WO2007061058A1

WO2007061058A1 - 刺激応答性分解ゲル

Info

Publication number: WO2007061058A1
Application number: PCT/JP2006/323458
Authority: WO
Inventors: Mitsuru Akashi; Yoshiki Sawa; Michiya Matsusaki
Original assignee: Osaka University
Priority date: 2005-11-24
Filing date: 2006-11-24
Publication date: 2007-05-31
Also published as: JPWO2007061058A1; EP1970400B1; US8263405B2; JP5219030B2; EP1970400A1; US20090117656A1; EP1970400A4

Abstract

　三次元細胞培養用足場材料の分解を自在に制御でき、細胞と細胞が産出した細胞外マトリックスのみから形成される完全に生体由来の三次元細胞組織体を構築でき、またその構築された細胞組織体を安全に回収することを可能とする、新規な還元刺激応答性分解ゲルを提供すること。　水溶性ポリマーを、分子鎖中にジスルフィド結合を有する化合物で架橋してなる刺激応答性ハイドロゲル。

Description

明細書

刺激応答性分解ゲル

技術分野

[0001] 本発明は、ハイド口ゲルに関する。より詳しくは、還元刺激応答性分解ゲルに関する。

背景技術

[0002] 現在の外科医療では移植医療や再建外科医療が中心であるが、慢性的なドナー不足という社会的問題を抱えており、また患者への負担が大きぐ再手術を余儀なくされるため、第三の医療として再生医療が注目され、その実現が求められている。

[0003] 皮膚や骨、軟骨などその構造が比較的単純な組織では、患者の組織幹細胞と生分解性の足場材料を組み合わせた培養法が有効であり、一部は臨床試験の段階まで進んでいる。しかし、肝臓や腎臓、脾臓など多種類の細胞と細胞外マトリックスから構築され、血管による栄養供給が必要とされる複雑な生体組織に関しては、未だ基礎研究の段階である。複雑な生体組織に関する研究が難航している理由の一つとして、細胞の三次元組織ィ匕の問題があげられる。

[0004] 細胞の組織化は、再生医療分野において活発に研究されている領域の一つである。組織ィ匕に関する研究は、感熱応答性高分子グラフト培養皿を用いた二次元細胞シートに関する研究と、多種類の細胞の積層化に関する研究に大別することができる。国内では東京女子医大の岡野らのグループ力感熱応答高分子のマイクロパターン化グラフト表面を用いた血管内皮細胞と肝実質細胞の共培養を研究しており、二次元の共培養細胞シートが調製できることを報告している (非特許文献 1、非特許文献 2、非特許文献 3)。国外では、ボストン大学の Desaiらのグループ力PDMSスタンプを用いたパターニング表面上に三種類の細胞を積層させた三次元的な細胞の組織化を報告してヽる (非特許文献 4)。

[0005] し力しながら、細胞シート法では三次元の組織ィ匕は達成できず、また Desaiらのような細胞のみの積層化の場合、細胞が移動することで結果的にランダムに混在化し、組織ィ匕を制御するまでには至っていない。また、近年、回転培養器を用いた細胞の 3 次元培養が行われている力細胞増殖による細胞密度の上昇に伴い栄養供給が困難となり、内部細胞が死滅することが問題とされている。このように、細胞の三次元組織ィ匕に関する研究は未だ基礎研究レベルを脱却しきれて、な、のみならず、三次元組織ィ匕に必要とされる基礎的な知見すら得られていない状況にあり、早急な解決案が求められている。

[0006] 一方、ポリ乳酸やコラーゲンのノ、イド口ゲル (足場材料)を用いた三次元培養'組織化に関する研究が十年来に渡り国内外で盛んに研究されている。これらのハイドロゲルは細胞接着性を有しているが、細胞培養後期には細胞が過密化し、またノ、イド口ゲルのミリからミクロンレベルの緻密な網目構造が内部への栄養供給を阻害するため内部細胞が死滅することが問題とされている。さらに、ポリ乳酸ハイド口ゲルは生体内に埋植後も 1年以上分解されずに残存し、炎症や腫瘍形成の原因となることが報告されている。これらの問題を解決するためには、足場材料の分解性を制御する必要がある。

[0007] し力しながら、これまで、三次元細胞培養用足場材料の分解を自在に制御し、細胞組織体の構築と安全な回収を行った研究は報告例がない。

非特許文献 1 :Y. Tsuda et al, J. Biomed. Mater. Res. 69A, 70—78 (2004) 非特許文献 2 : Y. Tsuda et al., Biomaterials 26, 1885-93 (2005)

