WO2019132604A2 - 인간 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물 - Google Patents

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    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus

Definitions

  • the present invention relates to a composition for regenerating and treating fibrous cartilage or elastic cartilage, a kit, and a regeneration method using the same.
  • Cartilage like other connective tissues, is composed of connective tissue cells and extracellular matrix, but unlike native connective tissue, it is a specialized connective tissue containing a rigid but somewhat flexible substrate.
  • the cartilage is classified into hyaline cartilage, elastic cartilage, and fibrous cartilage depending on the type and characteristics of the fibers that make up the cartilage matrix.
  • Glass cartilage contains mainly type II collagen and is the most common type of cartilage.
  • Type II collagen appears mostly in the form of microfibrils, and since the refractory index is almost the same as that of proteinaceous main component, the fiber component and intactness are observed as homogeneous materials.
  • Elastic cartilage is distinguished from glass cartilage in that it has abundant elastic fibers in the matrix.
  • Fibrous cartilage is less intangible than other cartilage, and there are many glue fibers, and most of these fibers are arranged in a certain direction. There is a difference that glue of glue fiber constituting fibrous cartilage is I type glue. Glass cartilage is observed on the articular surface of the bone, costal cartilage, trachea, and bronchus laryngeal cartilage. The elastic cartilage constitutes the external ear, epiglottis, and some larynx cartilage. The fibrocartilage consists of intervertebral disc, symphysis pubis, intra-articular meniscus, , And the fibrocartilage complex.
  • Meniscus which belongs to fibrous cartilage, is located between the femur and tibia and is one of the most important structures in maintaining the function of the knee joint.
  • the meniscus plays a very important role in dispersing the load and stress of the knee joint, absorbing the impact, lubricating the articular cartilage, absorbing the external impact, and protecting the articular cartilage.
  • the meniscus is formed by the half-moon-shaped mollusk bone located in the middle of the knee joint, and the cartilage plays a buffering effect between the joints.
  • the meniscus plate has two pairs of crescent-shaped cartilages in the left and right knee joints, which are called the lateral meniscus and medial meniscus, respectively.
  • the anterior cruciate ligament and posterior cruciate ligament traverse between them, connecting the upper femoral bone to the lower tibial bone.
  • the meniscus is often damaged in athletes. This is called 'meniscus rupture of the meniscus,' and meniscal tear usually occurs during exercise. However, in the late 50s and middle-ages in their mid-60s, degenerative arthritis is progressing to a certain degree, suddenly the back of the meniscus is broken and the rupture occurs a lot, and middle-aged women squat or kneel The meniscus may rupture as it continues for a long time. In this way, if the meniscus is torn or damaged, medication or surgical treatment will be performed.
  • the collagen component of the extracellular matrix helps to provide the strength of the cartilage, and the proteoglycan ECM component contributes to the shock absorption function. Also, the crescent-shaped tissue contains the vascularized outer part and the internal avascular area.
  • tissue damage is located in the outer part of the blood vessel, repair may be performed, but in some cases, it is not. If it is in the avascular area without blood vessels, natural remedy is not possible. .
  • surgical treatment can be divided into partial meniscectomy or subtotal or total meniscectomy according to the size and position of the cartilage tissue damage, and removal of the tissue due to resection is ultimately degenerative Since it causes arthritis, a medical technique for regenerating the damaged cartilage plate, which is a fundamental treatment, is required.
  • a polymer scaffold prepared in an appropriate form is sealed with a partially resected cartilage plate and is evaluated as a substitute for the same type of meniscus transplantation.
  • its stability and effectiveness have not yet been verified.
  • support-based grafting has a problem that incision of the knee is indispensable since a specific type of supporter must be inserted at the position of the cartilage plate.
  • an object of the present invention is to provide a composition for regenerating fibrous cartilage or elastic cartilage containing hydrogels prepared using fibrinogen, thrombin and physiologically active polymers, and a kit.
  • the present invention relates to fibrin; And a physiologically active polymer that forms an interpenetrating polymer network (IPN) structure with fibrin.
  • IPN interpenetrating polymer network
  • the present invention also provides a composition for regenerating fibrous cartilage or elastic cartilage comprising a hydrogel.
  • the present invention also provides a fibrous cartilage or a cartilage regeneration scaffold for regenerating cartilage, which comprises the cartilage regeneration composition.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising: a first compartment containing a fibrinogen solution; And a second compartment containing thrombin and a physiologically active macromolecule.
  • the present invention also provides a method for preparing a fibrinogen-containing composition comprising: 1) preparing 10 to 1000 mg / ml of fibrinogen as a first solution; 2) preparing a second solution by mixing thrombin and physiologically active polymer; The present invention also provides a method for producing a composition for regenerating fibrous cartilage or elastic cartilage.
  • the present invention also relates to a method for regenerating fibrocartilage or elastic cartilage of the present invention, comprising the steps of: administering to a subject in need of treatment; A fibrous cartilage or an elastic cartilage regeneration method.
  • the present invention also relates to fibrin; And a physiologically active polymer that forms an interpenetrating polymer network (IPN) structure with fibrin.
  • IPN interpenetrating polymer network
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a fibrocartilage or elastic cartilage defect disease comprising hydrogel.
  • the present invention also relates to a method for regenerating fibrogenic elastic cartilage of the present invention, comprising the steps of: administering to a subject in need of treatment;
  • the present invention provides a method for treating fibrocartilage or elastic cartilage defect disease.
  • composition and kit for regeneration of cartilage according to the present invention can be easily injected into a site requiring restoration or repair of fibrocartilage or elastic cartilage by a minimally invasive method, exhibit resistance to decomposition enzyme without toxicity in the body, Or retention, it can improve the behavior of surrounding cells and induce regeneration of fibrous cartilage or elastic cartilage defect tissue such as an effective meniscus. Therefore, the composition of the present invention is useful as a mediator for regeneration of a defective portion of a living tissue, and is useful in the field of bio-biomaterials.
  • FIG. 1 is a schematic view of a composition and kit for regenerating fibrous cartilage or elastic cartilage according to the present invention, and a hydrogel prepared thereby.
  • FIG. Figure 1 A illustrates a physiological state of the physiology that forms an interpenetrating polymer network (IPN) structure with fibrin and fibrin and a kit in the form of a syringe containing a mixture of fibrinogen and thrombin and polyethylene oxide (PEO) or pluronic (F127)
  • IPN interpenetrating polymer network
  • PEO polyethylene oxide
  • F127 pluronic
  • FIG. 1 shows a kit in the form of a syringe containing fibrinogen, platelet rich plasma (PRP) and a mixture of thrombin and polyethylene oxide (PEO) or pluronic (F127), fibrin and fibrin and interpenetrating polymer network IPN) structure of the hydrogel of the present invention.
  • PRP platelet rich plasma
  • PEO polyethylene oxide
  • F127 pluronic
  • 2 is a graph showing the elastic modulus of the hydrogel according to the change in thrombin concentration.
  • 2 (A) shows shear modulus.
  • 2B shows the compressive modulus (student t-test, * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001).
  • FIG. 3 is a graph showing changes in compressive and shear moduli of hydrogels according to changes in concentrations of polyethylene oxide (PEO) and pluronic 127 (F127) under a condition of a concentration of 1250 U / ml of thrombin.
  • FIG. 3A is a graph showing a change in compressive modulus according to PEO concentration of a hydrogel prepared using thrombin and PEO.
  • FIG. 3B is a graph showing a change in compressive modulus according to F127 concentration of a hydrogel prepared using thrombin, F127.
  • FIG. FIG. 3C is a graph showing shear modulus change according to PEO concentration of the hydrogel produced. (student t-test, * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001).
  • FIG. 4 is a diagram showing the change in shear modulus according to PRP addition under the conditions of a thrombin concentration of 1250 U / ml, polyethylene oxide (PEO) 5.0%, and Pluronic 127 (F127) 10.0%.
  • FIG. 4A shows the result of confirming the shear modulus of the fibrin-PEO hydrogel (Fb / PEO) and the PRP-added hydrogel (Fb / PEO + PRP).
  • 4B is a graph showing the result of confirming the shear modulus of the fibrin-F127 hydrogel (Fb / F127) and the PRP-added hydrogel (Fb / F127 + PRP).
  • FIG. 4A shows the result of confirming the shear modulus of the fibrin-PEO hydrogel (Fb / PEO) and the PRP-added hydrogel (Fb / PEO + PRP).
  • FIG. 4A shows the result of confirming the shear modulus of the fibrin-PEO hydrogel
  • 4C is a graph showing a shear modulus comparison graph of fibrin, fibrin-PEO, fibrin-PEO-PRP, fibrin-F127 and fibrin-F127-PRP hydrogels (*, **, *** Show statistical significance when compared with the fibrin group.)
  • FIG. 5 is a diagram showing decomposition patterns of tryptic enzymes treated with fibrin-F127, fibrin-PEO hydrogel and control fibrin alone.
  • FIG. 6 shows the cell survival rate after 24 hours in cells mixed with the prepared hydrogel.
  • 6A is a diagram showing the result of observation with a fluorescence microscope.
  • FIG. 6B is a graph showing cell viability.
  • FIG. 7 is a view showing the result of regeneration of the meniscal tear site of the rabbit.
  • FIG. 7A is a graphical representation showing the regeneration of the meniscus at 4 weeks, 8 weeks, and 12 weeks after injection of fibrin, fibrin-PEO, and fibrin-F127 hydrogels one week after the meniscus injury to be.
  • FIG. 7B is a graph showing the result of measuring the area of the regenerated meniscus plate.
  • FIG. 8 is a view showing the result of regeneration of the meniscal tear site of the rabbit.
  • 8A shows hematoxylin & eosin (H & E) showing the regenerated meniscus at 4 weeks, 8 weeks, and 12 weeks after injection of fibrin-PEO and fibrin-F127 hydrogels one week after the meniscus injury ), Safranin O staining and immunostaining for type I collagen (x40).
  • FIG. 8B shows the histological tissue quality score (A. meniscectomy, B. meniscus resection + fibrin alone treatment, C meniscus resection + fibrin + PEO, D. meniscus resection + fibrin + F127).
  • FIG. 9 is a graph showing the results of measuring the strength of the meniscus of the meniscus in which the injured meniscus of the rabbit is regenerated.
  • the present invention relates to fibrin; And a physiologically active polymer that forms an interpenetrating polymer network (IPN) structure with fibrin.
  • IPN interpenetrating polymer network
  • the present invention also provides a composition for regenerating fibrous cartilage or elastic cartilage comprising a hydrogel.
  • the hydrogel according to the present invention may be characterized in that the polymer chain of the physiologically active polymer is randomly penetrated into the fibrin polymer network formed by the action of fibrinogen and thrombin to form an interpenetrating complex.
  • the hydrogel in which the interpenetrating complex structure is formed is not biodegradable because it does not exhibit cytotoxicity, and it can be injected into a site requiring regeneration of fibrocartilage or elastic cartilage by a minimally invasive method.
  • it can be adhered or attracted to the injured area without being decomposed for a long time at the injection site, and it can improve the behavior of the surrounding cells to effectively induce regeneration of fibrous cartilage or elastic cartilage, Is effective for regeneration of meniscus.
