CN108096630A - 一种载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医用材料领域,具体涉及一种载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架及其制备与应用。该发明首先采用静电纺丝技术制备聚乳酸微米纤维支架,然后在其上修饰聚多巴胺层,最后用聚多巴胺将淫羊藿苷和去铁胺协同固定在支架上。该支架利用聚多巴胺提高了亲水性能、力学性能和细胞亲和性,利用淫羊藿苷和去铁胺的协同作用大幅提高了成骨性能和成血管性能。通过进一步采用热致相分离技术在聚乳酸微米纤维支架上复合壳聚糖纳米纤维网络,以此为基础再修饰聚多巴胺、淫羊藿苷和去铁胺,可显著提高支架的力学性能,且有利于血管网的形成。本发明涉及的材料成本低廉,采用的静电纺丝和热致相分离技术方法简单,材料性能易于调控,适合产业化。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域,具体涉及一种载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架及制备方法和应用。
背景技术
由各种原因引起的骨缺损与骨损伤是医学上常见的临床问题。植入骨是该问题的常用治疗方法,因此导致骨修复材料急迫并巨大的市场需求。聚乳酸具有良好的生物相容性、可调控的降解速率和可塑性,因此成为一类重要的骨修复材料。然而,聚乳酸具有机械性能较差、亲水性较差、缺乏骨传导性和骨诱导性,无成血管化能力等缺点,严重限制了其作为骨组织支架材料的应用。因此,为克服上述缺陷,一方面需要在聚乳酸基骨组织支架材料的表面实现成骨、成血管生物活性分子的快速、有效、高密度协同固定,另一方面,在骨组织和血管构建的基础上,实现力学性能、亲水性良好,且有利于血管网形成的分级结构也是支架材料设计的关键。
目前,提高聚乳酸基骨组织支架材料成骨和成血管能力的方法主要是将有利于成骨和成血管化的生长因子复合到聚乳酸基体中或修饰到聚乳酸支架材料的表面。然而,生长因子价格极其昂贵,且在使用过程中很容易失活,因此其应用受到了一定限制。相对而言,一些中药提取物和金属离子螯合剂由于具有来源丰富,价格低廉,生物活性高等优点而受到广泛关注。其中,淫羊藿苷(ICA)是一类黄酮类化合物,是中药淫羊藿中的主要活性成分。其具有促进成骨细胞的分化和抑制破骨细胞的形成的能力,可加速骨缺损的愈合。在聚乳酸膜表面修饰淫羊藿苷,有利于成骨细胞的黏附、增殖和碱性磷酸酶分泌,提高材料的成骨活性(Li,Huihua,et al.Materials Science and Engineering:C,2017,70:701-709.)。去铁胺(DFO)是一种金属离子螯合剂,其可促进内皮细胞增殖和血管再生。在聚乳酸膜表面修饰去铁胺,有利于内皮细胞的黏附、铺展和增殖,提高材料的成血管化能力(Liu,Hua,etal.Materials Science and Engineering:C,2017,79:399-409.)然而,上述研究仅仅是单一提高了聚乳酸材料的成骨活性或成血管化能力,且提高的程度非常有限。此外,制备的支架材料为膜层,其不具有力学性能良好且利于血管网形成的分级结构。
发明内容
为克服现有技术的缺点和不足,本发明的首要目的在于提供一种载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种由上述方法制备得到的载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架。
本发明的再一目的是提供上述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的应用。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
一种载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的制备方法,包括如下步骤:
(1)将聚乳酸溶解、分散于有机溶剂中,制得聚乳酸电纺丝溶液,然后以聚乳酸电纺丝溶液为原料进行静电纺丝,得到聚乳酸微米纤维支架;
(2)配制三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液,将多巴胺溶于缓冲溶液中,得到多巴胺溶液,将聚乳酸微米纤维支架浸泡于多巴胺溶液中,在室温和避光条件下反应1h~12h,而后取出,冲洗,干燥,得到聚多巴胺修饰的聚乳酸微米纤维支架;
(3)将淫羊藿苷和去铁胺分散在三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液中,得到淫羊藿苷、去铁胺混合溶液,将聚多巴胺修饰的聚乳酸微米纤维支架浸泡于淫羊藿苷、去铁胺混合溶液中,于室温下反应3h~24h,而后取出,冲洗,晾干,得到载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架。
作为本发明的改进,步骤(1)中制备的聚乳酸微米纤维支架还进行如下处理:将聚乳酸微米纤维支架浸泡在壳聚糖稀醋酸溶液中反应30min~12h,然后取出支架淬冷1h~24h,再冷冻,干燥来制备贯穿于聚乳酸微米纤维支架内部和表层的壳聚糖纳米纤维网络,得到由聚乳酸微米纤维支架和壳聚糖纳米纤维网络共同组成的微纳复合纤维网络支架,而后再进行步骤(2)和步骤(3)。
