CN109311224A - 明胶成型体的制造方法及明胶成型体 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于能够提供一种以高造型精度制造尽可能不含对活体有害的成分且活体适应性高的明胶成型体的方法、以及通过上述方法制造的明胶成型体。根据本发明，提供一种明胶成型体的制造方法，其包括：工序a，在基板上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末的层；及工序b，相对于在工序a中形成的层，从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在上述工序a中形成的层上，由此形成明胶成型体。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过从喷嘴部喷射规定的醇水溶液的液滴并使其飞翔，且使其着落于含有明胶粉末的层上而制造明胶成型体的方法。本发明还涉及一种通过上述方法制造的明胶成型体。
背景技术
正在推进实现陷入功能障碍或功能不全的活体组织或器官的再生的再生医疗的实用化。再生医疗是一种在无法仅通过活体所具有的天然愈合能力来恢复的活体组织中，使用细胞、支架及生长因子的1种以上来再生如与原始的组织相同的形态及功能的医疗技术。在再生医疗中，有时利用使用明胶等制作的三维成型体。
在专利文献1中记载有一种三维造型用材料，其包含粘结剂及粉末材料，粘结剂含有具有至少1个聚合性基团的聚合性化合物，粉末材料或聚合性化合物中的一个具有阳离子性基团和/或能够成为阳离子性基团的基团，另一个具有有机酸残基和/或其盐。在专利文献2中记载有一种具有表面层的三维造型物的制造方法，该方法包括：(i)层形成工序，在支撑体上形成具有规定的厚度的粉末材料的层；(ii)粘结工序，通过粘结剂使上述层中的粉末材料粘结，以使其成为将造型对象以平行的截面切割而得的截面形状；(iii)制作工序，通过依次重复进行(i)及(ii)的工序来制作三维造型物；(iv)包覆工序，通过含有(1)烯属不饱和化合物及(2)光聚合引发剂的光固化性组合物包覆所制作的三维造型物的表面；及(v)固化工序，使所包覆的光固化性组合物光固化。在专利文献3中记载有一种三维造型用材料，其包含粉末材料及粘结剂，粘结剂含有聚合物，该聚合物具有包含杂芳香环基的单体单元。
在专利文献4中记载有一种立体造型用粉末材料，其用于层叠多个通过树脂粘合的规定形状的粉末材料层来制造立体物体的立体造型，该粉末材料中，多种芯材包含通过水溶性树脂固定化的粒子。并且，在专利文献5中记载有一种三维造型物的制造方法，其通过层叠层来制造三维造型物，该方法包括：层形成工序，使用三维造型用组合物来形成上述层，该三维造型用组合物包含在表面具有异氰酸酯基的粒子、具有羟基的水溶性树脂及水系溶剂；以及喷墨工序，向上述层喷射固化性油墨。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-102526号公报
专利文献2：日本特开2010-228316号公报
专利文献3：日本特开2010-228103号公报
专利文献4：日本特开2016-037041号公报
专利文献5：日本特开2016-055531号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
具有如下报告：如Z Corporation公司的Z打印机系列那样，使用石膏粉末或淀粉粉末制造三维成型体的情况、如上述专利文献中的利用有机物进行的三维印刷。但是，期望研发制造用于再生医疗的明胶成型体、尤其是通过不包含阻碍活体适应性的有害成分而使活体适应性高，且高造型精度的明胶成型体的方法。
本发明应解决的课题在于，提供一种以高造型精度制造尽可能不含对活体有害的成分且活体适应性高的明胶成型体的方法、以及通过上述方法制造的明胶成型体。
用于解决技术课题的手段
为了解决上述问题，本发明人等进行深入研究的结果发现了：在基板上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末的层之后，从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使其着落于上述层上，由此能够以高造型精度制造活体适应性高的明胶成型体。本发明是基于这些见解而完成的。
即，根据本发明，提供以下的发明。
(1)一种明胶成型体的制造方法，其包括：工序a，在基板上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末的层；及工序b，相对于在工序a中形成的层，从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在上述工序a中形成的层上，由此形成明胶成型体。
(2)根据(1)所述的明胶成型体的制造方法，其中，上述工序a中的明胶为动物明胶或重组明胶。
(3)根据(1)或(2)所述的明胶成型体的制造方法，其中，上述工序b中的沸点为120℃以下的醇类是乙醇。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其在上述工序b之后还包括：工序c，在工序a中形成的层及在工序b中形成的明胶成型体上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末的层；及工序d，通过从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在上述工序c中形成的层上，由此制造明胶成型体。
(5)根据(4)所述的明胶成型体的制造方法，其中，上述工序c中的明胶为动物明胶或重组明胶。
(6)根据(4)或(5)所述的明胶成型体的制造方法，其中，上述工序d中的沸点为120℃以下的醇类是乙醇。
(7)根据(1)至(6)中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其中，工序b中，所制造的明胶成型体与上述基板接触。
(8)根据(1)至(3)中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其中，
工序b中，所制造的明胶成型体与上述基板接触，
在上述工序b之后，包括：工序c1，在工序a中形成的层及在工序b中形成的明胶成型体上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末的层；及工序d1，通过从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在上述工序c1中形成的层上，由此制造明胶成型体，
上述工序d1中，上述液滴着落于与在工序b中形成的明胶成型体的上表面的外周区域对应的区域上，
在上述工序d1之后，包括：工序e，在工序c1中形成的层及在工序d1中形成的明胶成型体上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末的层；及工序f，通过从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在上述工序e中形成的层上，由此制造明胶成型体，上述工序f中，上述液滴着落于与在工序d1中形成的明胶成型体的上表面的外周区域对应的区域以及被在工序d1中形成的明胶成型体包围的区域的内部区域上。