  • the physiologically active polymer may include, without limitation, a polymer capable of randomly penetrating the fibrin polymer network to form the interpenetrating complex hydrogel, and examples thereof include alginate, chitosan, hyaluronic acid, polyethylene glycol PEG), cellulose, polyacrylic acid (PAA), poly (glycolic acid) (PGA), poly (lactic acid) (PLA), PLA-PGA, PLA-PEG, dextran, dextran- (P (EO-co-PO)) and a pluronic / poloxamer (ethylene oxide / propylene oxide) copolymer, And preferably at least one selected from the group consisting of polyethylene oxide (hereinafter referred to as PEO) or Fluronic F127 (hereinafter referred to as F127).
  • PEO polyethylene oxide
  • F127 Fluronic F127
  • the cartilage to be regenerated may be fibrous cartilage or elastic cartilage among hyaline cartilage, fibrocartilage, or elastic cartilage.
  • Fibrous cartilage is a cartilage in which white fibrous tissue and cartilaginous tissue are mixed at various ratios. It is strong in compression but is arranged in a torn and tight state.
  • the fibrocartilage is connected to the cartilage or connective tissue and is characterized by buffering action in a region where distortion or compression occurs so that limited movement is possible and elasticity is maintained.
  • the vitreous cartilage consists mainly of II type collagen, and the fibrous component and intactness are uniformly observed.
  • the elastic cartilage is different from the glass cartilage in that the elastic fiber is abundant in the matrix, and the fibrocartilage is compared with the glass cartilage and elastic cartilage , which has a distinctive difference in that there are few intangibles and many glue fibers are connected in a constant arrangement.
  • the fibrous cartilage of the fibrous cartilage is different from the collagen of the type I collagen.
  • the fibrous cartilage unlike the elastic cartilage and the glass cartilage, has no distinct cartilage.
  • this type of arrangement of I-shaped glue fibers in the fibrous cartilage is known to be arranged at right angles to the adjacent lamella. By this characteristic arrangement of fibrocartilage, It can withstand pressure.
  • the fibrocartilage or elastic cartilage which is the object of regeneration and repair of the present invention, may be various cartilage and external ear, epiglottis, and some laryngeal cartilage, which are present in the intervertebral disc, And may include all of the various elastic cartilages present in the region of the cartilage, and preferably an intervertebral disc, a symphysis pubis cartilage, a meniscus, a fibrocartilage complex, , Cartilage of the temporomandibular joint, sternoclavicular joint, acetabular fossa cartilage, external ear, epiglottis, and larynx cartilage.
  • the meniscus is one of the structures which plays a very important role in maintaining the function of the knee joint, which is located between the femur and the joint surface of the tibia, and disperses the load and stress of the knee joint, It plays a very important role in lubricating joint cartilage, absorbing external impacts, and protecting articular cartilage.
  • This meniscus is formed by the half-moon-shaped cartilage located in the middle of the knee joint, and the cartilage plays a buffering effect between the joints.
  • the cartilage plate is very important for preventing degenerative arthritis.
  • Fibrin of the present invention and physiologically active polymers forming a fibrin and interpenetrating complex (IPN) structure exhibit resistance to decomposition in trypsin of a living body, and further decompose at 60 to 84 hours or more when compared with decomposition time of fibrin under the same conditions It can be maintained in gel form for a long time so that it can stay in the target site for a long time and induce the regeneration of fibrocartilage more effectively.
  • IPN interpenetrating complex
  • the hydrogel of the present invention may exhibit a shear modulus of 15 to 40 kPa under a condition of 100 radian / sec, and may exhibit a compressive modulus of 10 to 200 kPa. Since the hydrogel of the present invention exhibits the elastic modulus as described above, it is not rigid when regenerating fibrous cartilage, and can maintain flexibility and elasticity. Through this, it is possible to easily administer it regardless of the size and shape of the fibrocartilage- There is an advantage that the surrounding cells enter into the gel and cause tissue regeneration.
  • composition of the present invention may further comprise platelet-rich plasma (PRP).
  • PRP platelet-rich plasma
  • Platelet-rich plasma may be provided in a form mixed with fibrinogen, which is a preparation material of the hydrogel, and may further exhibit a superior shear modulus under a condition of 100 radian / sec in the case of containing platelet-rich plasma.
  • the composition of the present invention is in the form of a hydrogel composition for the regeneration of fibrocartilage and can be effectively administered to a site requiring minimal regeneration of fibrocartilage or elastic cartilage using a syringe or the like.
  • the composition of the present invention may preferably be used for regenerating fibrous cartilage or elastic cartilage, and may be used as a fibrous cartilage or a supporter for regenerating elastic cartilage.
  • the present invention provides a fibrous cartilage or scaffold for elastic cartilage regeneration comprising the fibrous cartilage or the composition for regenerating the elastic cartilage of the present invention.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising: a first compartment containing a fibrinogen solution; And a second compartment containing thrombin and a physiologically active macromolecule.
  • the kit of the present invention is composed of two or more compartments, and is intended to include a fibrinogen solution, thrombin, and a physiologically active polymer separately.
  • a fibrin-PEO or a fibrin-F217 hydrogel respectively.
  • the first solution of the first compartment and the second solution of the second compartment can be mixed in a syringe of a double syringe (double syringe), and the hydrolysis of the three-dimensional structure via the fibrin formation and the interpenetrating complex structure immediately Gel can be formed.
  • the first compartment may further contain platelet-rich plasma in addition to fibrinogen.
  • the platelet-rich plasma may exhibit a better shear modulus when the hydrogel is further prepared, and the fibrinogen and the platelet-rich plasma have a volume ratio of 1: 0.1 to 1: 1, preferably 1: 0.1 to 1: 0.8 May be mixed and included in the first compartment.
  • the kit of the present invention comprises fibrin; And a physiologically active polymer that forms a fibrin and interpenetrating polymer network (IPN) structure, for the purpose of containing in each compartment a first solution and a second solution, which are materials for the production of a hydrogel, , And the first compartment may contain fibrinogen as a first solution at a concentration of 10 to 1000 mg / ml, preferably 10 to 500 mg / ml, more preferably 50 to 200 mg / ml.
  • IPN interpenetrating polymer network
  • the first compartment may additionally contain an anti-fibrinolytic agent in the first solution, for example, such that afrotinin is preferably 0.5 mg / ml (3-8 TIU / mg), and in terms of KTU, 100 To 5500 KIU / ml, preferably 1950 to 5200 KIU / ml.
  • the second compartment may contain a second solution, and the second solution may include thrombin and a physiologically active polymer.
  • the thrombin may be contained in the second solution in an amount of 100 to 5000 units (U) / ml, preferably 250 U / ml to 3000 U / ml, more preferably 250 to 2800 U / ml.
  • Thrombin may be present in the final mixed composition at a final concentration of 250 U / ml to 1250 U / ml and may contain 5 to 50 mg / ml of calcium chloride (CaCl 2 ), preferably 5 (w / v)% As shown in FIG.
  • the physiologically active polymer may include, without limitation, polymers capable of randomly penetrating the fibrin polymer network to form an interpenetrating complex hydrogel, and examples thereof include alginate, chitosan, hyaluronic acid, polyethylene glycol (PEG) PGA, PLA-PEG, dextran, dextran-PEG, starch, collagen-based gel, agarose, polyglycolic acid (PLA) (P (EO-co-PO)) of ethylene oxide and propylene oxide, and a pluronic / poloxamer, at least one selected from the group consisting of polyacrylic acid, fluoric acid, heparan sulfate, glycosaminoglycan, polyethylene oxide And preferably at least one selected from the group consisting of PEO and F127.
  • the concentration of PEO in the final mixed composition is 2 to 20 (w / v), preferably 1 to 5% (w / v) % (w / v), preferably 2 to 10 (w / v)%.
  • the physiologically active polymer is F127
  • the concentration of F127 in the final mixed composition is 1 to 20 (w / v)%, preferably 3 to 10 (w / v) 40 (w / v)%, preferably 6 to 20 (w / v)%.
  • the kit may be used interchangeably with a medical device used for medical purposes, and the preferred form may be in the form of a double syringe.
  • the present invention also provides a method for preparing a fibrinogen-containing composition comprising: 1) preparing 10 to 1000 mg / ml of fibrinogen as a first solution; 2) preparing a second solution by mixing thrombin and physiologically active polymer; The present invention also provides a method for producing a composition for regenerating fibrous cartilage or elastic cartilage.
  • the production method of the present invention is characterized in that a preparation process of a first solution containing fibrinogen as a main component and a preparation process of a second solution containing a mixture of thrombin and a physiologically active polymer, preferably PEO or F127 as a main component, 2 solution is mixed and solidified in a double syringe and injected into the body.
  • the present invention provides a method of preparing a hydrogel for regenerating fibrous cartilage or elastic cartilage in which fibrin and physiologically active polymer form an interpenetrating complex (IPN) structure by mixing the first solution and the second solution; As shown in FIG.
  • IPN interpenetrating complex
  • the first solution may further contain platelet-rich plasma, and may further comprise mixing fibrinogen and platelet-rich plasma in a volume ratio of 1: 1 to 1: 2.
  • the first solution or the second solution of the present invention may further comprise a fibrous cartilage or a physiologically active substance necessary for regenerating elastic cartilage, and the physiologically active substance may be a cell culture medium or a growth factor.
  • the present invention also relates to a method for regenerating fibrocartilage or elastic cartilage of the present invention, comprising the steps of: administering to a subject in need of treatment; A fibrous cartilage or an elastic cartilage regeneration method.
  • the present invention also relates to fibrin; And a physiologically active polymer that forms an interpenetrating polymer network (IPN) structure with fibrin.
  • IPN interpenetrating polymer network
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a fibrocartilage or elastic cartilage defect disease comprising hydrogel.
  • the present invention also relates to a method for regenerating fibrocartilage or elastic cartilage of the present invention, comprising the steps of: administering to a subject in need of treatment;
  • the present invention provides a method for treating fibrocartilage or elastic cartilage defect disease.
  • the step of administering the composition for regeneration of fibrocartilage or elastic cartilage of the present invention comprises fibrin, which is formed immediately by mixing the first solution and the second solution contained in the kit of the present invention; And a physiologically active polymer that forms an interpenetrating polymer network (IPN) structure with fibrin, wherein the hydrogel is injected into the articular cavity through a minimally invasive method, It can exhibit resistance to the degradation enzyme at the injection site for a long time and can adhere to or remain attached to the injured area to improve the behavior of surrounding cells to effectively regenerate fibrous cartilage or elastic cartilage, preferably damaged cartilaginous meniscus.
  • the regenerated meniscus plate is excellent in shear and compressive elasticity and can maintain the strength of 50 to 80% of the normal cartilage plate. Therefore, it has excellent strength compared to the commercialized fibrin alone hydrogel, Or elastic cartilage defect disease.
  • the fibrocartilage or elastic cartilage defect means that the fibrocartilage, fibrocartilage and / or joint tissue (synovial membrane, articular cartilage, cartilaginous bone, etc.) are damaged by fibromyalgia injury or other inherited or acquired factors caused by mechanical stimulation or inflammatory reaction Of the cartilage.
