CN116392639A - 一种全层修复双层支架及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种全层修复双层支架及其制备方法及应用。利用电纺丝的方法制备的聚乳酸‑羟基乙酸纤维膜与柠檬酸交联的壳聚糖溶液制成复合水凝胶，利用多巴胺聚合吸附药物淫羊藿苷制成上层支架；将电纺丝方法制备的左旋聚乳酸/羟基磷灰石纤维膜与柠檬酸交联的壳聚糖溶液混合，制成复合支架，利用多巴胺聚合吸附药物槲皮素制成下层支架；然后在软骨层和骨层支架中间滴加柠檬酸交联的壳聚糖溶液得到双层复合支架。本发明将两种中药淫羊藿苷和槲皮素与生物支架结合，分别促进间充质干细胞在上层支架向成软骨和间充质干细胞在下层支架向成骨分化。植入体内后，具有良好的生物相容性，可有效修复关节软骨与软骨下骨的损伤，具有良好的临床应用前景。

Description

一种全层修复双层支架及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物材料领域与医用复合支架的技术领域，尤其涉及一种用于修复软骨与软骨下骨损伤的一种全层修复双层支架及其制备方法及应用。

背景技术

膝骨关节炎(KOA)是临床常见病,以关节软骨退化、关节周围和软骨下骨的结构改变为主要特征，由于软骨本身代谢能力低,修复能力有限,即使小到的浅层软骨损伤也不能自行修复。针对骨软骨损伤，以往的研究通常着重于对软骨的修复，而忽略了骨修复在其中的作用，因此修复效果并不令人满意。近年来，对于软骨和软骨下骨的组织学研究为骨软骨修复提供了新的思路。骨软骨组织可分为上层的软骨以及下层的软骨下骨两个部分，二者具有不同的组织结构和生物力学性能，所以我们的修复也应该更具有针对性，从而达到软骨与软骨下骨一起修复的目的。

骨软骨损伤的治疗及难点：在临床上，治疗骨软骨缺损的常用方法包括微骨折术、自体骨软骨移植和同种异体骨软骨移植等。微骨折术是从软骨损伤部位向软骨下骨钻孔以沟通髓腔，使来源于骨髓的富含营养物质、多种生长因子和种子细胞的血凝块充盈于骨软骨损伤部位，最终达到骨软骨损伤修复的目的。对于软骨损伤来说，微骨折术具有操作难度低、效果良好等特点。然而，微骨折术对于损伤面积过大的软骨损伤效果并不明显。此外，微骨折术最终形成一种纤维软骨瘢痕组织，这样的组织以I型胶原为主，II型胶原水平相对较低，这同样是微骨折术对于较大面积软骨缺损效果较差的原因之一，同样有研究显示，对于年轻患者来说，微骨折术的长期预后并不能令人满意。自体骨软骨移植通常要求供体具有与受体区域相仿的力学特性和生物学特性。然而，有一些临床研究显示自体的骨软骨移植物通常很难满足这一要求，目前来看，自体骨软骨移植面临的最主要问题是供区的发病情况，甚至造成严重的功能障碍。与自体骨软骨移植相比，同种异体骨软骨移植不但可以避开供区损伤的难题，还具有手术时间短和解剖结构高度匹配等优势，然而，同种异体骨软骨移植最大的限制就是难以及时获得相应的供体。并且，疾病传播、免疫排斥反应以及费用问题都不利于同种异体骨软骨移植的开展。因此，迫切需要替代疗法治疗骨软骨损伤。

组织工程技术为组织再生提供可行的方法，其已经在许多组织和器官的修复重建中被应用。不同类型的生物降解材料已经被用来修复软骨损伤。传统的均相支架难以同时平衡软骨形成和骨生成的需要以修复骨软骨损伤。

目前常用的支架材料大体可分为天然材料如胶原、透明质酸、壳聚糖等,人工材料如经基磷灰石、聚乳酸等。能否提供一个类似软骨细胞外基质理化环境是衡量载体材料是否适合的重要标准。关节软骨基质的主要化学成分是蛋白多糖和胶原。蛋白多糖是以透明质酸分子为主干,干链上许多短链蛋白共价结合氨基葡聚糖。天然材料包括各种基于胶原的载体材料、明胶,或者胶原和藻酸盐混合形成的凝胶剂,其最突出优点是无抗原性,生物相容性好,与细胞外基质结构相似,参与组织的愈合过程,然而由于降解太快,在作为细胞支架时往往提前塌陷而达不到诱生新组织的目的。人工合成多聚生物材料有PGA、PLLA(聚乳酸),或者混合物,这些载体材料有可塑性,有一定的强度,作为软骨组织工程支架材料能较好诱导、促进软骨细胞的粘附、增殖和分化,形成软骨组织主要缺点是降解较快,易出现崩解,使支架整体塌陷。而且由于降解过快,降解产物羟基酸在局部积聚,会造成局部值下降,使细胞中毒乃至死亡。

目前，由支架、种子细胞和有利的生长因子组成的组织工程已发展成为最有前途的软骨组织修复策略。移植种子细胞后，由于细胞外基质支持不足和炎症造成大量细胞死亡，得不到预期的效果，所以最佳的生物支架应具有生物相容性和生物可吸收性，同时支持细胞生长和分化，提供适应的机械环境并允许细胞营养物质的运输。纤维支架的孔隙率、纤维直径和纤维方向等性质能影响细胞的生理特性。通常纤维支架与细胞在体外结合，并预制成一定形状及尺寸，形成具有稳定机械结构的支架-细胞复合物，然后被植入体内修复缺损的组织，其缺点是预制的形状及尺寸难以完全满足缺损部位的不规则形状，不能与周围的组织很好地结合在一起。

