CN110468503B - 一种复合纳米纤维膜及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合纳米纤维膜及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物缓释载体技术领域，公开一种复合纳米纤维膜及其制备方法和应用。制备步骤如下：（1）、配制纺丝溶液：将5‑氟尿嘧啶、生物材料溶解于有机溶剂中，配制固含量浓度为6~15 wt%的纺丝溶液；（2）、静电纺丝：将纺丝溶液在纺丝溶液推进速度为0.1~2.5 mL/h、电压为5~25 kV、接收距离为5~25 cm的条件下进行静电纺丝，即得复合纳米纤维膜。本发明采用静电纺丝工艺，将5‑氟尿嘧啶纺于生物材料，制备成复合纳米纤维膜，可实现药物的可控释放，明显抑制眼部成纤维细胞增殖。

Description

一种复合纳米纤维膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物缓释载体技术领域，具体涉及一种复合纳米纤维膜及其制备方法和应用。
背景技术
眼部结膜下成纤维细胞增殖，是术后组织纤维化的主要原因。翼状胬肉术后成纤维细胞的增生，使胬肉术后复发率高达40%，翼状胬肉术后复发可引起睑球粘连、结膜囊缩窄，严重影响视力及眼球运动；成纤维细胞过度增殖，也是第二大致盲性眼病青光眼的滤过术后瘢痕化的罪魁祸首，导致抗青光眼术后1年的失败率高达15%。眼化学伤患者，结膜下广泛的纤维细胞增殖，引起睑球粘连和结膜囊缩窄，而眼表重建术后结膜下纤维细胞的过度增殖及瘢痕化，也是化学伤睑球粘连分离手术失败的主要原因。因此，如何抑制成纤维细胞增殖，抑制结膜下纤维化，对于提高眼部手术的成功率至关重要。为此，眼科工作者进行了大量的研究，曾经结膜下反复注射5-氟尿嘧啶（5-FU）以降低胬肉术后复发率及减少抗青光眼术后滤过道的瘢痕化，因药物被过快代谢，研究结果不尽如人意。
纳米纤维是药物释放载体领域最为重要的材料之一，在损伤组织的再生与修复、药物可控释放等领域具有巨大的应用前景。纳米纤维进行药物释放的主要机理是：纳米尺度的直径分布呈现巨大的比表面积，进而促进药物的担载和可控释放。具有多级降解性能的纤维由于其独特的功能，能够实现药物的可控长效释放，因此受到研究者的广泛关注。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种复合纳米纤维膜及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种复合纳米纤维膜的制备方法，制备步骤如下：
（1）、配制纺丝溶液：将5-氟尿嘧啶、生物材料溶解于有机溶剂中，配制固含量浓度为6~15 wt%的纺丝溶液；其中，5-氟尿嘧啶∶生物材料的质量比为1∶4~199；所述生物材料选自壳聚糖、蚕丝蛋白、海藻酸钠、聚乙烯醇、胶原、聚乳酸、聚己内酯、聚苯胺、聚氯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯和聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或多种；所述有机溶剂为六氟异丙醇和甲酸以体积比200~10∶10组成的混合溶液；
（2）、静电纺丝：将步骤（1）所得纺丝溶液在纺丝溶液推进速度为0.1~2.5 mL/h、电压为5~25 kV、接收距离为5~25 cm的条件下进行静电纺丝，即得复合纳米纤维膜。
较好地，所述生物材料优选为蚕丝蛋白和壳聚糖，且以质量比计，蚕丝蛋白∶壳聚糖=（7~9）∶（1~3）。
较好地，所述有机溶剂优选为六氟异丙醇和甲酸以体积比9∶1组成的混合溶液。
一种利用前述复合纳米纤维膜的制备方法制备的复合纳米纤维膜。
所述复合纳米纤维膜作为眼用抗增殖药物缓释膜的应用。
有益效果：本发明采用静电纺丝工艺，将5-氟尿嘧啶纺于生物材料，制备成复合纳米纤维膜，可实现药物的可控释放，明显抑制眼部成纤维细胞增殖。
附图说明
图1：复合纳米纤维膜的SEM图。
图2：复合纳米纤维膜的药物释放曲线：A）24 小时；B）10 周。
图3：复合纳米纤维膜-翼状胬肉原代成纤维细胞的细胞增殖结果。
图4：复合纳米纤维膜-翼状胬肉原代成纤维细胞的细胞迁移观察结果（10X，上图）以及迁移细胞柱状图（下图）。
图5：兔结膜下创伤模型，植入复合纳米纤维膜后术后18天及30天的照片。
图6：兔结膜下创伤模型，植入复合纳米纤维膜后术后30天，病理组织学HE染色结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
一种复合纳米纤维膜的制备方法，制备步骤如下：
（1）、配制纺丝溶液：将10 mg 5-氟尿嘧啶、10 mg壳聚糖、90 mg蚕丝蛋白溶解于1mL由六氟异丙醇和甲酸以体积比9∶1组成的混合溶液中；
（2）、静电纺丝：将步骤（1）所得纺丝溶液在纺丝溶液推进速度为0.8 mL/h、电压为15 kV、接收距离为20 cm的条件下进行静电纺丝，即得复合纳米纤维膜。