(9)根据(1)至(8)中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其还包括工序g，该工序g去除形成明胶成型体时未使用的粉末。
(10)根据(9)所述的明胶成型体的制造方法，其在上述工序g之后包括工序h，该工序h通过对成型体进行加热来使成型体固化。
(11)根据(10)所述的明胶成型体的制造方法，其中，将成型体加热1小时至72小时。
(12)根据(1)至(11)中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其还包括工序i，该工序i用支撑体包裹上述明胶成型体。
(13)根据(1)至(12)中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其还包括工序j，该工序j将细胞接种在上述明胶成型体上。
(14)根据(1)至(13)中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其中，明胶成型体为再生医疗用支架材料或组织修复材料。
(15)一种明胶成型体，其通过(1)至(14)中任一项所述的明胶成型体的制造方法来制造。
(16)根据(15)所述的明胶成型体，其为再生医疗用支架材料或组织修复材料。
(17)根据(15)或(16)所述的明胶成型体，其为骨再生用组织修复材料。
(18)根据(15)至(17)中任一项所述的明胶成型体，其中，孔隙率为20～40％。
(19)根据(15)至(18)中任一项所述的明胶成型体，其具有与外部空间连通的孔。
(20)根据(19)所述的明胶成型体，其中，与外部空间连通的孔贯穿成型体的内部，且在孔的两端与外部空间连通。
(21)根据(19)或(20)所述的明胶成型体，其中，与外部空间连通的孔的代表直径为300μm～2000μm。
(22)根据(15)至(21)中任一项所述的明胶成型体，其用支撑体包裹表面。
发明效果
根据基于本发明的明胶成型体的制造方法，能够以高造型精度制造尽可能不含对活体有害的成分且活体适应性高的明胶成型体。本发明的明胶成型体的活体适应性高，且具有高造型精度。
附图说明
图1表示使用经风干的明胶粉末制造的成型体。
图2表示使用经冷冻干燥的明胶粉末制造的成型体。
图3表示对粉末的平均粒径及水溶液组成与膜厚及收缩率之间的关系进行评价而得的结果。
图4表示使用作为喷射液的水或乙醇水溶液制造的明胶成型体。
图5表示具有孔隙的成型体和不具有孔隙的成型体的3D(三维)设计图及所制造的具有孔隙的成型体。
图6表示具有孔隙的成型体的3D(三维)设计图及所制造的具有孔隙的成型体。
图7表示用于评价骨再生的显微CT分析的结果。
图8表示用于评价骨再生的病理分析的结果(有连通孔的成型物)。
图9表示用于评价骨再生的病理分析的结果(没有连通孔的成型物)。
图10表示用于评价骨再生的病理分析的结果(冷冻干燥海绵)。
图11是与明胶成型体的填充率的测量方法有关的图。
图12表示明胶成型体的填充率的测量结果。
图13表示明胶成型体的填充率的测量结果。
图14表示明胶成型体的填充率的测量结果。
图15是表示在二维中用于路径的圆点为50％时不管在纵向还是在横向均产生路径的图。
图16是表示在层叠明胶粉末而得的成型体中，在显微CT分析中，立体连接孔隙率为30％且直径为100μm左右的孔而得的连通孔结构的图。
图17表示基于通常的方法的成型体的制造方法。
图18表示基于本发明的第一层叠方法的成型体的制造方法。
图19表示基于本发明的第二层叠方法的成型体的制造方法。
图20表示使水或50质量％乙醇水溶液的液滴着落于明胶粉末上之后的状态。
图21表示使用作为喷射液的水制造由层叠体构成的成型体的结果。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
[1]明胶成型体的制造方法
基于本发明的明胶成型体的制造方法包括：
工序a，在基板上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末的层；及工序b，相对于在工序a中形成的层，从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在上述工序a中形成的层上，由此形成明胶成型体。
本发明中，通过使用经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末、以及使用含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液，能够以高造型精度制造几乎没有翘曲或收缩且上层与下层牢固地粘合的高精度的明胶成型体。
＜1＞经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末
本发明中所使用的粉末为通过将明胶水溶液风干而获得的粉末、或对通过风干而获得的固体进行加工而得的粉末。
本说明书中提及的风干，是在0℃以上且60℃以下的温度下进行干燥的工艺，且在大气压中或减压干燥下进行。关于明胶，由于干燥温度而干燥后的分子结构不同，因此能够通过改变干燥温度来调节粉末的溶胀性。若干燥温度过高，则由喷墨描绘时的溶胀引起的尺寸变化变大，因此不优选。另一方面，若干燥温度过低，则溶解速度变慢，从基于层叠的造型的制造效率的观点考虑，不优选。因此，作为干燥温度，优选为10℃～40℃，更优选为20℃至30℃。并且，为了促进干燥，能够同时使用减压或送风等方法。作为压力，优选在1个大气压～各温度下的水的蒸汽压以上的范围。
在通过将明胶水溶液冷冻干燥来代替风干而制造粉末的情况下，若将醇水溶液喷墨描绘在冷冻干燥粉末上，则粉末溶解于油墨，无法造型。认为这是因为，在冷冻干燥的情形下，1个粉粒呈多个孔打开的状态，且密度小，容易溶解于醇水溶液。关于经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末，在粒子表面几乎没有孔隙，因此粒子的比表面积小，即使通过喷墨进行描绘，也只有粉粒的一部分、粉粒的表面溶解。
本发明中所使用的粉末的平均粒径为25～200μm。在平均粒径小于25μm、或平均粒径大于200μm的情况下，无法形成所期望的立体的粉末层叠物(成型体)。
(粉末的平均粒径的测量方法)
本发明中所使用的粉末的平均粒径能够通过通常已知的方法来测量，具体而言，能够使用直接观察法(光学显微镜、电子显微镜)、激光衍射·散射法、离心沉降法、电检测带法、光子相关法等来测量。作为测量法，有测量时在空气或其他气体中进行测量的干式法、将粒子分散于适当的溶剂中并进行测量的湿式法。直接观察法能够通过干式法来进行测量，激光衍射·散射法能够通过干式法或湿式法来进行测量，离心沉降法、电检测带法及光子相关法能够通过湿式法来进行测量。
上述的测量法中，湿式激光衍射·散射法在精度、再现性及测量的简便性方面优异。使用了湿式激光衍射·散射法的粒度分布测量器可市售，例如，可举出激光衍射式粒径分布测量装置SALD(Shimadzu Corporation)、MASTERSIZER(Malvern)、Microtrac MT(MicrotracBEL Corp.)、激光衍射散射法粒度分布测量装置LS13(Beckman Coulter,Inc.)、LASER MICRON SIZER(SEISHIN ENTERPRISE Co.,Ltd)、激光衍射/散射式粒径分布测量装置LA系列(HORIBA)等。本发明的实施例中，主要使用了激光衍射/散射式粒径分布测量装置LA920(HORIBA)。
