涉及该可逆可调控双功能水凝胶作为可降解水凝胶、3D细胞平台和信号分子的结合和释放的培养平台的应用。
背景技术
水凝胶是一类内部含有大量水的三维网络，它一般由亲水聚合物通过化学交联或物理交联形成。由于其理化性质和人体细胞外基质性质接近(高含水量低表面张力等)，与人体组织接触表现出良好的生物相容性，因此其在组织工程，细胞培养平台，及伤口敷料等生物医学领域中广泛应用。
水凝胶3D细胞培养平台一般具有高水含量、稳定的3D空间支撑、合适的机械强度，可为细胞提供气体交换和排出废物等基础功能。随着化学和材料科学的发展，很多可以模拟生理环境的具有细胞外基质性质的水凝胶3D细胞培养平台被研究出来。传统研究主要集中于具有稳定理化性质的静态的和均一的材料作为细胞培养平台。这些细胞培养平台的研究证明了材料的理化性质是细胞在其中生长分化的重要影响因素，但是这些静态环境的模拟相对于体内动态环境是十分不足的。近年来刺激响应材料在生物材料领域广泛应用，人们通过外加条件的刺激可以按需动态调节材料的理化性质，很多研究证明了培养平台动态调节对细胞的生长分化具有显著影响。
自由基加成断裂链转移反应是一种可在生理环境下进行的低浓度自由基引发的链式反应，这个反应的一个重要特点是烯丙基硫醚结构中的双键在反应后能够等物质的量的生成。这一特性使得这种结构有潜力成为多功能调控凝胶的结构基础。然而现有的将这种结构应用于3D细胞培养平台的水凝胶材料仅能实现单因素的调控(Adv.Mater.2017,29,1605001；ACS Cent.Sci.2018,4,909-916)。
发明内容
本发明的目的是提供一种可逆可调控双功能水凝胶及其制备方法与应用，该双功能水凝胶具有低溶胀率，结构稳定，细胞相容性良好，可通过紫外光可逆调控凝胶力学性能和带有巯基的信号分子的结合和释放，能够作为可降解水凝胶、3D细胞培养平台和信号分子的结合和释放的培养平台应用。
本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。
本发明的一种可逆可调控双功能水凝胶，包括质量比为(0.003-15):(5-300):(5-200)的水溶性光引发剂、ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚和巯基修饰的透明质酸
所述ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的结构式如式Ⅰ所示，式中，n和m均为整数，0＜n≤200，15≤m≤20；
Figure BDA0002923031170000021
优选的是，所述ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、在室温下，将含有聚乙二醇单甲醚的四氢呋喃加入到氢氧化钠水溶液中，在惰性气氛保护，0℃下，边搅拌边加入含对甲基苯磺酰氯的四氢呋喃，0℃反应4h以上后，用乙醚萃取，得到第一中间体；
所述聚乙二醇单甲醚：对甲基苯磺酰氯：氢氧化钠的物质的量比为1：(1.01-10)：(1.01-10)；
步骤二、将第一中间体和硫脲溶于乙醇中，先在惰性气氛保护下80℃加热回流3h，然后加入氢氧化钠水溶液，继续在80℃回流4h，最后冷却到室温，旋蒸除去乙醇，加入稀盐酸中和，用二氯甲烷萃取，得到第二中间体；
所述第一中间体：硫脲：氢氧化钠的物质的量比为1：(1.01-10)：(1.01-100)；
步骤三、将第二中间体和甲醇钠加入超干甲醇中，在惰性气氛保护下，先搅拌溶解，然后反应20min，得到的反应液滴入含3-氯-2-氯甲基丙烯的超干甲醇中，60℃回流20h，过滤，旋蒸，加水溶解，用二氯甲烷萃取，得到第三中间体；
所述第二中间体：甲醇钠：3-氯-2-氯甲基丙烯的物质的量比1：(1.01-2)：(1.01-2)；
步骤四、将第三中间体、碳酸钾和ε-聚赖氨酸溶于二甲基亚砜中，在惰性气氛保护下，70℃加热回流12h，使用截留分子量为2kDa的透析袋进行透析，每天换水三次，连续透析三天后，冻干，得到ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚；
所述第三中间体：碳酸钾：ε-聚赖氨酸的物质的量比1：(1.01-5)：(1-20)。