非特許文献 3 : A. Maya et al., Biomaterials 23, 1121-1130 (2002)

非特許文献 4 : W. Tan. et al., Biomaterials 25, 1355 (2004)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、三次元細胞培養用足場材料の分解を自在に制御でき、細胞と細胞が産出した細胞外マトリックスのみ力も形成される完全に生体由来の三次元細胞組織体を構築でき、またその構築された細胞組織体を安全に回収することを可能とする、新規な還元刺激応答性分解ゲルを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0009] すなわち、本発明は水溶性ポリマーを、分子鎖中にジスルフイド結合を有する化合物で架橋してなる刺激応答性ハイド口ゲルを提供するものである。

発明の効果

[0010] 本発明は刺激応答性を有する新規なノ、イド口ゲルを提供した。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]ポリ（ γ—グルタミン酸）一シスタミンハイド口ゲルの FT— IR ^ベクトルスペクトル

[図 2]ポリ（ γ—グルタミン酸）一シスタミンノヽイド口ゲルおよび該ゲルの分解物の FT— IRスぺク卜ノレスぺク卜ノレ。

[図 3]ポリ（γ グルタミン酸）一シスタミンノヽイド口ゲルおよび該ゲルの分解物の¹ Η— NMRスペクトルスペクトル。

[図 4]アルギン酸シスタミンハイド口ゲル凍結乾燥体の走査型電子顕微鏡写真。

[図 5] ε -ポリリシンジチォビスプロピオン酸ゲルの凍結乾燥体の走査型電子顕微鏡写真。

[図 6]ポリ（ γ グルタミン酸）シスタミンノ、イド口ゲル凍結乾燥体の走査型電子顕微鏡写真 (細胞培養前)。

[図 7]ポリ（ γ グルタミン酸）シスタミンハイド口ゲルの走査型電子顕微鏡写真 (細胞培養後)。

[図 8]細胞培養で得られた 3次元細胞組織体の走査型電子顕微鏡写真。

[図 9]蛍光ラベルイ匕ポリ（ γ—グルタミン酸）一シスタミンノ、イド口ゲルの蛍光顕微鏡写真 (細胞培養前)。

[図 10]蛍光ラベルイ匕ポリ（ γ グルタミン酸）シスタミンノ、イド口ゲルの蛍光顕微鏡写真 (細胞培養後)。

[図 11]蛍光ラベルイ匕ポリ（ Ί グルタミン酸）シスタミンノ、イド口ゲルの蛍光顕微鏡写真 (細胞播種無しで培養後)。

[図 12]蛍光ラベルイ匕ポリ（ γ—グルタミン酸）一シスタミンノ、イド口ゲルを分解し 1回洗浄後の細胞組織体の蛍光顕微鏡写真。

[図 13]蛍光ラベルイ匕ポリ（ γ—グルタミン酸）一シスタミンノ、イド口ゲルを分解し 5回洗浄後の細胞組織体の蛍光顕微鏡写真。 [図 14]蛍光ラベルイ匕ポリ（ γ—グルタミン酸）一シスタミンノ、イド口ゲルを分解し 5回洗浄後の細胞組織体の位相差顕微鏡写真。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明に使用できる水溶性ポリマーとしては、ポリアミノ酸、糖、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ビュル系ポリマー、およびその共重合体等の水溶性ポリマーである。「水溶性」が必要なのは、分解後に培地に溶解除去させるためである。水溶性である限り、分子量は特に限定されないが、分子量が低すぎると、細胞接着性と操作性に優れたハイド口ゲルを調製できな、ため、好ましくな、。

[0013] 水溶性ポリアミノ酸の具体例としては、ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—グルタミン酸）、ポリ（ァスパラギン酸）、ポリ（リシン）、ポリ（アルギニン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（セリン）、ポリ（トレオニン）、ポリ（チロシン）、およびその共重合体等、側鎖および末端に一 ΝΗ 、一 ΟΗ、一 COOH等の反応性官能基を有するものが挙げられる。

2

[0014] 糖の具体例としては、グルコース、セルロース、アルギン酸、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、へパリン、およびその共重合体等、側鎖および末端に CH OH、 -COOH, NH等の反応性官能基を有するものが挙げら

2 2

れる。

[0015] 水溶性ポリエステルとしては、ポリリンゴ酸、低分子量ポリ乳酸、低分子量ポリグリコール酸、低分子量ポリ ε—力プロラタトン、ポリ βーヒドロキシ酪酸等、側鎖および末端に ΝΗ 、一 ΟΗ、一 COOH等の反応性官能基を有するものが挙げられる。