对于骨修复材料的选择，一般要求材料具有良好的力学特性和骨传导性能。目前常用的人工骨材料，多数为磷酸钙材料，包括羟基磷灰石(HA)、β-磷酸三钙、白磷钙石和生物陶瓷等。其中，HA由于显示出良好的骨诱导特性和骨传导性以及其高生物相容性和与天然骨组织整合的能力而被用作骨植入物的主要材料。然而，HA所面临的主要问题是其在体内环境下降解缓慢。在骨折的愈合过程中，只有到达骨痂改造塑形阶段能够进行一定的负重，此时成骨和破骨活动同时进行，对骨折的长期预后至关重要，由此可推测骨修复材料的最佳降解时间应与该阶段相对应；目前公认这一过程需要大约8-12周的时间，而HA所需要的降解时间远超过12周；因此，单纯的HA材料并不利于骨缺损的修复。此外，机械性能较脆、可塑性较差和难以形成微孔结构等问题也阻碍着单纯HA材料作为植入的应用。同样单纯PLGA支架的机械性能同样也很难满足成骨的需要。

生长因子已经被证实在组织再生中具有十分重要的作用，既往的研究中有使用TGF-β可以促进软骨再生，已经有大量的研究表明TGF-β能够促进MSCs向软骨细胞分化，然而，TGF-β在体内的半衰期很难超过几个小时，而软骨修复需要几个月的时间，这就意味着在TGF-β发挥作用前就已经失活；如果持续注射TGF-β的话，则会产生骨赘形成和滑膜纤维化等不良反应，影响软骨修复效果；此外，TGF-β还可能存在致瘤性和毒性，这些缺点限制了它的临床应用。

发明内容

本发明的目的：为了克服现有技术存在的问题(材料不利于细胞生长、材料的孔径率、材料的生物相容性；在修复软骨的同时没有修复软骨下骨，软骨细胞来源有限)，提供一种全层修复双层支架及其制备方法，并将此支架应用于修复软骨及软骨下骨的损伤。

一种全层修复双层支架，所述全层修复双层支架包括相互连接的上下两层，其中上层载有中药单体淫羊藿苷，材质由聚乳酸和羟基乙酸和柠檬酸交联的壳聚糖和多巴胺构成；下层载有中药单体槲皮素，材质由左旋聚乳酸和羟基磷灰石和柠檬酸交联的壳聚糖溶液和多巴胺构成。

一种全层修复双层支架的制备方法，包括如下步骤：

S1、制备载淫羊藿苷的上层支架，即水凝胶：ICA@PDA/PLGA/CC；

S11：利用静电纺丝的方法制作聚乳酸-羟基乙酸PLGA纤维膜；

称取10g的三氟乙醇作为溶剂，将PLGA、PEO加入到三氟乙醇中，混合搅拌过夜；采用电压为5-6kv，注射速率为0.5cm/h，滚筒速度为1000r/min进行取向纺丝，得到PLGA纤维膜；最后将PLGA纤维膜在真空干燥箱内干燥3-4天，利用扫描电子显微镜观察所得纤维的形貌并测定其平均直径；

S12：制备PLGA/CC复合水凝胶；

首先，将壳聚糖CS加入到的乙酸水溶液中进行搅拌过夜，等到完全溶解后加入柠檬酸CA，搅拌约4个小时左右直至混匀，得到柠檬酸交联的壳聚糖溶液CC；然后，将PLGA纤维膜粉碎成短纤维，将其与壳聚糖水凝胶混合，搅拌均匀，静置除泡；将样品溶液缓慢倒入孔板中，于-7℃的冰箱内冷冻放置4天；4天后从冰箱内取出冷冻的PLGA/CC复合水凝胶，在复合水凝胶表面加入NaOH溶液，缓慢酸碱中和解冻4h；最后，在NaOH溶液中将已成型的样品完全浸泡1h，然后再用大量蒸馏水冲洗成品至中性，利用冻干机冻2-3天，得到PLGA/CC复合水凝胶；

S13：PDA涂覆的PLGA/CC复合水凝胶；

将PLGA/CC复合水凝胶放在0.5mg/mL多巴胺溶液，所述多巴胺溶液为5mg多巴胺溶于10mlTris-HCl缓冲液中，室温下摇晃12h得到带有PDA涂层的PLGA/CC复合水凝胶，即PDA/PLGA/CC；

S14：载药PDA/PLGA/CC复合水凝胶的制备；

首先，称取6.77mg淫羊藿苷ICA，溶于1mL二甲基亚砜DMSO，配置成1×10^-2mol/L的ICA原液，-20℃保存备用，在后续实验中根据需要加入稀释液稀释后使用；

将ICA原液通过酒精稀释得到1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6mol/L三种不同浓度的药物溶液，然后将PDA/PLGA/CC分别浸泡在不同浓度的药物溶液中，100rpm震荡12h进行吸附，制备出不同浓度的ICA@PDA/PLGA/CC支架；

S2、然后制备骨层：QU@PDA/PLLA/HAP/CC；

S21：利用静电纺丝方法获取PLLA/HAP纤维；

将0.7g wt＝70％的左旋聚乳酸PLLA、0.2g wt＝20％的羟基磷灰石HAP、0.1gwt＝10％的聚氧化乙烯PEO加入5ml的六氟异丙醇中，混合搅拌均匀，采用电压为6-7kv，注射速率为0.5cm/h，滚筒速度为1000r/min进行取向纺丝，得到PLLA/HAP纤维膜；最后，将PLLA/HAP纤维膜在真空干燥箱内干燥3-4天，利用扫描电子显微镜观察所得纤维的形貌并测定其平均直径；