湿式粒径分布测量中所使用的溶剂需要选择溶解明胶的溶剂、使明胶溶胀的溶剂以外的溶剂。作为合适的溶剂，能够使用醇类、酮类、酯类、烃类、硅油类等，但是从安全性、折射率等的理由考虑，优选醇类，其中，尤其优选乙醇、异丙醇。关于测量温度，只要没有特别标注，则为25℃(±3℃)。
通过湿式激光衍射·散射法测量的粒径以换算成球当量直径的粒径分布的形式表示。所谓本发明中的平均粒径，只要没有特别说明，则表示中值粒径(50％直径)。并且，除了中值粒径以外，有时还将10％直径、90％直径也用于粒子的特性，但是这些均由通过湿式激光衍射·散射法测量的粒径分布来求出。
(关于粉末的平均粒径的上限及下限)
若将粉末的平均粒径设为大于200μm，则粉末层叠物(成型体)的最小单元在XYZ方向上均成为200μm，因此无法制作高精度的成型体。并且，在如本发明的粉末层叠的情况下，主要因以下所记载的2个理由(理由1及理由2)，在粉末的平均粒径中存在下限。
理由1：由粉末的流动性的劣化及凝聚性的增加引起的重涂不良
众所周知，若减小平均粒径，则具有作为粒子的聚集体的粉末的流动性劣化，或产生凝聚块的倾向。若平均粒径减小，流动性劣化，产生凝聚块，则变得难以重涂。即使在鱼明胶的情况下，平均粒径为21μm时，粉末附着于辊上，或在重涂面的一部分产生能够目视的凹凸而无法进行高精度的重涂。
理由2：兼顾膜厚的增加与膜应力的抑制，制作高精度的结构物。
作为本发明的实施方式的一例，假设如下情况：在使用辊或刮板等，使作为粉粒的聚集体的明胶粉末平坦化之后，从喷墨喷头等喷射喷射液，并使喷射液从粉末的表面的上方飞翔到下方，且使喷射液着落于粉末表面上的同时使喷墨喷头等在作为与粉末水平的方向的XY方向上进行扫描，并形成面状的涂布面。在该情况下，所着落的喷射液进入作为粉末的构成要素的粒子与粒子的间隙，喷射液位于相邻的2个以上的粒子与粒子之间，通过喷射液溶解粉末的粒子的表面之后，进行喷射液的干燥，粉末的粒子与粒子临时粘附。上述体系中，在形成1层量的膜的粉末层叠的情况下，具有以下倾向。
在此所说的粉末的表面，不是构成粉末的每一个粉粒的表面，而是指作为粒子的聚集体的粉末的上部的空气层侧。在此所说的粒子的表面，是指作为粉末的构成要素的粒子的表面。
若增加每单位面积的喷射液滴量来进行描绘，则喷射液从粉末表面渗透到内部的量增加而膜厚增加，但是膜应力(膜的收缩和翘曲)增加。若每单位面积的喷射液滴量减少，则膜应力减小，但是膜厚减小。粉末层叠中，由于在Z方向的层叠间距存在下限的关系，因此膜厚要求一定值以上的膜厚。
由以下2个理由等，Z方向的层叠间距存在下限。
理由2-1：粉末层叠的造型时间的增加抑制
若将Z方向的层叠间距设定为较小，则为了获得其量、所期望的厚度，层叠次数增加而立体物体的造型速度变慢。造型速度不需要必要以上的精度。
理由2-2：机械精度
来自用于保持重涂时的水平度并无晃动地扫描的机械精度的要求。
现状的粉末层叠中，1层量的层叠间距为100μm左右。
关于1层量的层叠间距为100μm且形成1层所需的膜厚，若考虑上层与下层密合，则需要获得150μm至200μm左右的膜厚。
制造基于粉末层叠的成型体时，重要的是获得规定的膜厚。
但是，若为了获得某种规定的膜厚，增加每单位体积的喷射液滴量，则由膜应力无法获得适当的结构物，膜应力下降，因此若减少每单位体积的喷射液滴量，则上膜与下膜不会密合而无法获得立体的结构物。
作为将每单位体积的喷射液滴量的增减作为设计事项，欲增加膜厚与抑制膜应力之间为权衡关系，且在形成如本发明的粉末层叠物时成为障碍。
但是，作为将如上述的每单位体积的喷射液滴量的增减作为设计事项，即使在欲增加膜厚与抑制膜应力之间为权衡关系的情况下，若增加粉末的平均粒径，则并不是消极地调节权衡关系，而是解除权衡的关系，可兼顾欲增加膜厚与抑制膜应力。
而且，根据粉末的平均粒径的大小，兼顾程度增加。
关于每单位面积的涂布量的调节，能够通过调节通过从1个喷嘴喷射的1个液滴的量，或调节所着落的液滴与液滴的距离、着落密度来控制。
(关于粉末的制备方法)
粒子的平均粒径为25～200μm的粉末，例如能够通过粉碎经将明胶风干的固体来制备。
关于经风干的明胶固体的粉碎，能够使用已知的机械粉碎装置来进行微粒化。作为粉碎方法，有干式粉碎法和湿式粉碎法，但是在本发明的情况下，优选干式粉碎法。作为干式粉碎装置的代表例，可举出高速旋转型冲击式磨机，辊磨机、喷射磨机及介质搅拌型磨机等。
关于高速旋转型冲击式磨机，通过用高速旋转的锤、销、盘等对固体块施加冲击来进行粉碎，且根据粉碎前后的平均粒径的大小市售各种装置。例如，在粉碎后的平均粒径为cm级别中有颚式破碎机、锤磨机等，在粉碎后的平均粒径为数mm级别中可使用棒磨机、销磨机等。粉碎后的平均粒径为数十μm级别中，可使用还具备高速搅拌的盘、叶轮的磨机。并且，还优选使用通过具备高速旋转体和在其外周部具备屏幕，且发挥基于剪切力的微细化和局部分级别功能，由此设法提高粉碎粒子的均匀性的装置。
辊磨机中，将欲粉碎的固体放入旋转的辊之间，并在辊之间的压力下使其破碎并进行粉碎。作为粉碎后的平均粒径为数cm级别的装置，有辊式破碎机，作为粉碎后的平均粒径为数mm级别的装置，有辊磨机。
喷射磨机通过由高速气流引起的粒子彼此或对壁部等的碰撞、磨碎来进行微细化，且主要适于制作10μm以下的微细粒子。作为该方式的1种，不是通过粒子彼此的碰撞，而是通过使高速气流撞击专用碰撞板来进行粉碎的方式。还市售碰撞型喷射磨机这一装置，该碰撞型喷射磨机也适于粉碎比重轻的明胶的粒子。
介质搅拌型磨机的代表为球磨机。球磨机中，通过利用金属、磁性、金属氧化物的球的冲击、压缩、磨碎进行微细化，且通过将试样和球放入1个罐中并使其长时间旋转来进行微细化，但是也有不旋转而是高频率振动来进行粉碎。
粉碎经风干的明胶固体时，能够使用上述粉碎方法，但是粉碎明胶时，特别重要的是粉碎时的温度不会变得过高。期望将粉碎时的粒子的温度保持为80℃以下、优选为60℃以下。因此，优选在粉碎机中具备气冷或水冷等的冷却机构。并且，用液态氮等积极地进行冷冻并进行粉碎的方法也是有效的。并且，为了缩小粉碎效率、制造的粒子的平均粒径分布，优选在粉碎装置中具备分级机构。作为分级机构，通常为屏幕、离心分离。而且，从粉碎机的性能方面考虑，难以通过1次操作而将经风干的明胶固体粉碎至数十μm级别。通常，通过阶段性使用与粉碎级别对应的若干个粉碎机，能够获得具有平均粒径的微细粉末。
＜2＞在基板上形成含有经将明胶水溶液风干的粉末的层的工序a
本发明中的工序a为在基板上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末(还称为明胶粉末)的层的工序。基板可以设置于升降台上。
基板的材质、形状及大小并无特别限定，能够根据目的使用适当的基板。作为基板，优选具有规定的面积的平面的基板。基板的表面的大小并无特别限定，但是优选为0.5cm×0.5cm～50cm×50cm，更优选为3cm×3cm～15cm×15cm左右。基板的表面的形状可以是正方形，也可以是长方形。
作为基板的材质，可举出不锈钢、铝、铜、铁等金属原材料、玻璃、陶瓷等无机原材料、丙烯酰、甲基丙烯酸(聚甲基丙烯酸甲酯树脂等)、聚苯乙烯、聚丙烯、特氟龙(Teflon)(注册商标)等塑料原材料。
