JP2014517855A - 架橋ポリ−ε−リシン非粒状支持体 - Google Patents

Abstract

本発明は、非粒状の架橋ポリ−ε−リシンポリマーを提供する。ポリ−ε−リシンと架橋剤とはアミド結合によって連結され、架橋剤は、ポリ−ε−リシンのアルファ炭素のアミンと反応することができる少なくとも２つの官能基を有する。該ポリマーは、水および他の溶媒に適切に不溶性であり、例えば、シート、物品、または繊維などのマクロ形状で提供される。マクロ形状のポリマーは、広範な用途、例えば、創傷治療、粒状支持体（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｓｕｐｐｏｒｔ）と該支持体に結合されるまたは保持される機能材料とを含む医学的診断薬、ならびにペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖の固相合成、種の固定化、細胞培養、ならびにクロマトグラフ分離において有用である。

Description

本発明は、非粒状ポリマー支持体、該支持体を調製する方法、および固相プロセスにおける該支持体の使用に関する。特に、本発明は架橋ポリ−ε−リシンを含む非粒状ポリマー支持体に関し、とりわけマクロ形状での架橋ポリ−ε−リシン支持体に関する。該支持体は、広範な物理的および化学的プロセス、とりわけ基質との相互作用が必要とされるプロセス、例えば、固相合成、固相抽出、固相試薬、種の固定化、細胞培養、触媒反応、クロマトグラフィー、創傷管理、ならびに医学的診断薬において有用である。

本発明の目的のために、ポリマー支持体なる用語は、粒状タイプを除く、例えばモノリス、膜、繊維などの任意の形状のポリマーを記述するために使用される。

ポリ−ε−リシンは、天然に存在する多分散の短鎖ポリアミドであり、カルボキシル基とイプシロン（ε）アミノ基との間のアミド結合を介して連結したアミノ酸リシンから構成される。この構造は、アミド結合がリシンのカルボキシル基とεアミノ基との間で形成されるという点で普通ではなく、それに対し、従来よりポリ−リシンに採用される、ペプチド中のアミノ酸の間の普通のペプチド結合は、カルボキシル基とαアミノ基との間で形成される。天然に存在するポリ−ε−リシンの多分散性は、通常はアミノ酸２５〜３５個の間である。市販される従来のポリ−リシンでは、ペプチドはそれよりはるかに広い不十分に制御された多分散性を有し、通常はアミノ酸５〜５００個からなるものを何でも含有する。

架橋ポリ−ε−リシンは、アミド結合の間の鎖長が長いために構造的に従来のポリ−リシンより弾力性がある。構造的に、ポリ−ε−リシンは実質的にα−アミノナイロン５である。

ポリ−ε−リシンは現在、食品保存料として細菌発酵によって大規模に製造されている。それは高価ではなく、商業的量で容易に入手できる。本発明において、本発明人らは、ポリ−ε−リシンを架橋して幅広い技術にわたる用途を有する不溶性のポリマー支持体を形成することについて記述する。こうした用途には、それだけには限らないが、固相ペプチド合成、固相オリゴヌクレオチド合成、固相抽出、固相試薬、種の固定化、細胞培養、触媒反応、クロマトグラフィー、農薬の持続放出および医薬品の持続放出、再生医療ならびに医学的診断薬が含まれる。

固体支持体材料が固相合成プロセスに有用であることは公知である。例として、有機分子、特にペプチドおよびオリゴヌクレオチドの合成、種の固定化、触媒の担持、イオン交換、材料からの種の抽出、診断薬およびクロマトグラフィーを含めた広範な物理的および化学的プロセスが、固体支持体材料を採用する。

通常、有機分子の多段階合成は、次のステージに進む前に、各ステージで生成される中間体を分離する数多くの単離ステップを含む。これらのプロセスは、時間や費用がかかることが多く、また収率の点で不十分なことがある。中間体は、精製されて過剰な試薬および反応副生成物を除去することが必要とされることが多く、沈殿、濾過、二相溶媒抽出、固相抽出、結晶化およびクロマトグラフィーなどの操作が採用されることがある。

固相合成には、液相合成に優る幾つかの利点がある。例えば、標的分子を固体支持体に可逆的に付着（ａｔｔａｃｈ）させることによって、液相合成に使用される単離操作をある程度回避することができる。過剰な試薬および副生成物の一部は、固体支持体の濾過および洗浄によって除去することができる。あるプロセスでは、標的分子を実質的に定量的収率で回収することができ、それは液相合成では通常特に困難である。加えて、固体支持体上で操作を行うのに必要な時間は、通常、液相合成で同等の段階を実行するのに必要な時間よりはるかに少ない。

幅広いプロセスにおける種の固定化も公知である。例えば、ポリマー支持体は、化学触媒反応および生体触媒反応を含めた従来の有機化学で使用する触媒の固定化に汎用される。固定化酵素は、有機化学反応を実行するためにまたはキラル分割のために採用することができ、例えば、第二級アルコールを分割するために固定化ペニシリンアミダーゼが使用され（Ｅ．Ｂａｌｄａｒｏら、Ｔｅｔ．Ａｓｙｍ．４、１０３１、（１９９３）、また固定化ペニシリンＧアミダーゼも、アモキシシリンの製造においてベンジルペニシリンの加水分解に使用される（Ｃａｒｌｅｙｓｍｉｔｈ、Ｓ．Ｗ．ａｎｄ Ｌｉｌｌｙ、Ｍ．Ｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２１、１０５７〜７３、１９７９）。

固体支持体は、医療および診断用途のために生体巨大分子を固定化するのにも使用される。これには、タンパク質、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の固定化が含まれる。細胞培養は一般に、特異的な表面特性および形態を有する固体支持体上で行われる。支持体上の固定化酵素を、シグナルを発生するセンサーとして採用することもできる。一例は、グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ結合酵素系によるグルコースの検出であり、ここでは、グルコースが存在すると過酸化水素が発生し、それはペルオキシダーゼの基質であり、ペルオキシダーゼは多種多様な基質を酸化して着色、蛍光または発光シグナルをもたらす。

その蛍光が特定のカチオンまたはアニオンに感応する様々な蛍光体を利用して、ｐＨ測定のための水素イオンなどの特定のイオンの濃度を示すことができる。

ポリマー材料は、クロマトグラフィーで使用されることが多く、この場合、固体支持体は固定相と呼ばれる。クロマトグラフィーのある様式では、固定相の費用が制限的なことがある。他の様式では、固定相の物理的性質によって技術の有効性が低下することがある。例えば、アフィニティー、イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーにおいてよく使用される軟質ポリマーは、粒子の変形しやすい性質のために、高流量で使用することができない。他の多くの様式のクロマトグラフィーで使用される硬質のマクロポーラスポリマーは、機械的に脆弱である場合が多く、後で短寿命を来すことがある。

クロマトグラフ分離における固体支持体または固定相の用途は、例えば、製薬およびバイオテクノロジー産業で使用される複雑で技術的に高度な分離、および鉱業で使用されるより大規模なプロセスなど、極めて範囲が広い。製薬産業で最も価値が高い薬物の中には分取クロマトグラフィーによって精製されるものもあり、クロマトグラフ分離の向上は、技術的に有益であり、かつ経済的に有利であろう。鉱業および貴金属回収業では、世界の大部分のパラジウム、すなわち触媒コンバーターおよび高価値製品の製造などの広範な工業的用途およびプロセスに不可欠な成分は、固定化クラウンエーテルを使用して精錬することができる（Ｔｒａｃｚｙｋ、Ｆ．Ｐ．；Ｂｒｕｅｎｉｎｇ、Ｒ．Ｌ．；Ｉｚａｔｔ、Ｎ．Ｅ．「Ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＲＴ） ｆｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｅｔａｌ Ｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」；Ｉｎ Ｆｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｅ ｉｎ ｄｅｒ Ｈｙｄｒｏｍｅｔａｌｌｕｒｇｉｅ；１９９８、Ｖｏｒｔｒａｇｅ ｂｅｉｍ ３４．Ｍｅｔａｌｌｕｒｇｉｓｃｈｅｎ Ｓｅｍｉｎａｒ ｄｅｓ Ｆａｃｈａｕｓｓｃｈｕｓｓｅｓ ｆｕｅｒ Ｍｅｔａｌｌｕｒｇｉｓｃｈｅ Ａｕｓ−ｕｎｄ Ｗｅｉｔｅｒｂｉｌｄｕｎｇ ｄｅｒ ＧＤＭＢ；１８〜２０ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８；Ｇｏｓｌａｒ）。

