CN111587121A - 用于再生人纤维软骨或弹性软骨的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于再生及治疗软骨，优选地，纤维软骨或弹性软骨的组合物、试剂盒以及利用其的再生方法。根据本发明的用于再生软骨的组合物及试剂盒能够以微创方法简单的给药于需要再生纤维软骨或弹性软骨或恢复损伤的部位，对降解酶表现出抗性而在体内没有毒性，并粘附或存留在受损伤的注入部位，从而提高周围细胞的活动并可诱导半月板缺损组织的有效再生。因此，本发明的组合物作为有助于生物体组织缺损部位的再生的介质，可以有效地用于生物‑生物体材料领域中。

Description

用于再生人纤维软骨或弹性软骨的组合物
技术领域
本发明涉及用于再生及治疗纤维软骨或弹性软骨的组合物、试剂盒及利用其的再生方法。
背景技术
像其他结缔组织一样，软骨由结缔组织细胞和细胞外基质组成，但是，与固有结缔组织不同，它是一种包含坚硬且具有一定程度的柔韧性的基质的特殊的结缔组织。软骨根据形成软骨基质的纤维的种类和特性分为透明软骨(hyaline cartilage)、弹性软骨(elastic cartilage)及纤维软骨(fibrous cartilage)。透明软骨主要包含II型胶原，是最常见的软骨种类。II型胶原大多数以微纤维(microfibrils)的形态示出，由于折射率(refractory index)与作为无定形物质的主要成分的蛋白质糖几乎相同，观察到纤维成分和无定形物质是均匀的物质。弹性软骨与透明软骨的区别在于，基质中富含弹性纤维。与其他软骨相比，纤维软骨中无定形物质较少而胶原纤维较多，这些纤维大部分排列在规定的方向上。形成纤维软骨的胶原纤维的胶原质的区别在于，它是I型胶原质。在骨关节面(articular surface)、肋软骨(costal cartilage)、气管(trachea)、支气管(bronchus)及喉软骨(laryngeal cartilage)等中观察到透明软骨。弹性软骨形成外耳(external ear)和会厌(epiglottis)及部分喉软骨，纤维软骨存在于椎间盘(intervertebral disc)、耻骨联合(symphysis pubis)、关节内半月板(meniscus)及关节内纤维软骨复合体(fibrocartilage complex)等中。
属于纤维软骨的半月板位于股骨与胫骨关节面之间，是在维持膝关节功能中起到重要作用的结构物之一。半月状软骨起到非常重要的作用，即，分散膝关节的负荷和应力、吸收冲击、对关节软骨起到润滑作用、并通过吸收外部冲击来保护关节软骨。这种半月板由位于膝关节的中间的半月状的软骨形成，软骨板在关节之间起到缓冲作用，当站立、行走或跑步时，体重从上而下传递时，关节软骨起到吸收冲击的作用，以免受伤。
详细地，半月板在左右膝关节中两个初月形状的软骨分别成对，将其分别称为外侧半月板及内侧半月板。前交叉韧带和后交叉韧带穿过它们之间，并连接上股骨和下胫骨。
运动员中半月板受损伤的情况较多。将其称为“半月板撕裂”，半月板撕裂通常发生在运动过程的情况较多。但是，在50岁后期到60岁中期的中年人中退行性关节炎进展到某种程度的情况下，半月板的背面突然被断开并发生许多撕裂，并且还存在中年妇女长时间下蹲或做弯曲膝盖的家务，导致半月板部位被撕裂的情况。像这样，半月板被撕裂或损坏的情况下，服用药物或进行手术治疗。细胞外基质的胶原蛋白组分有助于提供软骨板的强度，蛋白多糖细胞外基质(ECM)组分贡献于冲击吸收功能。并且，初月形状的组织包含血管化(vascularized)的外部部分和内部无血管的(avascular)区域。组织损伤存在于血管分布的外部部分的情况下，可进行缝合手术，但也不能进行缝合手术的情况，若组织损伤存在于没有血管的无血管区域，由于不能自然愈合，需要进行切除手术。目前，手术治疗法根据软骨板组织损伤大小或位置可分为部分切除(partial meniscectomy)或次全切除或全切除术(subtotal or total meniscectomy)等，通过切除术去除组织最终诱发退行性关节炎，因此需要作为根本治疗法的用于再生治疗受损伤的软骨板的技术。
作为防止由软骨板缺损引起的退行性关节炎的发生的治疗方法，目前，具有“同种半月板移植术”和“利用合成代替物的半月板再生治疗”，同种半月板移植术需要与软骨板的大小和形状相匹配的供体移植物，并且，由于存在还需要去除没有缺损的患者的软骨板部位的问题以及移植物的固定等问题，临床结果仍然很差。
用于再生半月板软骨板的医疗设备的开发成果目前在世界上处于早期阶段，当前所开发的医疗设备有利用聚氨酯(Polyurethane)医疗设备Actifit(Orteq Ltd.)和Nusurface(Active Implants LLS)及以胶原蛋白n(Collagen)为主要成分的医疗设备Menaflex(ReGen Biologics，Inc.)，所有产品仅在本国获得使用许可，而在其他地区尚未进行临床试验和获得食品药品监督管理局(FDA)许可。应用于临床不到两年，因此还处于早期阶段，并且匹配大小或形状的问题以及通过缝合技能固定代替物的技术问题成为一个很大的缺陷。
在基于支撑体的移植的情况下，是将加工成适当的形态的高分子支撑体与部分切除的软骨板缝合的方式，尽管已将其评估为替代上述同种半月板移植术的技术，但尚未证实其稳定性和有效性。并且，基于支撑体的移植术是将特定形态的支撑体插入软骨板为止，因此，存在必须切开膝关节的问题点。
因此，如同种半月板移植术不需要去除所有软骨板，且不需要供体软骨板，并且，如目前所正在尝试的利用代替物的软骨板再生治疗，无需匹配缺损部位大小或形状，需要一种即使不使用缝合技能也可进行更优秀的再生治疗的技术。
发明内容
技术问题