  • the disease caused by such fibrocartilage or elastic cartilage defect is preferably a disease caused by damage or deficiency of fibrocartilage or elastic cartilage, more preferably, interspinous disc prolapse, symphysis pubis, TMJ injury, Arthroscopic osteoarthritis, external ear defects, and epiglottis or laryngeal cartilage defects in the joints of the joints of the hip joints, joint fractures of the joints of the triangular fibrocartilage complex, rupture of the ulnar collision syndrome, degenerative arthritis, meniscus cartilage damage, rheumatoid arthritis Lt; / RTI >
  • the intervertebral disc prolapse is also referred to as a disc, and may occur between the vertebrae or the pubic bone.
  • the degenerative arthritis and rheumatoid arthritis are diseases which can be caused or exacerbated by damage of fibrous cartilage or elastic cartilage, and can be treated or improved through restoration and regeneration of fibrocartilage or elastic cartilage damage.
  • the treatment of early degenerative osteoarthritis of the knee is minimized or minimized when the cartilage resection is performed or surgical methods such as cartilage transplantation are performed when the cartilage defect is severe. , It is known that the incidence of degenerative osteoarthritis can be reduced.
  • Methods of treatment may include direct injection or implantation of the composition into a target site, such as a joint.
  • Administration of the composition may often be performed as often as necessary to provide relief of symptoms, either by frequency of days, weeks, weeks, bimonthly, several times per month, monthly, or to alleviate symptoms.
  • the amount of the composition to be administered may be adjusted depending on the size of the joint and the severity of the condition. The frequency of subsequent administration to the sacroiliac is spaced by the recurrence time of the symptoms in the joint.
  • the particular dosage level for any particular patient will depend upon a variety of factors including the activity of the particular compound employed, age, weight, general health, sex, diet, time of administration, route of administration, excretion rate, And can be appropriately adjusted according to various factors.
  • the pharmaceutical compositions may be prepared and administered in dosage units. However, under special circumstances, more or less dosage units may be appropriate.
  • the administration of the dosage unit may be carried out by a single dose of the composition and also by multiple doses of the divided doses at specific intervals, or the administration may be carried out in several smaller dosage units.
  • the fibrocartilage or elastic cartilage defect disease is meniscal cartilage damage
  • the composition is administered to the joint space, such as, for example, the knee.
  • an individual with a knee meniscus injury may receive one, two, or three injections of about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ml or more per knee.
  • the volume administered may be adjusted based on the size of the joint.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the fibrous cartilage or elastic cartilage regeneration composition contained as an active ingredient.
  • the pharmaceutically acceptable carriers to be included in the composition of the present invention are those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, no.
  • the composition of the present invention may further contain lubricants, wetting agents, sweeteners, flavors, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container.
  • the formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
  • the first solution and the second solution which are hydrogel producing materials, were prepared.
  • the first solution and the second solution were prepared.
  • the first solution was prepared by mixing 10-1000 mg / ml of fibrinogen (Sigma-Aldrich) and 100-5500 KIU / ml of aprotinin (Sigma-Aldrich).
  • the second solution was prepared by dissolving PEO and calcium chloride in a solvent in which thrombin (Dyeon Pharmaceutical Co., Ltd.) powder was dissolved at a concentration of 100 to 2500 Unit (U) / mL at 37 ° C, and the concentration of PEO was 1 to 100 mg / And the concentration of calcium chloride was 5 to 50 mg / ml.
  • the hydrogel forming the interpenetrating complex structure prepared by mixing the first solution and the second solution thus prepared was named 'fibrin-PEO'.
  • the fibrinogen solution and the platelet-rich plasma were mixed at a ratio of 1.0: 0.1-1.0: 0.7 by volume to prepare a first solution, and the second solution was prepared in the same manner as in Example 1.1.
  • the hydrogel forming the interpenetrating complex structure prepared by mixing the first solution and the second solution thus prepared was named 'fibrin-PEO-PRP'.
  • Platelet-rich plasma obtained by separating the fibrin and rabbit blood as the first solution, and the second solution containing the pluronic 127 and the thrombin was prepared.
  • the fibrinogen solution and the platelet rich plasma were mixed at a ratio of 1.0: 0.1-1.0: 0.7 by volume to prepare a first solution, and a second solution was prepared in the same manner as in Example 1.2.
  • the hydrogel forming the interpenetrating complex structure prepared by mixing the first solution and the second solution thus prepared was named 'fibrin-F127-PRP'.
  • the first solution and the second solution were included in one and two compartments of the double syringe, respectively, and each solution flowed out from the individual compartments at the time of the procedure, To form a structure. Its schematic and solidified hydrogels are shown in Fig.
  • the hydrogel-forming materials of Examples 1.1 to 1.4 in the present invention all formed a three-dimensional structure hydrogel through immediate gelation.
  • the thus-prepared hydrogel is characterized in that PEO or F127 is partially penetrated between fibrin to form an interpenetrating polymer network (IPN).
  • IPN interpenetrating polymer network
  • the hydrogel was formed into a frame having a diameter of 8.0 mm, and the shear modulus and compressive modulus were measured.
  • the shear modulus was measured using a rheometer (ARES-LS, TA Instruments).
  • the plate spacing was set to 900 ⁇ m and the frequency condition was adjusted from 0.1 to 100 Hz.
  • the compressive modulus was measured using a universal tensile tester (Instron 5966, Instron Corporation).
  • the compressive modulus (E) was derived from the slope of the section with the elastic section in the stress - strain graph.
  • the concentration of fibrinogen was fixed at a constant concentration of 100 mg / ml, and the concentration of thrombin in the second solution was adjusted to 500, 1000, and 2500 U / mL before the final concentration of thrombin was 250 U / mL, 500 U / U / mL to prepare a hydrogel. After the preparation, the shear modulus and the compressive modulus were measured, and the results are shown in FIG.
  • the shear moduli of fibrin hydrogels increased in the order of 14.1 ⁇ 1.0, 14.7 ⁇ 0.7, and 15.4 ⁇ 0.6 kPa at 100 rad / s, respectively.
  • the compressive moduli of the fibrin hydrogels were 29.9 ⁇ 3.1, 43.1 ⁇ 5.2, and 93.6 ⁇ 9.0 kPa, respectively .
  • the compressive modulus of the hydrogel was measured when PEO or F127 was added as the second solution.
  • the concentration of fibrinogen in the first solution was fixed at a constant concentration of 100 mg / ml.
  • the concentration of thrombin in the second solution was fixed to 2500 U / mL so that the concentration of trovin in the final mixed composition was 1250 U / ml, and the concentration of PEO in the final mixed composition was 1.0, 3.0, 5.0% (w / v)
  • the concentration of PEO in the second solution was changed to 2.0, 6.0 and 10.0% (w / v) so that the concentration of F127 in the final mixed composition was 3.0, 7.0 and 10.0% (w / v) % (w / v) to prepare a second solution.
  • the change in compressive modulus according to each production example was confirmed, and the results are shown in Fig.
  • the fibrin-PEO hydrogels prepared according to the PEO concentration change under the condition of the thrombin concentration of 1250 U /
  • the shear modulus of the specimens increased in the order of 15.4 ⁇ 1.3, 18.5 ⁇ 1.2 and 21.5 ⁇ 1.5 kPa at 100 rad / s, respectively.
  • the first solution was prepared by mixing fibrinogen at 200 mg / ml and platelet-rich plasma (PRP) at a volume ratio of 1: 1 with the first solution to give a final fibrinogen concentration of 100 mg / ml.
  • PRP platelet-rich plasma
  • 2 solution were mixed to prepare a hydrogel by immediate solidification.
  • the hydrogel prepared was named fibrin-PEO-PRP or fibrin-F127-RPR.
  • FIG. 5 shows the decomposition patterns of hydrogels prepared from fibrin + PEO, fibrin + PEO + PRP, fibrin + F127 and fibrin + F127 + PRP prepared in Example 1.
  • the fibrin hydrogel as the control group was completely decomposed before 120 hours of trypsin treatment, but the fibrin + PEO group and the fibrin + F127 of the hydrogel prepared in the present invention reached 192 hours and 264 hours, . That is, it was confirmed that the hydrogel prepared according to the present invention was capable of slowing the degradation on average 72 hours compared to the control fibrin hydrogel due to the partial penetration effect of PEO or F127. Therefore, it has been confirmed that the use of the hydrogel of the present invention enables the desired effect to be achieved by staying in the body for a longer time.
  • a biocompatibility test was conducted to confirm whether the fibrin-PEO or fibrin-F127 hydrogel prepared in Example 4 is suitable for use as a therapeutic agent.
  • the fibrochondrocyte obtained from the rabbit cartilage was mixed with the first solution containing fibrinogen at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / mL and mixed with the second solution containing PEO or F127 to prepare a hydrogel, Cells were encapsulated within the hydrogel. Thereafter, the hydrogel was cultured in F-12 medium for 24 hours, and living cells and dead cells were stained using a Live / Dead assay kit (Invitrogen) and observed with a fluorescence microscope (AMF4300, EVOS, Life Technology). Four magnification images were taken and the cell viability was calculated and compared using the following equation, and the results are shown in FIG.
  • Cell survival rate number of viable cells / total number of cells x 100
  • the hydrogel prepared with PEO or F127 was also almost free of dead cells stained with red color, and the time-dependent, hydrogel cell viability /
  • the hydrogel prepared in the present invention is excellent in biocompatibility even though it remains in the living body for a long time in vivo.
  • the meniscus was damaged, and after returning the patella to its original position, the soft tissues around the patella were closed with an absorbable thread and the skin was closed with a non-absorbable thread. Gato was allowed to move freely after confirming that the patient was awake from the anesthesia. Analgesics and antibiotics were administered to prevent infection for 5 days after surgery.
  • fibrinogen 100 mg / mL and aprotinin 0.5 mg / mL were added to a prepared double syringe syringe 1 section, 2500 U / mL of thrombin, 5% (w / v)% of calcium chloride or 2500 U / mL of calcium chloride and 10.0% of PEO or 2500 U / mL of thrombin, 5% (w / v) of calcium chloride and 20.0% of F127 were added to the above animal model, The meniscus was implanted in the damaged area. I did not do anything on the opposite leg.
  • Example 8 Compressive strength test of regenerated meniscus plate
  • the important physical properties of the meniscus scaffold are the compressive strength that can withstand external forces. Therefore, the meniscus plate regenerated at 12 weeks in Example 7 was cut into 2 samples using a 4 mm punch, and the compressive strength was measured by a tensile tester. The fibrin-PEO and fibrin-F127 hydrogels of the present invention were injected and regenerated The strength of the meniscus was confirmed and the results are shown in Fig.
  • the compressive strength of tissue regenerated through injection of fibrin-PEO, fibrin-F127 hydrogels was significantly increased compared with the group treated with only meniscectomy only and fibrin alone Respectively.
  • the Mpa value was 203.3 ⁇ 43.2 and the compressive strength was 844.9 ⁇ 32.6 in the fibrin alone group, 4086.7 ⁇ 542.1 in the fibrin + PEO hydrogel injected group, and fibrin + F127 3406.8 ⁇ 312.1 in the group injected with hydrogel, and 6688.6 ⁇ 1012.5 in the case of normal meniscus.