2

[0016] 水溶性ポリアミドとしては、ポリマンナラアミド、ポリガラクタラミド等、側鎖および末端に NH 、一 OH、一 COOH等の反応性官能基を有するものが挙げられる。

2

[0017] 水溶性ポリエーテルとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等、末端に NH 、—OH、一 COOH等の反応性官能基を有するものが挙げられる。

2

[0018] 水溶性ビュル系ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリビニルァミン、ポリメタクリル酸、ポリアリルアミン等、側鎖に NH 、一 OH、一 COOH等の反応性官能基を有する

2

ものが挙げられる。

[0019] 上記水溶性ポリマーとしては、分解後の無毒性等の細胞に対する安全性の観点から、ポリアミノ酸、糖、ポリリンゴ酸等自然由来の水溶性ポリマーが好ましい。特に有機溶媒を使用せずに容易にハイド口ゲルを調製できる観点から、ポリアミノ酸、糖が選ばれ、ポリアミノ酸の中では、菌類力大量に回収することができる観点力ポリ（ ε —リシン)が選ばれ、菌類力も大量に回収でき、かつ高分子量体であるため材料ィ匕に有利である観点からポリ（γ—グルタミン酸）が選ばれる。糖の中では、ェビゃ力-などの甲羅に含まれて、るキチンをィ匕学的処理をすることで大量に回収できる観点からキトサンが選ばれ、海草に大量に含まれて、るため大量に回収できる観点力アルギン酸が選ばれる。

[0020] 本発明で使用する「分子鎖中にジスルフイド結合を有する化合物」（以下、単に「架橋剤」という）としては、シスタミン、シスチン、 2 ヒドロキシェチルジスルフイド、 3, 3，ージチォジプロピオン酸（DTDP)、グルタチオンジスルフイド、 3, 3，一ジチォプロピォヒドラジド、およびその誘導体等が挙げられる。それらの架橋剤は、末端反応性官能基、天然由来の観点から選択すればよぐ例えば、末端に ΝΗ

2を有し、その物および分解物も天然由来物であるという観点から、シスタミンが好ましく使用される。

[0021] 水溶性ポリマーを、架橋剤で架橋するには、水溶性ポリマーの有する反応性官能基と、架橋剤の有する反応性官能基とを反応させることにより行う。例えば、ポリ（γ— グルタミン酸)のシスタミンによる架橋は、下記反応により水溶液中でポリ（γ グルタミン酸)側鎖の COOH基と、シスタミンの末端 ΝΗとを縮合させ、アミド結合を形

2

成することにより行う。架橋の結果、ハイド口ゲルが得られる。

[0022] [化 1]

NH-CH-CH CH C

COOH

シスタミン， WSC

ポリ γ-グルタミン酸 ►

(γ-PGA)

r.t.， 4h

γ-PGA-シスタミンハイド口ゲル

[0023] 上記反応の際には、縮合剤、例えば 1 ェチル 3— [3 （ジメチルァミノ)プロピル] カルボジイミド（水溶性カルボジイミド: WSC)、 N, N，—ジシクロへキシルカルボジィミド (DCC)等をシスタミンに対して等モル〜 10倍モル程度使用してもよい。

[0024] 反応温度は、水溶性カルポジイミドの副生成物を抑制する観点から、 4〜25°C、好ましくは 4°C、反応圧力は常圧下でおこなうようにすればよい。

[0025] 反応条件の中で重要な条件は、水溶性ポリマーの濃度、官能基のモル比である。

理由は、細胞接着性と操作性に適したハイド口ゲルを調製する必要があるためである。例えば、上記化 1の架橋反応を行う場合は、ポリ（γ グルタミン酸)の濃度は 4〜9 重量％、好ましくは 5〜7重量％となるようにする。その濃度が高すぎると強固なハイド口ゲルとなり操作性に乏しぐ低すぎると形状を保つハイド口ゲルが調製できないという問題がある。

[0026] 官能基のモル比は、架橋剤の有する官能基の当量が、水溶性ポリマーの有する官能基半当量以上となるような割合を採用するようにする。そのモル比が小さすぎると、形状を保つハイド口ゲルが調製できな、という問題がある。