在基板上形成含有明胶粉末的层的工序中，能够通过任意的方法进行，该方法并无特别限定，但是例如，能够使用3D打印机(三维打印机)进行。作为3D打印机的一例，能够使用Z-Printer310plus(3D Systems Corporation(旧Z Corporation)等，但是并无特别限定。
＜3＞含有醇类的水溶液
本发明中，使用含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液。
作为用于形成成型体的喷射液，使用水的理由为如下2个理由。
理由1-1：在体内富含水分，基本上无害且安全性高。
理由1-2：因为能够溶解明胶粉末，并使粉末的粒子与粒子临时粘附。
本发明的明胶粉末的成型体能够通过粉末层叠来造型。作为利用粉末层叠的造型的一例，在本说明书中如上所述，但是能够使用辊或刮板等，使作为粉粒的聚集体的明胶粉末平坦化之后，从具备1个喷嘴～3000个喷嘴、更优选为100个喷嘴～3000个喷嘴的喷墨喷头等，喷射1pL～1000pL左右、更优选为10pL～100pL的喷射液，并使0.5mm～5mm左右、更优选为2mm～3mm左右的喷射液从粉末的表面的上方飞翔到下方，且使喷射液以0.5kHz～50kHz、更优选为3kHz～20kHz着落于粉末表面上的同时使喷墨喷头等在作为与粉末水平的方向的XY方向上扫描，并形成面状的涂布面。在此，所着落的喷射液进入作为粉末的构成要素的粒子与粒子的间隙，喷射液位于相邻的2个以上的粒子与粒子之间，通过喷射液溶解粉末的粒子的表面之后，进行喷射液的干燥，粉末的粒子与粒子临时粘附。除喷墨喷头以外，还考虑喷射分配器等。在喷射分配器的情况下，通常为1个喷嘴。
水溶解明胶，少量的水容易干燥。若将如喷墨的微小液滴(2pL～300pL左右)以面状均匀地涂布于粉末上，则在形成粉末之后，在10分钟左右以内，即使在室温下也容易几乎干燥。但是，由于水存在以下所记载的问题，因此在本发明中使用含有醇类的水溶液。使用含有醇类的水溶液的理由为以下4个理由。
(使用含有醇类的水溶液的理由)
理由2-1：兼顾膜厚的增加与膜应力的抑制，制造高精度的结构物。
若通过喷射液溶解粉末的粒子的表面，并进行喷射液的干燥，则在如粉末的粒子与粒子临时粘附的体系中，通过喷墨描绘而形成一层膜时，若为了增加膜厚，增加每单位体积的喷射液滴量来作为设计事项，则膜应力(膜的收缩和翘曲)变大，相反地抑制膜应力的产生，因此若减少每单位体积的喷射液滴量来作为设计事项，则膜厚变小。
将每单位体积的喷射液滴量的增减作为设计事项，欲增加膜厚与抑制膜应力处于权衡的关系，且在形成高精度的粉末层叠物时成为障碍。但是，若即使在将如上述的每单位体积的喷射液滴量的增减作为设计事项，欲增加膜厚与抑制膜应力为权衡的情况下，也使用含有醇类的水溶液，则消除权衡的关系，兼顾欲增加膜厚与抑制膜应力(参考图3)。
这推断为如下的机理。
明胶粉末的粒子溶解于水，但是假设明胶粉末的粒子的最外表面不是亲水性，而是疏水性的可能性高。由此，水与醇类的混合液中，通过喷射液的表面张力下降的效果、及疏水性的表面与醇类水溶液的相溶性增加，容易润湿到粒子的表面的效果，液渗透到粉末的里面。即使在因容易渗透到粉末中，每单元面积的喷射液滴量少的情况下，也能够获得与水相同膜厚的粉末层叠物。若通过喷射液溶解粉末的粒子的表面，然后，喷射液蒸发并进行干燥，则粉末的粒子与粒子通过明胶成分临时粘附。若液位于粒子与粒子之间，则成为液交联状态，并在粒子与粒子之间产生拉力，使粉末的膜体收缩。若使用含有醇类的水溶液，则每单位面积以少的喷射液滴量成为相同的膜厚，由此位于粒子与粒子之间的喷射液的量少，粒子与粒子之间的拉力变弱，粉末的膜的收缩减小。
假设明胶粒子的最外表面不是亲水性的理由是因为：在明胶粉末的造粒的干燥过程中，水分从明胶水溶液蒸发时，明胶分子与明胶分子或明胶分子内的亲水性的基团相面对，且疏水性基团朝向相反的一侧，进行稳定化以及朝向最外表面的外侧的亲水性基团变少，且变得相对疏水。并且认为：即使在粉碎由明胶水溶液制作的大块的固体明胶的情况下，固体明胶也从粘结力弱的疏水性面分离而成为2个以上的微细粒子，且粒子的最外表面为疏水性。
图20是将水和乙醇水溶液50质量％滴加着落于明胶上并观察其是否渗透的图。相对于喷墨的液滴为20μm，图20中，为针对2mm左右的大液滴的实验。如图20所示，在水刚着落之后经2分钟之后、即使经1小时之后也不会渗透到明胶粉末，但是乙醇水溶液在着落后1秒以内渗透，由此能够推测上述内容。
理由2-2：能够实现高频下的多个喷嘴在高频率下的高速描绘，造型速度增加，容易制造高精度的成型体。
一般的喷墨喷头以一维排列的300dpi～600dpi左右的喷嘴列、喷射频率为5～20kHz左右的高速喷射能力，高速形成涂布面。若由多个喷嘴以高速频率进行描绘，则可在非常短的时间内对明胶粉末喷射多个液滴。例如，即使以300dpi×5kHz的相对低速，在1cm×1cm的范围内进行描绘，也可在0.02秒左右的时间内进行描绘。
若使用Z-Printer310plus(300dpi，频率推测为5kHz以上)，并将喷射液设为水，描绘在约1cm×约1cm～约3cm×约3cm的明胶粉末上，则可目视观察形成有数mm尺寸的液滴的状态。能够推测为：刚描绘之后，至少在目视级别上粉末干燥，水不是渗透的状态，喷射在粉末上的喷射液即水全部合为一体而成为1个大的液滴。能够推测这是因为：如明胶粉末那样最外表面不是亲水性，而是疏水性，且如具有与粒子尺寸对应的凹凸的体系中，相对于水，产生如荷叶排斥水滴的被称为荷叶效应的现状，且成为超拒水状态，简言之，水不渗透。
同样地，将用水描绘1cm×1cm左右且用辊进行重涂以使厚度成为100μm设为1次操作(1层量)，重复进行5次(5层量)左右。
通常，3D打印机中，5层量左右是无法获得所期望的成型体的。通过重复5层量、5次左右、辊的重涂操作，将粉末上的数mm尺寸的水压碎或挤压成粉末，粉末开始润湿。若粉末开始润湿，则将润湿处作为起点而开始形成粉末层叠物，但是存在以下2个问题，无法制造高精度的成型体。
理由2-2-1：从喷头喷射油墨并进行描绘时，成为沿扫描方向延伸的不足1mm的棒状束聚集而成的成型体，无法获得高精度的成型体。认为这是从排列成一列的相邻的喷嘴喷射的喷射液刚着落于粉末的表面上之后不会渗透到明胶粉末中，而在粉末的表面上，聚集数列至10列左右的喷嘴的喷射液的着落干扰。通常的喷墨描绘中，为了防止着落干扰，通过表面活性剂降低喷射液的表面张力，或使用将二氧化硅的微粒以聚乙烯醇的高分子复合化而得的专用喷墨用纸，或在石膏、淀粉的粉末层叠等中，混合聚乙烯醇高分子。如该情况，对明胶粉末的渗透慢时，认为能够极端地发生着落干扰，并形成棒状束。并且，若用手抓住棒状束，则可轻松地剥离。但是，若使用含有醇类的水溶液，则快速渗透到明胶粉末中，因如水中观察到的着落干扰而无法形成棒状束，能够形成接近所期望的3D结构物的结构物。
理由2-2-2：虽然在水中发生极端的层叠偏离(参考图21)，但是若为混合有醇类的水溶液，则可大幅得到减缓。
理由2-3：喷射液滴状态的稳定