S22：PLLA/HAP/CC复合支架的制备；

首先，将壳聚糖CS加入到的乙酸水溶液中进行搅拌过夜，等到完全溶解后加入柠檬酸CA，搅拌约4个小时左右直至混匀，得到柠檬酸交联的壳聚糖溶液CC；然后将PLLA/HAP纤维纤维膜粉碎的短纤维，按照质量比为W_PLLA/HAP:W_CS＝1:2与CC溶液混合，搅拌均匀，静置除泡.然后,将混匀的样品溶液缓慢倒入孔板中，放置于-80℃的冰箱内冷冻放置4天；4天后取出冷冻的复合水凝胶，在复合水凝胶表面加入适量的浓度为0.5mol/L NaOH溶液，缓慢酸碱中和解冻4h；最后在0.5mol/L的NaOH溶液中将已成型的样品完全浸泡1h；最后，再用大量蒸馏水冲洗成品至中性，利用冻干机冻2-3天，得到PLLA/HAP/CC复合支架；

S23：PDA涂覆PLLA/HAP/CC水凝胶的制备；

将PLLA/HAP/CC复合支架浸泡在多巴胺溶液，所述多巴胺溶液为0.5g多巴胺溶于10mMTris-HCl缓冲液中，室温下轻轻摇动12h得到PDA涂覆的PLLA/HAP/CC支架，即PDA/PLLA/HAP/CC；

S24：载药PDA/PLLA/HAP/CC支架的制备；

配置母液：称取6.04mg槲皮素QU，溶于2mL的无水乙醇，配置成1×10^-2mol/L的QU原液，-20℃保存备用，在后续实验中根据需要加入稀释液稀释后使用；

利用无水乙醇对QU原液进行稀释得到1×10^-6、1×10^-5、5×10^-5M三个浓度梯度，得到不同浓度的QU溶液，将PDA/PLLA/HAP/CC支架分别浸泡在不同药物溶液中100rpm震荡12h进行吸附制备出负载不同浓度的QU@PDA/PLLA/HAP/CC支架；

S3、骨-软骨双层支架的制备；

S31：具体包括：软骨层：1mm；骨层：2mm；直径：2.5mm；将软骨层支架溶液PLGA/CC和骨层支架溶液PLLA/HAP/CC在直径为3mm的呼吸管冷冻交联3天，然后取出冻干；冻干后用手术刀切成软骨层厚度为1mm，骨层厚度为2mm的支架；然后浸泡在0.5mg/mL多巴胺溶液，所述多巴胺溶液为0.5g多巴胺溶于10mMTris-HCl缓冲液中，室温下轻轻摇动12h，进行涂层；然后将PDA/PLGA/CC和PDA/PLLA/HAP/CC分别浸泡在ICA和QU溶液中，摇晃12h；最后，在ICA@PDA/PLGA/CC软骨层和QU@PDA/PLLA/HAP/CC骨层支架中间滴加50ul的柠檬酸交联的壳聚糖溶液将软骨层和骨层进行粘合，放置在-7℃冷冻交联2天，得到载药的全层修复双层支架。

一种全层修复双层支架的应用，将本发明制备得到的全层修复双层支架应用于软骨及软骨下骨缺损部位从而修复软骨与软骨下骨的损伤。

本发明是具有不同机械强度和不同内部空间结构的双层支架，可同时满足软骨与骨修复的要求。

本发明的全层修复双层支架中使用的部分支架材料为壳聚糖，避免降解太快或对细胞有毒性，壳聚糖是葡糖胺和乙酞葡糖胺的复合聚合物,与分子结构相似,能模拟软骨细胞外基质环境,壳聚糖是一种天然有机高分子多糖,由甲壳素脱乙酞化制备而来。甲壳素是甲壳类动物的外壳、昆虫的表皮和真菌类的细胞壁组成物。一般情况下，把脱乙酰化程度高于50％，可溶解于酸性水溶液的甲壳素称为壳聚糖。壳聚糖(chitosan，CS)是一种具有多重功效的多糖，由于分子链上含有大量氨基和羟基，能够与羰基、氨基、羟基等通过氢键或静电作用结合，因而可作为模板控制聚合反应。壳聚糖因所具有的天然阳离子性、生物降解性、生物相容性、降解产物无毒性、内在抑菌性等独特的物理化学性能，在生物医疗、功能纺织品、精细化工、水处理等领域都得到了广泛的研究和应用，是目前研究应用最广泛的生物聚合物材料之一。此外，壳聚糖被证明是一种潜在的生物活性剂，具有控制生物膜的形成，抗菌广谱性，凝血止痛，刺激免疫细胞释放炎症因子，加速伤口愈合、促进组织生长的能力，在生物医用材料领域应用展现了巨大潜力。由于壳聚糖具有优异的细胞亲和性、生物降解性和组织相容性，壳聚糖结构中的乙酸化葡萄胺与软骨基质糖胺多糖结构相似,其降解产物为乙酞氨基葡萄糖和氨基葡萄糖,进入糖胺聚糖和糖蛋白代谢途径,甲基化过程中产生的低分子量甲壳素胺或寡聚糖在体内不积累,无免疫原性、无毒性、无刺激性、无热原反应、无致突变效应等,在用组织工程方法构建组织工程软骨和修复关节软骨缺损的过程中,生物支架提供一个稳定的三维空间支架结构,并保持足够空隙率,供细胞在其中进行物质交换、生长代谢,引导组织形成。壳聚糖具有抗菌和抗炎特性，这有利于减弱组织工程支架植入机体后产生的副作用。

本发明用于制备全层修复双层支架的材料利用静电来制造纳米级的聚合纤维支架材料，模仿体内软骨细胞外基质的胶原纤维。静电纺丝技术可以经济、快速地制备纳米或微米纤维，在电纺支架中封装蛋白质、抗菌药物等生物活性物质可以实现生物活性分子的传递从而促进椎纤维环组织的再生，目前静电纺丝技术已经成为一种用于生产多聚纳米纤维和创新生物材料的技术，通过该技术生产的纳米纤维具有结构可定制性、孔隙率高、比表面积大、均一性好的优点，可以产生类似于天然细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的纤维网络，因而常被用于组织工程中模拟ECM的纤维结构，以及传递生物活性物质。此外，静电纺丝纤维较大的比表面积类似于纤维环细胞ECM有利于细胞黏附和生长，为细胞提供了适宜的生存环境，因此静电纺丝已经成为重造纤维环组织结构的理想技术。由于静电纺丝纳米纤维的内部连接易通过交联、共价键结合、包埋等方法固定生物酶并使其均匀分散，从而提高酶的催化活性。通过改进的纺丝技术制备的具有纳米纤维纱线结构的支架，在保持纤维结构的基础上，又可以具有取向、多孔的微观结构，对于仿生三维组织的结构有重要的作用。静电纺丝支架具有较高的表面积与体积比，完全相连的孔隙及排列整齐的纤维可模仿各类组织的内环境，为软骨细胞和干细胞的增殖、分化提供良好的环境。