本发明人在解决必须伴随膝关节的切除及代替物的插入的现有技术的问题点并研究一种更简单的微创膝关节半月板软骨再生方法的过程中确认，若利用纤维蛋白原、凝血酶及生理活性高分子制备的水凝胶，即使通过微创方法也使作为纤维软骨的半月板有效地再生，从而完成了本发明。因此，本发明的目的在于，提供一种用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物、试剂盒，其包含利用纤维蛋白原、凝血酶及生理活性高分子制备的水凝胶。
技术方案
本发明提供一种包含水凝胶的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物，上述水凝胶包含：纤维蛋白；以及生理活性高分子，用于形成纤维蛋白和互穿网络聚合物(interpenetrating polymer network，IPN)结构。
并且，本发明提供包含用于再生软骨的上述组合物的用于再生纤维软骨或弹性软骨的支架。
并且，本发明提供用于再生纤维软骨或弹性软骨的试剂盒，包括：第一区域，包含纤维蛋白原溶液；以及第二区域，包含凝血酶及生理活性高分子。
并且，本发明提供用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物的制备方法，包括：步骤1)，准备10mg/ml至1000mg/ml的纤维蛋白原作为第一溶液；以及步骤2)，通过混合凝血酶及生理活性高分子来准备第二溶液。
并且，本发明提供纤维软骨或弹性软骨再生方法，包括将本发明的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物给药于需要治疗的个体的步骤。
并且，本发明提供包含水凝胶的用于预防或治疗纤维软骨或弹性软骨缺损疾病的药学组合物，上述水凝胶包含纤维蛋白；以及生理活性高分子，用于形成纤维蛋白和互穿聚合物网络结构。
并且，本发明提供纤维软骨或弹性软骨缺损疾病治疗方法，包括将本发明的用于再生纤维软骨及弹性软骨的组合物给药于需要治疗的个体的步骤。
发明的效果
根据本发明的用于再生软骨的组合物及试剂盒能够以微创方法简单的给药于需要再生纤维软骨或弹性软骨或恢复损伤的部位，对降解酶表现出抗性而在体内没有毒性，并粘附或存留在受损伤的注入部位，从而提高周围细胞的活动并可诱导半月板缺损组织的有效再生。因此，本发明的组合物作为有助于生物体组织缺损部位的再生的介质，可以有效地用于生物-生物体材料领域中。
附图说明
图1为示出根据本发明的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物及试剂盒的示意图以及由此制备的水凝胶的图。图1的A部分为示出包含纤维蛋白原及凝血酶和聚氧化乙烯(PEO)或普兰尼克(Pluronic)(P127)的混合物的注射器形态的试剂盒和利用形成纤维蛋白及纤维蛋白和互穿聚合物网络结构的生理活性高分子制备的本发明的水凝胶的图。
图1的B部分为示出包含纤维蛋白原、富含血小板血浆(PRP)及凝血酶和聚氧化乙烯或普兰尼克(P127)的混合物的注射器形态的试剂盒和利用形成纤维蛋白及纤维蛋白和互穿聚合物网络结构的生理活性高分子制备的本发明的水凝胶的图。
图2为示出水凝胶的弹性模量根据凝血酶浓度变化的图。图2的A部分为示出剪切弹性模量的图。图2的B部分为示出压缩弹性模量的图(t检验(student t-test)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图3为示出在1250U/ml的凝血酶浓度条件下水凝胶的压缩弹性模量及剪切弹性模量根据聚氧化乙烯和普兰尼克127(P127)的浓度变化而变化的图。图3的A部分为示出压缩弹性模量根据使用凝血酶、聚氧化乙烯制备的水凝胶的聚氧化乙烯浓度变化的图。图3的B部分为示出压缩弹性模量根据使用凝血酶、P127制备的水凝胶的P127浓度而变化的图。图3的C部分为剪切弹性模量根据所制备的水凝胶的聚氧化乙烯浓度变化的图(t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图4为示出在1250U/ml的凝血酶浓度、5.0％的聚氧化乙烯、10.0％的普兰尼克127(P127)的条件下，剪切弹性模量根据富含血小板血浆添加而变化的图。图4的A部分为示出确认添加纤维蛋白-聚氧化乙烯水凝胶(Fb/PEO)和富含血小板血浆的水凝胶(Fb/PEO+PRP)的剪切弹性模量的结果的图。图4的B部分为示出确认添加纤维蛋白-P127水凝胶(Fb/P127)和富含血小板血浆的水凝胶(Fb/P127+PRP)的剪切弹性模量的结果的图。图4的C部分为示出比较纤维蛋白、纤维蛋白-聚氧化乙烯、纤维蛋白-聚氧化乙烯-富含血小板血浆、纤维蛋白-P127、纤维蛋白-P127-富含血小板血浆水凝胶的剪切弹性模量的曲线图的图(曲线图顶端的*、**、***表示与纤维蛋白组进行比较时统计学上具有显著性)。
图5为示出所制备的纤维蛋白-P127、纤维蛋白-聚氧化乙烯水凝胶及对照组纤维蛋白单独处理组的处理胰蛋白酶时降解模式的图。
图6为示出与所制备的水凝胶混合的细胞在24小时后细胞存活率的图。图6的A部分为通过荧光显微镜观察的结果的图。图6的B部分为示出细胞存活度的曲线图。
图7为示出家兔的半月板损伤部位再生的结果的图。图7的A部分为示出在半月板损伤1周后，通过注入纤维蛋白、纤维蛋白-聚氧化乙烯、纤维蛋白-P127水凝胶，在4周、8周、12周肉眼观察到的半月板再生的形状的结果。图7的B部分为测量再生的半月板的面积的结果的曲线图。
图8为示出家兔的半月板损伤部位再生的结果的图。图8的A部分为示出在半月板损伤1周后，通过注入纤维蛋白-聚氧化乙烯、纤维蛋白-P127水凝胶，在4周、8周、12周观察到的半月板再生的形状的苏木和曙红(Hematoxylin&Eosin，H&E)、番红O(Safranin O)染色以及对I型胶原蛋白(Type I collagen)的免疫染色结果(x40)的图。图8的B部位示出组织学质量得分(Histological tissue quality score)的图(A：半月板切除术(Meniscectomy)，B：半月板切除术+纤维蛋白单独处理组，C：半月板切除术+纤维蛋白+聚氧化乙烯，D：半月板切除术+纤维蛋白+P127)。