若将水和乙醇混合，则表面张力下降，粘度增加。由此，随着接近最佳的喷墨的喷射条件，接近理想的喷射、飞翔形状，先滴与后滴的分裂距离变小，着落时不分裂而着落。并且，由于后滴的速度变快，因此后滴的飞翔弯曲的发生频率下降，描绘精度提高。并且，在水的情况下，能够利用以复杂的波浪形精确地调节的波浪形第一次喷射，但是若为混合有乙醇等醇类的水溶液，则能够以简单的矩形波喷射，还能够扩大喷射稳定的喷射速度的范围。作为一例，若各混合50质量％的水和乙醇，则与水的情况相比，粘度从1cP增加至2.8cP(100cP＝0.1Pa·s)，表面张力从72mN/m下降至28mN/m。最佳的粘度、表面张力根据喷墨喷头而改变，但是通常为3cP至12cP、25至35mN/m左右，接近适当的物理性质。通过添加乙醇，即使不添加大量添加到一般的喷墨油墨中的表面活性剂或增稠剂，也能够接近最佳的喷射液的物理性质，因此喷射稳定化。因此，先滴与后滴的分裂距离变小，液滴着落时，不分裂而着落。由于后滴的速度变快，因此后滴的飞翔弯曲的发生频率下降，描绘精度提高。
理由2-4：
假设重视安全性，也不使用除水以外的溶剂，但是若为沸点低的醇类，则能够使其从造型后的粉末层叠物蒸发，能够获得安全性高的结构物。虽然也取决于将明胶结构物用于再生医疗物的方法、明胶的种类，但是通常在135℃左右的温度下进行热交联之后移植到活体，若醇类的沸点为120℃以下，则能够从明胶结构物中除去醇类。
(醇类的具体例)
作为沸点为120℃以下的醇类的具体例，能够举出以下的醇，但是并无特别限定。
甲醇：沸点为65℃
乙醇：沸点为78℃
1-丙醇：沸点为97℃
2-丙醇：沸点为82℃
1-丁醇：沸点为117℃
2-丁醇：沸点为99℃
2-戊醇：沸点为119℃
叔丁醇：沸点为82℃
作为沸点为120℃以下的醇类，尤其优选乙醇。
醇水溶液中的醇类与水的混合比率并无特别限定，但是通常以质量比计为10:90～90:10，优选为20:80～80:20，更优选为30:70～70:30，进一步优选为40:60～60:40。作为一例，醇类与水的混合比率可以是50:50。
＜4＞制造包含醇水溶液的喷射的明胶成型体的工序b
本发明中，相对于工序a中形成的层，从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在工序a中形成的层上，由此形成明胶成型体。
本发明中，喷射醇水溶液的液滴。从喷嘴部喷射的醇水溶液的液滴在空间中移动，而不与喷嘴部和基板上含有明胶粉末的层的任一个接触。
本发明中，以醇水溶液的液滴喷射时，在喷头内喷嘴附近的温度并无特别限定，但是优选为15℃～35℃，更优选为20℃～30℃。没有环境及机械性控制，而在室温下放置装置的情况下，致动器驱动而温度升高，在喷头内喷嘴附近的温度成为稍微高于实验室的23℃环境的28℃左右。
醇水溶液的喷射能够使用具有喷嘴部的喷墨喷头来进行。已知有喷墨记录装置，其通过压电元件的致动器等而从喷嘴部喷射油墨液滴，并使其着落于介质上且在介质上形成图像。喷墨记录装置中，能够使喷嘴部的序列间距高密度化，并且能够喷射数皮升～100皮升的微小的油墨液滴。在日本特开2012-004555号公报中，记载有利用喷墨方式的功能材料的制造方法及装置，但是醇水溶液的喷射能够使用如日本特开2012-004555号公报中所记载的喷墨喷头来进行。日本特开2012-004555号公报中所记载的所有内容均被引用到本说明书中。
喷墨装置能够构成为包含载置基板的平台及朝向基板喷射醇水溶液的喷墨喷头。
平台可以构成为通过移动机构能够在垂直方向上自如地移动，还可以具有水平方向的移动机构。作为移动机构，例如能够使用齿轮齿条机构、滚珠丝杠机构等。通过控制移动机构，能够使平台移动到所期望的位置。
关于喷墨喷头，对基板的所期望的位置喷射从油墨罐供给的醇水溶液。作为喷墨喷头，能够使用具有压电方式的致动器的喷头，但是并无特别限定。
在粉体层叠的情况下，XY方向的移动通常是固定基板并在XY方向上操作喷墨喷头，但是喷墨喷头与基板可以相对移动，也可以构成为固定喷墨喷头并操作基板。
醇水溶液的描绘方式可以是串行打印机方式，也可以是行式打印机方式。为了有效地描绘大面积，利用单路径的行式打印机方式的装置是合适的。若为单路径，则仅通过穿过1次喷墨喷头和喷射油墨的基板的各区域，就能够对各区域的整个表面喷射油墨。
作为喷墨的方式，可以是连续型、按需型中的任一种。在数十cm平方以上的大面积上描绘的情况下，优选具有多个喷嘴的按需型。
带有按需型喷射方式的特征的致动器，能够使用压电方式、热方式、固体方式、静电吸引方式等各种方式。关于压电方式，除了水系以外，还能够喷射有机剂系，适于醇水溶液的喷射。并且，关于喷嘴的排列，可以是单列配置、多列配置、交错格子状配置中的任一种。
在粉体飞舞的情况下，10mm以上的飞翔距离长的连续型是合适的。另外，即使在飞翔距离比较短的压电方式中，也能够通过在喷头与基板之间同时使用静电场来确保飞翔距离并进行描绘。
在控制1皮升以下的微小的液滴量进行喷射的情况下，优选作为静电吸引方式的1种的从针前端喷射油墨的类型。
还能够在油墨罐至喷墨喷头的供给路径之间设置脱气模块。通过使用进行了脱气处理的醇水溶液，能够使来自喷墨喷头的喷射稳定。作为脱气方法，能够采用通过脱气过滤器的方法、进行超声波处理的方法等。
制造包含醇水溶液的喷射的明胶成型体的工序b，例如能够使用具备如上述的喷墨喷头的3D打印机(三维打印机)来进行。作为3D打印机的一例，能够使用Z-Printer310plus(3D Systems Corporation(旧Z Corporation))等，但是并无特别限定。
通过本发明的方法制造的明胶成型体的大小并无特别限定，但是在使明胶成型体近似于长方体的情况下，长方体的长度、宽度及高度分别优选为0.1mm～200mm，更优选为1mm～100mm。
＜5＞明胶
作为本发明中所使用的明胶，优选天然明胶、重组明胶或化学合成明胶。所谓天然明胶，是指由源自天然的胶原制成的明胶。明胶来源的活体并无特别限定，例如能够使用源自动物(哺乳类、鱼类等)的明胶。本发明中所使用的明胶为动物明胶或重组明胶。
所谓化学合成明胶，是指人工合成的明胶。明胶等肽的合成可以是固相合成，也可以是液相合成，但是优选固相合成。肽的固相合成对于本领域技术人员来而言是公知的，例如可举出作为氨基的保护而使用Fmoc基(Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基：芴基-甲氧基-羰基)的Fmoc基合成法、以及作为氨基的保护而使用Boc基(tert-Butyl Oxy Carbonyl基：叔丁氧基羰基)的Boc基合成法等。另外，化学合成明胶的优选的方式能够应用在本说明书中的后面叙述的重组明胶中所记载的内容。关于重组明胶，在本说明书中的后面叙述。
明胶的亲水性值“1/IOB”值优选为0至1.0。更优选为0至0.6，进一步优选为0至0.4。所谓IOB，是指基于由藤田穆提出的表示有机化合物的极性/非极性的有机概念图的亲疏水性的指标，其详细内容例如在“Pharmaceutical Bulletin(药学通报)”，vol.2，2，pp.163-173(1954)、“化学领域”vol.11，10，pp.719-725(1957)、“Fragrance Journal”，vol.50，pp.79-82(1981)等中进行了说明。简言之，将所有的有机化合物的来源设为甲烷(CH4)，且将其他化合物均视为甲烷的衍生物来对其碳原子数、取代基、改性部、环等分别设定一定的数值，将其分数相加来求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，并将该值标绘在以有机性值作为X轴且以无机性值作为Y轴的图上。所谓有机概念图中的IOB，是指有机概念图中的无机性值(IV)与有机性值(OV)之比即“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机概念图的详细内容，请参考“新版有机概念图-基础与应用-”(甲田善生等编著，三共出版、2008)。本说明书中，由取IOB的倒数的“1/IOB”值表示亲疏水性。是表示“1/IOB”值越小(接近0)，则越呈亲水性的符号。