优选的是，所述巯基修饰的透明质酸的制备方法为：将3,3`-二硫代丙酸二酰肼和透明质酸溶于水中，加入稀盐酸调节pH至4-6，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应24h后，加入氢氧化钠水溶液调节pH至7.5-10，加入二硫苏糖醇，反应24h后，使用截留分子量为8kDa的透析袋进行透析，每天换水三次，连续透析两天，冻干，得到巯基修饰的透明质酸；
所述透明质酸：3,3`-二硫代丙酸二酰肼：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：二硫苏糖醇的物质的量比为1:(0.2-1):(0.1-1):(0.5-3)。
优选的是，所述水溶性光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)或引发剂2959(I2959)。
优选的是，所述水溶性光引发剂、ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚与巯基修饰的透明质酸的质量比为(0.15-3):(12.5-50):(25-100)，尤其优选的为0.3:25:50。
本发明还提供上述可逆可调控双功能水凝胶的制备方法：在20-37℃下，将ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚、巯基修饰的透明质酸和水溶性光光引发剂分别溶解在磷酸盐缓冲溶液中，分别得到R1、R2和R3溶液，将R1、R2和R3溶液混合均匀，得到的混合液在0.1-50mW/cm2的340-430nm波长的光照射2-15min后，得到可逆可调控双功能水凝胶。
优选的是，所述磷酸盐缓冲溶液的pH＝7.4，0.01M。
优选的是，混合液中，ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的浓度为0.5-30wt％，更优选的为1.25-5wt％，尤其优选的为2.5wt％；巯基修饰的透明质酸的浓度为0.5-20wt％，更优选的为2.5-10wt％，尤其优选的为5wt％；水溶性光引发剂摩尔浓度为0.01-50mmol/L，更优选的为0.5-10mmol/L，尤其优选的为1mmol/L。
本发明还提供上述可逆可调控双功能水凝胶作为可降解水凝胶的应用，将双功能水凝胶在水溶性单巯基分子和水溶性光引发剂的混合液中浸泡8h以上，取出，得到可降解的水凝胶。
优选的是，所述水溶性单巯基分子为N-乙酰半胱氨酸(NAC)；混合液中，水溶性单巯基分子的摩尔浓度为0.1-200mmol/L，更优选的为5-50mmol/L，尤其优选的为20mmol/L。
优选的是，所述水溶性光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)或引发剂2959(I2959)；混合液中，水溶性光引发剂的摩尔浓度为0.01-50mmol/L，更优选的为0.5-10mmol/L，尤其优选的为1mmol/L。
本发明还提供上述可逆可调控双功能水凝胶作为信号分子的结合和释放的培养平台的应用，将双功能水凝胶在带有巯基的信号分子和水溶性光引发剂的第一混合液中浸泡8h以上，取出，用0.1-50mW/cm2的340-430nm波长的光照射2-15min后，实现信号分子的接入；将接入信号分子的凝胶在水溶性单巯基小分子和水溶性光引发剂的第二混合液中浸泡8h以上，取出，用0.1-50mW/cm2的340-430nm波长的光照射2-15min后，实现信号分子的释放。
优选的是，所述带有巯基的信号分子为异硫氰酸荧光黄聚乙二醇1000硫醇(FITC-PEG1000-SH)；第一混合液中，带有巯基的信号分子的摩尔浓度为1×10-6-5mmol/L，更优选的为1×10-4-1mmol/L，尤其优选的为3×10-3mmol/L。
优选的是，所述水溶性单巯基分子为N-乙酰半胱氨酸(NAC)；第二混合液中，水溶性单巯基小分子的摩尔浓度为0.1-200mmol/L，更优选的为5-50mmol/L，尤其优选的为20mmol/L。
优选的是，所述水溶性光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)或引发剂2959(I2959)；第一混合液和第二混合液中，水溶性光引发剂的摩尔浓度均为0.01-50mmol/L，更优选均为0.5-10mmol/L，尤其优选均为1mmol/L。