图9为示出测量家兔的半月板损伤部位再生的半月板的强度的结果的图。
具体实施方式
下面，详细说明本发明。
本发明提供用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物，其包含纤维蛋白；以及水凝胶，包含用于形成纤维蛋白和互穿聚合物网络结构的生理活性高分子。
本发明的水凝胶的特征在于，生理活性高分子的高分子链可随机穿透通过纤维蛋白原和凝血酶的作用形成的纤维蛋白高分子网并形成互穿网络聚合物。这种形成有互穿聚合物网络结构的水凝胶不具有细胞毒性，不仅具有优秀的生物相容性，而且还可用微创方法注入需要再生纤维软骨或弹性软骨的部位。并且，在注入部位中，可长时间粘附或存留在损伤的部位而不会降解，可通过提高周围细胞的活动来有效地诱导纤维软骨或弹性软骨的再生，因此对纤维软骨及弹性软骨，更优选地，对半月板再生有效。
在本发明中，生理活性高分子可以包括但不限于可通过随机穿透纤维蛋白高分子网来形成互穿网络聚合物水凝胶的高分子，例如，可以为选自由海藻酸盐、壳聚糖、透明质酸、聚乙二醇(PEG)、纤维素、聚丙烯酸(PAA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚乙醇酸(PLA-PGA)、聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)、葡聚糖、葡聚糖-聚乙二醇、淀粉、胶原蛋白基凝胶、琼脂糖、氟酸、硫酸乙酰肝素、糖胺聚糖、聚氧化乙烯、氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物(P(EO-co-PO))及普兰尼克/普兰尼克组成的组中的至少一种，优选地，可以为选自由聚氧化乙烯(polyethylene oxide，以下PEO)或普兰尼克127(以下P127)组成的组中的一种以上。
在本发明中，成为再生对象的软骨可以是透明软骨(hyaline cartilage)、纤维软骨(fibrocartilage)或弹性软骨(elastic cartilage)中的纤维软骨或弹性软骨。纤维软骨是由白色纤维组织和软骨组织以不同比例混合而成的软骨，虽对压迫较强，但容易被撕裂并且排列成致密的状态。纤维软骨与透明软骨或结缔组织连接存在，其特征在于，通过在发生变形或压缩的部位起到缓冲作用来保持弹性并允许有限的运动。透明软骨主要有型胶原质形成，均匀地观察到纤维成分和无定形物质，但是，弹性软骨与透明软骨的区别在于，它在基质中富含弹性纤维，与透明软骨及弹性软骨相比，纤维软骨的明显的区别在于，无定形物质少，而胶原纤维多，并以规定地排列连接。尤其，区别在于形成纤维软骨的胶原纤维的胶原质为I型胶原质，与弹性软骨、透明软骨不同，纤维软骨没有明显的软骨膜。已知在纤维软骨中形成层板的I型胶原纤维束与相邻的层板成直角排列，与其他软骨不同，通过纤维软骨的这种特征性排列在椎间盘具有特殊的弹性，从而可以承受由体重负载等产生的压力。
在本发明中，成为优选的再生、恢复损伤的对象的纤维软骨或弹性软骨均可包括椎间盘或存在于髋臼唇、关节半月部位的各种纤维软骨及外耳、会厌及存在于部分喉软骨部位的各种弹性软骨，优选地，可以是选自由椎间盘软骨、耻骨联合软骨、半月板、关节内纤维软骨复合体、颞下颌关节软骨、胸锁关节(sternoclavicularjoint)的关节盘、髋臼窝(acetabular fossa)软骨、外耳、会厌及喉软骨组成的组中的一种以上。
在本发明中，半月板是指位于股骨与胫骨的关节面之间并在维持膝关节的功能中起到非常重要的作用的结构物之一，起到非常重要的作用，即，分散膝关节的负荷和应力、吸收冲击、对关节软骨起到润滑作用、并通过吸收外部冲击来保护关节软骨。这种半月板由位于膝关节的中间的半月状的软骨形成，软骨板在关节之间起到缓冲作用，当站立、行走或跑步时，体重从上而下传递时，关节软骨起到吸收冲击的作用，以免受伤。
包含纤维蛋白以及用于形成纤维蛋白和互穿聚合物网络结构的生理活性高分子的本发明的水凝胶对生物体的胰蛋白酶具有降解抗性，在相同的条件下，与纤维蛋白的降解时间相比，具有60小时至84小时以上的降解抗性，可以长时间保持凝胶形态，因此可以在体内长时间停留在目的部位，可以进一步有效地诱导纤维软骨再生。
本发明的水凝胶在100rad/s的震动数条件下可具有15kPa至40kPa的剪切弹性模量，并可具有10kPa至200kPa的压缩弹性模量。本发明的水凝胶具有如下优点，即，通过具有如上所述的弹性模量，再生纤维软骨时可保持柔韧性和弹性而不硬，由此可以容易地给药，而与纤维软骨缺损部位的大小和形态无关，周围细胞流入给药的水凝胶中以引起组织再生。
本发明的组合物还可包含富含血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)。富含血小板血浆能够以与作为水凝胶的准备物质的的纤维蛋白原混合的形态提供，在进一步包含富含血小板血浆的情况下，在100rad/s震动数条件下可具有更优秀的剪切弹性模量。
本发明的组合物为用于再生纤维软骨的水凝胶组合物形态，利用注射器等，通过微创有效地给药于需要再生纤维软骨或弹性软骨的部位。优选地，本发明的组合物可以是用于再生纤维软骨或弹性软骨再生，可用作再生纤维软骨或弹性软骨的支撑体。
因此，本发明提供包含本发明的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物的用于再生纤维软骨或弹性软骨的支架。