关于明胶，由总平均亲水性(Grand average of hydropathicity)(GRAVY)值表示的亲疏水性指标中，优选为0.3以下且负9.0以上，进一步优选为0.0以下且负7.0以上。总平均亲水性(GRAVY)值能够通过《Gasteiger E.,Hoogland C.,Gattiker A.,Duvaud S.,Wilkins M.R.,Appel R.D.,Bairoch A.；Protein Identification and Analysis Toolson the ExPASy Server；(In)John M.Walker(ed)：The Proteomics Protocols Handbook，Humana Press(2005).pp.571-607》及《Gasteiger E.,Gattiker A.,Hoogland C.,IvanyiI.,Appel R.D.,Bairoch A.；ExPASy：the proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis.；Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003).》的方法而获得。
明胶可以被交联，也可以不被交联。作为一般的交联方法，已知有热交联、基于醛类(例如，甲醛、戊二醛等)的交联、基于缩合剂(碳二亚胺、氰胺等)的交联、酶交联、光交联、紫外线交联、疏水性相互作用、氢键、离子性相互作用等，在本发明中也能够使用上述交联方法。作为在本发明中所使用的交联方法，进一步优选热交联、紫外线交联或酶交联，尤其优选热交联。
在进行基于酶的交联的情况下，作为酶，只要具有高分子材料之间的交联作用，则并无特别限定，但是能够优选使用谷氨酰胺转氨酶及漆酶、最优选使用谷氨酰胺转氨酶来进行交联。作为用谷氨酰胺转氨酶进行酶交联的蛋白质的具体例，只要是具有赖氨酸残基及谷氨酰胺残基的蛋白质，则并无特别限制。谷氨酰胺转氨酶可以是源自哺乳类的谷氨酰胺转氨酶，也可以是源自微活体的谷氨酰胺转氨酶，具体而言，可举出AJINOMOTO CO.,INC.制造的ACTIVA系列、作为试剂而出售的源自哺乳类的谷氨酰胺转氨酶、例如OrientalYeast Co.,Ltd.制造、Upstate USA Inc.制造、Biodesign International制造等源自豚鼠肝脏的谷氨酰胺转氨酶、源自山羊的谷氨酰胺转氨酶、源自兔子的谷氨酰胺转氨酶等、源自人的凝血因子(Factor XIIIa，Haematologic Technologies,Inc.制造)等。
关于进行交联(例如，热交联)时的反应温度，只要能够进行交联，则并无特别限定，但是优选为-100℃～500℃，更优选为0℃～300℃，进一步优选为50℃～300℃，进一步优选为100℃～250℃，进一步优选为120℃～200℃。
作为本发明中所使用的明胶，尤其优选重组明胶。
所谓重组明胶，是指具有通过基因重组技术制成的类似明胶的氨基酸序列的多肽或蛋白样物质。本发明中能够使用的重组明胶优选具有由胶原中特征性的Gly-X-Y表示的序列(X及Y分别独立地表示氨基酸的任一种)的重复。在此，多个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以彼此不同。优选在一分子中包含2个序列以上的细胞粘附信号。作为本发明中所使用的重组明胶，能够使用具有源自胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。例如，能够使用EP1014176、美国专利6992172号、国际公开WO2004/085473、国际公开WO2008/103041等中所记载的重组明胶，但是并不限定于此。作为本发明中所使用的重组明胶而优选的重组明胶为以下方式的重组明胶。
关于重组明胶，因天然明胶原有的性能而活体相容性优异，且由于不是源自天然，因此无需担心牛海绵状脑病(BSE)等，非感染性优异。并且，与天然明胶相比，重组明胶更均匀，且序列已被确定，因此在强度及降解性方面也能够通过交联等而模糊较少且精确地设计。
关于重组明胶的分子量，并无特别限定，但是优选为2000以上且100000以下(2kDa(千道尔顿)以上且100kDa以下)，更优选为2500以上且95000以下(2.5kDa以上且95kDa以下)，进一步优选为5000以上且90000以下(5kDa以上且90kDa以下)，最优选为10000以上且90000以下(10kDa以上且90kDa以下)。
重组明胶优选具有由胶原中特征性的Gly-X-Y表示的序列的重复。在此，多个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以彼此不同。Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X及Y表示任意的氨基酸(优选除甘氨酸以外的任意的氨基酸)。所谓由胶原中特征性的Gly-X-Y表示的序列，是指明胶及胶原的氨基酸组成及序列中的与其他蛋白质相比非常特殊的部分结构。在该部分中，甘氨酸占整体的约3分之1，成为在氨基酸序列中3个中有1个甘氨酸的重复结构。甘氨酸为最简单的氨基酸，对分子链的配置的束缚也少，且在凝胶化时大大有助于螺旋结构的再生。由X及Y表示的氨基酸包含大量的亚氨基酸(脯氨酸、羟基脯氨酸)，优选占整体的10％～45％。优选重组明胶的序列的80％以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。
一般的明胶中，极性氨基酸中的带电荷的极性氨基酸与无电荷的极性氨基酸以1:1存在。在此，所谓极性氨基酸，具体地是指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及精氨酸，其中所谓极性无电荷氨基酸，是指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸。本发明中所使用的重组明胶中，所构成的所有氨基酸中，极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。上述极性氨基酸中的无电荷氨基酸的比例优选为5％以上且小于20％，更优选为5％以上且小于10％。而且，优选在序列上不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任一个氨基酸，更优选在序列上不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的2个以上的氨基酸。