本发明还提供上述可逆可调控双功能水凝胶作为3D细胞培养平台的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的双功能水凝胶采用的大分子单体是ε-聚赖氨酸和透明质酸；ε-聚赖氨酸是天然提取的抗菌肽，具有很好的杀菌能力，热稳定性好且安全无毒，由于其结构中氨基带有大量正电荷，可以参与到细胞活动当中促使细胞粘附生长和分化；透明质酸广泛分布于人体所有组织当中，尤其是在眼玻璃体、关节软骨、真皮和声带中，其在体内发挥维持细胞外空间、调节渗透压、润滑等重要生理功能；ε-聚赖氨酸和透明质酸均具有良好的细胞相容性，能为细胞提提供适宜的生长增殖环境。
2、本发明提供的双功能水凝胶在流变表征下展现出高弹性的性质，同时溶胀表征证明其在两周的浸泡时间内溶胀率较低，因此作为3D细胞培养平台可提供稳定的细胞培养环境。
3、本发明提供的双功能水凝胶采用多组分混合后光照成胶方式形成，十分利于细胞在3D培养过程中的的包埋负载，经实验检测，在水溶性光引发剂浓度为1mmol/L，10mW/cm2光照下5-15s实现溶胶到凝胶转换，有利于细胞在3D细胞培养平台中均匀分散，在水溶性光引发剂浓度为1mmol/L，10mW/cm2光照下达到凝胶平台的时间为2-15min，这有利于细胞在3D凝胶体系中保持活性。
4、本发明提供的双功能水凝胶在水溶性单巯基分子和水溶性光引发剂的溶液中浸泡后进行光照可发生降解，经实验检测，当水溶性单巯基分子浓度为20mmol/L，水溶性光引发剂浓度1mmol/L，10mW/cm2光照下，2min内即实现降解。
5、本发明提供的双功能水凝胶在成胶过程和降解过程中可通过调控光照的剂量，实现凝胶强度的精准调控。
6、本发明提供的双功能水凝胶在含有巯基的信号分子和水溶性光引发剂的溶液中浸泡后，进行光照可实现信号分子的可控接入，将接入信号分子的凝胶在水溶性单巯基小分子和水溶性光引发剂的溶液中再次浸泡一段时间后进行光照可实现信号分子的可控释放。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1中制备的ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的核磁共振氢谱的表征结果。
图2为本发明实施例1中制备的ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚和其原料ε-聚赖氨酸的傅立叶变换红外吸收光谱的表征结果。
图3为本发明实施例3中，频率扫描测试结果的储能模量(G`)和损耗模量(G``)变化曲线。
图4为本发明实施例3中，时间扫描光流变测试结果的储能模量(G`)和损耗模量(G``)变化曲线。
图5为本发明实施例3中，时间扫描光流变测试结果的储能模量(G`)对初始储能模量(G0`)归一化的变化曲线。
图6为本发明实施例3中，水凝胶溶胀性能测试的结果图。
图7为本发明实施例3中，水凝胶力学性能的可调控性测试结果图。
图8为本发明实施例3中，水凝胶荧光图案化表征测试结果。
图9为本发明实施例4中，水凝胶作为3D细胞培养台的活死染色实验。
图10为本发明实施例4中，水凝胶作为3D细胞培养台的细胞增殖定量实验。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施方式对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明的可逆可调控双功能水凝胶，由ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚、巯基修饰的透明质酸和水溶性光引发剂组成。
上述技术方案中，ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的结构式如式Ⅰ所示，式中，n和m均为整数，0＜n≤200，15≤m≤20；
Figure BDA0002923031170000061
Figure BDA0002923031170000071
本实施方式提供一种ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的制备方法，但不限于此，步骤为：
步骤一、在室温下，将含有聚乙二醇单甲醚的四氢呋喃加入到氢氧化钠水溶液中，在惰性气氛保护，0℃下，边搅拌边加入含对甲基苯磺酰氯的四氢呋喃，0℃反应4h以上后，用乙醚萃取四次，得到第一中间体；
其中，聚乙二醇单甲醚：对甲基苯磺酰氯：氢氧化钠的物质的量比为1：(1.01-10)：(1.01-10)；聚乙二醇单甲醚的数均分子量为70-9000Da；氢氧化钠水溶液的浓度优选为2-12.5mol/L；聚乙二醇单甲醚在四氢呋喃中的浓度优选为0.5g/mL；惰性气氛优选为氮气；