  • the strength of the regenerated meniscus plate by injecting the fibrin + PEO hydrogel and the fibrin + F127 hydrogel of the present invention was 60% or more of the normal meniscus plate, and thus it was confirmed that the meniscus plate can be effectively used for regeneration of the meniscus.

Abstract

본 발명은 연골, 바람직하게는 섬유연골 또는 탄성연골을 재생 및 치료하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 재생 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 연골 재생용 조성물 및 키트는 최소침습적 방법으로 간편하게 섬유연골 또는 탄성연골의 재생 또는 손상 회복이 필요한 부위에 투여가 가능하고, 체내 독성없이 분해 효소에 대한 저항성을 나타내며 손상된 주입부위에 접착 혹은 유치되어 머무름으로써, 주위 세포의 거동을 향상시켜 효과적인 반월상 연골판 결손조직의 재생을 유도할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 생체 조직 결손 부위의 재생을 도와주는 매개체로 바이오 생체 재료 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

인간 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물
본 발명은 섬유연골 또는 탄성연골을 재생 및 치료하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 재생 방법에 관한 것이다.
연골은 다른 결합조직과 같이 결합조직세포와 세포외기질로 구성되어 있지만, 고유결합조직과는 달리 단단하면서도 어느 정도 유연성이 있는 기질을 함유한 특수한 결합조직이다. 연골은 연골기질을 구성하는 섬유의 종류와 특성에 따라서　유리연골(hyaline cartilage),　탄성연골(elastic cartilage) 및　섬유연골(fibrous cartilage)로 분류된다. 유리연골은 주로 II형 아교질을 함유하고 있으며, 가장 흔한 종류의 연골이다. II형 아교질은 대부분 미세원섬유(microfibrils)의 형태로 나타나며 무형질의 주성분인 단백당과 굴절율(refractory index)이 거의 같기 때문에 섬유성분과 무형질은 균일한 물질로 관찰된다.　탄성연골은 기질 내에 탄력섬유가 풍부하다는 점에서 유리연골과 구별된다.　섬유연골은 다른 연골에 비해 무형질이 적으며, 아교섬유가 많고 이들 섬유는 대부분 일정한 방향으로 배열되어 있다. 섬유연골을 구성하는 아교섬유의 아교질은 I형 아교질인 차이점이 있다. 유리연골은 뼈의 관절면(articular surface), 늑연골(costal cartilage), 기관(trachea), 기관지(bronchus) 후두연골(laryngeal cartilage) 등에서 관찰된다. 탄성연골은 외이(external ear)와 후두덮개(epiglottis) 및 일부 후두연골을 구성하며, 섬유연골은 척추사이원반(intervertebral disc), 치골섬유연골결합(symphysis pubis), 관절내 반월상 연골판(meniscus), 및 관절내 섬유연골복합체(fibrocartilage complex) 등에 존재한다.　
섬유연골에 속하는 반월상 연골판(Meniscus)은 대퇴골과 경골의 관절면 사이에 위치하며 무릎 관절의 기능을 유지하는데 있어서 매우 중요한 역할을 하는 구조물 중에 하나이다. 반월상 연골은 무릎관절의 하중과 스트레스를 분산시키고, 충격을 흡수하며, 관절연골에 윤활작용을 하고, 외부의 충격을 흡수하여 관절 연골을 보호하는 아주 중요한 역할을 한다. 이러한, 반월상 연골판은 무릎 관절의 중간에 위치한 반달모양의 물렁뼈로 형성되고, 연골판은 관절 사이에서 완충작용을 하는데, 서있거나 걷거나 달릴 때, 체중이 위에서 아래로 전달될 때, 관절 연골이 손상되지 않도록 충격을 흡수하는 역할을 한다.
상세하게는, 반월상 연골판은 좌우 무릎 관절에 초승달 모양의 연골 2개가 각각 한쌍을 이루고 있고, 이를 각각 외측 반월상 연골판, 내측 반월상 연골판이라고 부른다. 그 사이를 전방 십자인대와 후방 십자인대가 가로지르며, 위쪽의 넙다리뼈와 아래쪽의 정강뼈를 연결한다.
반월상 연골판은 운동선수에서 손상되는 경우가 많다. 이를 '반월상 연골판 파열'이라고 부르고, 반월상 연골판 파열은 일반적으로 운동 중 발생하는 경우가 많다. 하지만 50대 후반에서 60대 중반의 중년층에서는 퇴행성관절염이 어느 정도 진행돼 있는 경우, 갑작스럽게 반월상 연골판 뒤쪽이 끊어지면서 파열이 많이 발생되고, 중년 여성들은 쪼그려 앉거나 무릎을 많이 구부리는 가사 일을 오랜 기간 지속해오면서 반월상 연골판 부위가 파열되는 경우도 있다. 이렇게, 반월상 연골판이 찢어지거나 훼손되는 경우, 약물 복용이나 수술적 치료를 시행하게 된다. 세포외 기질의 콜라겐 구성요소는 연골판의 강도를 제공하는데 도움이 되고, 프로테오글리칸 ECM 구성 요소는 충격 흡수 기능에 기여하고 있다. 또한 초승달 모양의 조직은 vascularized된 외부 부분과, 내부 avascular 지역을 포함하고 있다. 조직 손상이 혈관이 분포한 외부 부분에 있는 경우에는 봉합술을 시행할 수 있는 경우가 있으나, 그렇지 못할 경우도 있으며, 혈관이 없는 avascular 영역에 있으면 자연 치유가 가능하지 않기 때문에 절제하는 시술을 시행하게 된다. 현재 수술적 치료법으로는 연골판 조직 손상의 크기나 위치에 따라 부분절제 (partial meniscectomy) 또는 아전절제술이나 전절제술 (subtotal or total meniscectomy)등으로 나뉠 수 있으며, 절제술에 의한 인한 조직의 제거는 궁극적으로 퇴행성 관절염을 유발하게 되므로 근본적인 치료법인 손상된 연골판의 재생 치료를 위한 의료 기술이 요구되고 있다.
연골판 결손으로 인한 퇴행성 관절염의 발생을 막기 위한 치료 방법으로서, 현재 “동종 반월상 연골판 이식술”과 “합성 대체물을 이용한 반월상 연골판 재생치료”가 있으며, 동종 반월상 연골판 이식술은 연골판의 크기와 모양이 맞는 공여 이식물이 필요하고, 결손이 없는 환자의 연골판 부위도 모두 제거해야 하는 문제 및 이식물의 고정 등의 문제로 인해 아직 임상적 결과가 좋지 않다.
반월판 연골판 재생을 위한 의료기기 개발 성과는 현재 세계적으로 초기 단계이며 현 상태로 의료기기로 개발되어 있는 Polyurethane을 이용한 의료기기 Actifit (Orteq Ltd.)와 Nusurface (Active Implants LLS) 및 Collagen을 주성분으로 하는 의료기기 Menaflex (ReGen Biologics, Inc.)가 개발되어 있으며, 제품 모두 현재 개발된 자국에서만 사용 허가를 받은 상태이고, 타 지역에서는 아직 임상시험 및 FDA 진행이 되지 않은 상태이다. 임상에 적용한 지 2년 이내이므로 매우 초기단계이고, 크기나 모양을 맞추어 주는 문제 및 대체물을 봉합술기를 통하여 고정해야 하는 기술적 문제가 큰 단점이다.
지지체 기반의 이식술의 경우, 적절한 형태로 가공한 고분자 지지체를 부분 절제된 연골판과 봉합하는 방식이며, 상기 동종 반월상 연골판 이식술을 대체할 기술로 평가되고 있으나, 안정성 및 유효성이 아직 검증되지 않은 상태다. 또한, 지지체 기반 이식술은 특정한 형태의 지지체를 연골판 위치에 삽입해야 하므로 슬관절의 절개가 필수적인 문제점이 있다.
따라서, 동종 반월상 연골판 이식술에서처럼 불필요하게 모든 연골판을 제거할 필요가 없고, 공여 연골판을 필요로 하지 않으며, 또한, 현재 시도되고 있는 대체물을 이용한 연골판 재생치료에서처럼 결손부위 크기나 모양을 맞출 필요가 없고 봉합술기를 사용하지 않고도 더욱 우수한 재생치료가 이루어 질 수 있는 기술에 대한 필요성이 있다.
본 발명자는 슬관절의 절개 및 대체물의 삽입이 필수적으로 수반되는 종래 기술의 문제점을 해결하고 보다 간편한 최소 침습 슬관절 반월판 연골 재생 방법에 대하여 연구하던 중, 피브리노겐, 트롬빈 및 생리활성 고분자를 이용하여 제조된 하이드로겔을 이용하면 최소 침습적인 방법으로도 섬유연골인 반월상 연골판이 효과적으로 재생됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은 피브리노겐, 트롬빈 및 생리활성 고분자를 이용하여 제조된 하이드로겔을 포함한 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물, 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 피브린; 및 피브린과 상호침투복합체 (interpenetrating polymer network, IPN) 구조를 형성하는 생리활성 고분자;를 포함하는 하이드로겔을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 연골 재생용 조성물을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 스캐폴드를 제공한다.
또한 본 발명은 피브리노겐 용액을 포함하는 제1구획; 및 트롬빈 및 생리활성 고분자를 포함하는 제2구획을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 1) 피브리노겐 10 내지 1000mg/ml 를 제1용액으로 준비하는 단계; 2) 트롬빈 및 생리활성 고분자를 혼합하여 제2용액을 준비하는 단계; 를 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 피브린; 및 피브린과 상호침투복합체 (interpenetrating polymer network, IPN) 구조를 형성하는 생리활성 고분자;를 포함하는 하이드로겔을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 결손 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 섬유연골 탄성연골 재생용 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 결손 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 연골 재생용 조성물 및 키트는 최소침습적 방법으로 간편하게 섬유연골 또는 탄성연골의 재생 또는 손상 회복이 필요한 부위에 주입이 가능하고, 체내 독성없이 분해 효소에 대한 저항성을 나타내며 손상된 주입부위에 접착 혹은 유치되어 머무름으로써, 주위 세포의 거동을 향상시켜 효과적인 반월상 연골판과 같은 섬유연골 또는 탄성연골 결손조직의 재생을 유도할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 생체 조직 결손 부위의 재생을 도와주는 매개체로 바이오 생체 재료 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물 및 키트의 모식도 및 이를 통해 제조된 하이드로겔을 나타낸 도이다. 도 1의 A는 피브리노겐 및 트롬빈과 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 또는 플루로닉(F127)의 혼합물을 포함하는 주사기 형태의 키트와 피브린 및 피브린과 상호침투복합체 (interpenetrating polymer network, IPN) 구조를 형성하는 생리활성 고분자를 이용하여 제조된 본 발명의 하이드로겔을 나타낸 도이다.