固相抽出および固相試薬の調製におけるポリマー材料の使用も、化学、製薬およびバイオテクノロジー産業で公知である。

公知の固相支持体は、一般に、用途に適した物理的性質のポリマー材料を含む。使い勝手を良くするために、これらのポリマー材料はモノリス型であることが多い。

ペプチド合成では、伸長するペプチドを担持するポリマー支持体としてポリスチレンが広く採用され、それは、比較的安価で、広く入手可能であり、ペプチド合成において許容可能な性能を与える。ペプチドおよびオリゴヌクレオチドの固相合成に汎用される他の市販の支持体は、例えば複雑な製造プロセスのために高価なことがある。一般的には、ミクロポーラスポリマーおよびマクロポーラスポリマーが使用される。ミクロポーラスポリマーは、比較的低レベルの架橋剤を有し、それによってポリマー粒子は適切な溶媒中で溶媒和し、結果的に膨潤することが可能である。マクロポーラスポリマーは、大抵の場合、ポリマーマトリクスに高レベルの架橋剤を有し、大きな細孔を含有する。こうしたポリマー材料は、一般的に硬質であり、良好な流動性を有し、充填カラムでの使用に適している。

広範な用途における非粒状支持体、例えばモノリス型支持体としての使用に適切な、代替のまたは向上した、費用効果の高いポリマーを見出すことが依然として必要である。架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、特性の組み合わせに優れており、適正な架橋剤を選択することによって所望の特性に従って適合させることができ、広範な用途に費用効果的に採用することができることを、本発明者らは今や見出した。

Ｅ．Ｂａｌｄａｒｏら、Ｔｅｔ．Ａｓｙｍ．４、１０３１、（１９９３） Ｃａｒｌｅｙｓｍｉｔｈ、Ｓ．Ｗ．ａｎｄ Ｌｉｌｌｙ、Ｍ．Ｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２１、１０５７〜７３、１９７９ Ｔｒａｃｚｙｋ、Ｆ．Ｐ．；Ｂｒｕｅｎｉｎｇ、Ｒ．Ｌ．；Ｉｚａｔｔ、Ｎ．Ｅ．「Ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＲＴ） ｆｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｅｔａｌ Ｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」；Ｉｎ Ｆｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｅ ｉｎ ｄｅｒ Ｈｙｄｒｏｍｅｔａｌｌｕｒｇｉｅ；１９９８、Ｖｏｒｔｒａｇｅ ｂｅｉｍ ３４．Ｍｅｔａｌｌｕｒｇｉｓｃｈｅｎ Ｓｅｍｉｎａｒ ｄｅｓ Ｆａｃｈａｕｓｓｃｈｕｓｓｅｓ ｆｕｅｒ Ｍｅｔａｌｌｕｒｇｉｓｃｈｅ Ａｕｓ−ｕｎｄ Ｗｅｉｔｅｒｂｉｌｄｕｎｇ ｄｅｒ ＧＤＭＢ；１８〜２０ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８；Ｇｏｓｌａｒ

第１の態様では、本発明は非粒状の架橋ポリ−ε−リシンポリマーを提供する。

非粒状の架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、好ましくはマクロ形状である。用語「マクロ形状」は、ポリマーが、非粒状の形状に形成されており、かつモノリス型であり、粒状の形状では有効に使用するのに複数の粒子が必要であるのとは対照的に、単一体として使用するまたは取扱うことができる形状を有することを意味する。マクロ形状の例にはシート、繊維、および物品が含まれ、本目的のために、物品は三次元すべてに有意な長さを有し、それとは対照的に、繊維は一次元に、シートは二次元に有意な長さを有する。

非粒状ポリマーは、細孔を含有してもよい。細孔のサイズおよび分布は、意図する使用に従って適合させることができる。好ましくは、非粒状ポリマーは、マクロポア、ミクロポアもしくはスーパーマクロポア（ｓｕｐｅｒｍａｃｒｏｐｏｒｅ）を含有するか、またはミクロポーラスヒドロゲルもしくは繊維の形状である。

本発明は、本発明の第１の態様による架橋ポリ−ε−リシンポリマーを含む、非粒状支持体も提供する。

好ましくは、架橋剤はポリ−ε−リシンを不溶性にする。非粒状の架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、広範な用途のための支持体の提供において、とりわけ架橋が水および他の溶媒に不溶性であるポリマーをもたらす場合に、特に有用である。比較的低レベルの架橋が採用される場合、ポリマーは水溶性であることができ、これにより、以下に記述する通りのある種の用途に利点がもたらされる。適切には、ポリマーは、アミド結合で連結された、ポリ−ε−リシンと架橋剤とを含む。

架橋ポリ−ε−リシンのポリ−ε−リシン成分は、架橋ポリマーの主成分である。架橋剤は、ポリ−ε−リシンポリマーを互いに結び付けるように作用して、ポリ−ε−リシンポリマーが幅広い用途（それには、有機分子、例えばポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの合成のための支持体、クロマトグラフィー、本明細書で以下に記述する通りの機能材料用の支持体としての使用が含まれる）で使用するための構造体、例えば格子などをもたらすようにする。

ポリ−ε−リシンポリマー中の遊離アルファ（α）アミノ基と反応することができる、少なくとも２つの官能基、好ましくは２つ以上のカルボン酸基を有する架橋剤と反応することによって、ポリ−ε−リシンポリマーは適切に架橋される。架橋剤は、３つ以上の官能基を有して、同数のポリ−ε−リシンポリマー鎖と連結してもよいし、またはそれより少ない鎖と連結してもよいが、１つまたは複数のかかる鎖と複数の結合を有する。架橋剤は、架橋反応に関与せず、架橋ポリマーを使用する間に他の種と反応させるために利用可能のまま残される、他の官能基を含有してもよい。

ポリマー支持体における架橋のレベルを使用して、最終的な架橋ポリ−ε−リシンの物理的形状および化学反応性を制御することができる。高レベルの架橋を導入すれば、マクロポーラスポリマー支持体の調製に適した硬質の構造体が生成され、それに対して、低レベルの架橋であれば、より軟質でよりミクロポーラスの材料が生成される。低レベルの架橋ではアミン官能性が高く、それはキャッピングの制御によって容易に適合させることができる。扱い、溶媒和および物理的特性も、導入する架橋剤のタイプによって定めることができる。

適切には、架橋剤は特定の化合物または化合物群を含む。架橋剤は反復単位を含んでもよく、また多分散系であってもよいが、多分散性は、架橋時に形成される格子構造の適正な制御が確保されるように狭くする。架橋剤は、ポリ−ε−リシンのアルファ炭素のアミンと反応することができる少なくとも２つの官能基を含む。この目的に適した一般的な官能基の例には、カルボン酸が含まれる。

アミド結合は生分解性であり、本発明の架橋ポリマーおよびそれを含む支持体は、生分解性が重要な用途でとりわけ有用である。さらに、アミド結合は、生分解性であるだけでなく、例えばプロテアーゼなど酵素によって代謝することができ、医療用途で使用するのに特に有利であり、とりわけヒトまたは動物の体表または体内での医学的使用に有利である。ポリマーまたは支持体が経時的に適切に分解し、それによってその機能が完了した後で支持体を除去する操作が不要となるような医療用途に、本発明のポリマーおよび支持体は利益をもたらす。

とりわけ好ましい実施形態では、架橋剤とポリ−ε−リシンとの間の結合はアミド結合を含み、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、望ましくは少なくとも９０％、とりわけ実質的に結合のすべてがアミド結合である。

さらに好ましい実施形態では、ポリマーは軽く架橋され、イプシロンアミン基の１から５０％まで、１から２０％まで、１から１０％までが架橋される。本発明の軽く架橋されたポリマーおよび支持体は、有機種、例えばペプチドおよびヌクレオチド配列の合成、および活性な種、例えば薬学的に活性な薬剤の送達にとりわけ有用である。

したがって、好ましい実施形態では、架橋剤は、２つ以上のカルボン酸基と、２つ以上の基を連結する脂肪族鎖とを含む。架橋剤はポリ酸を含んでもよい。好ましい実施形態では、架橋剤は、式Ｘ［ＣＯ_２Ｈ］_ｎの化合物を含み、式中、ｎは２以上、好ましくは２から６、より好ましくは２から４であり、Ｘは疎水性または親水性の連結基であり、好ましくは脂肪族である。適切には、基Ｘは、連結基上の官能性置換基をすべて除いて、分子量１４から２５０、より好ましくは２８から１４０を有する。Ｘは、ヘテロ原子、例えば酸素および窒素を、連結基の主鎖の一部として含有してもよく、また架橋ポリ−ε−リシンポリマーを使用する間に他の種と反応させるための官能基を含有してもよい。