通常，多肽中，已知有作为细胞粘附信号发挥作用的最小氨基酸序列(例如，NagaiShoten Co.,Ltd.发行的“病理生理学(Pathophysiology)”Vol.9、No.7(1990年)527页)。本发明中所使用的重组明胶优选在一分子中具有2个以上的这些细胞粘附信号。作为具体的序列，从粘附的细胞的种类多这一方面考虑，优选以氨基酸单字母符号表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列的序列。进一步优选RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，尤其优选RGD序列。RGD序列中，优选ERGD序列。通过使用具有细胞粘附信号的重组明胶，能够提高细胞的基质产生量。
作为本发明中所使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD之间的氨基酸数在0～100之间不均匀，更优选RGD之间的氨基酸数在25～60之间不均匀。
关于该最小氨基酸序列的含量，从细胞粘附及增殖性的观点考虑，在蛋白质1分子中优选为3～50个，进一步优选为4～30个，尤其优选为5～20个。最优选为12个。
本发明中所使用的重组明胶中，RGD基序相对于氨基酸总数的比例优选至少为0.4％。在重组明胶包含350个以上的氨基酸的情况下，优选350个氨基酸的各段包含至少1个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例更优选至少为0.6％，进一步优选至少为0.8％，更进一步优选至少为1.0％，尤其优选至少为1.2％，最优选至少为1.5％。关于重组肽内的RGD基序的数量，每250个氨基酸中，优选至少为4个，更优选为6个，进一步优选为8个，尤其优选为12个以上且16个以下。RGD基序的0.4％的比例与每250个氨基酸至少为1个RGD序列对应。RGD基序的数量为整数，因此为了满足0.4％的特征，由251个氨基酸组成的明胶必须包含至少2个RGD序列。关于本发明的重组明胶，优选每250个氨基酸中，包含至少2个RGD序列，更优选每250个氨基酸中，包含至少3个RGD序列，进一步优选每250个氨基酸中，包含至少4个RGD序列。作为本发明的重组明胶的另一方式，包含至少4个RGD基序，优选包含6个RGD基序，更优选包含8个RGD基序，进一步优选包含12个以上且16个以下的RGD基序。
重组明胶可以被部分水解。
优选本发明中所使用的重组明胶由A-[(Gly-X-Y)n]m-B表示。n个X分别独立地表示氨基酸的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一种。m优选表示2～10的整数，更优选表示3～5的整数。n优选为3～100的整数，进一步优选为15～70的整数，尤其优选为50～65的整数。A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。另外，n个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以彼此不同。
更优选本发明中所使用的重组明胶由Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly(式中，63个X分别独立地表示氨基酸的任一种，63个Y分别独立地表示氨基酸的任一种。另外，63个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以彼此不同。)表示。
优选在重复单元中粘结多个天然存在的胶原的序列单元。在此所说的天然存在的胶原，只要是天然存在的，则可以是任一种胶原，但是优选I型、II型、III型、IV型或V型胶原。更优选，I型、II型或III型胶原。根据另一形态，上述胶原的来源优选人、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选人。
本发明中所使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。关于重组明胶的等电点的测量，能够如等电点电泳法(Maxey，C.R.(1976)；参考Phitogr.Gelatin 2，Editor Cox，P.J.Academic，London，Engl.)中所记载那样，通过测量使1质量％明胶溶液通过阳离子及阴离子交换树脂的混合床柱之后的pH来实施。
优选重组明胶不被去胺基化。
优选重组明胶不具有端肽。
优选重组明胶是通过编码氨基酸序列的核酸制备的实质上纯粹的多肽。
作为本发明中所使用的重组明胶，尤其优选如下肽的任一种：
(1)由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
(2)由在序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或加成1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列组成，且具有活体相容性的肽；或
(3)由序列号1中所记载的氨基酸序列与具有80％以上(进一步优选为90％以上，尤其优选为95％以上，最优选为98％以上)的序列相同性的氨基酸序列组成，且具有活体相容性的肽。
本发明中的序列相同性是指由以下式计算的值。
％序列相同性＝[(相同残基数)/(比对长度)]×100
2个氨基酸序列中的序列相同性能够通过本领域技术人员公知的任意的方法来确定，能够使用BLAST((Basic Local Alignment Search Tool)局部序列排比检索基本工具)程序(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)等来确定。
所谓“缺失、取代或加成1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列”中的“1个或多个”，是指优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，尤其优选为1～3个。
关于本发明中所使用的重组明胶，能够通过本领域技术人员公知的基因重组技术来制造，例如能够遵照EP1014176A2号公报、美国专利第6992172号公报、国际公开WO2004/085473号、国际公开WO2008/103041号等中所记载的方法来制造。具体而言，获取编码规定的重组明胶的氨基酸序列的基因，并将其导入到表达载体中，以制作重组表达载体，将其导入到合适的宿主而制作转化体。通过在合适的培养基中培养所获得的转化体，产生重组明胶，因此通过回收由培养物产生的重组明胶，能够制备本发明中所使用的重组明胶。
＜6＞层叠
基于本发明的明胶成型体的制造方法在上述工序b之后，还可以包括：
工序c，在工序a中形成的层及在工序b中形成的明胶成型体上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末的层；及工序d，通过从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在上述工序c中形成的层上，由此制造明胶成型体。
在进行如上述工序c及工序d中所记载的层叠的情况下，有时会产生层的偏离、对辊表面的附着等，但是本发明中，能够解决上述问题，能够实现优异的重涂性。
上述工序c能够以与工序a相同的方式进行。在工序c中使用的材料的种类可以与工序a的种类相同，也可以不同，但是优选相同。工序c中的明胶优选动物明胶或重组明胶。