[0027] 反応の終了は、反応容器を傾け、溶媒である水が流れないことを目安にして行うようにすればよい。

[0028] 反応生成物は水で洗浄し、水中にそのまま保存してよいし、凍結乾燥等の手段で乾燥してもよい。好ましくは水中に保存しておく。

[0029] 本発明のハイド口ゲルといえるためには、酸性 ρΗや還元剤に応答して分解する特性を有する必要がある。

[0030] 以上のようにして得られるハイド口ゲルは、還元刺激応答性を有している。「還元刺激応答性」とは、「還元雰囲気下もしくは還元剤に応答して分解し、かつ分解を制御できる」ということを意味している。本発明のハイド口ゲルは、還元剤の存在有無、濃度等により、分解速度を数分〜日単位で制御可能である。還元剤により架橋剤中に存在する S— S 結合が切断され、チオール基に分解される。

[0031] 還元剤としては、ジチオスレィトール（DTT)、グルタチオン（GSH)、ジヒドロリポ酸（ DHLA)、 j8—メルカプトエタノール、 j8—メルカプトェチルァミン、ジチォエリスリトール、システィン (Cys)等が使用できる。ダルタチオン（GSH)、ジヒドロリポ酸（DHLA) 、システィン (Cys)など生体内に存在する還元物質を用いることで、ノ、イド口ゲル内で増殖した細胞にダメージを与えることなくハイド口ゲルのみを分解させることが可能となる。細胞への安全性の観点からは、 GSH、 DHLA, Cysを使用することが好ましい

[0032] 分解の速度は、ハイド口ゲルの種類、還元剤の種類、その濃度、分解温度、圧力等に適宜調節可能である。例えば、下記実施例で示しているように、ポリ（γ ダルタミン酸）—シスタミンノ、イド口ゲルは、数分から日単位でその分解性を制御可能である。

[0033] 本発明の刺激応答性ポリ ( γ—グルタミン酸）—シスタミンハイド口ゲルは、細胞培養培地として適しており、ヒト細胞を含む種々の細胞が十分に増殖した後、分解除去することができ、細胞と細胞が産生したコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分のみ力構成された完全に生体由来の三次元の細胞組織体を回収することができる。また、ハイド口ゲルの形状を変えることで目的に応じたサイズ'形状の細胞組織体を得ることができる。還元反応による分解物はポリペプチドであるため細胞毒性がなぐ生体吸収性であり極めて安全である。なお、細胞培養培地には、通常使用される細胞増殖に必要な成分、例えば、ゥシ胎仔血清等を含有させることはいうまでもない。

[0034] 上記にお!、ては、主にポリ（ γ グルタミン酸）シスタミンハイド口ゲルを例に挙げ説明したが、上記記載および下記実施例を参考にすれば、当業者であればさほど困難を伴わずに、他のハイド口ゲルも同様に形成することができ、その分解性も制御できることを見、だせるはずである。

[0035] 他の応用としては、薬物および遺伝子徐放担体、骨再生材料、歯科材料、隔離膜材料、生体内での組織'臓器誘導のための足場材料等がある。

実施例

[0036] 調製例 1〜5

くポリ（ γ—グルタミン酸）—シスタミンハイド口ゲルの調製 >

[化 2] NH-

ポ

γ-PGA-シスタミンハイド口ゲル

[0037] 645mg (5 unit mmol)のポリ（ γ—グルタミン酸）（ γ—PGA)を 10mLの 0. 5M 炭酸水素ナトリウム水溶液に下記表 1に示した濃度 (wt%)で溶解し、 776mg (5mm ol)の水溶性カルポジイミド (WSC：縮合剤）を加えて 4°Cで 15分間攪拌した。架橋剤として 563mg (2. 5mmol)のシスタミンを添カロして数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ 1mmのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で 3時間反応させた。反応終了後、得られたノヽイド口ゲルを超純水で 4時間洗浄し、直径 lcmのディスク状に打ち抜き、それぞれの評価を行った。評価は、後述する。

[0038] [表 1]

1)膨潤比 = (Ws-Wd)/Wd、 Ws :膨潤ハイドロゲルの重量、 Wd :乾燥ハイド口ゲルの重量

2)ゲル化スピードが速同じ条件でゲル化させることができなかった。

3)「一」は形を保つハイド口ゲルが得られなかったことを意味する。

[0039] 上記調製例 3で得られたハイド口ゲルの FT— IR (フーリエ変換赤外吸収)スぺタトルを図 1に示す。

ポリ（ γ —グルタミン酸）のカルボキシル基のカルボ-ルに起因するピーク（vC=0) がシスタミンとの架橋後に小さくなつており、さらにアミド IIのピークの形状が変化していることから、ポリ（γ —グルタミン酸）のカルボキシル基がアミド基へ変化した、つまり、ポリ（γ —グルタミン酸）がシスタミンで架橋されていることがわかる。