酸基を連結する脂肪族鎖は、親水性であってもよく、好ましくはビス−カルボキシ−ポリアルキレングリコール、例えばビス−カルボキシ−ポリエチレングリコールであってもよく、または脂肪族鎖は疎水性であり、疎水性架橋剤をもたらしてもよく、例えば、セバシン酸はより親油性の支持体をもたらす。架橋剤は、前駆体材料、例えば無水物から誘導されてもよい。他の適切な架橋剤の例には、ニトリロ三酢酸、グルタル酸およびＨＯＯＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨが含まれる。

架橋剤が原子５個より少ない鎖長を有する場合、非粒状支持体またはマクロ形状の物理的一体性は、悪化するまたは失われる恐れがある。好ましい実施形態では、Ｘはヒドロカルビル基を含み、かつ水素原子および炭素原子のみを含み、好ましくは炭素原子３から１４個、より好ましくは６から１２個、とりわけ６から８個を含む。好ましくは、架橋剤は８から１０個の炭素原子を有する。ヒドロカルビル基は直鎖であっても分枝であってもよく、好ましくは直鎖である。ヒドロカルビル基は飽和であっても不飽和であってもよく、好ましくは飽和である。好ましい架橋剤の例には、炭素原子８から１０個を有するジカルボン酸、例えば、セバシン酸およびアゼライン酸などが含まれる。

ポリ−ε−リシンは、架橋の前に誘導体化または修飾して、当業者によく知られる他の架橋の化学が可能であるようにしてもよい。例えば、ポリ−ε−リシンは、架橋の前に誘導体化または修飾して、当業者によく知られる他の架橋の化学が可能であるようにしてもよい。例えば、ポリ−ε−リシンを、グルタル酸無水物との反応によってあらかじめ誘導体化し、次いで多官能アミンを使用し、本明細書で記述する活性化化学反応を使用して架橋することができるであろう。

ポリ−ε−リシンは、架橋の前に誘導体化または修飾して、当業者によく知られる他の架橋の化学が可能であるようにしてもよい。ポリ−ε−リシンは、アミノ酸、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸を使用して架橋されてもよい。この場合、架橋ポリ−ε−リシンは、分解すると天然に存在するアミノ酸だけを生じるだけとなる。例えばシスチンと反応すれば、同様に架橋されたポリマーが生成されることとなるが、この場合、構造体はシステインジスルフィド架橋を含有し、分解するとやはり天然に存在するアミノ酸を生じることとなる。

好ましい架橋剤の例には、グルタミン酸、シスチン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ））、アジピン酸、ドデカン二酸、合成ペプチド、とりわけ天然のコラーゲンの構造に基いたペプチド、トリペプチド配列−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−を含有する合成ペプチド、フィブリノーゲンおよび他の天然のタンパク質中の細胞結合ペプチド、複数のカルボン酸基を含有する天然に存在するポリマー、例えばゼラチン、アルギン酸、ならびに複数のカルボン酸を有するクラウンエーテル（金属キレート化およびクロマトグラフィーでの使用にとりわけ適する）が含まれる。さらなる適切な例を以下に示す。

ポリ−ε−リシンの多分散性は重大ではないが、好ましい実施形態では、ポリ−ε−リシンの多分散性は適切にはアミノ酸１０から５０個、好ましくは２５〜３５個の間である。多分散性が狭くなると、架橋ポリマー支持体の最終特性を一層正確に制御できるようになる。架橋ポリ−ε−リシンには、例えばいくつかの様式のクロマトグラフィーにおける用途など、多くの用途があると見込まれるが、鎖に沿って反復するＬ−キラル中心があるので、キラル分離に関して特に有利であり得る。ペンダントαアミノ基は容易に修飾されて、幅広いキラル選択特性を支持体に与えることとなる他のクロマトグラフ結合部位または他のキラル部分を組み込むことができる。

適切には、ポリ−ε−リシンと架橋剤との相対量は、ポリ−ε−リシンが架橋ポリ−ε−リシンポリマーの主成分であるように選択される。十分に架橋されたポリマーが必要とされる場合は、ポリ−ε−リシンポリマーと架橋剤の相対量は、ポリ−ε−リシンのアルファアミン基と架橋官能基に関して化学量論的モル当量となるように選択されるであろう。アミン官能性が所望される場合は、相当量より少ない架橋剤が採用されて、所望の割合の遊離アミン基をもたらす。適切には、架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、そのアルファアミン基の０から９５％を遊離アミン基として有する。比較的大きい割合の、例えば５０から１００％のアミン基が反応している好ましい実施形態では、架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、比較的硬質な特性を適切に示すこととなる。少ない割合のアミン基が、例えばアミン基の５から５０％までが反応して架橋をもたらす場合、ポリマーは適切に比較的軟質またはゲル様である。軟質またはゲル様ポリマーは、ポリペプチド、特に長いポリペプチドの合成にとりわけ有用である。

好ましい実施形態では、架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、０．００１ｍｍｏｌ／ｇより多く２０ｍｍｏｌ／ｇまで、０．０１から１０ｍｍｏｌ／ｇまでの架橋ポリ−ε−リシンポリマーから成り、好ましくは０．１から８ｍｍｏｌ／ｇまで、より好ましくは１から８ｍｍｏｌ／ｇまでであり、とりわけポリペプチド合成のために、例えば１から３ｍｍｏｌ／ｇまでである。

別の実施形態では、架橋ポリ−ε−リシンポリマーは０．０１から０．３ｍｍｏｌ／ｇから成り、核酸配列の合成に特に有利である。

架橋ポリ−ε−リシンポリマーをさらに反応させて、所与の用途向けの特定の官能性を与えてもよい。適切には、ポリマーを、少なくとも３つの官能基（このうち２つは、２本のポリマー鎖間に架橋をもたらすためのポリマーと反応する官能基、他は所望の用途で使用する遊離官能基（ｆｒｅｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）をもたらすための官能基）を有する化合物と反応させる。

架橋ポリ−ε−リシン支持体は、例えばコハク酸を使用してカルボン酸へ変換することによって、所望の通りにさらに官能化されてもよい。例として、アミン官能性支持体は、タンパク質、例えばタンパク質Ａを固定化する活性化ポリマーの調製において、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）塩酸塩で処理することができる。

架橋ポリ−ε−リシンポリマーは、過剰な架橋剤を含有して、所与の用途のためにカルボキシル官能性を提供してもよい。

非粒状ポリマーは、通常は分散重合法または乳化重合法によって作製することができ、その方法では、モノマー溶液は、重合開始前に不混和性の溶媒（連続相）中に分散する。ポリ−ε−リシンと架橋剤と、例えば触媒および開始剤などの重合成分との混合物は、適切に混合され、例えばシートもしくは物品などの所望のマクロ形状にキャストされるか、または繊維に紡糸されてもよい。繊維の場合、ポリ−ε−リシンの繊維が紡糸された後にポリマーが架橋されてもよいし、または架橋が架橋中もしくは架橋前に起こってもよい。通常は、次いで濾過され、洗浄され、分級されて、必要とされる粒径分布が単離される。

本発明の非粒状ポリマーは、多孔質、好ましくはマクロポーラスまたはミクロポーラスであってもよい。これらの用語は、当業者には公知である。

用語「マクロポーラス」は、通常比較的高度に架橋され、硬質であるポリマーを指す。マクロポーラスポリマーは、通常オングストロームの範囲（１〜５０００Ａ、すなわち０．１から５００ｎｍの細孔を有する。

用語「ミクロポーラス」は、比較的低レベルの架橋材料を有し、それほど細孔を有していないこともあるが、適正な溶媒に溶媒和し、膨潤して、例えばミクロポーラスヒドロゲルなどのゲルを形成するポリマーを指す。本発明によるミクロポーラスポリマーまたは支持体は、望ましくは透光性の、好ましくは透明なポリマーをもたらすような大きさのものである。

