CN101257933A - 组织再生用基材 - Google Patents

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Abstract

本发明提供组织再生用基材，其具有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等细胞生长因子的缓释能力，且细胞易于浸润，适于组织的再生。具体而言，涉及在含胶原及明胶的活体吸收性多孔基材中含有细胞生长因子而成的组织再生用基材，以及其制造方法。

Description

组织再生用基材
技术领域
本发明涉及组织再生用基材。具体而言，涉及用于将皮肤组织再生于烧伤、外伤等急性皮肤创伤以及褥疮、溃疡等慢性皮肤损伤的人工真皮基材等。
背景技术
皮肤缺损延及广范围时，有必要在早期封闭皮肤缺损部位。作为缺损的皮肤的再生方法，有不使用细胞而将作为模板的胶原海绵体移植于活体，在活体内使仿真皮组织再生的方法(人工真皮)。在人工真皮的情况下，真皮样组织进行再生后必须进行薄的分层植皮或将培养表皮进行移植，必须要尽早使真皮成分再生。
作为人工真皮的制造方法，一般是将胶原海绵体冻干的方法，为了控制在活体内的分解吸收速度，多进行交联。
作为促进皮肤组织再生的方法，可举出将某种生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)涂布于皮肤表面。虽然因皮肤吸收而具有效果，但为了维持该效果必须每天涂布。因此，尝试着通过使生长因子缓慢释放，从而通过一次给药即可使效果持续的方法。
例如，河合等明确了通过将含浸bFGF的明胶微球体注入到人工真皮，可促进bFGF的缓释效果和皮肤组织在活体内的构建(非专利文献1)。另外，还明确了，在制备细胞播种型(cell seeded-type)的培养皮肤时，通过添加含浸bFGF的明胶微球体可以促进组织的构建(非专利文献2)。
但是，该方法必须先将bFGF含浸于微球体，进而必须有在临床现场将该含浸bFGF的明胶微球体注入到人工真皮的操作，这很繁琐。
因此，如果能使人工真皮自身具有生长因子缓释能力，就可以仅在临床现场将生长因子涂布于人工真皮即能使用，可成为简便的方法。
现在，临床上最常使用的细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。bFGF的等电点为9.6，因电相互作用与例如等电点为5.0的明胶吸附。利用该特性，使bFGF吸附在用酸性明胶(等电点5.0)制成的微球体上，通过使用吸附有bFGF的微球体，可以在活体内经时缓释bFGF(专利文献1，非专利文献3)。
然而，在该方法中，必须要有下述等的手艺：作为微粒子的微球体一旦吸附bFGF后，就将吸附有bFGF的微球体注入于基材，对于临床现场的应用而言，有烦杂而难以使用的一面。
另一方面，考虑用易于吸附bFGF的酸性明胶制备人工真皮材料，使bFGF吸附于其上即可成为具有缓释能力的基材。但是，在活体内，明胶与胶原相比在细胞的浸润等方面差，因而不适于组织的再生。既能适量吸附bFGF，又使周围的细胞易于浸润的基材备受期待。
在专利文献2中，有如下记载：将明胶和胶原作为构成基材的必须成分，经紫外线照射而交联的医用基材被用于细胞培养载体、培养皮肤等中。
专利文献1：特开2003-325652号公报
专利文献2：特开平11-47258号公报
非专利文献1：K.Kawai等，Biomaterials，Vol.21，p.489-499(2000)
非专利文献2：佐生等，日本烧伤学会志，第29卷，p.24-30
非专利文献3：Y.Tabata等，J.Controlled Release，Vol.31，p.189-199(1994)
发明内容
本发明的目的是提供一种组织再生用基材，其具有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等细胞生长因子的缓释能力，且细胞易于浸润而适于组织的再生。