步骤二、将第一中间体和硫脲溶于乙醇中，先在惰性气氛保护下80℃加热回流3h，然后加入氢氧化钠水溶液，继续在80℃回流4h，最后冷却到室温，旋蒸除去乙醇，加入稀盐酸中和，用二氯甲烷萃取，得到第二中间体；
其中，第一中间体：硫脲：氢氧化钠的物质的量比为1：(1.01-10)：(1.01-100)；氢氧化钠水溶液的浓度优选为12.5mol/L；第一中间体在乙醇中的浓度优选为0.2g/mL；稀盐酸的浓度为1-3mol/L；惰性气氛优选为氮气；
步骤三、将第二中间体和甲醇钠加入超干甲醇中，在惰性气氛保护下，先搅拌溶解，然后反应20min，得到的反应液滴入含3-氯-2-氯甲基丙烯的超干甲醇中，60℃回流20h，过滤，旋蒸，加水溶解，用二氯甲烷萃取三次，得到第三中间体；
其中，第二中间体：甲醇钠：3-氯-2-氯甲基丙烯的物质的量比1：(1.01-2)：(1.01-2)；含3-氯-2-氯甲基丙烯在超干甲醇中的浓度优选为0.05g/mL；第二中间体在超干甲醇中的浓度优选为0.1g/mL；滴加速度优选为8mL/h；超干甲醇为纯度99.8％以上的甲醇，水含量低于50ppm)；惰性气氛为氮气；
步骤四、将第三中间体、碳酸钾和ε-聚赖氨酸溶于二甲基亚砜中，在惰性气氛保护下，70℃加热回流12h，使用截留分子量为2kDa的透析袋进行透析，每天换水三次，连续透析三天后，用冷冻真空干燥机冻干，得到ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚；
其中，第三中间体：碳酸钾：ε-聚赖氨酸的物质的量比1：(1.01-5)：(1-20)；第三中间体在二甲基亚砜中的浓度优选为0.05g/mL。
上述制备方法中，ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的合成路线为：
Figure BDA0002923031170000081
本实施方式提供一种巯基修饰的透明质酸的制备方法，但不限于此：将3,3`-二硫代丙酸二酰肼和透明质酸溶于水中，加入稀盐酸调节pH至4-6，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应24h后，加入氢氧化钠水溶液调节pH至7.5-10，加入二硫苏糖醇，反应24h后，使用截留分子量为8kDa的透析袋进行透析，每天换水三次，连续透析两天，冻干，得到巯基修饰的透明质酸；
其中，透明质酸：3,3`-二硫代丙酸二酰肼：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：二硫苏糖醇的物质的量比为1:(0.2-1):(0.1-1):(0.5-3)，透明质酸在水中的浓度优选为0.2-2wt％；稀盐酸的浓度优选为1-3mol/L，氢氧化钠水溶液的浓度优选为1-3mol/L。
上述技术方案中，水溶性光引发剂优选为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)或引发剂2959(I2959)。
上述技术方案中，水溶性光引发剂、ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚与巯基修饰的透明质酸的质量比为(0.003-15):(5-300):(5-200)，优选为(0.15-3):(12.5-50):(25-100)，尤其优选为0.3:25:50。
本发明的可逆可调控双功能水凝胶的制备方法：在20-37℃下，将ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚、巯基修饰的透明质酸和水溶性光光引发剂分别溶解在磷酸盐缓冲溶液中，分别得到R1、R2和R3溶液，将R1、R2和R3溶液混合均匀，得到的混合液在0.1-50mW/cm2的340-430nm波长的光照射2-15min后，得到可逆可调控双功能水凝胶；
其中，磷酸盐缓冲溶液的pH＝7.4，0.01M；ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的浓度优选为0.5-30wt％，更优选为1.25-5wt％，尤其优选为2.5wt％；巯基修饰的透明质酸的浓度为0.5-20wt％，更优选为2.5-10wt％，尤其优选为5wt％；水溶性光引发剂摩尔浓度为0.01-50mmol/L，更优选为0.5-10mmol/L，尤其优选为1mmol/L。