用語「スーパーマクロポーラス（ｓｕｐｅｒｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）」は、通常高度に架橋されるが、マクロポーラスポリマーよりはるかに大きい細孔を有するポリマー、例えばスポンジなどを指す。細孔は、通常ミクロンからｍｍの桁のものであり、通常０．５ｕｍから１ｍｍである。適切には、細胞培養用の本発明のポリマーまたは支持体は、２０ｕｍから５００ｕｍの孔を有する。

１つのサイズの細孔または特性を有することができる製品を生成することができるが、その製品を作製するポリマーが、製品より小さい細孔を有していてもよい。例えば、ミクロンからｍｍ規模の細孔を有するスーパーマクロポーラス製品を、ミクロポーラスまたはマクロポーラスであるポリマーから作製することができる。以下の実施例１では、製品はスーパーマクロポーラスであるが、実際のポリマーはミクロポーラスである。

本発明によるポリマーまたは支持体は、適切には１０から５００ミクロンの、例えば１０から１００ミクロンの空隙を適切に含む。好ましい実施形態では、マクロポーラスポリマーは、５０から３００ミクロン、より好ましくは１００から２００ミクロンの空隙を含む。

本発明は、貴金属触媒、例えばパラジウム触媒の担持に特に有用である。特に有利な例は、カルボン酸を形成するように官能化された架橋ポリ−ε−リシン上に担持された酢酸パラジウムである。

支持体は、導電性および発光ポリマーを伴う用途に採用されてもよい。発光ポリマーを含有する支持体を、表示パネル上に配置してもよい。

ポリマー支持体は、有機種、特に巨大分子の固相合成に、特に有用である。好ましい実施形態では、ポリマー支持体は、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖の合成に採用されてもよい。

本発明は、クロマトグラフィー法における固相としての、本発明によるモノリス型ポリマー支持体の使用をさらに提供する。

本発明のポリマー支持体は、バッチ式であるか、または支持体上の流れとしてであるかにかかわらず、支持体に接触するアルコール飲料から種を除去するための固相抽出、例えばイオン抽出およびイオン交換などにも有用である。

本発明の支持体は、抗体、オリゴヌクレオチド、酵素または蛍光物質を含めた種を固定化するのに使用してもよく、各支持体が溶液の異なる成分を分析するようにアレイに置かれてもよい。その表面に共有結合した、または表面に結合したポリマーを介して共有結合したリガンドを有するポリマーを、「ウェル」として採用してもよい。次いで、標的リガンド、例えば抗原、または相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列などの特異的結合を、確立された方法を使用して検出してもよい。

本発明のモノリス型ポリマー支持体はまた、生体触媒反応で使用するために生体触媒または細胞全体を固定化するのに採用されてもよい。生体触媒は、抽出下で混合物から固相を分離するためのフィルタープレートを備えたカラムまたはシステムで使用されることが多い。

本発明のモノリス型ポリマー支持体は、固相試薬、金属触媒および他の触媒、生体触媒、酵素、タンパク質、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含めた抗体、細胞全体、ならびにポリマーを含めた、種の固定化にとりわけ有利である。本発明は、酵素、例えばリパーゼＣａｌ Ｂなどの担持において特に有利である。リパーゼＣａｌ Ｂは、エステル交換法に採用することができる。

本発明は、本発明の支持体またはポリマーを使用してバイオディーゼル油を酵素によって製造する方法をさらに提供する。

本発明は、プロテインＡなどのアフィニティーリガンドの固定化にもとりわけ有用である。プロテインＡは、モノクローナル抗体の精製に適切に使用される。

さらなる用途では、本発明のポリマー支持体は、例えば遷移金属触媒およびリガンドを固定化することによって、化学触媒反応にも使用されてもよい。

なおさらなる用途では、本発明は細胞培養に使用されてもよい。動物細胞系の大量培養は、ウイルスワクチンおよびバイオテクノロジーの多くの製品の製造の基本である。動物の細胞培養における組換えＤＮＡ技術によって産生された生物学的製品には、酵素、合成ホルモン、免疫生物学的物質（モノクローナル抗体、インターロイキン、リンホカイン）および抗がん剤が含まれる。多くのより単純なタンパク質は、細菌培養においてｒＤＮＡを使用して産生することができるが、グリコシル化された（炭水化物修飾された）もっと複雑なタンパク質は、現在のところ動物の細胞内で作製しなければならない。かかる複雑なタンパク質の重要な例は、ホルモンであるエリスロポイエチンである。哺乳動物細胞培養物を成長させる費用は高いので、企業は絶えず技術の向上に目を向けている。

細胞は、懸濁液中でまたは接着培養物として成長させることができる。しかし、接着細胞には、細胞外基質成分をコーティングして接着性を上げることができ、また成長および分化に必要な他のシグナルを与えることができる表面が必要である。一般的に、固体組織に由来する細胞は接着性である。器官培養は、２次元培養皿ではなく３次元環境で細胞を成長させることを伴う。この３Ｄ培養系は、生化学的にも生理学的にもｉｎ ｖｉｖｏ組織の方に似ているが、多くの要因（例えば拡散）のために、維持するのは技術的に課題がある。ゼラチンは、加水分解されたコラーゲンであり、コラーゲンにおける鎖間および鎖内のアミド結合が化学的に加水分解されて可溶性ペプチド鎖が形成される。コラーゲンは、細胞が接着し、分化するのに理想的で自然な環境である。ポリ−ε−リシンは、他のタンパク質、例えばゼラチンなどと共重合して、コラーゲン様の環境を形成することもできる。

さらなる態様では、本発明は、細胞を培養するための、好ましくは支持体またはコーティングの表面上で細胞を培養するための、本発明によるポリマー、マクロポーラスまたはミクロポーラスの、支持体またはコーティングの使用を提供する。適切には、幹細胞を本発明のポリマー支持体上で培養して、無制御の分化を低減し、所望の分化を制御してもよい。

とりわけ好ましい実施形態では、本発明は、創傷ケアにおける使用に有益である。慢性創傷は、メタロプロテアーゼ（ｍｅｔａｌｌｉｎｏ−ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって増悪し、それは、酵素によって必要とされる金属イオンをキレート化するポリマー粒子によって不活性にすることができる。架橋ポリ−ε−リシン、好ましくは金属キレート種でキャップされたものが、本用途での使用に適切である。

本発明は、創傷治療製品またはその成分としての、非粒状架橋ポリ−ε−リシンまたは架橋ポリ−ε−リシンを含むモノリス型支持体の使用を提供する。創傷治療製品には、柔軟な物品が含まれてもよいが、好ましくは自立する物品が含まれる。創傷治療製品は、本発明によるポリマーもしくは粒状支持体（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｓｕｐｐｏｒｔ）、および創傷を治療する成分もしくは組成物、ならびに／または治療剤を適切に含む。

本明細書において、適切な使用に関して本発明のポリマーへの言及がなされた場合、特に記載のない限り、本発明の支持体もかかる使用に適切である。

好ましい実施形態では、本発明は、創傷管理に使用するための、ミクロポア、マクロポアまたはスーパーマクロポアを有する架橋ポリ−ε−リシンを含むシートを提供する。これらのシートは、術後の後に癒着を防ぐためのパッチとして内部に使用することができる。同様に、ポリマーは、組織再生を促進するためにインビボで使用することができる。

これらのシートは、外部の創傷管理における用途のために使用することもできる。本発明に記述するポリマーの幾つかの利点は、生体適合性、多孔性、親水性および化学修飾のしやすさにある。化学修飾によって、他の種、例として細胞結合タンパク質、細胞結合ペプチド、または抗凝固ペプチドなどを付着させることができるようになる。

本発明に記述するポリマーからの特別な利点は、その生体適合性から得られ、またある状況では、インビボで生体吸収されて、酵素分解されたときに天然に存在する物質を産生する潜在能力から得られる。

ポリマーのシートは、衛生用途において、例えばおむつの吸収剤として使用できる潜在能力がある。シート状ポリマーの用途についての別の例は、女性用ヘルスケア用品への抗生剤、抗菌剤および抗真菌剤の送達であろう。特に、ポリ−ε−リシンが抗菌性および抗真菌性を有するので、ポリマーシート自体が有用な殺菌作用を有することができる。架橋剤のセバシン酸およびドデカン二酸も殺菌性なので、過剰な架橋剤を有するポリマーシートも殺菌作用を有し、好ましい。

本発明は、イムノアッセイなどの医学的診断試験に特に有用である。したがって、本発明は、ある化合物の存在を検出するための医学的診断薬であって、本発明によるポリマーと、支持体中で該ポリマーによって担持される、検出すべき化合物と選択的に反応させるまたは結合させるための機能材料（酵素など、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）とを含む、医学的診断薬をさらに提供する。