并且，本发明提供用于再生纤维软骨或弹性软骨的试剂盒，包括：第一区域，包含纤维蛋白原溶液；以及第二区域，包含凝血酶及生理活性高分子。
本发明的试剂盒由两个以上的区域组成，其目的在于，分装纤维蛋白原溶液和凝血酶及生理活性高分子。例如，优选地，其目的在于，分别包含纤维蛋白-聚氧化乙烯或纤维蛋白-F217水凝胶的制备物质。第一区域的第一溶液和第二区域的第二溶液可在双注射器的注射器中进行混合，通过纤维蛋白形成及互穿聚合物网络结构形成，可立即形成三维结构的水凝胶。
除了纤维蛋白原以外，第一区域还可包含富含血小板血浆。在通过进一步包含富含血小板血浆来制备水凝胶的情况下，可具有更优秀的剪切弹性模量，纤维蛋白原与富含血小板血浆的体积比为1：0.1至1：1，优选地，能够以1：0.1至1：0.8的体积比进行混合，包含在第一区域中。
本发明的试剂盒的目的在于，将作为用于制备水凝胶的制备物质的第一溶液及第二溶液包含在各个区域中，上述水凝胶包含纤维蛋白以及用于形成纤维蛋白和互穿聚合物网络结构的生理活性高分子的水凝胶，第一区域可包含浓度为10mg/ml至1000mg/ml的纤维蛋白原作为第一溶液，优选地，包含浓度为10mg/ml至500mg/ml的纤维蛋白原，更优选地，可包含浓度为50mg/ml至200mg/ml的纤维蛋白原。在第一区域中，第一溶液中还可包含抗纤维溶解剂，例如，还可包含0.5mg/ml(3TIU/mg至8TIU/mg)的抑肽酶，用KTU单位换算时，可包含100KIU/ml至5500KIU/ml的抑肽酶，优选地，可包含浓度为1950KIU/ml至5200KIU/ml的抑肽酶。第二区域中可含有第二溶液，第二溶液可含有凝血酶及生理活性高分子。第二溶液中可含有100Unit(U)/ml至5000Unit(U)/ml的上述凝血酶，优选地，可包含浓度为250U/ml至3000U/ml的上述凝血酶，更优选地，可包含浓度为250U/ml至2800U/ml的上述凝血酶。凝血酶在最终混合组合物中的最终浓度可以为250U/ml至1250U/ml，可包含5mg/ml至50mg/ml的氯化钙(CaCl2)，优选地，还可包含至5(w/v)％。上述生理活性高分子可包括但不限于可通过随机穿透纤维蛋白高分子网来形成互穿网络聚合物水凝胶的高分子，例如，海藻酸盐、壳聚糖、透明质酸、聚乙二醇、纤维素、聚丙烯酸、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸、聚乳酸-聚乙二醇、葡聚糖、葡聚糖-聚乙二醇、淀粉、胶原蛋白基凝胶、琼脂糖、氟酸、硫酸乙酰肝素、糖胺聚糖、聚氧化乙烯、氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物及普兰尼克/普兰尼克组成的组中的至少一种，优选地，可以为选自由聚氧化乙烯或P127组成的组中的一种以上。在上述生理活性高分子为聚氧化乙烯的情况下，在最终混合组合物中聚氧化乙烯的浓度为1％(w/v)至10％(w/v)，优选地，第二溶液中可含有2％(w/v)至20％(w/v)的聚氧化乙烯直至在最终混合组合物中聚氧化乙烯的浓度为1％(w/v)至5％(w/v)，优选地，可包含2％(w/v)至10(w/v)％的聚氧化乙烯。并且，在上述生理活性高分子为P127的情况下，在最终混合组合物中P127的浓度为1％(w/v)至20(w/v)％，优选地，第二溶液中可含有2％(w/v)至40(w/v)％的P127直至在最终混合组合物中P127的浓度为3％(w/v)至10(w/v)％，优选地，可包含6％(w/v)至20(w/v)％的P127。
在本发明中，试剂盒可以与用于医疗目的的医疗设备互换使用，优选的形态可以为双注射器形态。
并且，本发明提供用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物的制备方法，包括：步骤1)，准备10mg/ml至1000mg/ml的纤维蛋白原作为第一溶液；以及步骤2)，通过混合凝血酶及生理活性高分子来准备第二溶液。
根据本发明的制备方法，包括制备用于再生纤维软骨或弹性软骨的水凝胶的准备物质的步骤，在需要再生纤维软骨或弹性软骨的个体需要进行治疗/手术的情况下，快速制备水凝胶，通过微创方法，可向关节腔内注入水凝胶。即，本发明的制备方法可包括：以纤维蛋白原为主要成分的第一溶液的准备过程及凝血酶和生理活性高分子，优选地，以聚氧化乙烯或P127的混合物为主要成分的第二溶液的准备过程；以及将第一溶液和第二溶液在双注射器中混合及固化并注入体内的过程。
因此，本发明还可包括用于制备用于再生纤维软骨或弹性软骨的水凝胶的步骤3)，通过混合上述第一溶液及第二溶液来使纤维蛋白和生理活性高分子形成互穿聚合物网络结构。
并且，在本发明的制备方法中，第一溶液还可包含富含血小板血浆，可包括以1：1至1：2的体积比进一步混合纤维蛋白原和富含血小板血浆的步骤。
本发明的第一溶液或第二溶液还可包含对纤维软骨或弹性软骨再生所需的生理活性物质，上述生理活性物质可以是细胞培养基或生长因子。
并且，本发明提供纤维软骨或弹性软骨再生方法，包括将本发明的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物给药于需要治疗的个体的步骤。
并且，本发明提供包含水凝胶的用于预防或治疗纤维软骨或弹性软骨缺损疾病的药学组合物，上述水凝胶包含纤维蛋白；以及生理活性高分子，用于形成纤维蛋白和互穿聚合物网络结构。
并且，本发明提供纤维软骨或弹性软骨缺损疾病治疗方法，包括将本发明的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物给药于需要治疗的个体的步骤。