本发明人为解决上述课题进行了精心研究，结果发现，在含胶原和明胶的活体吸收性多孔基材中含有bFGF而得到的基材具有良好的bFGF的缓释性，且细胞易于浸润，适于作为用于再生皮肤组织的组织再生用基材。基于该认识，进而反复研究，完成了本发明。
即，本发明提供以下的组织再生用基材及其制造方法。
第1项.组织再生用基材，在含胶原及明胶的活体吸收性多孔基材中含有细胞生长因子而成。
第2项.根据第1项所述的组织再生用基材，活体吸收性多孔基材的明胶含量为1～70重量％。
第3项.根据第1或2项所述的组织再生用基材，细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
第4项.根据第1～3项中任一项所述的组织再生用基材，将其在37℃的磷酸缓冲盐水(PBS)中浸渍3天后释放到该PBS中的细胞生长因子的量，相对于在组织再生用基材中所含浸的初期的细胞生长因子的总量，为7重量％以下。
第5项.根据第1～4项中任一项所述的组织再生用基材，将其在37℃的磷酸缓冲盐水(PBS)中浸渍7天后释放到该PBS中的细胞生长因子的量，相对于在组织再生用基材中所含浸的初期的细胞生长因子的总量，为15重量％以下。
第6项.根据第1～5项中任一项所述的组织再生用基材，具有平均孔径为10～500μm的连续孔。
第7项.根据第1～6项中任一项所述的组织再生用基材，在活体内在3周以内被分解吸收。
第8项.组织再生用基材的制造方法，包含下述工序：将含胶原及明胶的水性混合物冻干的工序，将得到的干燥体进行交联处理的工序，及使得到的交联体中含有细胞生长因子的工序。
以下，详述本发明。
I.组织再生用基材
本发明的组织再生用基材，是在含胶原及明胶的活体吸收性多孔基材中含有细胞生长因子而成。本发明的组织再生用基材是指广泛用于再生医疗的基材，例如在皮肤、骨、软骨、心肌、脂肪等的再生医疗中使用的基材。特别优选用作皮肤(真皮)的组织再生用基材，即人工真皮基材。
本发明的组织再生用基材中使用的活体吸收性多孔基材含有胶原及明胶作为必须成分。
作为上述明胶，没有特别限定，可以使用例如来自于牛、猪、鸡、鲑鱼等的骨、腱、皮等的明胶。优选对上述明胶进行酸处理或碱处理。酸处理过的明胶带正电荷，碱处理过的明胶带负电荷，因而如果利用该电荷，就可以通过静电结合将各种细胞生长因子无变性地结合于含具有正电荷或负电荷的明胶的活体吸收性多孔基材上。因此，细胞生长因子(例如bFGF)就可以良好地缓释。
作为上述胶原，没有特别限定，可以使用来自于牛、猪等的皮肤、腱等的胶原。从消除抗原性进一步提高安全性的角度讲，优选使用以蛋白水解酶、胃蛋白酶等酶处理胶原以尽可能去除端肽的去端肽胶原(atelocollagen)。去端肽胶原有I～IV型，可以根据基材的用途进行选择。作为培养皮肤、创伤被覆材料使用时，优选使用与真皮的构成成分接近的I型或III型。通过使活体吸收性多孔基材中含有胶原，使细胞容易浸润该基材。
活体吸收性多孔基材中所含的明胶含量为1～70重量％左右，优选20～60重量％左右，更优选30～50重量％左右。如果明胶的含量过多，则周围的组织难以进入活体吸收性多孔基材中，另一方面，如果明胶的含量过少，则由于明胶与细胞生长因子的静电相互作用导致吸附变弱，缓释性能下降。因此，如果处于上述含量范围，则可以有效发挥出明胶及胶原的效果，得到高治疗效果。
由于活体吸收性多孔基材成为三维地再生组织的基材，因此优选具有多孔结构。特别是优选具有许多的连续孔(连续的微细小孔)。通过所述结构，在本发明的组织再生用基材上播种细胞时，细胞可以浸润并粘附于微细小孔内并且可以三维地伸展。另外，即使不播种细胞而移植时，周围的细胞也可以容易地浸润。进而，可以向粘附的细胞供给充分的营养，可以使细胞正常地增殖及分化。