纤维支架一般使用的材料是聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)，聚乙醇酸(PGA)是一种具有良好生物降解性和生物相容性的合成高分子材料，一般以乙醇酸制中间产品乙交酯，乙交酯开环聚合成PGA。聚乳酸(PLA)又称为聚丙交酯，是以乳酸为单体聚合成的一类脂肪族聚酯。PLA植入生物体内后，随着时间的推移，在体内各种酶的作用下，聚乳酸主链上的酯键会慢慢开始水解，然后就会被降解成了乳酸单体。而乳酸分子在生物体内部经过多次循环作用后，最终被分解得到H₂O和CO₂。因此，对生物体来说没有任何的毒副作用，也不会污染环境。PLA也是因为其良好的生物安全和相容性，PGA与PLA相比主链单元少一个甲基，因而较PLA亲水性好、水解速度快。本发明的全层修复双层支架中，上层支架是使用了PLA和PGA的共聚物PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)，PLGA在机械和降解性能方面有了进一步的优化，通过改变PLA和PGA比例能调节PLGA的降解速率。将Ⅱ型胶原与PLLA/PLGA支架结合后，能促进软骨细胞的增殖和糖胺聚糖的沉积，同时通过阻止宿主组织浸润和包膜形成，减少炎症反应。

本发明采用了PLGA/HA多孔支架，这种支架既保留了HA的骨传导特性、成骨特性和成骨诱导性，同样也使得支架的力学特性和生物可降解特性可被调节。

本发明上层支架负载的中药单体淫羊藿苷，现代药理学研究表明淫羊藿苷(ICA)作为淫羊藿的主要活性成份，具有的补肝肾、强筋骨、祛风湿、抗衰老、提高免疫力、抑制肿瘤等药理作用。淫羊藿苷为淫羊藿的主要有效成分，具有多种复杂药效，研究表明淫羊藿苷能有效地促进BMSCs向软骨细胞定向分化并能增加软骨细胞特有的蛋白质产物。通过利用多巴胺聚合吸附药物淫羊藿苷可缓慢释放进行长久的软骨修复。

对于促进成骨的生长因子而言，目前最常应用的是骨形态发生蛋白(BMP)，尤其是BMP-2，在组织工程中，BMP-2通常被固定在支架上以促进成骨细胞分化，但因为从骨中分离出的天然BMP-2数量有限，同时蛋白质生长因子的共同缺点是半衰期短(数分钟至数小时)和清除率高，因此，需将初始剂量较高的BMP-2应用于缺损部位，以在愈合期间维持有效的体内浓度，然而超出生理剂量的BMP-2易产生不良反应，例如血肿、良性骨囊肿和癌症等。本发明下层支架负载的中药单体为槲皮素，槲皮素为中药杜仲的主要成分，有抗骨质疏松的作用，杜仲有补肝肾、利尿、消炎、润肠通便等功效，已有研究证实槲皮素对于脂肪来源的干细胞，具有抑制增殖和促进成骨分化的作用。

本发明是负载有淫羊藿苷和槲皮素的双层生物支架用来修复软骨以及软骨下骨损伤，负载有淫羊藿苷的上层支架修复软骨层，负载有槲皮素的下层支架修复软骨下骨层，从而达到骨软骨同步一体化修复的目的。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明制备出的载有淫羊藿苷、槲皮素两种中药单体的双层生物支架，该支架对细胞无生物毒性且能缓慢释放药物。

2、将临床使用有效的中药单体即淫羊藿苷和槲皮素与双层生物支架相结合可以实现定向输送药物，更好地促进间充质干细胞上层向成软骨和下层向成骨分化，从而能更能够有效的修复软骨与软骨下骨的损伤，为后期临床治疗软骨及软骨下骨损伤的患者提供可行性。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

一种全层修复双层支架，所述全层修复双层支架包括相互连接的上下两层，其中上层载有中药单体淫羊藿苷，材质由聚乳酸和羟基乙酸和柠檬酸交联的壳聚糖和多巴胺构成；下层载有中药单体槲皮素，材质由左旋聚乳酸和羟基磷灰石和柠檬酸交联的壳聚糖溶液和多巴胺构成。

一种全层修复双层支架的制备方法，包括如下步骤：

S1、制备载淫羊藿苷的上层支架，即水凝胶：ICA@PDA/PLGA/CC；

S11：利用静电纺丝的方法制作聚乳酸-羟基乙酸PLGA纤维膜；

称取10g的三氟乙醇作为溶剂，将PLGA、PEO加入到三氟乙醇中，混合搅拌过夜；采用电压为5-6kv，注射速率为0.5cm/h，滚筒速度为1000r/min进行取向纺丝，得到PLGA纤维膜；最后将PLGA纤维膜在真空干燥箱内干燥3-4天，利用扫描电子显微镜观察所得纤维的形貌并测定其平均直径；

S12：制备PLGA/CC复合水凝胶；

首先，将壳聚糖CS加入到的乙酸水溶液中进行搅拌过夜，等到完全溶解后加入柠檬酸CA，搅拌约4个小时左右直至混匀，得到柠檬酸交联的壳聚糖溶液CC；然后，将PLGA纤维膜粉碎成短纤维，将其与壳聚糖水凝胶混合，搅拌均匀，静置除泡；将样品溶液缓慢倒入孔板中，于-7℃的冰箱内冷冻放置4天；4天后从冰箱内取出冷冻的PLGA/CC复合水凝胶，在复合水凝胶表面加入NaOH溶液，缓慢酸碱中和解冻4h；最后，在NaOH溶液中将已成型的样品完全浸泡1h，然后再用大量蒸馏水冲洗成品至中性，利用冻干机冻2-3天，得到PLGA/CC复合水凝胶；