作为本发明的进一步改进,所述壳聚糖稀醋酸溶液中,壳聚糖的脱乙酰度大于85%,分子量为5~25万,其在溶液中的质量浓度为0.01%~3%,稀醋酸体积浓度为0.01%~5%,所述淬冷温度为-80℃~-196℃。
作为本发明的进一步改进,所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架中,壳聚糖纳米纤维网络和聚乳酸微米纤维支架的含量按质量百分比计分别为15%~30%、40%~55%。
作为本发明的进一步改进,所述微纳复合纤维网络支架的支架厚度为0.05nm~3mm,孔隙率为75%~95%,其中聚乳酸微米纤维支架的纤维直径为200nm~3000nm,纤维间孔径尺寸为80nm~1500nm,壳聚糖纳米纤维网络的纤维直径为1nm~800nm,纤维间的孔径尺寸为10nm~300nm。
步骤(3)中所述淫羊藿苷、去铁胺混合溶液中淫羊藿苷和去铁胺的质量比为9:1~1:9。
步骤(3)中所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架中,淫羊藿苷、去铁胺和聚多巴胺的含量按质量百分比计均为5%~15%。
步骤(1)中所述聚乳酸为聚(L-乳酸)或聚(D,L-乳酸),分子量为10~30万;所述有机溶剂为四氢呋喃、三氯甲烷、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、六氟异丙醇和丙酮中的一种或两种以上;当选用两种有机溶剂时,二者的体积比为7:1~9:1。
步骤(1)中所述聚乳酸电纺丝溶液的浓度为3%~25%g/mL,静电纺丝的静电压为8kV~30kV,供给流量为0.5mL/h~3mL/h。
步骤(2)中所述三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液浓度为0.001mol/L,pH为7~8,制备的多巴胺溶液浓度为0.5g/L~2g/L。
步骤(3)中所述淫羊藿苷、去铁胺混合溶液中的淫羊藿苷浓度为10μg/mL~120μg/mL,去铁胺浓度为10μg/mL~120μg/mL。
本发明进一步提供一种载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架,它是由上述方法制备得到的。
本发明进一步提供一种上述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的应用,将所述骨组织支架材料用于骨组织修复领域。
本发明与现有技术相比,具有如下优点和有益效果:
(1)将淫羊藿苷和去铁胺协同固定在聚乳酸基骨组织支架上,使支架材料兼具成骨和成血管化的功效,且效果明显优于单一淫羊藿苷或去铁胺修饰的聚乳酸材料。
(2)通过静电纺丝和热致相分离技术制备的具有分级结构的微纳复合纤维网络支架,不仅可赋予支架材料优异的力学性能,而且有利于骨愈合过程的血管网形成。
(3)采用的聚多巴胺层不仅可将淫羊藿苷和去铁胺协同固定在聚乳酸基骨组织支架表面,而且大大提高了材料的亲水性能、力学性能和细胞亲和性。
(4)制备的载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架实现了材料的亲水性、力学性能、成骨活性和成血管能力的完美结合,在骨组织修复领域的应用前景良好。
(5)本发明采用的材料来源丰富、成本低廉,同时制备方法简便易行,材料的组成与性能易于调控,易于产业化。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的接触角。
图2为本发明实施例2中制备的载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的CCK-8测试结果。
图3为本发明实施例3中制备的载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的场发射扫描电镜图。
图4为本发明实施例4中制备的载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的接触角。
图5为本发明实施例6中制备的载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架对成骨细胞培养24h后形貌铺展的激光共聚焦图。
图6为本发明实施例7中制备的载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架对成骨细胞钙结节沉积物的茜素红染色图。
图7为本发明实施例7中制备的载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架对成骨细胞成骨基因的PCR测定结果。
图8为本发明实施例8中制备的载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架对内皮细胞血管化基因的PCR测定结果。
图9为本发明实施例9中制备的载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架对内皮细胞血管化基因的Westen blot结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
如无特殊说明,本发明中所有原料和试剂均为市场常规的原料、试剂。各原料的缩写表示如下:聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D,L-乳酸)(PDLLA)、壳聚糖(CS)、聚多巴胺(PDA)、淫羊藿苷(ICA)、去铁胺(DFO)。