将本发明的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物进行给药的步骤的特征在于，通过混合包含在本发明的试剂盒中的第一溶液和第二溶液，立即形成包含纤维蛋白以及用于形成纤维蛋白和互穿聚合物网络结构的生理活性高分子的水凝胶，通过微创方法将上述所制备的水凝胶注入关节腔，对长时间注入部位具有降解酶抗性，粘附或存留在受损伤的部位，并提高周围细胞的活动，从而可以有效地再生纤维软骨或弹性软骨，优选地，受损伤的膝关节半月板。再生的半月板的剪切及压缩弹性力非常优秀，可保持正常软骨板的50％至80％的强度，强度比商用化的纤维蛋白单独水凝胶优秀，并且对纤维软骨或弹性软骨再生及纤维软骨或弹性软骨缺损疾病治疗非常有效。
上述纤维软骨或弹性软骨缺损是指纤维软骨、纤维软骨组织和/或关节组织(滑膜、关节囊、软骨下骨等)受到机械刺激或炎症反应受伤的纤维软骨损伤或其他先天性或后天性因素引起的弹性软骨损伤或缺损。优选地，由这种纤维软骨或弹性软骨缺损引起的疾病可以是由纤维软骨或弹性软骨的损伤或缺损引发的疾病，更优选地，可以是选自由椎间盘突出症、耻骨间盘损伤、颞下颌关节损伤、胸锁关节的关节盘损伤、腕关节的三角纤维软骨复合体撕裂、尺骨碰撞综合征、退行性关节炎、半月板损伤、类风湿性关节炎、外耳缺损及会厌或喉软骨缺损组成的组中的一种以上。上述椎间盘突出症还被称为腰间盘突出，还可发生在椎体之间或耻骨之间。上述退行性关节炎及类风湿性关节炎是可由纤维软骨或弹性软骨的损伤引起或加重的疾病，可通过再生或回复纤维软骨或弹性软骨的损伤来进行治疗或使其好转。与此相关地，在本领域中众所周知，为了治疗膝关节的早期退行性骨关节炎，在进行软骨板切除术时进行最小切除，或者，在软骨板缺损严重的情况下，通过进行软骨板移植术等手术方法来使纤维软骨或弹性软骨的遗失最小化，或者，可通过代替方法减少退行性骨关节炎的发生。
治疗方法可包括将组合物直接注入或植入关节等目标部位中。组合物的给药通常可以以时常、天、周、每周几次、每隔一个月、每月几次、以月为单位的频率或为减轻症状所需的频率来进行。在使用于关节内的情况下，根据关节的大小及状态的严重程度，可调节给药的组合物的量。根据上述关节中症状的复发时间，对向该关节的后续给药频率是有时差的。
对于任何特定患者的特定给药剂量水平可根据多种因子来进行适当地调节，包括所采用的特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合及治疗中的特定疾病的严重程度。但是，在特殊情况下，更高或更低的剂量单位是合适的。上述给药剂量单位的给药可通过上述组合物的单次给药以及以特定间隔多次给药分开的剂量来进行，或者给药可以以几个较小的剂量单位来进行。
在一具体例中，纤维软骨或弹性软骨缺损疾病是半月板损伤，上述组合物例如给药于膝盖等关节空间。
例如，对具有膝盖半月板损伤的个体而言，每个膝盖可以注射约2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml以上，1次、2次或3次。在其他关节的情况下，给药的体积可基于其关节的大小来进行调节。
但是，对任何特定患者的特定给药剂量水平可取决于多种因子，包括所采用的特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合及治疗中的特定疾病的严重程度。
除了作为有效成分所包含的上述用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物以外，本发明的组合物还可包含药剂学上可接受的载体。
包含在本发明的组合物中的药剂学上可接受的载体是制剂时通常所利用的，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。除了上述成分以外，本发明的组合物还可包含润滑剂，润湿剂，甜味剂，调味剂，乳化剂，悬浮剂，保鲜剂等。
通过使用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂，根据本发明所属领域的技术人员可以容易地实施的方法配制本发明的药剂学组合物，可制备成单位剂量形态或装入多剂量容器中来进行制备。此时，剂型是油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浓缩剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包括分散剂或稳定剂。
具体实施方式
实施例1.用于制备水凝胶的第一溶液及第二溶液的制备
仅通过微创方法实现缺损的人体组织再生，制备作为水凝胶制备物质的第一溶液及第二溶液。
1.1利用纤维蛋白和聚氧化乙烯的水凝胶制备物质的制备
制备利用纤维蛋白和聚氧化乙烯的作为水凝胶的制备物质的第一溶液及第二溶液。通过混合纤维蛋白原(Sigma-Aldrich)10mg/ml至1000mg/ml及100～5500KIU/ml的抑肽酶(Sigma-Aldrich)来制备了第一溶液。在37℃的温度下，在溶解有浓度为100Unit(U)/mL至2500Unit(U)/mL的凝血酶(Reyon制药)粉末的溶剂中溶解聚氧化乙烯和氯化钙来制备第二溶液，将聚氧化乙烯制备成浓度为1mg/ml至100mg/ml，而且氯化钙的浓度为5mg/ml至50mg/ml。将通过混合如此制备的第一溶液和第二溶液来制备的形成互穿聚合物网络结构的水凝胶命名为“纤维蛋白-聚氧化乙烯”。
1.2.利用纤维蛋白和普兰尼克127(P127)的水凝胶之别物质的制备
制备作为利用纤维蛋白和P127的水凝胶的制备物质的第一溶液及第二溶液。以与上述实施例1.1中指出的结构相同的结构制备第一溶液，在第二溶液的准备过程中，P127(Sigma Aldrich，P2443)使用浓度为2mg/ml至200mg/ml的P127，在0℃至4℃的温度的冰欲(ice bath)中，通过将P127溶解于凝血酶溶液来制备第二溶液。通过混合如此制备的第一溶液和第二溶液来制备的形成互穿聚合物网络结构的水凝胶命名为“纤维蛋白-P127”。