本发明的可逆可调控双功能水凝胶能够作为可降解水凝胶的应用，将双功能水凝胶在水溶性单巯基分子和水溶性光引发剂的混合液中浸泡8h以上，取出，得到可降解的水凝胶；
其中，水溶性单巯基分子优选为N-乙酰半胱氨酸(NAC)；混合液中，水溶性单巯基分子的摩尔浓度优选为0.1-200mmol/L，更优选为5-50mmol/L，尤其优选为20mmol/L；
水溶性光引发剂优选为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)或引发剂2959(I2959)；混合液中，水溶性光引发剂的摩尔浓度优选为0.01-50mmol/L，更优选为0.5-10mmol/L，尤其优选为1mmol/L。
本发明的可逆可调控双功能水凝胶能够作为信号分子的结合和释放的培养平台的应用，将双功能水凝胶在带有巯基的信号分子和水溶性光引发剂的第一混合液中浸泡8h以上，取出，用0.1-50mW/cm2的340-430nm波长的光照射2-15min后，实现信号分子的接入；将接入信号分子的凝胶在水溶性单巯基小分子和水溶性光引发剂的第二混合液中浸泡8h以上，取出，用0.1-50mW/cm2的340-430nm波长的光照射2-15min后，实现信号分子的释放；
其中，带有巯基的信号分子为异硫氰酸荧光黄聚乙二醇1000硫醇(FITC-PEG1000-SH)；第一混合液中，带有巯基的信号分子的摩尔浓度为1×10-6-5mmol/L，更优选为1×10-4-1mmol/L，尤其优选为3×10-3mmol/L；
水溶性单巯基分子为N-乙酰半胱氨酸(NAC)；第二混合液中，水溶性单巯基小分子的摩尔浓度优选为0.1-200mmol/L，更优选为5-50mmol/L，尤其优选为20mmol/L；
水溶性光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)或引发剂2959(I2959)；第一混合液和第二混合液中，水溶性光引发剂的摩尔浓度均为0.01-50mmol/L，更优选均为0.5-10mmol/L，尤其优选均为1mmol/L。
本发明的可逆可调控双功能水凝胶能够作为3D细胞培养平台的应用。
在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。本发明的室温为25℃。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的制备方法(n＝7，15≤m≤20)：
步骤一、将氢氧化钠(1.2g，30mmol)溶于纯水(5mL)中，冷却到室温后，加入含数均分子量为350Da的聚乙二醇单甲醚(7g，20mmol)的四氢呋喃(5mL)。在氮气保护，0℃下，边搅拌边加入含对甲基苯磺酰氯(3.8g，20mmol)的四氢呋喃(5mL)，0℃反应4h后，用乙醚萃取四次，每次10mL，得到第一中间体。
步骤二、将第一中间体(2.02g，4mmol)和硫脲(0.32g，4.2mmol)溶于乙醇(10mL)中，先在氮气保护下80℃加热回流3h，然后加入含0.4g氢氧化钠的水溶液(3mL)，继续在80℃回流4h，最后冷却至室温，旋蒸浓缩，加入3mol/L的稀盐酸中和，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，得到第二中间体。
步骤三、将第二中间体(0.772g，2mmol)和甲醇钠(0.119g，2.2mmol)加入超干甲醇(99.8％，水含量低于50ppm)(8mL)中，在氮气保护下搅拌溶解后，反应20min，得到的混合液以8mL/h的速度滴入含3-氯-2-氯甲基丙烯(0.25g，2mmol)的甲醇(5mL)中，60℃回流20h，过滤，旋蒸，加水溶解，用二氯甲烷萃取四次，每次15mL，得到第三中间体。
步骤四、将第三中间体(0.238g，0.5mmol)、碳酸钾(0.076g，0.55mmol)和ε-聚赖氨酸(0.22g)溶于二甲基亚砜(8mL)中，在氮气保护下，70℃加热回流12h。使用截留分子量为2kDa的透析袋进行透析，每天换水三次，连续透析三天后，冻干，得到ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚。