实施例1
(1)采用三氯甲烷配置PDLLA溶液,得到浓度为15%g/mL的电纺丝溶液。经磁力搅拌、超声分散后,将电纺丝溶液注入电纺丝液供给装置,在20kV的静电压下进行纺丝,电纺丝液的供给流量为2mL/h,接收板距离注射泵针头距离15cm,得到PDLLA微米纤维支架。
(2)取三甲基氨基甲烷溶解于去离子水,边搅拌边用1mol/L的盐酸调溶液pH为7,配成0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液。将多巴胺溶于上述缓冲溶液,磁力搅拌后得到1g/L的多巴胺溶液。将PDLLA微米纤维支架浸泡于多巴胺溶液中,在室温和避光条件下反应6h,然后取出支架材料,用去离子水多次冲洗支架,充分干燥后,得到PDA修饰的PDLLA微米纤维支架(PDLLA-PDA)。
(3)将ICA和DFO分散在0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液中,经磁力搅拌、超声分散后,得到ICA浓度为60μg/mL、DFO浓度为60μg/mL的ICA、DFO混合溶液,然后将PDA修饰的PDLLA微米纤维支架浸泡于ICA、DFO混合溶液,于室温下反应12h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干后,得到载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织支架(PDLLA-PDA/ICA/DFO)。
参阅附图1,可见本实施例中纯PDLLA支架的接触角为1194±0.5°,经PDA层修饰后,PDLLA-PDA复合支架的接触角进一步下降至65.2±0.1°。这是由于PDA分子结构中含有大量的含N基团和酚羟基,这些基团使得PDA具有较好的亲水性,因此大大提高了PLLA支架的亲水性。相比于PDLLA-PDA复合支架,进一步固定生物活性物质ICA和DFO后的PDLLA-PDA/ICA/DFO复合支架的接触角变化不明显,为67.3±0.2°。综上所述,本实施例中所制备的复合支架亲水性能比纯PDLLA支架有显著的提高。
实施例2
(1)采用四氢呋喃溶剂配置PLLA溶液,得到浓度为25%g/mL的电纺丝溶液。经磁力搅拌、超声分散后,将电纺丝溶液注入电纺丝液供给装置,在30kV的静电压下进行纺丝,电纺丝液的供给流量为3mL/h,接收板距离注射泵针头距离15cm,得到PLLA微米纤维支架。
(2)取三甲基氨基甲烷溶解于去离子水,边搅拌边用1mol/L的盐酸调溶液pH为8,配成0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液。将多巴胺溶于上述缓冲溶液,磁力搅拌后得到2g/L的多巴胺溶液。将PLLA微米纤维支架浸泡于多巴胺溶液中,在室温和避光条件下反应12h,然后取出支架材料,用去离子水多次冲洗支架,充分干燥后,得到PDA修饰的PLLA微米纤维支架(PLLA-PDA)。
(3)将ICA和DFO分散在0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液,经磁力搅拌、超声分散后,得到ICA浓度为120μg/mL、DFO浓度为120μg/mL的ICA、DFO混合溶液,然后将PDA修饰的PLLA微米纤维支架浸泡于ICA、DFO混合溶液,于室温反应3h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干后,得到载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织支架(PLLA-PDA/ICA/DFO)。
附图2为成骨细胞(MC3T3-E1)和内皮细胞(HUVECs)在本实施例中制备的PLLA、PLLA-PDA和PLLA-PDA/ICA/DFO支架表面培养1、4和7天的细胞增殖情况。可见培养1天后,各组样品膜测得的成骨细胞、内皮细胞的OD值均较小。当细胞培养至第7天时,各组样品膜测得的成骨细胞、内皮细胞的OD值出现明显差异,从高往低依次是:PLLA-PDA/ICA/DFO>PLLA-PDA>PLLA,说明ICA和DFO可以显著促进成骨细胞和内皮细胞的生长和增殖。
实施例3
(1)采用甲苯溶剂配置PLLA溶液,得到浓度为3%g/mL的电纺丝溶液。经过磁力搅拌、超声分散后,将电纺丝溶液注入电纺丝液供给装置,在20kV的静电压和1mL/h的供给流量下进行纺丝,得到PLLA微米纤维支架。
(2)将PLLA微米纤维支架浸泡于稀醋酸体积浓度为5%、CS质量浓度为0.01%的CS稀醋酸溶液,浸泡时间为12h。然后取出支架于-140℃下进行淬冷1h,最后冷冻干燥,得到具有分级结构的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架。
(3)取三甲基氨基甲烷溶解于去离子水,边搅拌边用1mol/L的盐酸调溶液pH为8,配成0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液。将多巴胺溶于上述缓冲溶液,磁力搅拌后得到2g/L的多巴胺溶液。将PLLA/CS微纳复合纤维网络支架浸泡于多巴胺溶液中,在室温和避光条件下反应12h,然后取出支架材料,用去离子水多次冲洗支架,充分干燥后,得到PDA修饰的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架(PLLA/CS-PDA)。