多くの医学的診断薬は、様々な診断用リガンドを固定化する固体支持体に依存する。本発明のポリマー支持体を、液相を介して固相を物理的に分離する医学的診断法に使用してもよい。

さらなる用途では、ポリマー支持体は、吸収剤として使用されてもよい。ポリマー支持体は、家庭内でこぼれたもの、例えば、茶、コーヒーおよびワインを吸収するのに使用されてもよく、または大規模な用途で、例えば流出物から油を吸収するのに使用されてもよい。吸収性支持体は、流出物を吸収した後に放置して生分解させるのに使用してもよく、または油が水塊中に流出した場合、効率的に油を捕捉し、油を浮揚性の塊中に保持して、収集および廃棄するのに使用してもよい。有利には、架橋ポリ−ε−リシンは生分解性であり、それにより廃棄が容易になり、環境影響が低下する。

本発明のポリマー支持体は、ある期間にわたって放出すべき化合物、例えば薬学的または農薬的な化合物または組成物を運ぶ生分解性の担体として使用されてもよい。こうした使用により、支持体中の化合物の配合量に従って化合物の投与計画を適合させる手段が得られる。医薬品の場合、例えば化学療法など、患者に定期的に大用量を服薬することを要求するのではなく、例えば連続的な持続放出で活性物質の正しい用量を支援することにおいて、これは有利であり得る。

適切には、支持体はミクロポアを含み、透明な形状に調製されてもよい。ポリマーは、例えばコンタクトレンズおよび角膜包帯（ｃｏｒｎｅａｌ ｂａｎｄａｇｅ）を含めた、光学用途向けの代用ポリマーを適切に提供することができる。ポリマーは、コンタクトレンズの形状にキャストされてもよい。この形状において、ポリマーは抗菌性および抗真菌性の表面をもたらすことができ、薬物の持続放出のために使用することもできるであろう。ポリマーの透明な形状の光学特性は、顕微鏡および望遠鏡などの光学機器においても用途を有する。

本発明は、レンズを生成する方法であって、ポリ−ε−リシンと架橋剤とを重合触媒の存在下で合わせるステップ、およびレンズ型の容器にキャストして透明なミクロポーラスモノリスを生成するステップを含む方法を提供する。

三次元マクロポーラス構造体は、広範囲にわたる用途で調製されてきた。これらには、それだけには限らないが、クロマトグラフィーの固定相としての多孔質モノリス、種を濾過するための多孔質ディスク、電気浸透ポンプ用の多孔質材料、固相合成および他の化学変換用の固体支持体、絶縁材料、燃料電池用途で使用するための多孔質膜、ならびに組織工学用の多次元の足場が含まれる。

３Ｄ構造体を調製する現在の技術に関連する問題は、主として明確に規定された細孔寸法および相互連結流路（ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｃｈａｎｎｅｌ）を作成することができないことに関係する。細孔寸法がより明確に規定されるような状況において、適用することができるポリマーの種類の範囲は限られている。ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００５６９９は、制御された細孔を相互連結孔（ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｈｏｌｅ）とともにマクロポーラスポリマーに導入するプロセスを記載する。本発明で記述するポリマーも、この技術を使用してマクロポーラス状で存在することができ、本明細書で例として記述する。本発明で記述するポリマーは、他のマクロポーラス構造体、例えばポリＨＩＰＥを形成するのに使用することもできるであろう。

好ましい一実施形態では、３Ｄ構造体は、マクロポーラスポリマーの自己組織化によって形成される。

クロマトグラフィー用途において、３Ｄ構造体はモノリスと称されることが多い。モノリスがクロマトグラフィー用途に使用されるとき、３Ｄ構造体は従来の粒状の固定相に置き換わる。粒状固定相の細孔内を物質移動させる通常の駆動力である拡散とは対照的に、これはモノリスの細孔を通って対流するので、大きい分子、例えばタンパク質などの分離速度を実質的に増大させることができる。通常は、モノリス型材料を平型または管状の型で調製し、シートまたは円柱を型から取り出し、多孔質ポリマーを穿孔またはスライスして、ディスクを得る。こうしたモノリス内の細孔は、ポロゲンを添加することによって組み込まれる。例えばシリカベースのモノリスでは、ポロゲンは、通常ポリエチレングリコールなどの大分子である。例えばポリスチレンベースのモノリスでは、ポロゲンはトルエンであることが多い。現在使用されているポロゲンにより、連結度が明確に規定されていない、広い孔径分布が導入され、それはモノリスのクロマトグラフ性能に好ましくない。本発明の架橋ポリ−ε−リシンから作製されるモノリス型カラムは、クロマトグラフィーならびに広範なクロマトグラフィー用途、例えば、アフィニティー、イオン交換、逆相、順相およびキラルクロマトグラフィーにとりわけ有用である。

ポリマー電解質膜（ＰＥＭ）燃料電池としても公知であるプロトン交換膜燃料電池は、例えば輸送用途のために開発された燃料電池の一種である。こうしたＰＥＭ燃料電池は、均一な細孔構造によって決定付けられる効率的な対流をその特性の中で与えなければならない、特殊なポリマー電解質膜を使用する。本明細書で記述する技術を使用して独自に適用することができる追加的な化学的および物理的特性は、この分野に追加された利益をもたらすことができる。本発明のポリマーは、容易に修飾されて、この分野で適用可能であると見込まれる幅広い特性を導入することができる。

本発明のポリマーを使用して調製される３Ｄマクロポーラスポリマーは、ポリマーによって担持される機能材料も含んでもよい。適切な機能材料の例には、触媒、ペプチド合成のための開始剤種、薬学的活性物質、農薬的活性物質、巨大分子、酵素、核酸配列およびタンパク質が含まれる。

本発明は、貴金属触媒、例えばパラジウム触媒の担持に特に有用である。特に有利な例は、カルボン酸を形成するように官能化された架橋ポリ−ε−リシン上に担持された酢酸パラジウムである。

ポリ−ε−リシンにキラルな性質があるので、かかる触媒にキラル選択性を付与することもできる。

本発明の３Ｄマクロポーラスポリマーは、固体支持体が使用されるいかなる化学的または物理的プロセスに使用されてもよい。

３Ｄマクロポーラスポリマーまたはポリマーコーティングは、導電性および発光ポリマーを伴う用途に採用されてもよい。発光ポリマーを含有する粒状支持体（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｓｕｐｐｏｒｔ）を、表示パネル状に配置してもよい。

３Ｄマクロポーラスポリマーは、有機種、特に巨大分子の固相合成に、特に有用である。好ましい実施形態では、３Ｄマクロポーラスポリマーは、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖の合成に採用されてもよい。

本発明による３Ｄマクロポーラスポリマーは、慣習的に採用されていた装置より単純なものを使用することによって、固相合成を単純化する。カラムベースのシステムでは、３Ｄマクロポーラスポリマーは、モノリス型の形状でそれ自体を使用されてもよい。この場合、３Ｄマクロポーラスポリマーを形成するポリマーは、固相合成の支持体を提供する。

３Ｄマクロポーラスポリマーが従来の固相合成用ポリマー支持体の周りに形成されるならば、３Ｄマクロポーラスポリマーは不活性であってもよく、従来の固相合成用ポリマーを支持する機械的骨格を提供するだけであってもよい。

上述した２つの例において、３Ｄマクロポーラスポリマーは、特許ＷＯ２００８／０１２０６４に記載される通りに、シードビーズ中に封入されてもよい。

好ましい実施形態では、本発明の架橋ポリマーは、３Ｄマクロポーラスポリマーの形状であり、タンパク質、ポリペプチド、抗体、オリゴヌクレオチド、酵素、細胞全体または蛍光物質を含めた種を固定化するのに使用されてもよい。マクロポーラスポリマーは、アレイ中の各３Ｄマクロポーラスポリマーが溶液の異なる成分を分析するのに使用されるように、アレイに置かれてもよい。その表面に共有結合した、または表面に結合したポリマーを介して共有結合したリガンドを有する３Ｄマクロポーラスポリマーを、「ウェル」に採用してもよい。次いで、標的リガンド、例えば抗原または相補的ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列などの特異的結合を、確立された方法を使用して検出してもよい。