S13：PDA涂覆的PLGA/CC复合水凝胶；

将PLGA/CC复合水凝胶放在0.5mg/mL多巴胺溶液，所述多巴胺溶液为5mg多巴胺溶于10mlTris-HCl缓冲液中，室温下摇晃12h得到带有PDA涂层的PLGA/CC复合水凝胶，即PDA/PLGA/CC；

S14：载药PDA/PLGA/CC复合水凝胶的制备；

首先，称取6.77mg淫羊藿苷ICA，溶于1mL二甲基亚砜DMSO，配置成1×10^-2mol/L的ICA原液，-20℃保存备用，在后续实验中根据需要加入稀释液稀释后使用；

将ICA原液通过酒精稀释得到1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6mol/L三种不同浓度的药物溶液，然后将PDA/PLGA/CC分别浸泡在不同浓度的药物溶液中，100rpm震荡12h进行吸附，制备出不同浓度的ICA@PDA/PLGA/CC支架；

S2、然后制备骨层：QU@PDA/PLLA/HAP/CC；

S21：利用静电纺丝方法获取PLLA/HAP纤维；

将0.7g wt＝70％的左旋聚乳酸PLLA、0.2g wt＝20％的羟基磷灰石HAP、0.1gwt＝10％的聚氧化乙烯PEO加入5ml的六氟异丙醇中，混合搅拌均匀，采用电压为6-7kv，注射速率为0.5cm/h，滚筒速度为1000r/min进行取向纺丝，得到PLLA/HAP纤维膜；最后，将PLLA/HAP纤维膜在真空干燥箱内干燥3-4天，利用扫描电子显微镜观察所得纤维的形貌并测定其平均直径；

S22：PLLA/HAP/CC复合支架的制备；

首先，将壳聚糖CS加入到的乙酸水溶液中进行搅拌过夜，等到完全溶解后加入柠檬酸CA，搅拌约4个小时左右直至混匀，得到柠檬酸交联的壳聚糖溶液CC；然后将PLLA/HAP纤维纤维膜粉碎的短纤维，按照质量比为W_PLLA/HAP:W_CS＝1:2与CC溶液混合，搅拌均匀，静置除泡.然后,将混匀的样品溶液缓慢倒入孔板中，放置于-80℃的冰箱内冷冻放置4天；4天后取出冷冻的复合水凝胶，在复合水凝胶表面加入适量的浓度为0.5mol/L NaOH溶液，缓慢酸碱中和解冻4h；最后在0.5mol/L的NaOH溶液中将已成型的样品完全浸泡1h；最后，再用大量蒸馏水冲洗成品至中性，利用冻干机冻2-3天，得到PLLA/HAP/CC复合支架；

S23：PDA涂覆PLLA/HAP/CC水凝胶的制备；

将PLLA/HAP/CC复合支架浸泡在多巴胺溶液，所述多巴胺溶液为0.5g多巴胺溶于10mMTris-HCl缓冲液中，室温下轻轻摇动12h得到PDA涂覆的PLLA/HAP/CC支架，即PDA/PLLA/HAP/CC；

S24：载药PDA/PLLA/HAP/CC支架的制备；

配置母液：称取6.04mg槲皮素QU，溶于2mL的无水乙醇，配置成1×10^-2mol/L的QU原液，-20℃保存备用，在后续实验中根据需要加入稀释液稀释后使用；

利用无水乙醇对QU原液进行稀释得到1×10^-6、1×10^-5、5×10^-5M三个浓度梯度，得到不同浓度的QU溶液，将PDA/PLLA/HAP/CC支架分别浸泡在不同药物溶液中100rpm震荡12h进行吸附制备出负载不同浓度的QU@PDA/PLLA/HAP/CC支架；

S3、骨-软骨双层支架的制备；

S31：具体包括：软骨层：1mm；骨层：2mm；直径：2.5mm；将软骨层支架溶液PLGA/CC和骨层支架溶液PLLA/HAP/CC在直径为3mm的呼吸管冷冻交联3天，然后取出冻干；冻干后用手术刀切成软骨层厚度为1mm，骨层厚度为2mm的支架；然后浸泡在0.5mg/mL多巴胺溶液，所述多巴胺溶液为0.5g多巴胺溶于10mMTris-HCl缓冲液中，室温下轻轻摇动12h，进行涂层；然后将PDA/PLGA/CC和PDA/PLLA/HAP/CC分别浸泡在ICA和QU溶液中，摇晃12h；最后，在ICA@PDA/PLGA/CC软骨层和QU@PDA/PLLA/HAP/CC骨层支架中间滴加50ul的柠檬酸交联的壳聚糖溶液将软骨层和骨层进行粘合，放置在-7℃冷冻交联2天，得到载药的全层修复双层支架。

进一步的，本发明步骤S11中，所述PLGA:PEO的浓度比为8:2，三氟乙醇的浓度为5％。

进一步的，本发明步骤S12中，所述乙酸水溶液的浓度为3％，壳聚糖CS与柠檬酸CA的混合质量比为7:3，聚乳酸-羟基乙酸纤维膜与壳聚糖水凝胶的混合质量比为1:2，NaOH溶液的浓度为0.5mol/L。

进一步的，本发明多巴胺溶液的pH值为8.5。

进一步的，本发明步骤S21中，左旋聚乳酸、羟基磷灰石、聚氧化乙烯的质量比为7:2:1。

进一步的，本发明步骤S22中，所述乙酸水溶液的浓度为3％，壳聚糖CS与柠檬酸CA的质量比为7:3，左旋聚乳酸PLLA/羟基磷灰石HAP纤维膜粉碎的短纤维与柠檬酸交联的壳聚糖溶液质量比为1:2。