(4)将ICA和DFO分散在0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液中,经磁力搅拌、超声分散后,得到ICA浓度为30μg/mL、DFO浓度为30μg/mL的ICA、DFO的混合溶液,然后将PLLA/CS-PDA微纳复合纤维网络支架浸泡于ICA、DFO混合溶液,于室温反应24h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干后,得到载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织支架(PLLA/CS-PDA/ICA/DFO)。
附图3为本实施例中制备的PLLA、PLLA/CS、PLLA/CS-PDA及PLLA/CS-PDA/ICA/DFO支架的场发射扫描电镜图。可见静电纺丝制备的PLLA微米纤维无串珠且相对均匀,纤维直径分布为700nm~1.5μm。通过热致相分离技术在PLLA微米纤维支架上引入的CS纳米纤维网络不仅覆盖于支架表面,还贯穿于支架整体,CS纳米纤维直径分布为50nm~300nm,分布均一且形态良好。由PDA修饰的PLLA/CS微纳复合纤维网络表面粗糙度显著增加。ICA和DFO均匀地固定在PLLA/CS-PDA支架上。
实施例4
(1)采用三氯甲烷配置PLLA溶液,得到浓度为15%g/mL的电纺丝溶液。经磁力搅拌、超声分散后,将电纺丝溶液注入电纺丝液供给装置,在20kV的静电压下进行纺丝,电纺丝液的供给流量为2mL/h,接收板距离注射泵针头距离15cm,得到PLLA微米纤维支架。
(2)将PLLA微米纤维支架浸泡于稀醋酸体积浓度为5%、CS质量浓度为3%的CS稀醋酸溶液,浸泡时间为12h。然后取出复合支架于-196℃下进行淬冷24h,最后冷冻干燥,得到具有分级结构的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架。
(3)取三甲基氨基甲烷溶解于去离子水,边搅拌边用1mol/L的盐酸调溶液pH为7,配成0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液。将多巴胺溶于上述缓冲溶液,磁力搅拌后得到1g/L的多巴胺溶液。将PLLA/CS微纳复合纤维网络支架浸泡于上述多巴胺溶液中,在室温和避光条件下反应6h;然后取出支架材料,用去离子水多次冲洗支架,充分干燥后,得到PDA修饰的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架(PLLA/CS-PDA)。
(4)将ICA和DFO分散在0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液中,经磁力搅拌、超声分散后,得到ICA浓度为30μg/mL、DFO浓度为10μg/mL的ICA、DFO的混合溶液;然后将PDA修饰的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架浸泡于ICA、DFO混合溶液,于室温反应24h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干后,得到载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织支架(PLLA/CS-PDA/ICA/DFO)。
附图4为PLLA、PLLA/CS、PLLA/CS-PDA及PLLA/CS-PDA/ICA/DFO支架的接触角测试结果。可见纯PLLA支架的接触角为120.3±0.8°,引入CS纳米纤维网络后支架的接触角减小为93.1±4.3°,再经PDA修饰后,复合支架的接触角进一步下降至67.2±0.4°。这是由于CS和PDA分子结构中含有大量的含N基团和酚羟基,这些基团使得CS和PDA具有较好的亲水性,因此大大提高了支架的亲水性。相比于PLLA/CS-PDA复合支架,进一步固定生物活性物质ICA和DFO后的复合支架的接触角变化不明显。综上所述,本实施例中所制备的复合支架亲水性能比纯PLLA支架有显著的提高。
实施例5
(1)采用三氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺双溶剂(体积比为8:1)配置PLLA溶液,得到浓度为25%g/mL的电纺丝溶液。经磁力搅拌、超声分散后,将电纺丝溶液注入电纺丝液供给装置,在30kV的静电压下进行纺丝,电纺丝液的供给流量为0.5mL/h,接收板距离注射泵针头距离15cm,得到PLLA微米纤维支架。
(2)将PLLA纤维支架浸泡于稀醋酸体积浓度为0.01%、CS质量浓度为3%的CS稀醋酸溶液,浸泡时间为30min。然后取出支架于-180℃下进行淬冷24h,最后冷冻干燥,得到具有分级结构的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架。
(3)取三甲基氨基甲烷溶解于去离子水,边搅拌边用1mol/L的盐酸调溶液pH为8,配成0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液。将多巴胺溶于缓冲溶液,磁力搅拌后得到0.5g/L的多巴胺溶液。将PLLA/CS微纳复合纤维网络支架浸泡于多巴胺溶液中,在室温和避光条件下反应1h,然后取出支架材料,用去离子水多次冲洗支架,充分干燥后,得到PDA修饰的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架(PLLA/CS-PDA)。