도 1의 B 는 피브리노겐, 혈소판 풍부 혈장 (PRP) 및 트롬빈과 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 또는 플루로닉(F127)의 혼합물을 포함하는 주사기 형태의 키트와 피브린 및 피브린과 상호침투복합체 (interpenetrating polymer network, IPN) 구조를 형성하는 생리활성 고분자를 이용하여 제조된 본 발명의 하이드로겔을 나타낸 도이다.
도 2는 트롬빈 농도 변화에 따른 하이드로겔의 탄성률을 나타낸 도이다. 도 2의 A 는 전단 탄성률을 나타낸 도이다. 도 2의 B 는 압축탄성률을 나타낸 도이다 (student t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 3은 트롬빈 농도 1250U/ml 조건 하에서 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) 와 플루로닉 127 (F127)의 농도변화에 따른 하이드로겔의 압축 탄성률 및 전단 탄성률 변화를 나타낸 도이다. 도 3의 A 는 트롬빈, PEO 를 이용하여 제조된 하이드로겔의 PEO 농도에 따른 압축 탄성률 변화를 나타낸 도이다. 도 3의 B는 트롬빈, F127을 이용하여 제조된 하이드로겔의 F127 농도에 따른 압축 탄성률 변화를 나타낸 도이다. 도 3의 C는 제조된 하이드로겔의 PEO 농도에 따른 전단 탄성률 변화를 나타낸 도이다. (student t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 4는 트롬빈 농도 1250U/ml, 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) 5.0 %, 플루로닉 127 (F127) 10.0 %의 조건 하에서, PRP 첨가에 따른 전단 탄성률 변화를 나타낸 도이다. 도 4의 A는 피브린-PEO 하이드로겔 (Fb/PEO) 과 PRP 첨가 하이드로겔 (Fb/PEO+PRP) 의 전단 탄성률을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 4의 B는 피브린-F127 하이드로겔 (Fb/F127) 과 PRP 첨가 하이드로겔 (Fb/F127+PRP) 의 전단 탄성률을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 4의 C는 피브린, 피브린-PEO, 피브린-PEO-PRP, 피브린-F127, 피브린-F127-PRP 하이드로겔의 전단 탄성률 비교 그래프를 나타낸 도이다 (그래프 상단에 있는 *, **, ***은 피브린 그룹과의 비교 시 통계학적 유의성을 나타낸다.)
도 5는 제작된 피브린-F127, 피브린-PEO 하이드로겔 및 대조군 피브린 단독 처리군의 트립신 효소 처리시 분해양상을 나타낸 도이다.
도 6는 제작된 하이드로겔과 혼합된 세포의 24시간 후 세포생존율을 나타낸 도이다. 도 6의 A 는 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다. 도 6의 B는 세포 생존도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 가토의 반월상 연골판 손상 부위가 재생되는 결과를 나타낸 도이다. 도 7의 A는 반월상 연골판 손상 1주일 후, 피브린, 피브린-PEO, 피브린-F127 하이드로겔을 주입하여 4주, 8주, 12주에 관찰된 반월상 연골판이 재생된 모습을 보여주는 육안적 결과이다. 도 7의 B는 재생된 반월상 연골판의 면적을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 가토의 반월상 연골판 손상 부위가 재생되는 결과를 나타낸 도이다. 도 8의 A는 반월상 연골판 손상 1주일 후, 피브린-PEO, 피브린-F127 하이드로겔을 주입하여 4주, 8주, 12주에 관찰된 반월상 연골판이 재생되는 모습을 보여주는 Hematoxylin & Eosin (H&E), Safranin O 염색 및 Type I collagen에 대한 면역염색 결과 (x40)를 나타낸 도이다. 도 8의 B는 Histological tissue quality score 를 나타낸 도이다 (A. 반월판 절제술(Meniscectomy), B. 반월판 절제술+피브린 단독 처리군, C 반월판 절제술+피브린+PEO, D. 반월판 절제술+피브린 +F127).
도 9는 가토의 반월상 연골판 손상 부위가 재생된 반월상 연골판의 강도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 피브린; 및 피브린과 상호침투복합체 (interpenetrating polymer network, IPN) 구조를 형성하는 생리활성 고분자;를 포함하는 하이드로겔을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 하이드로겔은 피브리노겐과 트롬빈의 작용으로 형성되는 피브린 고분자망에 생리활성 고분자의 고분자 사슬이 무작위적으로 침투되어 상호 침투 복합체를 형성하고 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 이와 같이 상호 침투 복합체 구조가 형성된 하이드로겔은 세포 독성을 나타내지 않아 생체 적합성이 우수할 뿐만 아니라, 최소 침습적 방법으로도 섬유연골 또는 탄성연골의 재생이 필요한 부위에 주입이 가능하다. 또한 주입 부위에 장시간 분해되지 않고 손상된 부위에 접착 혹은 유치되어 머무를 수 있으며, 주위 세포의 거동을 향상시켜 섬유연골 또는 탄성연골의 재생을 효과적으로 유도할 수 있어 섬유연골 및 탄성연골의 재생, 더욱 바람직하게는 반월상 연골판 재생에 효과적이다.
본 발명에 있어서, 생리활성 고분자는, 피브린 고분자망에 무작위적으로 침투하여 상호 침투 복합체 하이드로겔을 형성할 수 있는 고분자를 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 알긴산염, 키토산, 히알루론산, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 셀룰로스, 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산)(PLA), PLA-PGA, PLA-PEG, 덱스트란, 덱스트란-PEG, 전분, 콜라겐 기저 겔, 아가로스, 플루론산, 헤파란 설페이트, 글리코사미노글리칸, 폴리에틸렌 옥사이드(PEO), 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 공중합체(P(EO-co-PO)) 및 플루로닉/폴록사머로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide, 이하 PEO) 또는 플루로닉 127 (Fluronic F127, 이하 F127) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 재생의 대상이 되는 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage) 중에서 섬유연골 또는 탄성연골일 수 있다. 섬유연골은 하얀 섬유성 조직과 연골성 조직이 다양한 비율로 섞여있는 연골로, 압박에는 강하지만 잘 찢어지고 치밀한 상태로 배열되어 있다. 섬유연골은 유리연골이나 결합 조직과 연결되어 존재하며 뒤틀림이나 압박이 일어나는 부위에서 완충 작용을 하여 제한된 움직임이 가능하도록 하고 탄력을 유지하는 것을 특징으로 한다. 유리연골은 주로 Ⅱ 형 아교질로 구성되고, 섬유성분과 무형질이 균일하게 관찰되나, 탄성연골은 기질 내에 탄력섬유가 풍부하다는 점에서 유리연골과 차이점이 있고 섬유연골은 유리연골 및 탄성연골과 비교하여 무형질이 적으며 아교섬유가 많고 일정한 배열로 연결되어 있다는 점에서 뚜렷한 차이점을 갖는다. 특히 섬유연골을 구성하는 아교 섬유의 아교질은 I 형 아교질로 차이점이 있으며, 섬유연골은 탄성연골, 유리연골과 달리 뚜렷한 연골막이 없다. 섬유연골에서 층판을 이루는 I형 아교섬유다발은 이웃한 층판과 직각으로 배열되는 것으로 알려져 있으며, 다른 연골과 달리 섬유연골의 이러한 특징적 배열에 의하여 척추 사이 원판 등에서 특별한 탄성을 가지고 체중 부하 등에 의해 생성되는 압력에 잘 견딜 수 있게 한다.
본 발명에 있어서 바람직한 재생, 손상 회복의 대상이 되는 섬유연골 또는 탄성연골은 추간원판이나 관절순, 관절 반월 부위에 존재하는 다양한 섬유연골 및 외이(external ear), 후두덮개(epiglottis) 및 일부 후두연골 부위에 존재하는 다양한 탄성연골을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 추간판 연골(intervertebral disc), 치골섬유연골결합(symphysis pubis) 연골, 반월상 연골판(meniscus), 관절내 섬유연골복합체 (fibrocartilage complex), 악관절 연골, 복장빗장관절 (sternoclavicular joint) 의 관절원반, 비구순 (acetabular fossa) 연골, 외이(external ear), 후두덮개(epiglottis) 및 후두연골로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상 일 수 있다.
본 발명에 있어 반월상 연골판이란, 대퇴골과 경골의 관절면 사이에 위치하며 무릎 관절의 기능을 유지하는데 있어서 매우 중요한 역할을 하는 구조물 중에 하나이며, 무릎관절의 하중과 스트레스를 분산시키고, 충격을 흡수하며, 관절 연골에 윤활작용을 하고, 외부의 충격을 흡수하여 관절 연골을 보호하는 아주 중요한 역할을 한다. 이러한, 반월상 연골판은 무릎 관절의 중간에 위치한 반달모양의 연골로 형성되고, 연골판은 관절사이에서 완충작용을 하는데, 서있거나 걷거나 달릴 때, 체중이 위에서 아래로 전달될 때, 관절 연골이 손상되지 않도록 충격을 흡수하는 역할을 한다. 따라서 연골판은 퇴행성 관절염의 예방에 있어 매우 중요함이 알려져 있다.
본 발명의 피브린; 및 피브린과 상호침투복합체 (IPN) 구조를 형성하는 생리활성 고분자;를 포함하는 하이드로겔은 생체의 트립신에 분해 저항성을 나타내고, 동일한 조건에서 피브린의 분해 시간과 비교하였을 때 60 내지 84 시간 이상 더 분해 저항성을 갖고 오래도록 겔 형태를 유지할 수 있으므로 체내에서 목적 부위에 오래 잔류하여 섬유연골 재생을 더욱 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명의 하이드로겔은 100 radian / sec 진동수 조건 하에서 15 내지 40 kPa의 전단 탄성률을 나타낼 수 있으며, 10 내지 200 kPa의 압축 탄성률을 나타낼 수 있다. 본 발명의 하이드로겔이 상기와 같은 탄성률을 나타냄으로써, 섬유연골 재생 시 딱딱하지 않고 유연성과 탄성을 유지할 수 있고, 이를 통해 섬유연골 결손 부위의 크기와 형태에 무관하게 쉽게 투여가 가능하고 투여된 하이드로겔 내로 주위 세포가 유입되어 조직 재생을 일으키는 장점이 있다.
본 발명의 조성물은 혈소판 풍부 혈장 (platelet-rich plasma, PRP) 을 더 포함할 수 있다. 혈소판 풍부 혈장은 하이드로겔의 준비 물질인 피브리노겐과 혼합한 형태로 제공될 수 있으며, 혈소판 풍부 혈장을 더 포함하는 경우 100 radian / sec 진동수 조건 하에서 더욱 우수한 전단 탄성률을 나타낼 수 있다.
본 발명의 조성물은 섬유연골 재생을 위한 하이드로젤 조성물 형태이며, 주사기 등을 이용하여 최소 침습적으로 섬유연골 또는 탄성연골의 재생이 필요한 부위에 효과적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용일 수 있으며, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 지지체로 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 스캐폴드를 제공한다.