对实施例1制备的ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚进行核磁共振氢谱表征和傅立叶变换红外吸收光谱表征，结果分别如图1和图2所示。图1和图2可以证明ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚成功合成。
将实施例1中数均分子量为350Da(n＝7)的聚乙二醇单甲醚替换为其它分子量的聚乙二醇单甲醚，便可以制备得到，0＜n≤200，(n为整数)内的其它的ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚，这里不再一一举例，m的数值由ε-聚赖氨酸，ε-聚赖氨酸是一种天然聚合物，聚合度分布为15-20，不是固定值。
实施例2
巯基修饰的透明质酸的制备方法：
将3,3`-二硫代丙酸二酰肼(0.106g，0.45mmol)和透明质酸(0.2g)溶于20mL水中，加入浓度为3mol/L稀盐酸调节pH为4.5，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.03g，0.15mmol)，室温反应24h后，加入浓度为3mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至8.5，加入二硫苏糖醇(0.346g，2.25mmol)，反应24h后，使用截留分子量为8kDa的透析袋进行透析，每天换水三次，连续透析两天，冻干，得到巯基修饰的透明质酸。
实施例3
可逆可调控双功能水凝胶的制备方法：
在37℃下将实施例1制备的ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚25mg，实施例2制备的巯基修饰的透明质酸50mg分别溶于400μLPBS缓冲液(pH＝7.4，0.01M)，将1mg LAP溶于200μL PBS缓冲液(pH＝7.4,0.01M)，将三组分混合摇匀，获得凝胶前驱体，将凝胶前驱体在10mW/cm2的365nm紫外光照至形成凝胶(2-15min)，即得到可逆可调控双功能水凝胶。
对实施例3制备的可逆可调控双功能水凝胶进行震荡模式下的频率扫描流变测试。测试方法如下：取实施例3制备的可逆可调控双功能水凝胶，置于流变仪上，使用直径25mm的平板转子，选定测试厚度1mm，在37℃下以1％的应变进行0.1-100Hz的频率扫描。图3为实施例3中可逆可调控双功能水凝胶的频率扫描测试结果的储能模量(G`)和损耗模量(G``)变化曲线。从图3可以看出，本发明的水凝胶呈现出高弹性和高稳定性。
将实施例3中的凝胶前驱体进行震荡模式下的时间扫描的光流变测试。测试方法如下：取实施例3中的凝胶前驱体置于流变仪上，使用直径25mm的平板转子，选定测试厚度1mm，在37℃下以1％的应变和1Hz的频率进行时间扫描，20s后用10mW/cm2的365nm紫外光照得到水凝胶。图4为实施例3中凝胶前驱体的时间扫描光流变测试结果的储能模量(G`)和损耗模量(G``)变化曲线。从图4可以看出，本发明的水凝胶在10min以内达到凝胶平衡，最终凝胶强度4800Pa。
对实施例3制备的可逆可调控双功能水凝胶在20mmol/L的水溶性单巯基分子NAC和1mmol/L水溶性光引发剂LAP的混合液中浸泡12h后进行震荡模式下的时间扫描的光流变测试。测试方法如下：取实施例3中的凝胶前驱体，置于流变仪上，使用直径25mm的平板转子，选定测试厚度1mm，在37℃下以1％的应变和1Hz的频率进行时间扫描，20s后用10mW/cm2的365nm紫外光照得到凝胶。图5为实施例3中凝胶前驱体的时间扫描光流变测试结果的储能模量(G`)对初始储能模量(G0`)归一化的变化曲线。从图5可以看出，可以看出凝胶降解较快能在2min内实现降解。
对实施例3制备的可逆可调控双功能水凝胶进行溶胀性能测试。测试方法如下：取三块实施例3制备的可逆可调控双功能水凝胶，分别称重后，置于37℃PBS缓冲溶液(pH＝7.4,0.01M)中，每两天取出擦干称重。测量浸泡14天内的溶胀情况。测试结果如图6所示。从图6可以看出，本发明的溶胀率较低，在第14天溶胀率不到10％。