(4)将ICA和DFO分散在0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液中,经磁力搅拌、超声分散后,得到ICA浓度为30μg/mL、DFO浓度为70μg/mL的ICA、DFO的混合溶液,然后将PDA修饰的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架浸泡于ICA、DFO混合溶液,于室温反应24h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干后,得到载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织支架PLLA/CS-PDA/ICA/DFO。
通过拉伸测试对上述制备的骨组织支架的力学性能进行了研究(参阅表1),可见在纯PLLA纤维支架中贯穿CS纳米纤维网络后,PLLA基体材料的拉伸强度、拉伸模量及断裂伸长率均有显著提高;再在PLLA/CS复合支架表面修饰一层PDA后,材料的拉伸强度、拉伸模量及断裂伸长率均进一步提升。在PLLA/CS-PDA支架表面进一步固定ICA和DFO后,支架的力学性能较PLLA/CS-PDA复合支架略有下降,但仍显著优于纯PLLA和PLLA/CS支架。
表1各组纤维复合支架材料的拉伸性能
实施例6
载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织工程支架的制备
(1)采用三氯甲烷/四氢呋喃双溶剂(体积比为7:1)配置PLLA溶液,得到浓度为25%g/mL的电纺丝溶液。经磁力搅拌、超声分散后,将电纺丝溶液注入电纺丝液供给装置,在30kV的静电压下进行纺丝,电纺丝液的供给流量为0.5mL/h,接收板距离注射泵针头距离15cm,得到PLLA微米纤维支架。
(2)将PLLA微米纤维支架浸泡于稀醋酸体积浓度为0.01%、CS质量浓度为3%的CS稀醋酸溶液,浸泡时间为30min。然后取出复合支架,于-196℃下进行淬冷24h,最后冷冻干燥,得到具有分级结构的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架。
(3)取三甲基氨基甲烷溶解于去离子水,边搅拌边用1mol/L的盐酸调溶液pH为8,配成0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液。将多巴胺溶于上述缓冲溶液,磁力搅拌后得到0.5g/L的多巴胺溶液。将PLLA/CS微纳复合纤维网络支架浸泡于上述多巴胺溶液中,在室温和避光条件下反应1h,然后取出支架材料,用去离子水多次冲洗支架,充分干燥后,得到PDA修饰的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架(PLLA/CS-PDA)。
(4)将ICA和DFO分散在0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液中,经磁力搅拌、超声分散后,得到ICA浓度为60μg/mL、DFO浓度为10μg/mL的ICA、DFO的混合溶液,然后将PLLA/CS-PDA微纳复合纤维网络支架浸泡于ICA、DFO混合溶液,于室温下反应24h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干后,得到载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织支架(PLLA/CS-PDA/ICA/DFO)。
对照组:单载ICA或DFO的聚乳酸基骨组织工程支架的制备
将ICA和DFO分别分散在10mM的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液中,经磁力搅拌、超声分散后,得到60μg/mL的ICA溶液和10μg/mL的DFO溶液;将PLLA/CS-PDA支架分别浸泡于ICA溶液和DFO溶液中,于室温下反应24h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干,得到单载ICA的聚乳酸基骨组织工程支架(PLLA/CS-PDA/ICA)和单载DFO的聚乳酸基骨组织工程支架(PLLA/CS-PDA/DFO)。
附图5为成骨细胞在纯PLLA、PLLA/CS、PLLA/CS-PDA、PLLA/CS-PDA/ICA、PLLA/CS-PDA/DFO及PLLA/CS-PDA/ICA/DFO支架表面培养24h后的激光共聚焦图。可见经过24h的培养,细胞在纯PLLA支架表面只可见少量伪足,尚无明显的肌动蛋白纤维丝,且铺展较差。在PLLA/CS-PDA支架表面单载ICA或DFO后,细胞均铺展良好,F-actin束状肌动蛋白微丝结构清晰,整齐一致平行排列,横跨整个细胞,向着细胞伸展方向拉伸。而当ICA和DFO协同固定在PLLA/CS-PDA支架表面后,单个细胞铺展面积和细胞核进一步明显增大,应力纤维显著增粗,可见更多、更粗的细胞伪足,细胞间的相互连接更为紧密。说明本实施例中制备的PLLA/CS-PDA/ICA/DFO复合支架较单载ICA或DFO的复合支架具有更好的细胞亲和性,粘附性和铺展性能。
实施例7
载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织工程支架的制备
(1)采用丙酮溶剂配置PLLA溶液,得到浓度为25%g/mL的电纺丝溶液。经磁力搅拌、超声分散后,将电纺丝溶液注入电纺丝液供给装置,在8kV的静电压下进行纺丝,电纺丝液的供给流量为0.5mL/h,接收板距离注射泵针头距离15cm,得到PLLA微米纤维支架。