所得复合纳米纤维膜的SEM图见图1。
对照例1
与实施例1的不同之处在于：步骤（1）中，5-氟尿嘧啶的添加量为0，其它均同实施例1，最后制得的是空白纳米纤维膜。
体外释放实验
（1）标准曲线的建立：以磷酸缓冲盐溶液作为溶媒，精确称量一定量的5-氟尿嘧啶，配制为1 mg/mL的母液，并稀释成为不同的浓度0.1、1、2.5、5、25 μg/mL；以磷酸缓冲盐溶液作为空白对照，采用紫外分光光度计于265 nm处测定标准曲线。以265 nm处的吸光度对5-氟尿嘧啶的质量浓度做线性回归，得到UV标准曲线：y=0.0708c+0.0016（c为5-氟尿嘧啶的质量浓度，R2=0.9999）；
（2）体外释放实验：取一定面积（8 mm*10 mm）的复合纳米纤维膜，放入透析袋中（截留分子量为3500），并加入1 mL的磷酸缓冲盐溶液，两端夹紧透析袋；精确量取磷酸缓冲盐溶液100 mL于玻璃瓶中，将透析袋转移至瓶内，并将玻璃瓶放入37 ℃恒温孵育箱中“摇晃”，转速为100 r/min；定时取出1 mL溶液介质，并加入1 mL的磷酸缓冲盐溶液，紫外分光光度计分析溶液介质中的5-氟尿嘧啶的含量，计算得出药物释放率，并对时间作图，得到体外药物释放曲线。
本实验中，所述磷酸缓冲盐溶液为0.1 mol/L的磷酸氢二钾缓冲盐溶液（pH=7.4）。结果见图2。可知：本发明复合纳米纤维膜24 h药物释放约10%（图2A），10周药物释放约100%（图2B）。这是因为：本发明采用静电纺丝工艺，将5-氟尿嘧啶（5-FU）纺于壳聚糖与蚕丝蛋白，制备成复合纳米纤维膜，5-FU早期通过壳聚糖的降解达到释放，然后随着蚕丝蛋白的缓慢降解再实现长期释放。
细胞增殖试验
取原发性翼状胬肉纤维细胞原代培养，并行α-SMA及VIM抗原鉴定，将第3代胬肉纤维细胞5000个/孔，接种96孔板，加DMEM-F12（含10%FBS）培养基1 mL/孔，培养24小时后，加备好的复合纳米纤维膜（4 mm*6 mm）/孔，释放24小时后，弃去原来的DMEM-F12（含10%FBS）培养基，更换成新的DMEM-F12（含10%FBS）培养基，孵育24小时，加CCK8试剂10μL/孔，孵育4h后，450 nm测定吸光度。结果见图3。可知：孵育24小时后，随着复合纳米纤维膜组药物浓度的增加，胬肉纤维细胞增殖被明显抑制，差别具统计学意义。
细胞迁移试验
取原发性翼状胬肉纤维细胞原代培养，并行α-SMA及VIM抗原鉴定，将第3代胬肉纤维细胞2×105 个/孔加入六孔板中，每孔接种2 mL DMEM-F12（含10%FBS）培养基中，培养24小时后，弃去原来的DMEM-F12（含10%FBS）培养基，更换成DMEM-F12（含0.5%FBS）培养基，饥饿培养8 h后，进行细胞划痕试验，PBS冲洗细胞，然后每孔加入一块4 mm*6 mm的复合纳米纤维膜组（有药物）以及2 mL DMEM-F12（含0.5%FBS）培养基，24小时后观察结果见图4。同时，以空白纳米纤维膜（无药物）和空白对照（PBS冲洗细胞后，只添加培养基，其它什么也不添加，无纤维膜无药物）作为对照。可知：与空白对照（无纤维膜无药物）及空白纳米纤维膜（无药物）相比，本发明复合纳米纤维膜组迁移的纤维细胞数明显减少，差别具统计学意义。
动物实验
采用新西兰大白兔结膜下创伤模型，具体如下：10%（W/V）水合氯醛溶液诱导全身麻醉后，碘伏消毒眼周后庆大霉素溶液（质量浓度0.02%）冲洗结膜囊，沿角膜缘上方剪开并分离结膜及结膜下弹氏囊组织，创伤面积约8 mm*10 mm，结膜下分别植入大小约6 mm*8 mm空白纳米纤维膜和复合纳米纤维膜。术后7天常规点左氧氟沙星滴眼液，预防感染。术后每两天观察结膜囊分泌物及充血、水肿情况，术后30天，取兔眼球及球结膜组织行HE染色观察各组病理组织学变化。结果见图5和6。可知：将本发明复合纳米纤维膜置于结膜下，与空白纳米纤维膜相比，本发明复合纳米纤维膜有效减轻创伤区结膜充血、水肿（图5）；病理组织学检测显示，本发明复合纳米纤维膜明显抑制兔结膜下炎症浸润及纤维细胞增殖（图6）。

Claims (3)

1.一种复合纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
（1）、配制纺丝溶液：将10 mg 5-氟尿嘧啶、10 mg壳聚糖、90 mg蚕丝蛋白溶解于1 mL由六氟异丙醇和甲酸以体积比9∶1组成的混合溶液中；
（2）、静电纺丝：将步骤（1）所得纺丝溶液在纺丝溶液推进速度为0.1~2.5 mL/h、电压为5~25 kV、接收距离为5~25 cm的条件下进行静电纺丝，即得复合纳米纤维膜。
2.一种利用如权利要求1所述复合纳米纤维膜的制备方法制备的复合纳米纤维膜。
3.一种如权利要求2所述复合纳米纤维膜作为眼用抗增殖药物缓释膜的应用。
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