作为活体吸收性多孔基材的微细小孔的平均孔径，可以根据想要再生的组织或器官来选择最适的值，优选10～500μm左右，更优选50～300μm左右。如果不足10μm，则细胞不能浸润到活体吸收性多孔基材的内部，有时细胞粘附性极端变差，或粘附的细胞不能三维地伸展。如果超过500μm，则细胞的密度变低，有不能再生组织或器官的情况。
本发明的组织再生用基材直接反映了上述活体吸收性多孔基材的多孔结构。
本发明的组织再生用基材，在含胶原及明胶的活体吸收性多孔基材中含有细胞生长因子而成。作为细胞生长因子，只要是促进血管新生、提高细胞活性的物质就没有特别限定，例如具有血管新生作用这样的细胞生长因子，具体可举出碱基性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管生成素、转化生长因子(TGF)。本发明特别优选的实施方式为bFGF。
本发明的组织再生用基材中细胞生长因子的含量，可以根据其再生对象组织等适当选择，没有特别限定。优选对于1cm2为0.1μg～100μg左右，优选含有1μg～50μg左右即可。
本发明的组织再生用基材具有可以经长时间稳定地缓释细胞生长因子的所谓优异的缓释性能。例如，虽然bFGF促进血管新生具有提高细胞活性的作用，但bFGF是活体内不稳定的物质，并且即使在水溶液状态下使用，也几乎看不到所期待的生物效果。但是，通过在上述活体吸收性多孔基材中含浸规定量的bFGF，可以缓释bFGF从而稳定持续地发挥bFGF作用。
本发明的组织再生用基材具有如下特征：例如，使其在37℃的磷酸缓冲盐水(PBS)中浸渍3天后释放到该PBS中的细胞生长因子的量，相对于在组织再生用基材中所含浸的初期的细胞生长因子的总量，为7重量％以下(优选6重量％以下)。另外，有如下特征：使其在37℃的磷酸缓冲盐水(PBS)中浸渍7天后释放到该PBS中的细胞生长因子的量，相对于在该基材中所含浸的初期的细胞生长因子的总量，为15重量％以下(优选13重量％以下)。特别是细胞生长因子为bFGF时，能再现性良好地发挥上述的缓释性能。
进而，本发明的组织再生用基材，由于含有含胶原及明胶的活体吸收性基材，因而在活体内在3周以内被分解吸收。
组织再生用基材的含水率优选的下限为90％，优选的上限为99.8％。活体吸收性多孔基材的含水率对应于该活体吸收性多孔基材的交联度，交联度越高含水率越低。如果含水率不足90％，则有得到的组织再生用基材不具有适于移植的柔软性的情况，如果超过99.8％，则有得到的组织再生用基材不能在培养液、缓冲液中保持强度的情况。更优选的下限为95％，更优选的上限为98％。另外，含水率按以下计算式得出。
含水率(％)＝[(Ws-Wd)/Ws]×100(％)
式中，Ws表示将组织再生用基材在25℃下浸渍于磷酸缓冲盐水中1小时时的重量(湿润重量)，Wd表示使用真空干燥机将抗愈合材料完全干燥时的重量(干燥重量)。
II.组织再生用基材的制法
本发明的组织再生用基材通过含有下述工序的制造方法来制造：将含胶原及明胶的水性混合物冻干的工序，将得到的干燥体进行交联处理的工序，及使得到的交联体中含有细胞生长因子的工序。
首先，混合上述的明胶及胶原制成水溶液，将其流延于适当的模型框中，在-40～-80℃下冻结30分钟～2小时左右。通过将该冻结物进行冻干，制备海绵状的活体吸收性多孔基材。
接着，将得到的冻干物进行交联处理制备活体吸收性多孔基材。作为冻干物的交联方法，没有特别限定，可列举出热交联法、γ射线照射法、紫外线照射法、电子束照射法、X射线照射法、使用交联剂的化学交联法等。其中，从可以使基材的整体达到均匀的交联度来进行交联的角度讲，优选使用交联剂的化学交联法。
作为化学交联法，可以进行例如在含有戊二醛等交联剂的水溶液中浸渍冻干物，进行化学交联。通过水洗除去剩余的戊二醛，根据需要进行再次冻干，从而得到被交联的活体吸收性多孔基材。
接着，在得到的被交联的基材中含有细胞生长因子，作为其方法没有特别限定，可例示例如，将含有细胞生长因子的水溶液滴落于该交联体，使含有细胞生长因子的水溶液含浸于该交联体等。其后，可以根据需要进一步设置干燥工序。