[0040] 調製例 6〜9

シスタミンの濃度を 1126mg (5. Ommol)とし、 γ—PGAを表 1に示した濃度で溶解した以外、調製例 1と同様に行い、ディスク状のノ、イド口ゲルを作製し、同様に評価

〕0041 。 u 645mg (5 unit mmol)の γ—PGAを lOmLの 0. 5M炭酸水素ナトリウム水溶液に下記表 2に示した濃度 (wt%)で溶解し、 776mg (5mmol)の水溶性カルポジイミド (WSC :縮合剤）を加えて 4°Cで 15分間攪拌した。架橋剤として 923mg (2. 5mmo 1)のシスタミンを添加して数分間攪拌した後、厚さ lmmのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で 3時間反応させた。反応終了後、超純水で 4時間洗浄し、直径 lcmのディスク状に打ち抜き、それぞれの評価を行った。

[0042] [表 2]

1 )膨潤比= (\¾-\^ <1、 Ws :膨潤ハイド口ゲルの重量、 Wd :乾燥ハイド口ゲルの重量

2)「一」は形を保つハイド口ゲルが得られなかったことを意味する。

[0043] <ハイド口ゲルの分解試験 >

下記に、ポリ（ γ—グルタミン酸）一シスタミンノヽイド口ゲルの分解機構を示しておく。

[化 4]

H Η—.—-.自"

調製例 2、 3、 4、 12、 13で得られたそれぞれのゲルと凍結乾燥後のゲルを 50mL の超純水 (milliQ水、ミリポア社製）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)、細胞培養培地 ( 10%のゥシ胎児血清を含む）（イーグル MEM (EMEM)：日水製薬株式会社製）に浸漬し、分解までに必要な時間を測定した。分解に要した時間は、目視観察によりゲルが確認できなくなるまでに要した時間とした。

[0045] なお、上記分解試験は架橋密度が大きく影響する実験であるため、膨潤度が同程度であるサンプル (調製例 7、 8、 9、 11、 14)および適当なゲルを形成しなかったサンプル (調製例 1、 5、 6、 10)は本実験に用いな力つた。

[0046] また、還元剤として 25mMのジチオスレィトール（DTT)または 1. OmMのグルタチオン (GSH)を含む、超純水、 PBS、細胞培養培地にゲルを浸漬し、分解までに必要な時間を評価した。分解によるゲルの重量変化は、所定時間後にゲルを溶液力ゝら取り出し、キムワイプ (株式会社クレシァ製)で余分な水分を除去した後に計測することで確認した。結果を下記表 3に示す。

[0047] 図 2に、調製例 3で得られたポリ（ γ—グルタミン酸）一シスタミンノヽイド口ゲル FT— I Rスペクトル (上段）および該ゲルを DTTにより上記の方法で分解した分解物の FT —IRスペクトル（下段）に示した。図 3に、調製例 3で得られたポリ（ γ グルタミン酸）シスタミンハイド口ゲルの¹ H— NMRスペクトル（上段）、および該ゲルを DTTにより上記の方法で分解した分解物の¹ H— NMRスペクトル（下段）を示した。

[0048] 図 2の FT— IRにおいて、ポリ（ γ—グルタミン酸）一シスタミンハイド口ゲルでは検出されなかったチオール基のピーク力分解物では 2500cm^{_ 1}付近に検出された。ジスルフイド結合は IR ^ベクトルにお、て検出されな、ことが知られて、る。この結果よオール基に分解されたことがわかる。

[0049] 図 3の¹ H— NMRにおいて、ポリ（ γ—グルタミン酸）一シスタミンハイド口ゲル分解物では 2. 8ppmにチオール基に起因するピークが検出された。この結果より、ポリ（に分解されたことがわかる。

[0050] [表 3] M7\

架橋 M 状態漉度 rniiHQ PBS E E DTT(25m ) GHS d mM) milliQ PBS EMEM miliiQ PBS EMEM

5wt% 50h 23h 0.75 O.SOh 0.50h a.oh 4.5h 邇潤ゲル 6wt% - 一 80h 4.0h 1.5h 1.5h ― 45h 20h