1.3.利用包含富含血小板血浆的纤维蛋白和聚氧化乙烯的水凝胶制备物质的制备
制备含有富含血小板血浆的纤维蛋白-聚氧化乙烯水凝胶制备物质，包含纤维蛋白和从兔子血液中分离得到的富含血小板血浆作为第一溶液，包含聚氧化乙烯及凝血酶作为第二溶液。以1.0：0.1～1.0：0.7的体积比混合纤维蛋白原溶液和富含血小板血浆来制备第一溶液，以与实施例1.1相同的方式制备第二溶液。将通过混合如此制备的第一溶液和第二溶液来制备的形成互穿聚合物网络结构的水凝胶命名为“纤维蛋白-聚氧化乙烯-富含血小板血浆”。
1.4.利用含有富含血小板血浆的纤维蛋白和P127的水凝胶制备物质的制备
制备包含纤维蛋白和从兔子血液中分离得到的富含血小板血浆作为第一溶液、包含普兰尼克127及凝血酶作为第二溶液的互穿高分子网。以1.0：0.1～1.0：0.7的体积比混合纤维蛋白原溶液和富含血小板血浆来制备第一溶液，以与实施例1.2相同的方式制备第二溶液。将通过混合如此制备的第一溶液和第二溶液来制备的形成互穿聚合物网络结构的水凝胶命名为“纤维蛋白-P127-富含血小板血浆”。
1.5立即凝胶化的确认
将在实施例1.1至实施例1.4中制备的第一溶液和第二溶液分别包含在双注射器的第一区域及第二区域，手术时，每个溶解分别从各自区域流出并合并在一起，立即形成凝胶化，以使能够形成三维结构体。在图1中示出其示意图及固化的水凝胶。
如图1所示，在本发明中，实施例1.1至实施例1.4的水凝胶制备物质均通过立即凝胶化来形成三维结构体水凝胶。如此制备的水凝胶的特征在于，部分聚氧化乙烯或P127穿透纤维蛋白之间以形成互穿网络聚合物。
实施例2.根据凝血酶浓度浓度的水凝胶的压缩及剪切弹性模量的确认
为了确认根据纤维蛋白原和凝血酶的浓度组合生成的水凝胶的弹性模量变化，在直径为8.0mm的模具中制备水凝胶，以测定剪切弹性模量和压缩弹性模量。利用流变仪(rheometer)(ARES-LS，TA Instruments)测定剪切弹性模量，板(plate)间距设为900μm，震动数条件调至0.1Hz值100Hz。利用万能拉伸试验机(Instron 5966，Instron Corporation)测定压缩弹性模量。在应力-变形率曲线图中，利用具有弹性区间的区间的斜率得出导出压缩弹性模量(E)值。将纤维蛋白原的浓度固定在100mg/ml的恒定浓度，在混合至凝血酶的最终浓度为250U/ml、500U/ml及1250U/ml之前，通过将第二溶液的凝血酶的浓度调至500U/ml、1000U/ml、2500U/ml来制备水凝胶，制备后测定剪切弹性模量和压缩弹性模量，并将其结果示出在图2中。
如图2所示，确认在利用纤维蛋白原及凝血酶制备的水凝胶中根据凝血酶浓度变化的形成简单高分子网水凝胶的剪切弹性模量变化曲线图(A)、压缩弹性模量变化曲线图(B)，结果显示，将凝血酶浓度按250U/ml、500U/ml、1250U/ml顺序增加时，在100rad/s条件下纤维蛋白水凝胶的剪切弹性模量分别按14.1±1.0kPa、14.7±0.7kPa、15.4±0.6kPakPa顺序增加。并且，压缩弹性模量也随着凝血酶的浓度的增加而增加，因此将凝血酶浓度按250U/ml、500U/ml、1250U/ml顺序增加时，纤维蛋白水凝胶的压缩弹性模量分别按29.9±3.1kPa、43.1±5.2kPa、93.6±9.0kPa顺序增加。
实施例3.根据阿添加聚氧化乙烯及P127的压缩弹性模量的确认
对添加聚氧化乙烯或P127作为第二溶液时的水凝胶的压缩弹性模量进行测量。第一溶液的纤维蛋白原的浓度固定在100mg/ml的恒定浓度。将第二溶液中凝血酶的浓度固定在2500U/ml，以使最终混合组合物中凝血酶的浓度为1250U/ml，并将第二溶液中聚氧化乙烯的浓度改为2.0％(w/v)、6.0％(w/v)、10.0％(w/v)，以使最终混合组合物中聚氧化乙烯的浓度为1.0％(w/v)、3.0％(w/v)、5.0％(w/v)，将P127的浓度改为6.0％(w/v)、14.0％(w/v)、20.0％(w/v)，以使最终混合组合物中P127的浓度为3.0％(w/v)、7.0％(w/v)、10.0％(w/v)，由此制备第二溶液。确认根据各制备例的压缩弹性模量变化，并将其结果示出在图3中。
如图3所示，当通过将聚氧化乙烯混合至1.0％(w/v)、3.0％(w/v)、5.0％(w/v)浓度来制备水凝胶时，分别具有103.3±4.9kPa、108.4±4.8kPa、120.1±3.3kPa的压缩弹性模量(A)，当通过将P127混合至3.0％(w/v)、7.0％(w/v)、10.0％(w/v)浓度来制备水凝胶时，分别具有72.0±4.3kPa、122.0±9.6kPa、156.0±9.8kPa的压缩弹性模量(B)。
并且，在1250U/ml的凝血酶浓度条件下，确认根据聚氧化乙烯浓度变化而形成的纤维蛋白-聚氧化乙烯水凝胶的剪切弹性模量变化，结果显示，将聚氧化乙烯浓度按1.0％、3.0％、5.0％的顺序增加时，制备的纤维蛋白-聚氧化乙烯水凝胶的剪切弹性模量在100rad/s条件下分别按15.4±1.3kPa、18.5±1.2kPa、21.5±1.5kPa顺序增加。
实施例4.根据在聚氧化乙烯及P127中添加富含血小板血浆的压缩弹性模量的确认
通过混合2500U/ml的凝血酶、10.0％的聚氧化乙烯或20.0％的P127来制备第二溶液。将200mg/ml的纤维蛋白原作为第一溶液，以1：1的体积比混合富含血小板血浆与第一溶液来制备，以使最终纤维蛋白原的浓度为100mg/ml，混合第一溶液和第二溶液，通过立即固体化来制备水凝胶。将制备的水凝胶命名为纤维蛋白-聚氧化乙烯-富含血小板血浆或纤维蛋白-P127-富含血小板血浆。为了确认富含血小板血浆对水凝胶的物性的影响，通过不含富含血小板血浆的实验组(纤维蛋白-聚氧化乙烯、纤维蛋白-P127)、包含单独纤维蛋白的实验组，确认剪切弹性模量变化，其结果示出在图4及表1中。