(2)将PLLA纤维支架浸泡于稀醋酸体积浓度为0.01%、CS质量浓度为3%的CS稀醋酸溶液,浸泡时间为30min。然后取出支架,于-196℃下进行淬冷24h,最后冷冻干燥,得到具有分级结构的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架。
(3)取三甲基氨基甲烷溶解于去离子水,边搅拌边用1mol/L的盐酸调溶液pH为8,配成0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液。将多巴胺溶于上述缓冲溶液,磁力搅拌后得到0.5g/L的多巴胺溶液。将PLLA/CS微纳复合纤维网络支架浸泡于多巴胺溶液中,在室温和避光条件下反应2h,然后取出支架材料,用去离子水多次冲洗支架,充分干燥后,得到PDA修饰的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架(PLLA/CS-PDA)。
(4)将ICA和DFO分散在10mM的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液,经磁力搅拌、超声分散后,得到ICA浓度为10μg/mL、DFO浓度为50μg/mL的ICA、DFO的混合溶液,然后将PLLA/CS-PDA支架浸泡于ICA、DFO混合溶液,于室温下反应24h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干后,得到载ICA和DFO的聚乳酸骨组织支架(PLLA/CS-PDA/ICA/DFO)。
对照组:单载ICA或DFO的聚乳酸基骨组织工程支架的制备
将ICA和DFO分别分散在10mM的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液中,经磁力搅拌、超声分散后,得到10μg/mL的ICA溶液和50μg/mL的DFO溶液;将PLLA/CS-PDA支架分别浸泡于ICA溶液和DFO溶液中,于室温下反应24h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干,得到单载ICA的聚乳酸基骨组织工程支架(PLLA/CS-PDA/ICA)和单载DFO的聚乳酸基骨组织工程支架(PLLA/CS-PDA/DFO)。
图6为本实施例中纯PLLA、PLLA/CS、PLLA/CS-PDA、PLLA/CS-PDA/ICA、PLLA/CS-PDA/DFO及PLLA/CS-PDA/ICA/DFO支架进行体外成骨细胞培养过程中钙结节染色结果。可见培养21天后,在纯PLLA支架表面,零星分布着几颗的钙结节,且形态小,染色浅。随着CS纳米纤维网络的引入,支架上的钙结节数量略微增加。在PLLA/CS-PDA复合支架上进一步单载ICA或DFO后,可明显看到支架上的钙结节形态增大。而当ICA和DFO被协同固定到PLLA/CS-PDA复合支架上后,复合支架表面的钙结节圆润饱满,体积变大,诱导矿化效果非常显著。
图7为本实施例中纯PLLA、PLLA/CS、PLLA/CS-PDA、PLLA/CS-PDA/ICA、PLLA/CS-PDA/DFO及PLLA/CS-PDA/ICA/DFO支架进行体外成骨细胞培养过程中成骨基因的PCR测定结果。可见经过7天和14天的细胞培养,成骨基因(Runx-2、ALP、COL-I和OCN)在各组支架上的表达程度从高到低依次为:PLLA/CS-PDA/ICA/DFO>PLLA/CA-PDA/ICA>PLLA/CS-PDA/DFO>PLLA/CS-PDA>PLLA/CS>PLLA。说明CS纳米纤维网络可促进成骨细胞在PLLA支架上的基因表达。进一步在PLLA/CS-PDA支架上单载ICA或DFO后,支架对成骨细胞的体外成骨基因表达明显增强。而当ICA和DFO被协同固定在在支架上后,支架对上调成骨细胞的成骨基因表达作用远大于单载ICA或DFO的支架。
上述结果表明本实施例中,相对单载ICA或DFO,ICA和DFO的协同加入对PLLA促成骨分化功能发挥着更大的促进作用。
实施例8
载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织工程支架的制备
(1)采用二氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺双溶剂(体积比9:1)配置PLLA溶液,得到浓度为3%g/mL的电纺丝溶液。经磁力搅拌、超声分散后,将电纺丝溶液注入电纺丝液供给装置,在8kV的静电压下进行纺丝,电纺丝液的供给流量为2mL/h,接收板距离注射泵针头距离15cm,得到PLLA微米纤维支架。
(2)将PLLA微米纤维支架浸泡于稀醋酸体积浓度为0.01%、CS质量浓度为1.5%的CS稀醋酸溶液,浸泡时间为30min。然后取出支架,于-80℃下进行淬冷24h,最后冷冻干燥,得到具有分级结构的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架。
(3)取三甲基氨基甲烷溶解于去离子水,边搅拌边用1mol/L的盐酸调溶液pH为7,配成0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液。将多巴胺溶于上述缓冲溶液,磁力搅拌后得到0.5g/L的多巴胺溶液。将PLLA/CS微纳复合纤维网络支架浸泡于多巴胺溶液中,在室温和避光条件下反应1h,然后取出支架材料,用去离子水多次冲洗支架,充分干燥后,得到PDA修饰的微纳复合纤维网络支架(PLLA/CS-PDA)。