7wt% - - 14h 14h 3.5h ―

シスタミン

5wt% ― - 5,5曰 5h 0.75h 3. Oh 36h 20h 乾燥ゲル 6wt% ― 15h 2.5h 3. Oh 15h 48h 28h

7wt% ― _ 7.0曰 14h 3.5h 3.0h - 73h 20h

6wt% 18h 3,0h 4.5h ― ― 湿潤ゲル

シスチン 7wt% ： 18h 17h

乾燥ゲ 6wt% ― 4.5h 4,0h 12h 一

1} ハイド口ゲル調製時の r— PGAの濃度

2) Γ一 jは一週間後でも分解しなかったことを意味している。

[0051] 表 3に示されているように、本発明のハイド口ゲルは、 DTTまたは GSH等の還元剤の存在有無、濃度等により、分解速度を数分〜日単位で制御可能である。 DTTまたは GSH等の還元剤を存在させた場合、分解速度がはやい。 EMEM培地中には GS Hが極微量存在するので、分解が緩やかに起こっている。超純水（ミリ Q (milliQ)水）中では全く分解が起こって！/ヽなヽ。

[0052] <アルギン酸シスタミンハイド口ゲルの調製 >

[化 5]

452mg (l unit mmol)のアルギン酸（Alg)を 8. 59mLの 0. 5M炭酸水素ナトリウム水溶液に 5wt%の濃度で溶解し、 310mg (2mmol)の水溶性カルボジイミド (WS C：縮合剤）を加えて室温で 15分間攪拌した。架橋剤として 225mg (lmmol)のシスタミンを添加して数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ 2mmのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で 24時間反応させた。反応終了後、得られたハイドロゲルを超純水で 48時間洗浄し、直径 lcmのディスク状に打ち抜、た。

[0053] 得られたアルギン酸シスタミンノ、イド口ゲルの凍結乾燥体の走査型電子顕微鏡写真を図 4に示す。

[0054] 上記調製法で得られたゲルと凍結乾燥後のゲルを還元剤として 25mMのジチォスレイトール (DTT)を含む 50mLの超純水に浸漬し、分解の過程を観察した。分解に要した時間は 60分であった。分解に要した時間は、目視観察によりゲルが確認できなくなるまでに要した時間とした。

[0055] <キトサンジチォビスプロピオン酸ゲルの調製 >

[化 6]

_CT—ジチォビスプロピオン酸ゲル

[0056] 95mg (0. 5 unit mmol)のキトサンを 61mg (0. 4mmol)の 1—ヒドロキシ 1H—ベンゾトリアゾール（HOBt) (キトサン溶解のために必要）を含む 9. 4mLの超純水に 0 . 5wt%の濃度で溶解した。 210mg (lmmol)のジチォビスプロピオン酸（DTDP)と 310mg (2mmol)の WSCを含む 6. 3mLの 0. 5M炭酸水素ナトリウム水溶液とキトサン水溶液を混合して数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ 2mmのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で 24時間反応させた。得られたノヽイド口ゲルを超純水で 48時間洗浄し、直径 lcmのディスク状に打ち抜、た。

[0057] < ε -ポリリシンジチォビスプロピオン酸ゲルの調製 >

[化 7]

ε—PL—ジチォビスプロピオン酸ゲルの調製

[0058] 164mg (l unit mmol)の ε—ポリリシン（ ε—PL)を 0. 57mLの 0. 5M炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解した。 105mg (0. 5mmol)の DTDPと 155mg (lmmol)の WSCを含む 2mLの 0. 5M炭酸水素ナトリウム水溶液と ε — PL水溶液を混合して数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ 2mmのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で 3時間反応させた。得られたハイド口ゲルを超純水で 48時間洗浄し、直径 lcmのディスク状に打ち抜!/、た。

[0059] 得られた ε -ポリリシンジチォビスプロピオン酸ゲルの凍結乾燥体の走査型電子顕微鏡写真を図 5に示す。

[0060] <ハイド口ゲル上での細胞培養および GSHによるハイド口ゲルの分解 >

<細胞シートの存在 >

γ—PGA濃度が 6wt%で調製したシスタミン架橋ハイド口ゲル (調製例 3)を細胞培養培地（10%のゥシ胎仔血清含有）に 30分間浸漬し、ハイド口ゲル中の水分を培地に置換した。その後、ゲルを 24ゥエル (well)マルチプレートに設置し、 1. O X 10⁶個のマウス L929繊維芽細胞をハイド口ゲル上に播種して 2mLの培地を加え、 37°C、 5 %COのインキュベータ一中で 1週間細胞を培養した。その間に、 2日に一度古い培