一种全层修复双层支架的应用，将本发明制备得到的全层修复双层支架应用于软骨及软骨下骨缺损部位从而修复软骨与软骨下骨的损伤。

实施例1

一种载中药单体的双层生物支架的制备方法，具体步骤如下：

1、首先制备软骨层，即水凝胶：ICA@PDA/PLGA/CC；

1.1利用静电纺丝的方法制作聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纤维膜；

称取10g的三氟乙醇作为溶剂，将PLGA:PEO(8:2)加入到5wt％的三氟乙醇中，混合搅拌过夜；采用电压为5-6kv，注射速率为0.5cm/h，滚筒速度为1000r/min进行取向纺丝，得到PLGA纤维膜；最后将PLGA纤维膜在真空干燥箱内干燥3-4天，利用扫描电子显微镜观察所得纤维的形貌并测定其平均直径；

1.2制备PLGA/CC复合水凝胶；

首先，将壳聚糖(CS)加入到3％的乙酸水溶液中进行搅拌过夜，等到完全溶解后加入柠檬酸(CA)(CS:CA＝7:3)，搅拌约4个小时左右直至混匀，得到柠檬酸交联的壳聚糖溶液(CC)；然后，将PLGA纤维膜粉碎成短纤维，将其与壳聚糖水凝胶(W_PLGA:Wcs＝1:2)混合，搅拌均匀，静置除泡；将样品溶液缓慢倒入孔板中，于-7℃的冰箱内冷冻放置4天；4天后从冰箱内取出冷冻的PLGA/CC复合水凝胶，在复合水凝胶表面加入浓度为0.5mol/L的NaOH溶液，缓慢酸碱中和解冻4h；最后，在0.5mol/L的NaOH溶液中将已成型的样品完全浸泡1h，然后再用大量蒸馏水冲洗成品至中性，利用冻干机冻2-3天，得到PLGA/CC复合水凝胶；

1.3PDA涂覆的PLGA/CC复合水凝胶；

将PLGA/CC复合水凝胶放在0.5mg/mL多巴胺溶液(5mg多巴胺溶于10mlTris-HCl缓冲液中，pH＝8.5)中，室温下摇晃12h得到带有PDA涂层的PLGA/CC复合水凝胶(PDA/PLGA/CC)；

1.4载药PDA/PLGA/CC复合水凝胶的制备；

首先，称取6.77mg淫羊藿苷(ICA)，溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)，配置成1×10^-2mol/L的ICA原液，-20℃保存备用，在后续实验中根据需要加入稀释液稀释后使用；

将ICA原液通过酒精稀释得到1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6mol/L三种不同浓度的药物溶液，然后将PDA/PLGA/CC分别浸泡在不同浓度的药物溶液中，100rpm震荡12h进行吸附，制备出不同浓度的ICA@PDA/PLGA/CC支架；

2、制备骨层：QU@PDA/PLLA/HAP/CC；

2.1利用静电纺丝方法获取PLLA/HAP纤维

将0.7g的左旋聚乳酸PLLA(wt＝70％)和0.2g的羟基磷灰石HAP(wt＝20％)和0.1g的聚氧化乙烯PEO(wt＝10％)加入5ml的六氟异丙醇中，混合搅拌均匀，采用电压为6-7kv，注射速率为0.5cm/h，滚筒速度为1000r/min进行取向纺丝，得到PLLA/HAP纤维膜；最后，将PLLA/HAP纤维膜在真空干燥箱内干燥3-4天，利用扫描电子显微镜观察所得纤维的形貌并测定其平均直径；

2.2PLLA/HAP/CC复合支架的制备

首先，将一定量的CA加入到w＝3％的乙酸水溶液中进行搅拌过夜，等到完全溶解后，加入一定量的CA(W_CS:W_CA＝7:3)，搅拌约4个小时左右直至混匀；然后将PLLA/HAP纤维纤维膜粉碎的短纤维，按照一定质量比(W_PLLA/HAP:W_CS＝1:2)与CC溶液混合，搅拌均匀，静置除泡.然后,将混匀的样品溶液缓慢倒入孔板中，放置于-80℃的冰箱内冷冻放置4天；4天后取出冷冻的复合水凝胶，在复合水凝胶表面加入适量的浓度为0.5mol/LNaOH溶液，缓慢酸碱中和解冻4h；最后在0.5mol/L的NaOH溶液中将已成型的样品完全浸泡1h。最后，再用大量蒸馏水冲洗成品至中性，利用冻干机冻2-3天，得到PLLA/HAP/CC复合支架；

2.3PDA涂覆PLLA/HAP/CC水凝胶的制备

将PLLA/HAP/CC复合支架浸泡在0.5mg/mL多巴胺溶液(0.5g多巴胺溶于10mMTris-HCl缓冲液中，pH＝8.5)中，室温下轻轻摇动12h得到PDA涂覆的PLLA/HAP/CC支架(PDA/PLLA/HAP/CC)；

2.4载药PDA/PLLA/HAP/CC支架的制备

配置母液：称取6.04mg槲皮素(QU)，溶于2mL的无水乙醇，配置成1×10^-2mol/L的QU原液，-20℃保存备用，在后续实验中根据需要加入稀释液稀释后使用；

利用无水乙醇对QU原液进行稀释得到1×10^-6、1×10^-5、5×10^-5M三个浓度梯度，得到不同浓度的QU溶液，将PDA/PLLA/HAP/CC支架分别浸泡在不同药物溶液中100rpm震荡12h进行吸附制备出负载不同浓度的QU@PDA/PLLA/HAP/CC支架；