本发明的组织再生用基材(特别是人工真皮基材)可以稳定地缓释细胞生长因子，且细胞易于浸润，因而可以促进创伤治愈，实现大幅缩短治愈时间。
附图说明
图1：显示试验例1中的bFGF体外缓释试验结果的图。
图2：是将试验例1中的海绵体的明胶含量设为0重量％时的组织切片图像。
图3：是将试验例1中的海绵体的明胶含量设为10重量％时的组织切片图像。
图4：是将试验例1中的海绵体的明胶含量设为30重量％时的组织切片图像。
图5：是将试验例1中的海绵体的明胶含量设为50重量％时的组织切片图像。
图6：是将试验例1中的海绵体的明胶含量设为100重量％时的组织切片图像。
具体实施方式
以下，示出实施例来具体说明本发明，但本发明并非限于此。
[试验例1]
(1)胶原和明胶的混合海绵体的制备
将来源于猪腱的I型胶原和来源于猪皮肤的明胶混合制成水溶液。将水溶液装入模型框中在-40℃下冻结1小时，然后通过冻干制备海绵体。
通过将该海绵体在真空中110℃下处理来进行热交联。进而，在热交联后，浸渍于0.2％戊二醛、0.05N乙酸水溶液中进行化学交联。通过水洗除去剩余的戊二醛，进行再次冻干，从而得到交联的胶原-明胶海绵体。将该交联海绵体用于下面的体外缓释试验。
(2)体外缓释试验
实验中使用的海绵体是使用明胶含量为0、10、30、50重量％的海绵体。将其制成12mmφ厚3mm的海绵体，将100μl的bFGF水溶液滴落于海绵体，以使其含浸有40μg的bFGF。
缓释试验如下进行：将海绵体浸渍于37℃的PBS中，用ELISA法对1、3、5、7、9天后释放到PBS中的bFGF进行定量。
当将含浸后的各海绵体中所含的bFGF的重量设为100时，将经过天数的bFGF释放量的比例，即bFGF溶出比例(％)示于表1及图1。
表1
Figure A20068003261100101
(3)埋植试验
实验中使用的海绵体，使用明胶含量为0、10、30、50、100重量％的海绵体。将其制成12mmφ厚3mm的海绵体，将100μl的bFGF水溶液滴落于海绵体，以使其含浸有40μg的bFGF。将该海绵体埋植于豚鼠背部全层皮肤缺损层，经过2周后的组织切片图像示于图2～6中。
在明胶100重量％的海绵体中，观察到周围组织的细胞浸润少，而且细胞潜入到海绵体下的向下生长物(downgrowth)的图像。另一方面，随着胶原含量变高，细胞浸润增多，组织的再生也良好，但胶原为100重量％的情况下，细胞生长因子的缓释性能降低。因此，为了不妨碍周围组织的浸润，且发挥细胞生长因子的缓释功能，有必要以最适的混合比例混合明胶。

Claims (8)

1.组织再生用基材，在含胶原及明胶的活体吸收性多孔基材中含有细胞生长因子而成。
2.根据权利要求1所述的组织再生用基材，其特征在于，活体吸收性多孔基材的明胶含量为1～70重量％。
3.根据权利要求1所述的组织再生用基材，其特征在于，细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子bFGF。
4.根据权利要求1所述的组织再生用基材，其特征在于，将其在37℃的磷酸缓冲盐水PBS中浸渍3天后释放到该PBS中的细胞生长因子的量，相对于在组织再生用基材中所含浸的初期的细胞生长因子的总量，为7重量％以下。
5.根据权利要求1所述的组织再生用基材，其特征在于，将其在37℃的磷酸缓冲盐水PBS中浸渍7天后释放到该PBS中的细胞生长因子的量，相对于在组织再生用基材中所含浸的初期的细胞生长因子的总量，为15重量％以下。
6.根据权利要求1所述的组织再生用基材，其特征在于，具有平均孔径为10～500μm的连续孔。
7.根据权利要求1所述的组织再生用基材，其特征在于，在活体内在3周以内被分解吸收。
8.组织再生用基材的制造方法，包含下述工序：将含胶原及明胶的水性混合物冻干的工序，将得到的干燥体进行交联处理的工序，及使得到的交联体中含有细胞生长因子的工序。
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