表1
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如图4及表1所示，测量剪切弹性模量结果显示，当在相同条件下，在纤维蛋白中混合有聚氧化乙烯、P127的组中，当添加富含血小板血浆时，具有更高的剪切弹性模量。
实施例5.用于确认体内持续效果的酶降解模式比较
为了确认在酶处理下通过混合本发明的第一溶液及第二溶液制备的水凝胶的体外(in vitro)降解模式，将水凝胶浸泡在0.00125％的胰蛋白酶溶液后，每小时测量其重量，并且与初始重量进行比较，测量降解速度。具体地，为了预测将基于纤维蛋白的水凝胶注入体内时的纤维蛋白降解模式，使用代表性的作为纤维蛋白降解酶的胰蛋白酶在体外确认降解模式，在0.00125％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)的条件下，将确认通过对照组纤维蛋白水凝胶和在实施例4中制备的纤维蛋白+聚氧化乙烯、纤维蛋白+聚氧化乙烯+富含血小板血浆、纤维蛋白+P127、纤维蛋白+P127+富含血小板血浆制备的水凝胶的降解模式的结果示出在图5中。
如图5所示，在经胰蛋白酶处理120小时之前，作为对照组的纤维蛋白水凝胶完全被降解，但是在本发明中制备的水凝胶中，确认纤维蛋白+聚氧化乙烯组只有在达到192小时才被降解，而纤维蛋白+P127只有在达到264小时才被降解。即，确认了在本发明中制备的水凝胶与对照纤维蛋白水凝胶相比，由于聚氧化乙烯或P127的部分相互穿透作用效果，可将降解平均延迟72小时。因此，若利用本发明的水凝胶，则可以长时间停留在体内并可实现目的效果。
实施例6.生物相容性确认
为了确认在实施例4中确认的纤维蛋白-聚氧化乙烯或纤维蛋白-P127水凝胶是否适于用作治疗剂，进行了生物相容性确认实验。以1×105细胞(cell))/mL的浓度将获自兔子软骨的纤维软骨细胞(fibrochondrocyte)与包含纤维蛋白原的第一溶液混合后，通过混合其与包含聚氧化乙烯或P127的第二溶液来制备水凝胶，并将细胞封装在水凝胶内部。随后，将水凝胶在F-12培养基中培养24小时，使用活/死分析试剂盒(Live/Dead assay kit)(Invitrogen)分别对存活的细胞和凋亡的细胞进行染色，利用荧光显微镜(AMF4300，EVOS，Life Technology)观察。拍摄4个10倍图像，并利用下述式计算并比较细胞存活率，将其结果示出在他图6中。
细胞存活率＝存活的细胞数量/总细胞数量×100
如图6所示，与对照组纤维蛋白水凝胶相比的结果，在通过包含聚氧化乙烯或P127来制备的水凝胶中也几乎未观察到被染成红色的凋亡的细胞，每小时确认水凝胶细胞存活/凋亡荧光图像的结果确认，与对照组纤维蛋白水凝胶相比，在本发明中制备的纤维蛋白-聚氧化乙烯及纤维蛋白-P127水凝胶中，细胞存活没有差异。因此，将在本发明中制备的水凝胶给药于体内时，即使长时间保留在生物体也具有优异的生物相容性。
实施例7.半月板损伤动物模型中半月板再生效果验证
为了验证利用在上述实施例4中制备的纤维蛋白和聚氧化乙烯或纤维蛋白和P127制备的水凝胶是否在半月板损伤动物模型中具有半月板再生效果，进行了如下实验。
更具体地，为了制备家兔(rabbit)关节软骨损伤动物模型，选择健康的家兔，利用根据体重的适量的氯胺酮和隆朋麻醉后，确认家兔充分全身麻醉，剃除两侧下肢的膝关节部位后，在保持姿势的同时用绷带固定。用聚维酮对两侧膝关节部位进行消毒，触摸膝盖骨确认位置后，沿着穿过膝关节上方、下方、膝盖骨的内侧的切除线采用旁正中入路(paramedian approach)到达膝关节内，将膝盖骨向外侧掰开使膝关节弯曲并观察关节内部。在确认没有异常病理意见后，去除(meniscectomy)三分之二以上的半月板。如上所述，诱发半月板损伤，然后使膝盖骨转回到其原始位置后，用吸收性线缝合膝盖骨周围的软组织，并用非吸收性线缝合皮肤。确认家兔从麻醉中醒来后，允许它们可以自由活动，并在术后5天酶使用止痛剂和抗生素以预防感染。1周后，准备好的双注射器(double syringe)的注射器第一区域中加入100mg/mL的纤维蛋白原、0.5mg/mL的抑肽酶，在注射器第二区域中加入2500U/ml的凝血酶、5(w/v)％的氯化钙或2500U/ml的凝血酶、5(w/v)％的氯化钙和10.0％的聚氧化乙烯或2500U/ml的凝血酶、5(w/v)％的氯化钙和P12720.0％后，在不切除上述动物模型的左侧皮肤的情况下注入半月板损伤部位。对另一侧腿未做任何处理。经过4周、8周及16周后，从每只家兔中取出进行了损伤及治疗的半月板并进行肉眼评价，采用image J程序测定再生的半月板的面积并进行评价。并且，固定组织后，进行了苏木和曙红、番红O染色及对I型胶原蛋白的免疫染色，通过利用组织学质量得分定量化分析再生的半月板。其结果如图7及图8所示。
如图7及图8所示，与仅包含纤维蛋白制备的对照组水凝胶相比，在注入纤维蛋白-聚氧化乙烯及纤维蛋白-P127水凝胶的组中，从第4周开始生成纤维(fibrous)化的组织，在第12周确认生成类似于半月板组织的组织。这些结果表明，即使在家兔的半月板损伤1周后没有切除皮肤的情况下注入纤维蛋白-聚氧化乙烯及纤维蛋白-P127水凝胶，也可以在4周、8周、12周再生半月板。因此，若利用纤维蛋白-聚氧化乙烯及纤维蛋白-P127水凝胶，在损伤的膝关节半月板部位中，由于周围细胞的活动，可以以优秀的效率生成软骨板细胞，并可以有效地治疗半月板损伤。
实施例8.再生的半月板的压缩强度试验
半月板支撑体的重要的物性是可承受从外部施加的力量的压缩强度。因此，在上述实施例7中，利用4mm的冲头从在第12周再生的半月板的两处切割样品后，通过拉伸度仪测定压缩强度，确认通过注入本发明的纤维蛋白-聚氧化乙烯及纤维蛋白-P127水凝胶再生的半月板的强度，并将其结果示出在图9中。