또한 본 발명은 피브리노겐 용액을 포함하는 제1구획; 및 트롬빈 및 생리활성 고분자를 포함하는 제2구획을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 2개 이상의 구획으로 이루어져 있으며, 피브리노겐 용액과 트롬빈 및 생리활성 고분자를 각각 나누어 포함하는 것을 목적으로 한다. 예컨대 바람직하게는 피브린-PEO 또는 피브린-F217 하이드로겔의 제조 물질을 각각 나누어 포함하는 것을 목적으로 한다. 제1구획의 제1용액과 제2구획의 제2용액은 더블 시린지 (이중 주사기) 의 시린지 내에서 혼합이 이루어질 수 있으며, 즉각적으로 피브린 형성 및 상호 침투 복합체 구조 형성을 통해 3차원적 구조의 하이드로겔이 형성될 수 있다.
제1구획에는 피브리노겐 외에 혈소판 풍부 혈장을 더 포함할 수 있다. 혈소판 풍부 혈장을 더 포함하여 하이드로겔을 제조하는 경우 더욱 우수한 전단 탄성률을 나타날 수 있고, 피브리노겐과 혈소판 풍부 혈장은 1:0.1 내지 1:1 부피비, 바람직하게는 1:0.1 내지 1:0.8 의 부피비로 혼합하여 제1구획에 포함될 수 있다.
본 발명의 키트는 피브린; 및 피브린과 상호침투복합체 (interpenetrating polymer network, IPN) 구조를 형성하는 생리활성 고분자;를 포함하는 하이드로겔을 제조하기 위한 제조물질인 제1용액 및 제2용액을 각각의 구획에 포함하는 것을 목적으로 하며, 제1구획은 제1용액으로 피브리노겐을 10 내지 1000mg/ml 농도, 바람직하게는 10 내지 500mg/ml 의 농도, 더욱 바람직하게는 50 내지 200mg/ml 농도로 포함할 수 있다. 제1구획에는 항섬유소 용해제가 제1용액에 추가적으로 포함될 수 있으며, 예컨대 아프로티닌이 바람직하게는 0.5mg/ml (3 내지 8 TIU/mg) 이 되도록 추가적으로 포함될 수 있고, KTU 단위로 환산 시, 100 내지 5500 KIU/ml, 바람직하게는 1950 내지 5200 KIU/ml 농도로 포함될 수 있다. 제2구획에는 제2용액이 포함될 수 있으며, 제2용액에는 트롬빈 및 생리활성 고분자가 포함될 수 있다. 상기 트롬빈은 제2용액 내 100 내지 5000 Unit(U)/ml 포함될 수 있으며, 바람직하게는 250 U/ml 내지 3000 U/ml 농도, 더욱 바람직하게는 250 내지 2800 U/ml 농도로 포함될 수 있다. 트롬빈은 최종 혼합 조성물 내에서 최종 농도가 250 U/ml 내지 1250 U/ml 일 수 있고, 염화칼슘(CaCl2)이 5 내지 50 mg/ml 포함될 수 있으며, 바람직하게는 5 (w/v)% 가 되도록 추가적으로 포함될 수 있다. 상기 생리활성 고분자는 피브린 고분자망에 무작위적으로 침투하여 상호 침투 복합체 하이드로겔을 형성할 수 있는 고분자를 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 알긴산염, 키토산, 히알루론산, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 셀룰로스, 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산)(PLA), PLA-PGA, PLA-PEG, 덱스트란, 덱스트란-PEG, 전분, 콜라겐 기저 겔, 아가로스, 플루론산, 헤파란 설페이트, 글리코사미노글리칸, 폴리에틸렌 옥사이드(PEO), 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 공중합체(P(EO-co-PO)) 및 플루로닉/폴록사머로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 PEO 또는 F127 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 생리활성 고분자가 PEO 인 경우, 이는 최종 혼합 조성물 내에서 PEO 의 농도가 1 내지 10% (w/v), 바람직하게는 1 내지 5 % (w/v) 가 되도록 제2 용액 내에 2 내지 20 % (w/v)로 포함될 수 있고, 바람직하게는 2 내지 10(w/v) % 로 포함될 수 있다. 또한 상기 생리활성 고분자가 F127인 경우 이는 최종 혼합 조성물 내에서 F127의 농도가 1 내지 20(w/v) %, 바람직하게는 3 내지 10 (w/v) %이 되도록, 제2용액 내에 2 내지 40(w/v) %, 바람직하게는 6 내지 20 (w/v) %로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어, 키트는 의료적 목적으로 사용되는 의료 기기와 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 바람직한 형태는 더블 시린지 형태일 수 있다.
또한 본 발명은 1) 피브리노겐 10 내지 1000mg/ml 를 제1용액으로 준비하는 단계; 2) 트롬빈 및 생리활성 고분자를 혼합하여 제2용액을 준비하는 단계; 를 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 하이드로겔의 준비물질 제조 단계를 포함하여, 섬유연골 또는 탄성연골 재생이 필요한 개체에 치료/시술이 필요한 경우 신속하게 하이드로겔을 제조하여 최소 침습적 방법을 통해 관절강 내로 하이드로겔을 주입할 수 있다. 즉 본 발명의 제조방법은 피브리노겐을 주성분으로 하는 제1용액의 준비과정 및 트롬빈과 생리활성 고분자, 바람직하게는 PEO 또는 F127의 혼합물을 주성분으로 하는 제2용액의 준비과정, 그리고 제1용액과 제2용액이 더블 시린지 내에서 혼합되어 고형화되며 체내에 주입되는 과정을 포함할 수 있다.
따라서 본 발명은 3) 상기 제1용액 및 제2용액을 혼합하여 피브린과 생리활성 고분자가 상호침투복합체 (IPN) 구조를 형성하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 하이드로겔을 제조하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 제조방법에 있어서, 제1용액에는 혈소판 풍부 혈장을 더 포함할 수 있으며, 피브리노겐과 혈소판 풍부 혈장을 1:1 내지 1:2의 부피비로 더 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 제1용액 또는 제2용액에는 섬유연골 또는 탄성연골 재생에 필요한 생리 활성 물질이 더 포함될 수 있으며, 상기 생리 활성 물질은 세포배양배지 또는 성장인자 일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 피브린; 및 피브린과 상호침투복합체 (interpenetrating polymer network, IPN) 구조를 형성하는 생리활성 고분자;를 포함하는 하이드로겔을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 결손 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 결손 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물을 투여하는 단계는 본 발명의 키트에 포함된 제1용액과 제2용액이 혼합되어 즉시 형성되는, 피브린; 및 피브린과 상호침투복합체 (interpenetrating polymer network, IPN) 구조를 형성하는 생리활성 고분자;를 포함하는 하이드로겔을 투여하는 것을 특징으로 하며, 상기 제조된 하이드로겔은 최소 침습적 방법을 통해 관절강에 주입되고, 오랜 시간 주입 부위에 분해 효소 저항성을 나타내며 손상된 부위에 접착 혹은 유치되어 머무르면서, 주위 세포의 거동을 향상시켜 섬유연골 또는 탄성연골, 바람직하게는 손상된 슬관절 반월상 연골판을 효과적으로 재생시킬 수 있다. 재생된 반월상 연골판은 전단 및 압축 탄성력이 매우 우수하며, 정상 연골판의 50 내지 80%의 강도를 유지할 수 있어, 상용화된 피브린 단독 하이드로겔 대비 강도가 우수하고, 섬유연골 또는 탄성연골 재생 및 섬유연골 또는 탄성연골 결손 질환 치료에 매우 효과적이다.
상기 섬유연골 또는 탄성연골 결손이란, 섬유연골, 섬유연골 조직 및/또는 관절조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해된 섬유연골 손상 혹은 기타 선천적 혹은 후천적 요인에 의한 탄성연골 손상 혹은 결손을 말한다. 이러한 섬유연골 또는 탄성연골 결손으로 인한 질환은 바람직하게는 섬유연골 또는 탄성연골의 손상 또는 결손으로 인해 발생하는 질환일 수 있고, 더욱 바람직하게는 척추사이원판 탈출증, 치골간판 손상, 악관절 손상, 복장빗장관절의 관절원반 손상, 손목 관절의 삼각섬유연골 복합체 파열, 척골 충돌 증후군, 퇴행성 관절염, 반월상 연골판 손상, 류마티스성 관절염, 외이(external ear) 결손, 및 후두덮개(epiglottis) 또는 후두연골 결손으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 척추사이원판 탈출증은 디스크라고도 불리며, 척추체간 혹은 치골 사이에서도 발생할 수 있다. 상기 퇴행성 관절염 및 류마티스성 관절염은 섬유연골 또는 탄성연골의 손상에 의하여 발생 혹은 악화될 수 있는 질환으로, 섬유연골 또는 탄성연골의 손상 회복 및 재생을 통해 치료 혹은 호전될 수 있다. 이와 관련하여 당 분야에서는 슬관절의 초기 퇴행성 골관절염 치료를 위하여 연골판 절제술시 최소한의 절제를 하거나, 연골판 결손이 심한 경우에 연골판 이식술과 같은 수술적 방법을 수행하여 섬유연골 또는 탄성연골의 소실을 최소화하거나 대체하는 방법을 통해 퇴행성 골관절염의 발생을 줄일 수 있음이 알려져 있다.
치료 방법은 조성물을 표적 부위, 예컨대 관절로 직접 주사 또는 이식하는 것을 포함할 수 있다. 조성물의 투여는 종종, 일, 주, 주 당 수회, 격월, 월당 수회, 월단위의 빈도로, 또는 증상의 경감을 제공하기 위해 필요한 만큼의 빈도로 실행될 수 있다. 관절 내 사용의 경우, 관절의 크기 및 상태의 심각도에 따라, 투여되는 조성물의 양을 조절할 수 있다. 당 관절로의 후속 투여의 빈도는 상기 관절에서의 증상의 재발 시간에 따라 간격을 두게 된다.
임의의 특정 환자에 대한 특정 투여량 수준은 채택된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배설률, 약물 조합 및 치료 중인 특정 질환의 극심도를 포함하는 다양한 인자에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 약학 조성물은 투여량 단위로 제조되고 투여될 수 있다. 그러나, 특별한 상황에서, 더 많거나 더 낮은 용량 단위가 적절할 수 있다. 상기 투여량 단위의 투여는 상기 조성물의 일회 투여 및 또한 특정 간격으로 분할된 용량의 복수 투여 둘 모두에 의해 진행되거나 또는 투여는 수개의 더 작은 용량 단위로 실행될 수 있다.
일 구체예에서, 섬유연골 또는 탄성연골 결손질환은 반월상 연골판 손상이고, 상기 조성물은, 예를 들어, 무릎과 같은, 관절 공간에 투여된다.
예를 들어, 무릎 반월상 연골판 손상을 갖는 개체는 무릎 당 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ml 이상의 주사를 1, 2, 또는 3회 맞을 수 있다. 다른 관절의 경우, 투여되는 부피는 그 관절의 크기에 기초하여 조정될 수 있다.
그러나, 임의의 특정 환자에 대한 특정 투여량 수준은 채택된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배설률, 약물 조합 및 치료 중인 특정 질환의 극심도를 포함하는 다양한 인자에 의존적으로 변경될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로서 포함되는 상기 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물에 더하여 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
실시예 1. 하이드로겔 제조용 제1용액 및 제2용액 제조
결손된 인체 조직 재생을 최소 침습적 방법만으로 달성하기 위하여, 하이드로겔 제조물질인 제1용액 및 제2용액을 제조하였다.