对实施例3制备的可逆可调控双功能水凝胶的力学性能的可调控性进行震荡模式下时间扫描的光流变测试。测试方法如下：取实施例3中凝胶前驱体置于流变仪上，使用直径25mm的平板转子，选定测试厚度1mm，在37℃下以1％的应变和1Hz的频率进行时间扫描，20s后用10mW/cm2的365nm紫外光照进行光流变表征，光照40s后停止光照，无光条件下测试80s后再次打开光源继续光照，重复上述开关灯操作直到水凝胶达到凝胶平台，随后将水凝胶取下，浸泡在含1mmol/L的LAP和20mmol/L的NAC的PBS缓冲溶液(pH＝7.4,0.01M)中12h，取出，擦干，继续进行重复上述开关灯操作的光流变表征到水凝胶完全降解。测试结果如图7所示。从图7可以看出，在凝胶增强过程中凝胶强度可由延长光照时间增加，在经过12h浸泡后凝胶强度可由光照延长光照时间减弱。
对实施例3制备的可逆可调控双功能水凝胶进行信号分子的结合和释放的表征。测试方法如下：取实施例3制备的可逆可调控双功能水凝胶置于含300μmol/L的LAP和300μmol/L的FITC-PEG1000-SH的PBS缓冲溶液(pH＝7.4,0.01M)中12h，取出，擦干，置于100μm宽条纹图案的光掩模板下，用10mW/cm2的365nm紫外光照3min，得到的水凝胶置于磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4,0.01M)中浸泡4h重复三次后，用激光共聚焦显微镜进行表征。将表征后的水凝胶置于含300μmol/L的LAP和300μmol/L的NAC的PBS缓冲溶液(pH＝7.4,0.01M)中再次浸泡12h，取出，擦干，置于旋转九十度的光掩模板下，用10mW/cm2的365nm紫外光照3min，得到的水凝胶再次置于磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4,0.01M)中浸泡4h重复三次后，用激光共聚焦显微镜进行表征。测试结果图8所示，A可以看出荧光分子成功接入，B可以看出光照下凝光分子实现了释放。因此可以证明本发明的水凝胶可以实现信号分子接入的可逆调控。
实施例4
可逆可调控双功能水凝胶作为3D细胞培养台的应用：
取100μL浓度为500w/mL的NIH 3T3细胞液加入实施例3的凝胶前驱体中，混匀，得到含细胞的前驱体，将含细胞的前驱体每孔50μL加入96孔板，用10mW/cm2的365nm紫外光照3min，得到水凝胶，向水凝胶上加入200μL完全DMEM，置于培养箱培养，每两天更换一次培养基；
在培养1，7，14天后分别将培养基移除，向其中加入染色液100μL(含钙黄绿素AM2μM和碘化吡啶4μM)，培养30min后移除染色液并用杜氏磷酸盐缓冲液清洗三次，随后在激光共聚焦显微镜下观察细胞活死状态。测试结果如图9所示。从图9可以看出，本发明的水凝胶作为3D细胞培养平台在培养期间NIH 3T3细胞能实现较好的存活；
在培养1，7，14天后分别将培养基移除，向其中加入培养基100μL和10μL细胞计数试剂(CCK-8)，将孔板放入培养箱培养4h，后用酶标仪定量检测。结果如图10所示。测试从图10可以看出，在培养7天时NIH 3T3细胞相较于第一天增殖了45％，在培养14天时NIH 3T3细胞相较于第一天增殖了83％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.可逆可调控双功能水凝胶，其特征在于，由质量比为(0.003-15):(5-300):(5-200)的水溶性光引发剂、ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚和巯基修饰的透明质酸为反应原料制备得到；
所述ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的结构式如式Ⅰ所示，式中，n和m均为整数，0＜n≤200，15≤m≤20。
Figure FDA0003449086220000011
2.根据权利要求1所述的可逆可调控双功能水凝胶，其特征在于，所述ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、在室温下，将含有聚乙二醇单甲醚的四氢呋喃加入到氢氧化钠水溶液中，在惰性气氛保护，0℃下，边搅拌边加入含对甲基苯磺酰氯的四氢呋喃，0℃反应4h以上后，用乙醚萃取，得到第一中间体；
所述聚乙二醇单甲醚：对甲基苯磺酰氯：氢氧化钠的物质的量比为1：(1.01-10)：(1.01-10)；
步骤二、将第一中间体和硫脲溶于乙醇中，先在惰性气氛保护下80℃加热回流3h，然后加入氢氧化钠水溶液，继续在80℃回流4h，最后冷却到室温，旋蒸除去乙醇，加入稀盐酸中和，用二氯甲烷萃取，得到第二中间体；
所述第一中间体：硫脲：氢氧化钠的物质的量比为1：(1.01-10)：(1.01-100)；