本発明の３Ｄマクロポーラスポリマーは、生体触媒を固定化するのにも採用されてもよい。生体触媒は、抽出下で混合物から固相を分離するためのフィルタープレートを備えたカラムまたはシステムで使用されることが多い。本明細書で言及された、固相合成およびクロマトグラフィーに観察される問題は、固相抽出でも同様に観察される。本発明の３Ｄマクロポーラスポリマーは、クロマトグラフィーおよび固相合成で得られる利点と同様の利点をもたらす。

本発明の３Ｄマクロポーラスポリマーは、固相試薬、金属触媒および他の触媒、生体触媒、酵素、タンパク質、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含めた抗体、細胞全体、ならびにポリマーを含めた、種の固定化にとりわけ有用である。本発明は、酵素、例えばリパーゼＣａｌ Ｂなどの担持において特に有利である。リパーゼＣａｌ Ｂは、バイオディーゼル油の製造に一般に採用される。さらに、本発明の３Ｄマクロポーラスポリマー構造を通る向上した対流は、マトリックス全体にわたる粘稠な植物油の流れに特に適しているので、特にバイオディーゼル油の製造に用途を見出すことができる。

なおさらなる用途では、本発明は細胞培養に使用されてもよい。動物細胞系の大量培養は、ウイルスワクチンおよびバイオテクノロジーの多くの製品の製造の基本である。動物の細胞培養における組換えＤＮＡ技術によって産生された生物学的製品には、酵素、合成ホルモン、免疫生物学的物質（モノクローナル抗体、インターロイキン、リンホカイン）および抗がん剤が含まれる。多くのより単純なタンパク質は、細菌培養においてｒＤＮＡを使用して産生することができるが、グリコシル化された（炭水化物修飾された）もっと複雑なタンパク質は、現在のところ動物の細胞内で作製しなければならない。かかる複雑なタンパク質の重要な例は、ホルモンであるエリスロポイエチンである。哺乳動物細胞培養物を成長させる費用は高いので、企業は絶えず技術の向上に目を向けている。

細胞は、懸濁液中でまたは接着培養物として成長させることができる。しかし、接着細胞には、細胞外基質成分をコーティングして接着性を上げることができ、また成長および分化に必要な他のシグナルを与えることができる表面が必要である。一般的に、固体組織に由来する細胞は接着性である。器官培養は、２次元培養皿ではなく３次元環境で細胞を成長させることを伴う。この３Ｄ培養系は、生化学的にも生理学的にもインビボ組織の方に似ているが、多くの要因（例えば拡散）のために、維持するのは技術的に課題がある。

本明細書で記述する発明によって、細胞培養にとってより自然な環境を提供する生分解性ポリマーを調製することができ、分解したときに天然に存在するアミノ酸だけを放出するように設計することができる生分解性材料を提供することができる。こうした３Ｄマクロポーラスポリマー構造（１００μｍ超の細孔が作成されたときは一般にスーパーマクロポーラスと称される）は、静止および対流状態の下で迅速に細胞および栄養素を移動するのに適している。本発明の３Ｄマクロポーラスポリマー構造は、ほとんどどの形およびサイズにも製造またはキャストすることができるので、再生医療用の重要な足場をもたらすことができる。ゼラチンは、加水分解されたコラーゲンであり、コラーゲンにおける鎖間および鎖内のアミド結合が化学的に加水分解されて可溶性ペプチド鎖が形成される。コラーゲンは、細胞が接着し、分化するのに理想的で自然な環境である。ポリ−ε−リシンは、他のタンパク質、例えばゼラチンなどと共重合して、コラーゲン様の環境を形成することもできる。本明細書で記述する発明により、他の細胞培養用途に、より自然な環境を提供する生分解性ポリマーを調製することができる。本発明は、バイオ燃料を生成するために、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）などの藻類の培養に採用されてもよい。３Ｄマクロポーラスの足場として調製した架橋ポリ−ε−リシンは、藻類の培養用に容易に改変される環境を提供することができ、池の水面に浮かびやすいように設計し、紫外光を受ける手段を向上させることができる。

本発明は、イムノアッセイなどの医学的診断試験に特に有用である。したがって、本発明は、ある化合物の存在を検出する医学的診断薬であって、本発明による粒状支持体（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｓｕｐｐｏｒｔ）、マクロポーラス支持体、ミクロポーラス支持体またはコーティングと、支持体中で該ポリマーによって担持される、検出すべき化合物と選択的に反応させるまたは結合させるための機能材料（酵素など、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）とを含む、医学的診断薬をさらに提供する。

多くの医学的診断薬は、様々な診断用リガンドを固定化する固体支持体に依存する。本発明の３Ｄマクロポーラスポリマーを、液相を介して固相を物理的に分離することが必要とされる医学的診断法に使用してもよい。

診断法、スクリーニングおよび化合物ライブラリー用途は、マイクロアレイシステムを使用することが多い。ポリ−ε−リシン、架橋剤および活性化剤を、プリンターを通して別々に組み合わせて様々な表面上に、マイクロアレイの精密な配置を置くことができる。同様に、印刷技法は、創傷ケアおよび再生医療用の人工皮膚を調製するのに使用することができるであろう。

さらなる実施形態では、ポリマーは、電界紡糸を通して、または繊維を製造する従来の技法によって、繊維に二次加工してもよい。繊維マット、ばら繊維または織り繊維が、記述した分野のすべてにおいて用途を有すると見込まれる。

ポリマーは、吹付けによって塗布することもできるので、例えば抗菌性および抗真菌性コーティングを含めた幅広い用途に、有用なコーティングを提供することができる。

本発明を、添付の図面を参照することによって説明する。

ポリ−ε−リシンの図式表現を示す図である。 二官能性カルボン酸と架橋したポリ−ε−リシンの図式表現を示す図である。 例としてアスパラギン酸と架橋したポリ−ε−リシンの図式表現を示す図である。 シスチンと架橋したポリ−ε−リシンの図式表現を示す図である。 ニトリロ三酢酸と架橋したポリ−ε−リシンの図式表現を示す図である。 ポリアクリロニトリルバルーン溶解前の実施例１の生成物のＳＥＭを示す図である。 実施例２の自己組織化スーパーマクロポーラスシートのＳＥＭを示す図である。 実施例２の自己組織化スーパーマクロポーラスシートのＳＥＭを示す図である。 実施例３のポリマー全体にわたる増殖を示す、染色細胞の試料切片を示す図である。 実施例３のポリマー全体にわたる増殖を示す、染色細胞の試料切片を示す図である。 実施例３のポリマー全体にわたる増殖を示す、染色細胞の試料切片を示す図である。 実施例４のポリマー全体にわたる増殖を示す、染色細胞の試料切片を示す図である。 実施例６からの、自己組織化スーパーマクロポーラスチューブの写真を示す図である。 実施例９からの、得られた架橋ナノ繊維マットのＳＥＭを示す図である。 実施例１０のレンズの写真を示す図である。

本発明を、以下の非限定的な実施例によって説明する。

実施例１−スーパーマクロポーラス架橋ポリ−ε−リシンの調製
ポリ−ε−リシン（２００ｍｇ、アミン含有量１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ／水（２．４５ｃｍ^３、１：１ｖ／ｖ）に溶解し、ＮＭＭ（０．１３７ｃｍ^３、１．２ｍｍｏｌ）、続いてグルタル酸無水物（７０ｍｇ、グルタル酸無水物０．６ｍｍｏｌ、すなわちアミンに対して過剰量）を添加した。反応を２時間進行させた。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１４３ｍｇ）を添加し、続いてＥｘｐａｎｃｅｌ ９２０ ＤＥＸ ８０ ｄ３０（８０μｍポリアクリロニトリルバルーン）（５０ｍｇ、約３ｃｍ^３）およびＥＤＣＩ（２２４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、重合を開始した。混合物を１分間完全に混合し、ポリプロピレン表面上のシートにキャストし、その後コルクボーラーを使用してディスクに切断した。重合を放置して、一晩室温で完了させた。

ポリアクリロニトリルバルーンが溶解する前の生成物のＳＥＭを図６に示す。示される空洞は、図の右下部分にある３００ミクロンのスケールバーとの比較によって示される通り、およそ２０から１００ミクロンの大きさである。

上で調製したディスクをＤＭＦで一晩処理してポリアクリロニトリルバルーンを溶解し、次いで、リン酸カリウム緩衝液（１００ｍｍｏｌ／ｄｍ^３、ｐＨ７）および水で完全に洗浄し、その後水から凍結乾燥した。