(4)将ICA和DFO分散在10mM的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液,经磁力搅拌、超声分散后,得到ICA浓度为120μg/mL、DFO浓度为60μg/mL的ICA、DFO的混合溶液,然后将PLLA/CS-PDA微纳复合纤维网络支架浸泡于ICA、DFO混合溶液,于室温下反应24h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干后,得到载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织支架(PLLA/CS-PDA/ICA/DFO)。
对照组:单载ICA或DFO的聚乳酸基骨组织工程支架的制备
将ICA和DFO分别分散在10mM的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液中,经磁力搅拌、超声分散后,得到120μg/mL的ICA溶液和60μg/mL的DFO溶液;将PLLA/CS-PDA支架分别浸泡于ICA溶液和DFO溶液中,于室温下反应24h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干,得到单载ICA的聚乳酸基骨组织工程支架(PLLA/CS-PDA/ICA)和单载DFO的聚乳酸基骨组织工程支架(PLLA/CS-PDA/DFO)。
附图8为本实施例中纯PLLA、PLLA/CS、PLLA/CS-PDA、PLLA/CS-PDA/ICA、PLLA/CS-PDA/DFO及PLLA/CS-PDA/ICA/DFO支架进行体外内皮细胞培养过程中成血管基因的PCR测定结果。可见经过7天的培养,与空白组和纯PLLA支架相比,内皮细胞在五组复合支架材料表面的基因表达均有明显提高。其中生物活性物质改性的三组复合支架上的效果更为突出,基因表达量由高到低依次是PLLA/CS-PDA/ICA/DFO>PLLA/CS-PDA/ICA>PLLA/CS-PDA/DFO。
上述结果表明本实施例中,相对单载ICA或DFO,ICA和DFO的协同加入对PLLA的成血管化能力发挥着更大的促进作用。
实施例9
载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织工程支架的制备
(1)采用三氯甲烷/N,N-二甲基甲酰胺双溶剂(体积比8:1)配置PLLA溶液,得到浓度为3%g/mL的电纺丝溶液。经磁力搅拌、超声分散后,将电纺丝溶液注入电纺丝液供给装置,在8kV的静电压下进行纺丝,电纺丝液的供给流量为1mL/h,接收板距离注射泵针头距离15cm,得到PLLA微米纤维支架。
(2)将PLLA纤维支架浸泡于稀醋酸体积浓度为0.01%、CS质量浓度为3%的CS稀醋酸溶液,浸泡时间为6h。然后取出支架,于-80℃下进行淬冷12h,最后冷冻干燥,得到具有分级结构的PLLA/CS微纳复合纤维网络支架。
(3)取三甲基氨基甲烷溶解于去离子水,边搅拌边用1mol/L的盐酸调溶液pH为7,配成0.001mol/L的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液。将多巴胺溶于上述缓冲溶液,磁力搅拌后得到2g/L的多巴胺溶液。将PLLA/CS微纳复合纤维网络支架浸泡于多巴胺溶液中,在室温和避光条件下反应12h,然后取出支架材料,用去离子水多次冲洗支架,充分干燥后,得到PDA修饰的微纳复合纤维网络支架(PLLA/CS-PDA)。
(4)将ICA和DFO分散在10mM的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液,经磁力搅拌、超声分散后,得到ICA浓度为20μg/mL、DFO浓度为120μg/mL的ICA、DFO的混合溶液,然后将PLLA/CS-PDA支架浸泡于ICA、DFO混合溶液中,于室温下反应3h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干后,得到载ICA和DFO的聚乳酸基骨组织支架(PLLA/CS-PDA/ICA/DFO)。
对照组:单载ICA或DFO的聚乳酸基骨组织工程支架的制备
将ICA和DFO分别分散在10mM的三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液中,经磁力搅拌、超声分散后,得到20μg/mL的ICA溶液和120μg/mL的DFO溶液;将PLLA/CS-PDA支架分别浸泡于ICA溶液和DFO溶液中,于室温下反应24h。而后取出,用去离子冲洗,自然晾干,得到单载ICA的聚乳酸基骨组织工程支架(PLLA/CS-PDA/ICA)和单载DFO的聚乳酸基骨组织工程支架(PLLA/CS-PDA/DFO)。