如图9所示，与未做任何处理的(仅进行半月板切除术(meniscectomy only))组和单独处理纤维蛋白的组相比，确认通过注入纤维蛋白-聚氧化乙烯、纤维蛋白-P127水凝胶再生的组织的压缩强度明显增加。具体地，在未做任何处理而仅做半月板切除术的组中，Mpa值为203.3±43.2，仅注入纤维蛋白的组的压缩强度为844.9±32.6，注入纤维蛋白+聚氧化乙烯水凝胶的组的压缩强度为4086.7±542.1，注入纤维蛋白+P127水凝胶的组的压缩强度为3406.8±312.1，而且，正常半月板(Normal meniscus)的情况下，确认其值为6688.6±1012.5。因此，确认通过注入本发明的纤维蛋白+聚氧化乙烯水凝胶及纤维蛋白+P127水凝胶再生的半月板的强度为正常软骨板的60％以上，因此可以有效地用于软骨板再生。

Claims (19)

1.一种包含水凝胶的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物，其特征在于，上述水凝胶包含：
纤维蛋白；以及
生理活性高分子，用于形成纤维蛋白和互穿聚合物网络结构。
2.根据权利要求1所述的包含水凝胶的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物，其特征在于，上述生理活性高分子为选自由聚氧化乙烯及普兰尼克组成的组中的一种。
3.根据权利要求1所述的包含水凝胶的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物，其特征在于，上述纤维软骨或弹性软骨为选自由椎间盘软骨、耻骨联合软骨、半月板、关节内纤维软骨复合体、颞下颌关节软骨、胸锁关节的关节盘、髋臼窝软骨、外耳、会厌及喉软骨组成的组中的一种。
4.根据权利要求1所述的包含水凝胶的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物，其特征在于，上述水凝胶具有胰蛋白酶降解抗性。
5.根据权利要求1所述的包含水凝胶的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物，其特征在于，上述水凝胶在100rad/s的条件下具有15kPa至40kPa的剪切弹性模量或10kPa至200kPa的压缩弹性模量。
6.根据权利要求1所述的包含水凝胶的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物，其特征在于，还包含富含血小板血浆。
7.一种用于再生纤维软骨或弹性软骨的支架，其特征在于，包含权利要求1至6中任一项所述的包含水凝胶的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物。
8.一种用于再生纤维软骨或弹性软骨的试剂盒，其特征在于，包括：
第一区域，包含纤维蛋白原溶液；以及
第二区域，包含凝血酶及生理活性高分子。
9.根据权利要求8所述的用于再生纤维软骨或弹性软骨的试剂盒，其特征在于，上述第一区域还包含富含血小板血浆。
10.根据权利要求8所述的用于再生纤维软骨或弹性软骨的试剂盒，其特征在于，包含浓度为10mg/ml至1000mg/ml的上述纤维蛋白原。
11.根据权利要求8所述的用于再生纤维软骨或弹性软骨的试剂盒，其特征在于，包含浓度为100U/ml至5000U/ml的上述凝血酶。
12.根据权利要求8所述的用于再生纤维软骨或弹性软骨的试剂盒，其特征在于，包含2％(w/v)至20％(w/v)的上述生理活性高分子，上述生理活性高分子为聚氧化乙烯。
13.根据权利要求8所述的用于再生纤维软骨或弹性软骨的试剂盒，其特征在于，包含2％(w/v)至40％(w/v)的上述生理活性高分子，上述生理活性高分子为普兰尼克127。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的用于再生纤维软骨或弹性软骨的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒为双注射器形态。
15.一种用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1)，准备10mg/ml至1000mg/ml的纤维蛋白原作为第一溶液；以及
步骤2)，通过混合凝血酶及生理活性高分子来准备第二溶液。
16.根据权利要求15所述的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物的制备方法，其特征在于，还包括制备用于再生纤维软骨或弹性软骨的水凝胶的步骤3)，通过混合上述第一溶液及第二溶液来使纤维蛋白和生理活性高分子形成互穿聚合物网络结构。
17.根据权利要求15所述的用于再生纤维软骨或弹性软骨的组合物的制备方法，其特征在于，上述步骤1)的第一溶液还包含富含血小板血浆，并包括以1：1至1：2的体积比混合纤维蛋白原和富含血小板血浆的步骤。
18.一种包含水凝胶的用于预防或治疗纤维软骨或弹性软骨缺损疾病的药学组合物，其特征在于，上述水凝胶包含：
纤维蛋白；以及
生理活性高分子，用于形成纤维蛋白和互穿聚合物网络结构。
19.根据权利要求18所述的用于预防或治疗纤维软骨或弹性软骨缺损疾病的药学组合物，其特征在于，上述纤维软骨或弹性软骨缺损疾病为选自由椎间盘突出症、耻骨间盘损伤、颞下颌关节损伤、胸锁关节的关节盘损伤、腕关节的三角纤维软骨复合体撕裂、尺骨碰撞综合征、退行性关节炎、半月板损伤、类风湿性关节炎、外耳缺损及会厌或喉软骨缺损组成的组中的一种以上。
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