3、骨-软骨双层支架的制备，

具体包括：软骨层：1mm；骨层：2mm；直径：2.5㎜；将软骨层支架溶液(PLGA/CC)和骨层支架溶液(PLLA/HAP/CC)在直径为3mm的呼吸管冷冻交联3天，然后取出冻干；冻干后用手术刀切成软骨层厚度为1mm，骨层厚度为2mm的支架；然后浸泡在0.5mg/mL多巴胺溶液(0.5g多巴胺溶于10mMTris-HCl缓冲液中，pH＝8.5)中，室温下轻轻摇动12h，进行涂层；然后将PDA/PLGA/CC和PDA/PLLA/HAP/CC分别浸泡在ICA和QU溶液中，摇晃12h；最后，在ICA@PDA/PLGA/CC软骨层和QU@PDA/PLLA/HAP/CC骨层支架中间滴加50ul的柠檬酸交联的壳聚糖溶液将软骨层和骨层进行粘合，放置在-7℃冷冻交联2天，得到载药的骨-软骨双层复合支架。

实施例2、动物关节修复实验

1、材料名称及数量

供试品：实施例1各实例的全层修复支架，12个载药双层支架，12个不载药双层支架，共24个。

2、实验动物分组

取雄性SpragueeDawley(SD)大鼠(8周大)，24只。随机分成实验组、对照组,24只大鼠均在双侧膝关节制作骨软骨缺损模型,在实验组12只大鼠的右膝关节骨软骨缺损处植入载有淫羊藿苷、槲皮素的双层支架，左侧造模的膝关节不做处理，作为空白对照；对照组12只大鼠的右膝关节骨软骨缺损处植入不载药的双层支架，左侧造模的膝关节不做处理，作为空白对照。

3、实验动物造模

用水合氯醛腹腔内注射眺体重麻醉,麻醉起效后,将大鼠仰卧位放于操作台面上,以剪刀剪去术区鼠毛备皮,用的酒精消毒术区。两组于膝关节内侧,做直切口长约,切开皮肤、筋膜,顿性分离至股骨远端,切开关节囊,显露股骨髁,使髌骨向外侧脱位,应用特制的手术器械在SD大鼠双侧股骨的滑车槽中形成了全厚度的骨软骨缺损(直径2.5mm，深3mm)。造模后立即将载有淫羊藿苷、槲皮素的双层支架移植到实验组大鼠的右膝股骨远端的骨软骨缺损中，未治疗大鼠左膝的骨软骨缺损并作为空白对照。对照组在造模后立即将载有间充质干细胞的双层支架移植到对照组大鼠右膝股骨远端的骨软骨缺损中，未治疗大鼠左膝的骨软骨缺损并作为空白对照。用生理盐水彻底冲洗关节腔,去除造模形成软骨屑,用一丝线逐层缝合完成手术方案。所有的老鼠都回到他们的手术后的笼子并允许其自由移动。术后连续3日腹腔内注射青霉素40万单位,动物肢体不固定,正常饮食,动物在笼中自由活动。

4、标本处理

4.1取材、保存

分别于术后4周、8周、12周三个时间点取材,实验组每个时间点处死4只大鼠,对照组每个时间点处死4只大鼠。取双膝关节原切口,充分显露股骨远端关节面,于股骨髁上上用手锯垂直于骨干截下股骨远端。剔出周围软组织,将标本放置于液氮中保存。

5、研究内容

5.1.观察关节是否肿胀。

5.2.支架植入区域软骨修复情况以及CT检测软骨下骨修复情况。

6、实验结果

大体观察结果表明，植入后随时间增加，SD大鼠关节肿胀逐渐消退，且疼痛行为逐渐消失。在第8周时，在软骨损伤修复方面，载药支架组要优于空白支架组以及空白对照组，空白支架组与空白对照组相比软骨修复方面相仿。再修复软骨下骨方面，从CT扫描结果发现载药支架以及空白支架组都有一定的修复作用。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种全层修复双层支架，其特征在于，所述全层修复双层支架包括相互连接的上下两层，其中上层载有中药单体淫羊藿苷，材质由聚乳酸和羟基乙酸和柠檬酸交联的壳聚糖和多巴胺构成；下层载有中药单体槲皮素，材质由左旋聚乳酸和羟基磷灰石和柠檬酸交联的壳聚糖溶液和多巴胺构成。

2.一种制备权利要求1所述的全层修复双层支架的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、制备载淫羊藿苷的上层支架，即水凝胶：ICA@PDA/PLGA/CC；

S11：利用静电纺丝的方法制作聚乳酸-羟基乙酸PLGA纤维膜；

称取10g的三氟乙醇作为溶剂，将PLGA、PEO加入到三氟乙醇中，混合搅拌过夜；采用电压为5-6kv，注射速率为0.5cm/h，滚筒速度为1000r/min进行取向纺丝，得到PLGA纤维膜；最后将PLGA纤维膜在真空干燥箱内干燥3-4天，利用扫描电子显微镜观察所得纤维的形貌并测定其平均直径；

S12：制备PLGA/CC复合水凝胶；

首先，将壳聚糖CS加入到的乙酸水溶液中进行搅拌过夜，等到完全溶解后加入柠檬酸CA，搅拌约4个小时左右直至混匀，得到柠檬酸交联的壳聚糖溶液CC；然后，将PLGA纤维膜粉碎成短纤维，将其与壳聚糖水凝胶混合，搅拌均匀，静置除泡；将样品溶液缓慢倒入孔板中，于-7℃的冰箱内冷冻放置4天；4天后从冰箱内取出冷冻的PLGA/CC复合水凝胶，在复合水凝胶表面加入NaOH溶液，缓慢酸碱中和解冻4h；最后，在NaOH溶液中将已成型的样品完全浸泡1h，然后再用大量蒸馏水冲洗成品至中性，利用冻干机冻2-3天，得到PLGA/CC复合水凝胶；