2

地を捨て新し、培地に交換した。

[0061] 1週間後、培地を除去し、 ImMの GSHを含む培地にゲルを 6時間浸漬することでハイド口ゲルのみを分解した。ハイド口ゲル上の細胞およびゲルの分解により回収した細胞シートにっ、て、その細胞の様子を位相差顕微鏡により確認した。

[0062] さらに、得られた細胞シートをティッシュカルチャーポリスチレンディッシュ（TCPS) 上で 3日間培養したところ、細胞シートから TCPSへの細胞移動が確認された。これは、得られた細胞シートが生存して、ることを示して！/、る。

[0063] <三次元細胞組織体の調製 >

645mg (5 unit mmol)のポリ（ γ—グルタミン酸）（ γ—PGA)を 10mLの 0. 5M 炭酸水素ナトリウム水溶液に 6wt%の濃度で溶解し、 776mg (5mmol)の水溶性力ルボジイミド (WSC :縮合剤）を加えて 4°Cで 15分間攪拌した。架橋剤として 563mg ( 2. 5mmol)のシスタミンを添カロして数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ 2mmのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温で 24時間反応させた。反応終了後、得られたノヽイド口ゲルを超純水で 48時間洗浄し、直径 lcmのディスク状に打ち抜き、 3日間凍結乾燥した。得られたゲルの走査型電子顕微鏡 (SEM)観察結果を図 6 (培養食 ι〗）に示す。

[0064] 凍結乾燥後のハイド口ゲルを細胞培養培地（ 10%のゥシ胎仔血清含有）に 30分間浸漬した。その後ゲルを 6ゥエル (well)マルチプレートに設置し、 1. O X 10⁶個のマウス L929繊維芽細胞をハイド口ゲル上に播種して 5mLの培地を加え、 37°C、 5% CO のインキュベータ一中で 10日間培養した。その間に、 2日に一度古い培地を捨て新

2

しい培地に交換した。

[0065] 10日間培養後のゲルの SEM観察を図 7に示す。 SEM観察の結果より、ゲル内部の空孔に細胞が侵入して、ることが分かる。

[0066] 10日後、培地を除去し、 5mMのシスティンを含む 50mLの培地にゲルを 12時間浸漬することでハイド口ゲルのみを分解した。

ゲルのみを分解させた後には、ゲルの大きさから転写された直径 lcm,厚さ 2mm の組織体が得られた。分解により得られた細胞と細胞が産出した細胞外マトリックスから構成される組織体の SEM観察を図 8に示した。

[0067] 図 8から細胞 1個当たりの大きさは 10 μ m程度である。この 10 μ mの細胞が直径 lc m,厚さ 2mmの組織体を構成するためには、細胞が縦方向'横方向に緻密に存在する必要がある。単純に 2mmの厚さを形成するためには、 200個の細胞が縦に連なることが必要になる。ゲルの大きさから転写された直径 lcm,厚さ 2mmの組織体を構成することは到底不可能であるので、細胞が細胞が産出したコラーゲン成分と緻密に三次元的に存在することがわかる。図 8の電子顕微鏡の写真力もも、細胞が横方向だけでなく縦方向にも連なって、る。すなわち三次元的に細胞が集まった組織体が得られていることは明らかである。

[0068] <蛍光ラベルイ匕ハイド口ゲルを用いた三次元細胞組織体形成後のハイド口ゲル分解成分の残存評価 >

(蛍光ラベルイ匕 γ— PGAの合成）

20mg (156 unit mol)のポリ（ γ —グルタミン酸）（ γ— PGA)を 10mLの 0. 5M 炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、 1. 0π^ (644 /ζ πιο1)の水溶性カルポジイミド（ WSC :縮合剤）を加えて 4°Cで 15分間攪拌した。遮光後、蛍光試薬である lmg (l. 56 μ mol)の Alexa Fluor 488 cadaverine, sodium asltを添カ卩して 4°Cで 1時間、室温で 24時間反応させた。反応終了後、遮光しながら 3日間超純水で透析を行うことで精製し、 3日間遮光下で凍結乾燥することで蛍光ラベル化 γ— PGAを得た。