步骤三、将第二中间体和甲醇钠加入超干甲醇中，在惰性气氛保护下，先搅拌溶解，然后反应20min，得到的反应液滴入含3-氯-2-氯甲基丙烯的超干甲醇中，60℃回流20h，过滤，旋蒸，加水溶解，用二氯甲烷萃取，得到第三中间体；
所述第二中间体：甲醇钠：3-氯-2-氯甲基丙烯的物质的量比1：(1.01-2)：(1.01-2)；
步骤四、将第三中间体、碳酸钾和ε-聚赖氨酸溶于二甲基亚砜中，在惰性气氛保护下，70℃加热回流12h，使用截留分子量为2kDa的透析袋进行透析，每天换水三次，连续透析三天后，冻干，得到ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚；
所述第三中间体：碳酸钾：ε-聚赖氨酸的物质的量比1：(1.01-5)：(1-20)。
3.根据权利要求1所述的可逆可调控双功能水凝胶，其特征在于，所述巯基修饰的透明质酸的制备方法为：将3,3`-二硫代丙酸二酰肼和透明质酸溶于水中，加入稀盐酸调节pH至4-6，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应24h后，加入氢氧化钠水溶液调节pH至7.5-10，加入二硫苏糖醇，反应24h后，使用截留分子量为8kDa的透析袋进行透析，每天换水三次，连续透析两天，冻干，得到巯基修饰的透明质酸；
所述透明质酸：3,3`-二硫代丙酸二酰肼：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：二硫苏糖醇的物质的量比为1:(0.2-1):(0.1-1):(0.5-3)。
4.根据权利要求1所述的可逆可调控双功能水凝胶，其特征在于，所述水溶性光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐或引发剂2959。
5.权利要求1-4任何一项所述的可逆可调控双功能水凝胶的制备方法，其特征在于，在20-37℃下，将ε-聚赖氨酸烯丙基甲氧基聚乙二醇硫醚、巯基修饰的透明质酸和水溶性光光引发剂分别溶解在磷酸盐缓冲溶液中，分别得到R1、R2和R3溶液，将R1、R2和R3溶液混合均匀，得到的混合液在0.1-50mW/cm2的340-430nm波长的光照射2-15min后，得到可逆可调控双功能水凝胶。
6.权利要求1-4任何一项所述的可逆可调控双功能水凝胶作为可降解水凝胶的应用，其特征在于，将双功能水凝胶在水溶性单巯基分子和水溶性光引发剂的混合液中浸泡8h以上，取出，得到可降解的水凝胶。
7.根据权利要求6所述的可逆可调控双功能水凝胶作为可降解水凝胶的应用，其特征在于，
所述水溶性单巯基分子为N-乙酰半胱氨酸，混合液中，水溶性单巯基分子的摩尔浓度为0.1-200mmol/L；
所述水溶性光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐或引发剂2959，混合液中，水溶性光引发剂的摩尔浓度为0.01-50mmol/L。
8.权利要求1-4任何一项所述的可逆可调控双功能水凝胶作为信号分子的结合和释放的培养平台的应用，其特征在于，将双功能水凝胶在带有巯基的信号分子和水溶性光引发剂的第一混合液中浸泡8h以上，取出，用0.1-50mW/cm2的340-430nm波长的光照射2-15min后，实现信号分子的接入；将接入信号分子的凝胶在水溶性单巯基小分子和水溶性光引发剂的第二混合液中浸泡8h以上，取出，用0.1-50mW/cm2的340-430nm波长的光照射2-15min后，实现信号分子的释放。
9.根据权利要求8所述的可逆可调控双功能水凝胶作为信号分子的结合和释放的培养平台的应用，其特征在于，
所述带有巯基的信号分子为异硫氰酸荧光黄聚乙二醇1000硫醇，第一混合液中，带有巯基的信号分子的摩尔浓度为1×10-6-5mmol/L；
所述水溶性单巯基分子为N-乙酰半胱氨酸，第二混合液中，水溶性单巯基小分子的摩尔浓度为0.1-200mmol/L；
所述水溶性光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐或引发剂2959，第一混合液和第二混合液中，水溶性光引发剂的摩尔浓度均为0.01-50mmol/L。
10.权利要求1-4任何一项所述的可逆可调控双功能水凝胶作为3D细胞培养平台的应用。
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