このスーパーマクロポーラス架橋ポリ−ε−リシンを使用し、ヒトの胚性幹細胞の三次元成長および増殖を支持することが示された。

実施例２−自己組織化スーパーマクロポーラス架橋ポリ−ε−リシンのシートの調製
水（１００ｃｍ^３）中にポリ−ε−リシン（４．９３ｇ、アミン含有量２８．７ｍｍｏｌ）、ドデカン二酸（３．４７ｇ、カルボキシル含有量３０ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（１．１５ｇ、２８．７ｍｍｏｌ）を含有する溶液を調製した。

ＥＤＣＩ（１４．４６ｇ、７５ｍｍｏｌ）およびＨＯＮＳｕ（１．６５ｇ、１４ｍｍｏｌ）の水（３０ｃｍ３）溶液を上の溶液に添加し、混合物を直ちにトレーに注ぎ込み、５ｍｍの深さの層を形成した。

２０〜３０分後、混合物は凝固し、５ｍｍ厚のスーパーマクロポーラスシートを形成した。シートを水で完全に洗浄し、次いで凍結乾燥によって乾燥した。

自己組織化スーパーマクロポーラスシートのＳＥＭを図７ａおよび７ｂに示す。

実施例３−自己組織化スーパーマクロポーラス架橋ポリ−ε−リシン上でのマウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）の３Ｄ培養
上のシートから切断されたスーパーマクロポーラスディスクをリン酸緩衝食塩水（３×ＰＢＳ）で洗浄し、３０分間紫外線を照射し、その後細胞を接触させた。

ディスクにマウス胚性幹細胞を播種し、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）、１０００Ｕ／ｍＬの白血病抑制因子（ＬＩＦ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＫ）および２％ウシ胎児血清（ＰＡＡ）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）中で培養した。この培地を一日おきに変えた。

細胞の固定に関与するポリマーと接触するＥＳＣを、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で免疫染色し、続いてＰＢＳ（３×）で洗浄した。細胞を、ブロッキング溶液（１０％ウシ胎児血清、ＰＢＳ中０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）とともに室温で４０分間インキュベートした。ブロッキング溶液を除去し、一次抗体溶液を添加し（Ｏｃｔ４／Ｎａｎｏｇ）、細胞を４℃で一晩インキュベートした。細胞を洗浄し（３×ＰＢＳ）、二次抗体溶液を添加し、室温で２時間インキュベートし、その後細胞を洗浄し（３×ＰＢＳ）、核マーカーである、ＤＡＰＩ（１ｃｍ^３ＤＡＰＩ：１μＬ（１／１００＊＊作業溶液＋１ｍＬ ＰＢＳ）で対比染色し、室温で５分間暗所でインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、カバーガラスおよび蛍光用封入剤とともにスライドに載せた。

ポリマー全体にわたる増殖を示す染色細胞の試料切片を、図８ａ、８ｂおよび８ｃに示す。

ＥＳＣをポリマー上に播種し、ＥＳＣの付着を判定し、また最も重要なものとして、経時的なＥＳＣ自己複製に及ぼすポリマーの効果を判定した。

図８ａでは、ＥＳＣをスーパーマクロポーラスポリマー上に播種し、７日間増殖させた。７日後に、ＥＳＣおよびポリマーを固定し、ゼラチンに包埋し、凍結し、切片に分け、その後ＤＡＰＩ（青色）とアルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｓｅ）（赤色）とで共染色した。ポリマーは、ＥＳＣの生存能および付着を支持し、またＥＳＣはアルカリホスファターゼ発現を保持した。スケールバーは１００μｍを表し、画像は全集合の代表的なものである。実験は３回繰り返した。

図８ｂの場合は、ＥＳＣをスーパーマクロポーラスポリマー上に播種し、７日間増殖させた。７日後に、ＥＳＣおよびポリマーを固定し、ゼラチンに包埋し、凍結し、切片に分け、その後自己複製マーカー、ｎａｎｏｇ（緑色）で染色した。ポリマーはＥＳＣの付着を支持することが示され、さらにＥＳＣはｎａｎｏｇに対して陽性のままであり、よって自己複製能を維持する。スケールバーは２５ｕｍを表す。画像は、全集合の代表的なものである。

図８ｃでは、ＥＳＣをスーパーマクロポーラスポリマー上に播種し、７日間増殖させた。７日後に、ＥＳＣおよびポリマーを固定し、ゼラチンに包埋し、凍結し、切片に分け、その後自己複製マーカーＯｃｔ４（赤色）と核マーカーＤＡＰＩ（青色）とで共染色した。ポリマーはＥＳＣの付着を支持し、さらにＥＳＣはＯｃｔ４に対して陽性のままであり、よって自己複製能を維持する。スケールバーは５０ｕｍを表す。画像は、全集合の代表的なものである。

ポリマーはＥＳＣの付着を支持し、さらにＥＳＣはアルカリホスファターゼの発現を７日間まで保持した。同様にＥＳＣは、自己複製マーカー、すなわち転写因子である、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の発現を７日後に維持していた。まとめると、これにより、この特別なポリマーは、ＥＳＣの生存能を支持するだけでなく、いかなるＥＳＣスケールアップ培養条件においても極めて重要である、ＥＳＣ多能性の維持も支持することを示唆する。

実施例４−自己組織化スーパーマクロポーラス架橋ポリ−ε−リシン上での腎細胞の３Ｄ培養
上のシートから切断されたスーパーマクロポーラスディスクをリン酸緩衝食塩水（３×ＰＢＳ）で洗浄し、３０分間紫外線を照射し、その後細胞を接触させた。

ディスクにマウスの腎臓幹細胞（ＫＳＣ）を播種し、１０％ウシ胎児血清（ＰＡＡ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）、１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）、１ｍＭの２−β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）中で培養した。この培地を一日おきに変えた。

ＫＳＣ（ＧＦＰ染色）をポリマー上に播種し、付着／相互作用をモニターした。初期には１日目に、ＫＳＣは表面上で丸いままであったが、１０日目に、ＫＳＣの形態は、ポリマーの表面周辺で概して平坦化したように見える。

ポリマー全体にわたって増殖を示す染色細胞の試料切片を、図９に示す。ＫＳＣ（ＧＦＰ）をスーパーマクロポーラスポリマー上に播種し、付着／相互作用をモニターした。初期には１日目に、ＫＳＣは表面上で丸いままであったが、１０日目に、ＫＳＣの形態は、ポリマーの表面周辺で概して平坦化したように見える。

実施例５−自己組織化スーパーマクロポーラス架橋ポリ−ε−リシン上でのシュワン神経細胞の培養
スーパーマクロポーラスポリマーの試料を１２ウェルの組織培養皿のウェルに三重に置き、１時間紫外線殺菌し、その後試料をシュワン細胞成長培地［ＳＣＧＭ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ＧＧＦ＋フォルスコリン）］に水和させた。２つの細胞密度（シュワン細胞５００，０００および５０，０００）を、ＳＣＧＭ中のそれぞれのスーパーマクロポーラスポリマーの足場の上に播種した。アラマーブルー吸光度アッセイを使用して、細胞増殖を試験した。

アラマーブルーの結果により、シュワン細胞は初期にスーパーマクロポーラスポリマーの足場に付着し、２４時間後にその中で生存することが示される。全細胞増殖を５日間にわたって進行させ、すべての試料を試験した。

要約すれば、シュワン細胞の初期の付着および成長は、試験したすべての試料で２４時間目にアラマーブルーが減少したことによって実証された。試験した材料はすべて、さらに長い期間シュワン細胞の生存を支持したので、それらは神経再生の支持するに適した生体材料である。

実施例６−自己組織化スーパーマクロポーラス架橋ポリ−ε−リシンのチューブの調製
水（１００ｃｍ３）中にポリ−ε−リシン（４．９３ｇ、アミン含有量２８．７ｍｍｏｌ）、ドデカン二酸（３．４７ｇ、カルボキシル含有量３０ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（１．１５ｇ、２８．７ｍｍｏｌ）を含有する溶液を調製した。

ＥＤＣＩ（１４．４６ｇ、７５ｍｍｏｌ）およびＨＯＮＳｕ（１．６５ｇ、１４ｍｍｏｌ）の水（３０ｃｍ３）溶液を上の溶液に添加し、混合物を直ちにチューブ状の型に注ぎ込んだ。