1.1 피브린과 폴리에틸렌옥사이드 ( PEO ) 를 이용한 하이드로겔 제조물질 제조
피브린과 PEO를 이용한 하이드로겔의 제조물질인 제1용액 및 제2용액을 제조하였다. 제1용액은 피브리노겐 (Sigma-Aldrich) 10 내지 1000 mg/ml 및 아프로티닌 (Sigma-Aldrich) 100 ~ 5500 KIU/ml를 혼합하여 제조하였다. 제2용액은 트롬빈(이연제약) 분말이 100 내지 2500 Unit(U)/mL의 농도로 용해된 용제에 PEO 와 염화칼슘을 37℃에서 용해시켜 제조하였으며, PEO의 농도는 1 내지 100 mg/ml, 그리고 염화칼슘의 농도는 5 내지 50 mg/ml 로 하여 제조하였다. 이와 같이 제조된 제1용액과 제2용액을 혼합하여 제조되는 상호침투복합체 구조를 형성하는 하이드로겔을 '피브린-PEO'로 명명하였다.
1.2. 피브린과 플루로닉 127 (F127) 을 이용한 하이드로겔 제조 물질 제조
피브린과 F127 를 이용한 하이드로겔의 제조물질인 제1용액 및 제2용액을 제조하였다. 제1용액은 상기 실시예 1.1 에서 명시된 구성과 동일하게 제조하였으며, 제2용액의 준비과정에 있어서 F127 (Sigma Aldrich, P2443) 은 2 내지 200 mg/ml 농도로 이용하고, 0 내지 4℃의 ice bath에서 트롬빈 용액에 용해시켜 제조하였다. 이와 같이 제조된 제1용액과 제2용액을 혼합하여 제조되는 상호침투복합체 구조를 형성하는 하이드로겔을 '피브린-F127'로 명명하였다.
1.3. PRP가 함유된 피브린과 PEO 을 이용한 하이드로겔 제조 물질 제조
제1용액으로 피브린과 토끼 혈액에서 분리하여 얻은 혈소판풍부 혈장 (Platelet-Rich Plasma, PRP) 을 포함하고, 제2용액으로 PEO 및 트롬빈을 포함하는 PRP 가 함유된 피브린-PEO 하이드로겔 제조물질을 제조하였다. 피브리노겐 용액과 혈소판 풍부 혈장을 1.0: 0.1 ~ 1.0: 0.7 부피비로 혼합하여 제1용액을 제조하였고, 제2용액은 실시예 1.1 과 동일하게 제조하였다. 이와 같이 제조된 제1용액과 제2용액을 혼합하여 제조되는 상호침투복합체 구조를 형성하는 하이드로겔을 '피브린-PEO-PRP'로 명명하였다.
1.4. PRP가 함유된 피브린과 F127을 이용한 하이드로겔 제조 물질 제조
제1용액으로 피브린과 토끼 혈액에서 분리하여 얻은 혈소판풍부 혈장 (Platelet-Rich Plasma, PRP) 을 포함하고, 제2용액으로 플루로닉 127 및 트롬빈을 포함하는 상호침투 고분자망을 제조하였다. 피브리노겐 용액과 혈소판 풍부 혈장을 1.0: 0.1 ~ 1.0: 0.7 부피비로 혼합하여 제1용액을 제조하였고, 제2용액은 실시예 1.2와 동일하게 제조하였다. 이와 같이 제조된 제1용액과 제2용액을 혼합하여 제조되는 상호침투복합체 구조를 형성하는 하이드로겔을 '피브린-F127-PRP'로 명명하였다.
1.5 즉각적인 겔화 확인
상기 제조된 실시예 1.1 내지 1.4에서 제1용액과 제2용액을 각각 더블 시린지의 1구획 및 2구획에 포함시켰으며, 시술 시 각각의 용액이 개별 구획에서 흘러나와 합쳐지면서 즉각적으로 겔화되어 3차원 구조체를 형성할 수 있도록 제조하였다. 이의 모식도 및 고형화된 하이드로겔을 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 실시예 1.1 내지 1.4의 하이드로겔 제조 물질은 모두 즉각적인 겔화를 통해 3차원 구조체 하이드로겔을 형성하였음을 확인하였다. 이와 같이 제조된 하이드로겔은 피브린의 사이 사이에 PEO 또는 F127 이 부분 침투하여 IPN(interpenetrating polymer network) 을 형성하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
실시예 2. 트롬빈 농도에 따른 하이드로겔의 압축 및 전단탄성률 확인
피브리노겐과 트롬빈의 농도 조합에 따라 생성되는 하이드로겔의 탄성률 변화를 확인하기 위하여, 하이드로겔을 직경 8.0 mm의 틀에 제작하여 전단탄성률과 압축탄성률을 측정하였다. 전단탄성률은 rheometer (ARES-LS, TA Instruments)를 이용하여 측정하였고 plate 간격은 900 μm 로 설정하고 진동수 조건은 0.1에서 100 Hz로 조절하였다. 압축탄성률은 만능인장시험기(Instron 5966, Instron Corporation)를 이용해 측정하였다. 응력-변형률 그래프에서 탄성구간을 가지는 구간의 기울기를 이용해 압축탄성률(E) 값을 도출하였다. 피브리노겐의 농도는 일정한 농도인 100mg/ml 로 고정하고 트롬빈의 최종 농도가 250 U/mL, 500 U/mL 및 1250 U/mL 이 되도록 혼합되기 전 제2용액의 트롬빈의 농도를 500, 1000, 2500 U/mL로 조절하여 하이드로겔을 제조하였으며, 제조 후 전단 탄성률과 압축 탄성률을 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 피브리노겐 및 트롬빈으로 제조된 하이드로겔에서 트롬빈 농도 변화에 따른 구성된 단순 고분자망 하이드로겔의 전단 탄성률 변화 그래프 (A), 압축 탄성률 변화 그래프 (B) 를 확인한 결과, 트롬빈 농도를 250, 500, 1250 U/ml 순으로 증가시켰을 때, 피브린 하이드로겔의 전단 탄성률은 100 rad/s 에서 각각 14.1±1.0, 14.7±0.7, 15.4±0.6 kPa 순으로 증가했음을 확인하였다. 또한 압축 탄성률 또한 트롬빈의 농도가 증가할수록 증가하여 트롬빈 농도를 250, 500, 1250 U/ml 순으로 증가시켰을 때, 피브린 하이드로겔의 압축 탄성률은 각각 29.9±3.1, 43.1±5.2, 93.6±9.0 kPa 순으로 증가했음을 확인하였다.
실시예 3. PEO 및 F127 추가에 따른 압축 탄성률 확인
제2용액으로 PEO 또는 F127을 추가하였을 때의 하이드로겔의 압축탄성률을 측정하였다. 제1용액의 피브리노겐의 농도는 일정한 농도인 100mg/ml 로 고정하였다. 최종 혼합 조성물 내 트로빈의 농도가 1250U/ml 이 되도록 제2 용액 중 트롬빈의 농도를 2500 U/mL로 고정하고, 최종 혼합 조성물 내 PEO의 농도가 1.0, 3.0, 5.0 % (w/v)가 되도록 제2용액 중 PEO의 농도를 2.0, 6.0, 10.0 % (w/v)으로 변화시켰으며, 최종 혼합 조성물 내 F127 농도가 3.0, 7.0, 10.0 % (w/v) 이 되도록 6.0, 14.0, 20.0 % (w/v)로 변화시켜 제2용액을 제조하였다. 각 제조예에 따른 압축 탄성률 변화를 확인하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, PEO 농도를 1.0, 3.0, 5.0 % (w/v)로 혼합하여 하이드로겔을 제작하였을 때, 각각 103.3±4.9 kPa, 108.4±4.8 kPa, 120.1±3.3 kPa 의 압축탄성률 (A) 을 나타냈고, F127의 농도를 3.0, 7.0, 10.0 % (w/v)로 혼합하여 하이드로겔을 제작하였을 때, 각각 72.0±4.3 kPa, 122.0±9.6 kPa, 156.0±9.8 kPa의 압축탄성률 (B) 을 나타냈다.
또한 트롬빈 농도 1250 U/ml 조건 하에서 PEO 농도 변화에 따라 형성된 피브린-PEO 하이드로겔의 전단 탄성률 변화를 확인한 결과, PEO 농도를 1.0, 3.0, 5.0 % 순으로 증가시켰을 때, 제조된 피브린-PEO 하이드로겔의 전단 탄성률은 100rad/s 조건에서 각각 15.4±1.3, 18.5±1.2, 21.5±1.5 kPa 순으로 증가했음을 확인하였다.
실시예 4. PEO 및 F127에 PRP 추가에 따른 압축 탄성률 확인
트롬빈 2500 U/mL, PEO 10.0 % 또는 F127 20.0 % 를 혼합하여 제2용액을 제조하였다. 제1용액은 피브리노겐을 200mg/ml 로 하고, 혈소판풍부 혈장 (PRP) 을 제1용액과 1:1의 부피비로 혼합하여 제조하여 최종 피브리노겐의 농도가 100mg/ml 이 되도록 하였으며, 제1용액과 제2용액을 혼합하여 즉각적인 고체화를 통해 하이드로겔을 제작하였다. 제조된 하이드로겔은 피브린-PEO-PRP 또는 피브린-F127-RPR 로 명명하였다. 혈소판 풍부 혈장이 하이드로겔의 물성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 혈소판풍부 혈장을 포함하지 않은 실험군 (피브린-PEO, 피브린-F127), 피브린 단독 포함 실험군을 통해 전단 탄성률 변화를 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 4 및 표 1 에 나타내었다.
100 rad/s에서의 전단 탄성률 (kPa)
피브린+PEO 21.2 ± 2.98
피브린+PEO+PRP 30.59 ± 2.39
피브린+F127 23.88 ± 2.55
피브린+F127+PRP 31.32 ± 4.65
도 4 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 전단 탄성률을 측정한 결과, 피브린에 PEO, F127이 혼합된 그룹 모두 동일한 조건에서 혈소판 풍부 혈장이 첨가되었을 때 더 높은 전단 탄성률을 나타내었다.