附图9为本实施例中纯PLLA、PLLA/CS、PLLA/CS-PDA、PLLA/CS-PDA/ICA、PLLA/CS-PDA/DFO及PLLA/CS-PDA/ICA/DFO支架进行体外内皮细胞培养过程中成血管基因的Westenblot测定结果。可内皮细胞在各组支架表面培养7天后成血管相关蛋白的定性和定量结果与PCR测试结果大体一致。表明CS纤维网络和多巴胺的修饰可以在一定程度上促进内皮细胞的eNOS、HIF-1α、VEGF和CD31的蛋白表达,并且在PLLA/CS-PDA复合支架表面进一步固定ICA或DFO后,支架对细胞血管化表达的促进作用进一步提高,尤其是ICA和DFO的同时引入具有更加明显的协同效果。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所做的进一步详细说明,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质,或者原理所做的更改,替换,修饰,组合,简化均在本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将聚乳酸溶解、分散于有机溶剂中,制得聚乳酸电纺丝溶液,然后以聚乳酸电纺丝溶液为原料进行静电纺丝,得到聚乳酸微米纤维支架;
(2)配制三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液,将多巴胺溶于缓冲溶液中,得到多巴胺溶液,将聚乳酸微米纤维支架浸泡于多巴胺溶液中,在室温和避光条件下反应1h~12h,而后取出,冲洗,干燥,得到聚多巴胺修饰的聚乳酸微米纤维支架;
(3)将淫羊藿苷和去铁胺分散在三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液中,得到淫羊藿苷、去铁胺混合溶液,将聚多巴胺修饰的聚乳酸微米纤维支架浸泡于淫羊藿苷、去铁胺混合溶液中,于室温下反应3h~24h,而后取出,冲洗,晾干,得到载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架。
2.根据权利要求1所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的制备方法,其特征在于,步骤(1)中制备的聚乳酸微米纤维支架还进行如下处理:将聚乳酸微米纤维支架浸泡在壳聚糖稀醋酸溶液中反应30min~12h,然后取出支架淬冷1h~24h,再冷冻,干燥,得到由聚乳酸微米纤维支架和壳聚糖纳米纤维网络共同组成的微纳复合纤维网络支架,而后再进行步骤(2)和步骤(3)。
3.根据权利要求2所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的制备方法,其特征在于:所述壳聚糖稀醋酸溶液中,壳聚糖的脱乙酰度大于85%,分子量为5~25万,其在溶液中的质量浓度为0.01%~3%,稀醋酸体积浓度为0.01%~5%,淬冷温度为-80℃~-196℃。
4.根据权利要求2所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架,其特征在于:所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架中,壳聚糖纳米纤维网络和聚乳酸微米纤维支架的含量按质量百分比计分别为15%~30%、40%~55%。
5.根据权利要求2所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架,其特征在于:所述微纳复合纤维网络支架的支架厚度为0.05nm~3mm,孔隙率为75%~95%,其中聚乳酸微米纤维支架的纤维直径为200nm~3000nm,纤维间孔径尺寸为80nm~1500nm,壳聚糖纳米纤维网络的纤维直径为1nm~800nm,纤维间的孔径尺寸为10nm~300nm。
6.根据权利要求1-5任一项所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述淫羊藿苷、去铁胺混合溶液中淫羊藿苷和去铁胺的质量比为9:1~1:9。
7.根据权利要求1-5任一项所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的制备方法,其特征在于:所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架中,淫羊藿苷、去铁胺和聚多巴胺的含量按质量百分比计均为5%~15%。
8.根据权利要求1-5任一项所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述聚乳酸为聚(L-乳酸)或聚(D,L-乳酸),分子量为10~30万;所述有机溶剂为四氢呋喃、三氯甲烷、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、六氟异丙醇和丙酮中的一种或两种以上;当选用两种有机溶剂时,二者的体积比为7:1~9:1;所述聚乳酸电纺丝溶液的浓度为3%~25%g/mL,静电纺丝的静电压为8kV~30kV,供给流量为0.5mL/h~3mL/h;
步骤(2)中所述三甲基氨基甲烷/盐酸缓冲溶液浓度为0.001mol/L,pH为7~8,制备的多巴胺溶液浓度为0.5g/L~2g/L;
步骤(3)中所述淫羊藿苷、去铁胺混合溶液中的淫羊藿苷浓度为10μg/mL~120μg/mL,去铁胺浓度为10μg/mL~120μg/mL。
9.一种载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架,其特征在于:它是由权利要求1-8任一项所述方法制备得到的。
10.一种权利要求9所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架的应用,其特征在于:将所述载淫羊藿苷和去铁胺的聚乳酸基骨组织支架材料用于骨组织修复领域。
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