[0069] (蛍光ラベル化ゲル'細胞培養）

7mgの蛍光ラベル化 γ— PGA(0. 05 unit mol)と 638mg (4. 95 unit ^ mol )のポリ（γ—グルタミン酸）（γ—PGA)を lOmLの 0. 5M炭酸水素ナトリウム水溶液に 6wt%の濃度で溶解し、 776mg (5mmol)の水溶性カルボジイミド (WSC：縮合剤 )をカ卩えて遮光下 4°Cで 15分間攪拌した。架橋剤として 563mg (2. 5mmol)のシスタミンを添加して数分間攪拌した後、得られた溶液を厚さ 2mmのシリコンゴムを挟んだガラス板に流し込み、室温'遮光下で 24時間反応させた。反応終了後、得られたハイド口ゲルを超純水で 48時間洗浄し、直径 lcmのディスク状に打ち抜き、 3日間凍結乾燥した。細胞培養前のゲルの蛍光顕微鏡観察写真が図 9である。

[0070] 蛍光ラベルイ匕ゲルを細胞培養培地（10%のゥシ胎仔血清含有）に 30分間浸漬した。その後ゲルを 6ゥエル (well)マルチプレートに設置し、 1. O X 10⁶個のマウス L929 繊維芽細胞をハイド口ゲル上に播種して 5mLの培地を加え、 37°C、 5% COのイン

2 キュベータ一中で 2週間培養した。その間に、 2日に一度古い培地を捨て新しい培地に交換した。 2週間培養後のゲルの蛍光顕微鏡観察による写真が図 10である。また、比較として細胞を播種せずに同じ条件で 2週間培地中でインキュベートしたゲルの蛍光顕微鏡観察による写真が図 11である。

[0071] (細胞培養蛍光ラベル化ゲルの分解）

2週間後、培地を除去し、 5mMのシスティンを含む 50mLの培地にゲルを 12時間浸漬することでハイド口ゲルのみを分解した。 12時間後リン酸緩衝生理食塩水（PBS )で一度洗浄した後の分解により得られた組織体の蛍光顕微鏡観察の写真を図 12 に示した。若干蛍光が観察されることから、分解物の残存が確認された。その後、 PB Sにて 5回洗浄した後の蛍光顕微鏡写真および同じ場所の位相差顕微鏡写真を図 1 3および図 14に示した。位相差顕微鏡で組織体が観察される場所で蛍光が観察されな力つたことから、分解物が完全に除去されて!、ることが確認された。産業上の利用可能性

本発明の刺激応答性ハイド口ゲルは、細胞と細胞が産出した細胞外マトリックスのみ力形成される完全に生体由来の三次元細胞組織体を構築可能であり、また安全に回収することが可能となることから、再生医療産業の分野に利用可能である。その他、環境に対しても安全であるため、保水剤など環境分野に利用可能である。

Claims

請求の範囲

[1] 水溶性ポリマーを、分子鎖中にジスルフイド結合を有する化合物で架橋してなる刺激応答性ハイド口ゲル。

[2] 水溶性ポリマーが、ポリ（ γ—グルタミン酸）、ポリ（ α—グルタミン酸）、ポリ（ァスパラギン酸）、ポリ（リシン）、ポリ（アルギニン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（セリン）、ポリ（トレオニン)、ポリ（チロシン）、からなるグループ、およびその共重合体から選択される、請求項 1に記載のハイド口ゲル。

[3] 水溶性ポリマーが、ポリ（ γ—グルタミン酸)またはポリ（リシン)である、請求項 1に記載のハイドロゲノレ。

[4] 水溶性ポリマーが、ポリ（ γ—グルタミン酸)である、請求項 1に記載のハイド口ゲル

[5] 水溶性ポリマーが、アルギン酸またはキトサンである、請求項 1に記載のハイドロゲル。

[6] 分子鎖中にジスルフイド結合を有する化合物力シスタミン、シスチンまたは 3, 3' ージチォジプロピオン酸である、請求項 1〜5 、ずれかに記載のハイド口ゲル。

[7] 分子鎖中にジスルフイド結合を有する化合物が、シスタミンまたはシスチン請求項 1 〜51、ずれかに記載のハイド口ゲル。

[8] 請求項 1〜7 、ずれかに記載の刺激応答性ハイド口ゲル力もなる細胞培養のための足場材料。

[9] 請求項 1〜7 、ずれかに記載の刺激応答性ハイド口ゲル力もなる細胞培養のための足場材料で細胞を培養する工程、および

刺激応答性ハイド口ゲルを生体内存在還元物質で分解し、培養細胞を該ハイド口ゲルから分離する工程、

を経ること特徴とする細胞培養方法。

[10] 生体内存在還元物質が、ダルタチオン (GSH)、ジヒドロリポ酸 (DHLA)またはシスティン (Cys)である、請求項 9に記載の細胞培養方法。