실시예 5. 체내 지속 효과확인을 위한 효소 분해 양상 비교
본 발명의 제1용액 및 제2용액의 혼합을 통해 제조되는 하이드로겔의 효소처리 하에서 분해양상을 in vitro에서 확인하고자 트립신 0.00125 % 용액에 하이드로겔을 담근 후, 시간별로 그 무게를 측정하여 최초 무게와 비교하여 분해속도를 측정하였다. 구체적으로 피브린 기반 하이드로겔의 체내 주입 시 피브린 분해 양상을 예상하기 위해 대표적인 피브린 단백질 분해 효소인 트립신을 사용하여 체외에서 분해 양상을 확인하였으며, 0.00125% 트립신/EDTA 조건 하에서 대조군 피브린 하이드로겔과 실시예 4에서 제조한 피브린+PEO, 피브린+PEO+PRP, 피브린+F127, 피브린+F127+PRP 을 통해 제조된 하이드로겔의 분해 양상을 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군인 피브린 하이드로겔은 트립신 처리 120 시간 경과 이전에 완전히 분해되었으나, 본 발명에서 제작한 하이드로겔 중 피브린+PEO 군은 192 시간, 피브린+F127 은 264 시간에 도달해야만 분해되는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에서 제작한 하이드로겔은 PEO 또는 F127의 부분 상호침투 효과로 인해 대조군 피브린 하이드로겔에 비해 평균 72시간 분해를 늦출 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 하이드로겔을 이용하면 보다 오랜 시간 체내에 머물며 목적하는 효과를 달성할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 생체 적합성 확인
실시예 4에서 제조한 피브린-PEO 또는 피브린-F127 하이드로겔이 치료제로 사용하는데 적합한지 여부를 확인하기 위하여 생체적합성 확인 실험을 수행하였다. 토끼 연골에서 얻은 섬유성 연골세포(fibrochondrocyte)를 피브리노겐을 포함하는 제 1용액에 1x105 cell/mL의 농도로 혼합한 뒤 이를 PEO 또는 F127을 포함하는 제2용액과 혼합하여 하이드로겔을 제작하였으며, 하이드로겔 내부에 세포를 캡슐화시켰다. 이후 하이드로겔을 24시간동안 F-12 배지에서 배양하고 Live/Dead assay kit (Invitrogen)를 사용해 살아있는 세포와 사멸된 세포를 각각 염색하여 형광현미경(AMF4300, EVOS, Life Technology)을 이용해 관찰하였다. 10 배율 이미지 4 개를 촬영하고 아래 식을 이용하여 세포 생존율을 계산, 비교하고 그 결과를 도 6에 나타내었다.
세포생존율 = 생존한 세포 수 / 전체 세포 수 x 100
도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군 피브린 하이드로겔과 비교한 결과, PEO 또는 F127을 포함하여 제조된 하이드로겔 역시 붉은색으로 염색된 사멸된 세포가 거의 관찰되지 않았으며, 시간 별, 하이드로겔 세포 생존/사멸 형광 이미지를 확인한 결과 본 발명에서 제조한 피브린-PEO 및 피브린-F127 하이드로겔 모두에서 대조군 피브린 하이드로겔과 비교 시 세포 생존의 차이가 없음을 확인하였다. 따라서 본 발명에서 제조된 하이드로겔은 모두 생체 내 투여 시 생체에 오래 잔존함에도 생체 적합성이 우수함을 확인하였다.
실시예 7. 반월상 연골 손상 동물모델에서 반월상 연골판 재생 효과 검증
상기 실시예 4 에서 제조된 피브린과 PEO 또는 피브린과 F127 를 이용하여 제조되는 하이드로겔이 반월상 연골판 손상 동물모델에서 반월상 연골판 재생 효과를 나타내는지 검증하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 가토(rabbit) 관절 연골 손상 동물모델을 제작하기 위하여, 건강한 가토를 선택하여 체중에 따른 적절한 양의 케타민과 럼푼으로 주사마취한 후, 가토가 충분히 전신마취가 되었음을 확인하고, 양쪽 하지의 슬관절 부위를 면도한 후, 자세를 유지시키면서 반창고로 고정하였다. 양측 슬관절 부위를 포비돈으로 소독하고, 슬개골을 촉지하여 위치를 확인한 후, 슬관절의 위, 아래, 슬개골의 내측을 지나는 절개선을 따라 방정중 접근(paramedian approach)으로 슬관절 내에 도달하고, 슬개골을 외측으로 젖히면서 슬관절을 굴곡시켜 관절 내부를 관찰하였다. 특이한 병적 소견이 없음을 확인한 후, 반월상 연골판을 3분의 2 이상 제거 (meniscectomy) 하였다. 상기와 같이 반월상 연골판 손상을 유발하고, 이후 슬개골을 원래 위치로 되돌린 후, 슬개골 주위의 연부 조직을 흡수성 실로 봉합하고, 피부를 비흡수성실로 봉합하였다. 가토가 마취에서 깨어나는 것을 확인한 후 자유롭게 움직일 수 있도록 허용하였으며, 수술 후 5일간 감염을 막기 위해 진통제와 항생제를 투여하였다. 일주일 뒤에, 준비된 더블시린지(double syringe) 주사기 1 구획에는 피브리노겐 100mg/mL, 아프로티닌 0.5 mg/mL을, 주사기 2 구획에는 트롬빈 2500 U/mL, 염화칼슘 5 (w/v)% 또는 트롬빈 2500 U/mL, 염화칼슘 5 (w/v)% 과 PEO 10.0 %, 또는 트롬빈 2500 U/mL, 염화칼슘 5 (w/v)% 과 F127 20.0% 을 넣은 뒤, 상기 동물 모델의 왼쪽에 피부를 절개하지 않고, 반월상 연골판 손상 부위에 주입하였다. 반대측 다리에는 아무것도 처리하지 않았다. 4주, 8주 및 16주가 경과한 후, 각 가토로부터 손상 및 치료를 수행하였던 반월상 연골판을 떼어 내어 육안적 평가를 실시하였으며, 이를 재생된 반월상 연골판의 면적을 image J 프로그램을 사용하여 측정하여 평가하였다. 또한 조직을 고정한 후, H&E, Safranin O 염색 및 Type I collagen 에 대한 면역염색을 수행하였으며, Histological tissue quality score 를 이용한 정량화를 통해 재생된 반월상 연골판을 분석하였다. 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 피브린만 단독으로 포함하여 제조된 대조군 하이드로겔에 비해 피브린-PEO 및 피브린-F127 하이드로겔을 주입한 군에서는 4주부터 fibrous 한 조직이 생성되기 시작하여 12주에는 반월상 연골판 조직과 유사한 조직이 생성되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 가토의 반월상 연골판 손상 1주일 후에 피브린-PEO 및 피브린-F127 하이드로겔을 피부 절개 없이 주입하더라도 4주, 8주, 12주에 반월상 연골판이 재생될 수 있음을 보여주는 결과이다. 따라서 피브린-PEO 및 피브린-F127 하이드로겔을 이용하면, 손상된 슬관절 반월상 연골판 부위에서 주위 세포의 거동으로 인해 연골판 세포를 우수한 효율로 생성할 수 있어, 효과적으로 반월상 연골판 손상을 치료할 수 있음을 확인하였다.
실시예 8. 재생된 반월상 연골판의 압축강도 시험
반월상 연골 지지체의 중요한 물성은 외부에서 가해지는 힘에 견딜 수 있는 압축 강도이다. 따라서 상기 실시예 7에서 12주째 재생된 반월상 연골판을 4mm 펀치를 이용해 2군데로 샘플을 잘라낸 후 인장력 측정기로 압축강도를 측정하여, 본 발명의 피브린-PEO 및 피브린-F127 하이드로겔을 주입하여 재생된 반월상 연골판의 강도를 확인하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리 하지 않은 (meniscectomy only)군과 피브린을 단독 처리한 군에 비해 피브린-PEO, 피브린-F127 하이드로겔의 주입을 통해 재생된 조직의 압축강도가 눈에 띄게 증가하는 것을 확인하였다. 구체적으로 아무것도 처리하지 않은 Meniscectomy only에서 Mpa 값은 203.3±43.2, 피브린을 단독 주입한 군에서는 844.9±32.6의 압축 강도를 확인하였으며, 피브린+PEO 하이드로겔을 주입한 군에서는 4086.7±542.1, 피브린+F127 하이드로겔을 주입한 군에서는 3406.8±312.1, 그리고 Normal meniscus 의 경우에는 6688.6±1012.5 값을 확인하였다. 따라서 본 발명의 피브린+PEO 하이드로겔 및 피브린+F127 하이드로겔을 주입하여 재생된 반월상 연골판의 강도가 정상 연골판의 60% 이상 되는 것을 확인하여 연골판 재생에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

Claims (19)

  1. 피브린; 및 피브린과 상호침투복합체 (interpenetrating polymer network, IPN) 구조를 형성하는 생리활성 고분자;를 포함하는 하이드로겔을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생리활성 고분자는 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide, PEO) 및 플루로닉 (Fluronic) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종인, 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 섬유연골 또는 탄성연골은 추간판 연골(intervertebral disc), 치골섬유연골결합(symphysis pubis) 연골, 반월상 연골판(meniscus), 관절내 섬유연골복합체 (fibrocartilage complex), 악관절 연골, 복장빗장관절 (sternoclavicular joint) 의 관절원반, 비구순 (acetabular fossa) 연골, 외이(external ear), 후두덮개(epiglottis) 및 후두연골로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 트립신 분해 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 100 radian/sec 의 조건 하에서 15 내지 40 kPa 의 전단 탄성률 또는 10 내지 200kPa 의 압축 탄성률을 갖는 것을 특징으로 하는, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma, PRP)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 스캐폴드.
  8. 피브리노겐 용액을 포함하는 제1구획; 및
    트롬빈 및 생리활성 고분자를 포함하는 제2구획을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제1구획은 혈소판 풍부 혈장 (platelet-rich plasma, PRP)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 키트.
  10. 제8항에 있어서, 상기 피브리노겐은 10 내지 1000mg/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 키트.
  11. 제8항에 있어서, 상기 트롬빈은 100 U/ml 내지 5000 U/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 키트.
  12. 제8항에 있어서, 상기 생리활성 고분자는 폴리에틸렌옥사이드이며, 2 내지 20 % (w/v)로 포함되는 것을 특징으로 하는, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 키트.
  13. 제8항에 있어서, 상기 생리활성 고분자는 플록사머 127이며, 2 내지 40 % (w/v)로 포함되는 것을 특징으로 하는, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 키트.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 더블 시린지 형태인 것을 특징으로 하는, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 키트.
  15. 1) 피브리노겐 10 내지 1000mg/ml 를 제1용액으로 준비하는 단계;
    2) 트롬빈 및 생리활성 고분자를 혼합하여 제2용액을 준비하는 단계; 를 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 3) 상기 제1용액 및 제2용액을 혼합하여 피브린과 생리활성 고분자가 상호침투복합체 (IPN) 구조를 형성하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 하이드로겔을 제조하는 단계; 를 더 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물의 제조방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 1) 단계의 제1용액은 혈소판 풍부 혈장을 더 포함하며, 피브리노겐과 혈소판 풍부 혈장을 1:1 내지 1:2의 부피비로 혼합하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 섬유연골 또는 탄성연골 재생용 조성물의 제조방법.
  18. 피브린; 및 피브린과 상호침투복합체 (interpenetrating polymer network, IPN) 구조를 형성하는 생리활성 고분자;를 포함하는 하이드로겔을 포함하는 섬유연골 또는 탄성연골 결손 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 섬유연골 또는 탄성연골 결손 질환은 척추사이원판 탈출증, 치골간판 손상, 악관절 손상, 복장빗장관절의 관절원반 손상, 손목 관절의 삼각섬유연골 복합체 파열, 척골 충돌 증후군, 퇴행성 관절염, 반월상 연골판 손상, 류마티스성 관절염, 외이(external ear) 결손, 및 후두덮개(epiglottis) 또는 후두연골 결손으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 섬유연골 또는 탄성연골 결손 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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