２０〜３０分後、混合物は凝固し、壁圧が５ｍｍである外径１５ｍｍのチューブを形成した。チューブを水で完全に洗浄し、次いで凍結乾燥によって乾燥した。

自己組織化スーパーマクロポーラスチューブの写真を図１０に示す。

実施例７−クロマトグラフ分離用のスーパーマクロポーラスカラムのモノリスの調製
水（１０ｃｍ^３）中にポリ−ε−リシン（０．４９ｇ、アミン含有量２．９ｍｍｏｌ）、ドデカン二酸（０．３５ｇ、カルボキシル含有量３．０ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（０．１１５ｇ、２．９ｍｍｏｌ）を含有する溶液を調製した。

ＥＤＣＩ（１．４５ｇ、７．５ｍｍｏｌ）およびＨＯＮＳｕ（０．１６５ｇ、１．４ｍｍｏｌ）の水（３ｃｍ^３）溶液を上の溶液に添加し、混合物を直ちに使用して空のＨＰＬＣカラム（直径４．６ｍｍ×１０ｃｍ）に充填した。

２０〜３０分後、混合物は凝固し、モノリスを形成した。モノリスをＨＰＬＣシステム上で完全に洗浄した。

実施例８−抗体を精製するための、架橋ポリ−ε−リシンスーパーマクロポーラスカラムのモノリス上でのプロテインＡの固定化
ｒプロテインＡの架橋ポリ−ε−リシンへのカップリング
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１ｇ）を冷ＭＥＳ緩衝液（２５ｍｍｏｌ／ｄｍ^３、ｐＨ５．０、２．５ｃｍ^３）に溶解し、ＥＤＣＩ（１ｇ）を溶解したＭＥＳ緩衝液（２５ｍｍｏｌ／ｄｍ^３、ｐＨ５．０、２．５ｃｍ^３）と混合した。この溶液を、ＨＰＬＣポンプを使用してモノリスに通した。モノリスをＭＥＳ緩衝液（２５ｍｍｏｌ／ｄｍ^３、ｐＨ５．０、５０ｃｍ^３）で洗浄し、直ちにｒプロテインＡ（２５ｍｍｏｌ／ｄｍ^３ＭＥＳ、ｐＨ５．０中に５ｃｍ^３、４ｍｇ／ｃｍ^３）の溶液をカラム上にかけ、一晩静置した。モノリスをＴｒｉｚｍａ−ＨＣｌ（３０ｃｍ^３ ｐＨ７．４）で洗浄し、ポリマー上の残りのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをすべてブロックした。モノリスを水（１００ｃｍ^３）で洗浄し、水中で保存した。

プロテインＡベースのモノリスを試験して、当業者に公知の標準条件下でそれがヒトＩｇＧを保持するかどうかを判定した。カラムは、予想通りにヒトＩｇＧを保持することが示された。

実施例９−電界紡糸繊維の調製
ＤＭＳＯ（６ｃｍ^３）中にポリアクリロニトリル（０．８ｇ、平均分子量１５０，０００）、ポリ−ε−リシン（０．４ｇ）およびセバシン酸（０．２４ｇ）を含有する溶液を、電界紡糸し（２４ｋＶ、０．５ｃｍ^３／時）、４０℃および湿度３０％の回転ドラム上に移した。

生成した電界紡糸繊維のマットの一部分（５ｃｍ２）をＥＤＣＩの水溶液（５ｃｍ^３の水に１ｇ）で１時間処理し、水で完全に洗浄した。得られた架橋繊維マットをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで完全に洗浄し、ＰＡＮ支持体を除去し、次いでメタノールで洗浄し、その後風乾した。

得られた架橋ナノ繊維マットのＳＥＭを図１１に示す。

実施例１０−光学的に透明なレンズの調製
水（１．５ｃｍ^３）中にポリ−ε−リシン（０．４９ｇ、アミン含有量２．９ｍｍｏｌ）、セバシン酸（０．１５ｇ、カルボキシル含有量１．４５ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（０．０６ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を含有する溶液を調製した。

ＥＤＣＩ（０．８３ｇ、４．３５ｍｍｏｌ）の水（１ｃｍ^３）溶液を上の溶液に添加し、混合物を直ちに使用してポリプロピレンの試験チューブの底部に充填し、レンズをキャストできることを実証した。

２０〜３０分後、混合物は凝固し、コンタクトレンズに類似した透明なポリマーを形成した。レンズを水で完全に洗浄し、次いで放置して風乾した
レンズの写真を図１２に示す。

Claims (23)

1. 非粒状の架橋ポリ−ε−リシンポリマー。
2. アミド結合によって連結された、ポリ−ε−リシンと架橋剤とを含む、請求項１に記載のポリマー。
3. ポリ−ε−リシンのアルファ炭素のアミンと反応することができる少なくとも２つの官能基を含む架橋剤で架橋される、請求項１または２に記載のポリマー。
4. 架橋剤が、２つ以上のカルボン酸基と、該２つ以上の基を連結する脂肪族鎖とを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリマー。
5. 水に不溶性である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリマー。
6. 多孔質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリマー。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリマーを含む、非粒状支持体。
8. 架橋ポリ−ε−リシン支持体が、非粒状媒体を直接的にまたは間接的にコーティングするために使用される、請求項７に記載の非粒状支持体。
9. 架橋ポリ−ε−リシン支持体が、非粒状媒体をコーティングするために使用され、かつ非粒状媒体に共有結合される、請求項７または８に記載の非粒状支持体。
10. 架橋ポリ−ε−リシンが、有機非粒状媒体をコーティングするために使用される、請求項７〜９のいずれか一項に記載の非粒状支持体。
11. 架橋ポリ−ε−リシンが、無機非粒状媒体をコーティングするために使用される、請求項７から９のいずれか一項に記載の非粒状支持体。
12. 架橋ポリ−ε−リシンが官能化されて、触媒、ペプチド合成の開始剤種、オリゴヌクレオチド合成の開始剤種、固相有機合成の開始剤種、薬学的活性物質、農薬的活性物質、クロマトグラフ分離用の表面、細胞培養または分化を促進するための種、タンパク質または他の生体巨大分子を含む材料をもたらす、請求項７〜１１のいずれかに記載の非粒状架橋ポリ−ε−リシンベースの支持体。
13. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の架橋ポリ−ε−リシンを含む、三次元構造体。
14. ミクロポーラス、マクロポーラスまたは繊維である、請求項１３に記載の三次元構造体。
15. 架橋ポリ−ε−リシンでコーティングされた請求項１３または１４に記載の三次元マクロポーラス構造体であって、コーティングするために使用される架橋ポリ−ε−リシンが、ミクロポーラス、マクロポーラスまたは繊維構造体に直接的または間接的に共有結合される、三次元マクロポーラス構造体。
16. 架橋ポリ−ε−リシンでコーティングされた請求項１３または１４に記載の三次元マクロポーラス構造体であって、コーティングするために使用される架橋ポリ−ε−リシンが、ミクロポーラス、マクロポーラスまたは繊維構造体に共有結合されない、三次元マクロポーラス構造体。
17. 架橋ポリ−ε−リシンが官能化されて、触媒、ペプチド合成の開始剤種、オリゴヌクレオチド合成の開始剤種、固相有機合成の開始剤種、薬学的活性物質、農薬的活性物質、クロマトグラフ分離用の表面、細胞培養または分化を促進するための種、タンパク質または他の生体巨大分子を含む材料をもたらす、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の三次元架橋ポリ−ε−リシンベースの支持体。
18. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリマーまたは請求項７〜１７のいずれか一項に記載の支持体を含む、シート、物品、または繊維。
19. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリマーもしくは請求項７〜１７のいずれか一項に記載の支持体、および創傷を治療するための成分もしくは組成物、ならびに／または治療剤を含む、創傷治療製品。
20. ポリマーまたは支持体がシートの形状である、請求項１９に記載の創傷治療製品。
21. 請求項７〜１７８のいずれか一項に記載の非粒状支持体を含み、かつ該支持体に結合したまたは保持される機能材料を含む、医学的診断薬。
22. 機能材料が、ポリマーによって担持される酵素を含む、請求項２１に記載の医学的診断薬。
23. ペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖の固相合成；固相抽出；固相有機化学；固相試薬、金属触媒および他の触媒、生体触媒、酵素、タンパク質、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含めた抗体、細胞全体ならびにポリマーから選択される種の固定化；細胞培養；クロマトグラフ分離用固定相の調製から選択されるプロセスにおける、あるいは吸収剤としてまたは徐放製品用の生分解性担体として使用するための、請求項７〜１７のいずれか一項に記載の非粒状支持体の使用。