S13：PDA涂覆的PLGA/CC复合水凝胶；

将PLGA/CC复合水凝胶放在0.5mg/mL多巴胺溶液，所述多巴胺溶液为5mg多巴胺溶于10mlTris-HCl缓冲液中，室温下摇晃12h得到带有PDA涂层的PLGA/CC复合水凝胶，即PDA/PLGA/CC；

S14：载药PDA/PLGA/CC复合水凝胶的制备；

首先，称取6.77mg淫羊藿苷ICA，溶于1mL二甲基亚砜DMSO，配置成1×10^-2mol/L的ICA原液，-20℃保存备用，在后续实验中根据需要加入稀释液稀释后使用；

将ICA原液通过酒精稀释得到1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6mol/L三种不同浓度的药物溶液，然后将PDA/PLGA/CC分别浸泡在不同浓度的药物溶液中，100rpm震荡12h进行吸附，制备出不同浓度的ICA@PDA/PLGA/CC支架；

S2、然后制备骨层：QU@PDA/PLLA/HAP/CC；

S21：利用静电纺丝方法获取PLLA/HAP纤维；

将0.7g wt＝70％的左旋聚乳酸PLLA、0.2g wt＝20％的羟基磷灰石HAP、0.1gwt＝10％的聚氧化乙烯PEO加入5ml的六氟异丙醇中，混合搅拌均匀，采用电压为6-7kv，注射速率为0.5cm/h，滚筒速度为1000r/min进行取向纺丝，得到PLLA/HAP纤维膜；最后，将PLLA/HAP纤维膜在真空干燥箱内干燥3-4天，利用扫描电子显微镜观察所得纤维的形貌并测定其平均直径；

S22：PLLA/HAP/CC复合支架的制备；

首先，将壳聚糖CS加入到的乙酸水溶液中进行搅拌过夜，等到完全溶解后加入柠檬酸CA，搅拌约4个小时左右直至混匀，得到柠檬酸交联的壳聚糖溶液CC；然后将PLLA/HAP纤维纤维膜粉碎的短纤维，按照质量比为W_PLLA/HAP:W_CS＝1:2与CC溶液混合，搅拌均匀，静置除泡.然后,将混匀的样品溶液缓慢倒入孔板中，放置于-80℃的冰箱内冷冻放置4天；4天后取出冷冻的复合水凝胶，在复合水凝胶表面加入适量的浓度为0.5mol/L NaOH溶液，缓慢酸碱中和解冻4h；最后在0.5mol/L的NaOH溶液中将已成型的样品完全浸泡1h；最后，再用大量蒸馏水冲洗成品至中性，利用冻干机冻2-3天，得到PLLA/HAP/CC复合支架；

S23：PDA涂覆PLLA/HAP/CC水凝胶的制备；

将PLLA/HAP/CC复合支架浸泡在多巴胺溶液，所述多巴胺溶液为0.5g多巴胺溶于10mMTris-HCl缓冲液中，室温下轻轻摇动12h得到PDA涂覆的PLLA/HAP/CC支架，即PDA/PLLA/HAP/CC；

S24：载药PDA/PLLA/HAP/CC支架的制备；

配置母液：称取6.04mg槲皮素QU，溶于2mL的无水乙醇，配置成1×10^-2mol/L的QU原液，-20℃保存备用，在后续实验中根据需要加入稀释液稀释后使用；

利用无水乙醇对QU原液进行稀释得到1×10^-6、1×10^-5、5×10^-5M三个浓度梯度，得到不同浓度的QU溶液，将PDA/PLLA/HAP/CC支架分别浸泡在不同药物溶液中100rpm震荡12h进行吸附制备出负载不同浓度的QU@PDA/PLLA/HAP/CC支架；

S3、骨-软骨双层支架的制备；

S31：具体包括：软骨层：1mm；骨层：2mm；直径：2.5mm；将软骨层支架溶液PLGA/CC和骨层支架溶液PLLA/HAP/CC在直径为3mm的呼吸管冷冻交联3天，然后取出冻干；冻干后用手术刀切成软骨层厚度为1mm，骨层厚度为2mm的支架；然后浸泡在0.5mg/mL多巴胺溶液，所述多巴胺溶液为0.5g多巴胺溶于10mMTris-HCl缓冲液中，室温下轻轻摇动12h，进行涂层；然后将PDA/PLGA/CC和PDA/PLLA/HAP/CC分别浸泡在ICA和QU溶液中，摇晃12h；最后，在ICA@PDA/PLGA/CC软骨层和QU@PDA/PLLA/HAP/CC骨层支架中间滴加50ul的柠檬酸交联的壳聚糖溶液将软骨层和骨层进行粘合，放置在-7℃冷冻交联2天，得到载药的全层修复双层支架。

3.根据权利2要求所述的制备方法,其特征在于，步骤S11中，所述PLGA:PEO的浓度比为8:2，三氟乙醇的浓度为5％。

4.根据权利2要求所述的制备方法,其特征在于，步骤S12中，所述乙酸水溶液的浓度为3％，壳聚糖CS与柠檬酸CA的混合质量比为7:3，聚乳酸-羟基乙酸纤维膜与壳聚糖水凝胶的混合质量比为1:2，NaOH溶液的浓度为0.5mol/L。

5.根据权利2要求所述的制备方法,其特征在于，多巴胺溶液的pH值为8.5。

6.根据权利2要求所述的制备方法,其特征在于，步骤S21中，左旋聚乳酸、羟基磷灰石、聚氧化乙烯的质量比为7:2:1。

7.根据权利2要求所述的制备方法,其特征在于，步骤S22中，所述乙酸水溶液的浓度为3％，壳聚糖CS与柠檬酸CA的质量比为7:3，左旋聚乳酸PLLA/羟基磷灰石HAP纤维膜粉碎的短纤维与柠檬酸交联的壳聚糖溶液质量比为1:2。

8.一种全层修复双层支架的应用，其特征在于，将权利要求2制备得到的全层修复双层支架应用于软骨及软骨下骨缺损部位从而修复软骨与软骨下骨的损伤。