上述工序d能够以与工序b相同的方式进行。工序d中使用的材料的种类可以与工序b的种类相同，也可以不同，但是优选相同。
工序d中使用的醇类与工序b的情况同样地尤其优选乙醇。
在进行工序c及工序d的情况下，其次数并无特别限定，能够以1次以上的任意的次数进行，例如能够进行1次～3000次。
＜7＞基于层叠的成型方法
(7-1)本发明的第一层叠方法
根据本发明的优选的方式，能够制造明胶成型体，以使工序b中所制造的明胶成型体与基板接触。
将基于通常的方法的成型体的制造方法示于图17。图17的A为在基板上形成含有粉末的层的工序a。图17的B为如下工序，即，相对于在工序a中形成的层，从喷嘴部喷射醇水溶液的液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在工序a中形成的层上，由此形成明胶成型体。图17的B中，形成第一层的成型体。图17中所示的方法中，第一层的成型体成为不与基板接触并在第一层的成型体(由最初形成的层构成的成型体)的下方存在粉末的状态。在该状态下，如图17的C所示，若作为工序c，形成包含第二层的粉末的层，则使第一层的成型体的位置偏离。然后，如图17的D所示，若进行工序d，则在与第一层的成型体偏离的位置上形成第二层的成型体。与上述同样地，如图17的E所示，第三层以后的成型体的位置也与第一层的成型体及第二层的成型体的位置偏离。在使用质量轻的明胶粉末的情况下，显著产生如上述的成型体的位置偏离的现象。
相对于此，将基于本发明的第一层叠方法的成型体的制造方法示于图18。图18的A为在基板上形成含有粉末的层的工序a，但是使含有粉末的层的厚度成为与第一层的成型体的厚度实质上相同的厚度。通过如此形成含有粉末的层，如图18的B所示，在形成第一层的成型体(由最初形成的层构成的成型体)的情况(工序b)下，第一层的成型体成为与基板接触的状态，成为在第一层的成型体的下方不存在粉末的状态。通过设为上述状态，如图18的C所示，即使作为工序c，形成包含第2层的粉末的层，也能够防止第一层的成型体的位置偏离。由此，如图18的D及E所示，第二层以后的成型体能够无偏离地形成于与第一层的成型体相同的位置上。
根据本发明，可提供一种成型体的制造方法，其包括：
工序a，在基板上形成含有粉末的层；及
工序b，相对于在工序a中形成的层，从喷嘴部喷射液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在工序a中形成的层上，由此形成成型体(其中，所形成的成型体与基板接触)。
而且，根据本发明，提供一种成型体的制造方法，其包括：
工序a，在基板上形成含有粉末的层；
工序b，相对于在工序a中形成的层，从喷嘴部喷射液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在工序a中形成的层上，由此形成成型体(其中，所形成的成型体与基板接触)；
工序c，在工序b之后，在工序a中形成的层及在工序b中形成的成型体上形成含有粉末的层；及
工序d，通过从喷嘴部喷射液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在工序c中形成的层上，由此制造成型体。
(7-2)本发明的第二层叠方法
进一步优选的方式中，本发明的明胶成型体的制造方法中，在工序b中，所制造的明胶成型体与基板接触，
在工序b之后，包括：工序c1，在工序a中形成的层及在工序b中形成的明胶成型体上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末的层；及工序d1，通过从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在工序c1中形成的层上，由此制造明胶成型体，
工序d1中，液滴着落于与在工序b中形成的明胶成型体的上表面的外周区域对应的区域上，
在工序d1之后，包括：工序e，在工序c1中形成的层及在工序d1中形成的明胶成型体上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25～200μm的粉末的层；及工序f，通过从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在上述工序e中形成的层上，由此制造明胶成型体，工序f中，上述液滴着落于与在工序d1中形成的明胶成型体的上表面的外周区域对应的区域、以及被在工序d1中形成的明胶成型体包围的区域的内部区域上。
上述方式的方法中，通过形成盒子形状的成型体及在其内部形成成型体(目标成型体)，盒子形状的成型体能够防止内部的成型体的偏离。盒子形状的成型体使用上述本发明的第一层叠方法中所记载的方法来形成，以不偏离第一层的成型体的位置。并且，内部的成型体不与盒子形状的成型体连结(即，内部的成型体的底面及侧面不与盒子形状的成型体接触)。上述本发明的第一层叠方法中所记载的方法中，形成所期望的成型体之后，进行从基板剥离的操作时，担心因操作而成型体的形状变形，从而需要谨慎的操作。但是，根据本发明的第二层叠方法，能够不破坏形状而容易地获得所期望的成型体(内部的成型体)。即，使内部的成型体从包含粉末的层分离时，无需施加力，因此能够制造全长为数mm的微小的成型体、具有多个孔的成型体、数百μm的薄的成型体。并且，根据本发明的第二层叠方法，能够制造具有弯曲面的球状的成型体作为下层(第一层)的结构。
将基于本发明的第二层叠方法的成型体的制造方法示于图19。图19的A是在基板上形成含有粉末的层的工序a，但是含有粉末的层的厚度成为与盒子形状的成型体的第一层的成型体的厚度实质上相同的厚度。如此形成含有粉末的层，由此如图19的B所示，在形成盒子形状的成型体的第一层的成型体(由最初形成的层构成的成型体)的情况(工序b)下，第一层的成型体成为与基板接触的状态，且成为在第一层的成型体下不存在粉末的状态。通过设为上述状态，如图19的C所示，即使作为工序c1而形成包含盒子形状的成型体的第2层的粉末的层，也能够防止盒子形状的成型体的第一层的成型体的位置偏离。图19的D表示通过从喷嘴部喷射液滴并使其飞翔，且使液滴着落于在工序c1中形成的层上，由此制造明胶成型体的工序d1。图19的D中，液着落于与成型体的上表面的外周区域对应的区域上。
图19的E表示在进行在工序c1中形成的层及在工序d1中形成的明胶成型体上形成含有粉末的层的工序e之后，通过从喷嘴部喷射液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在工序e中形成的层上，由此制造明胶成型体的工序f。工序f中，液着落于被在工序d1中形成的明胶成型体包围的区域的内部区域上，由此能够形成内部的成型体。图19的F表示通过重复进行工序e及f，在盒子形状的成型体的内部形成具有所期望的形状的(内部的)成型体。
根据本发明，提供一种成型体的制造方法，其包括：
工序a，在基板上形成含有粉末的层；工序b(在工序b中制造的成型体与基板接触)，相对于在工序a中形成的层，从喷嘴部喷射液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在工序a中形成的层上，由此形成成型体；工序c1，在工序b之后，在工序a中形成的层及在工序b中形成的成型体上形成含有粉末的层；工序d1(在工序d1中，上述液滴着落于与在工序b中形成的成型体的上表面的外周区域对应的区域上)，通过从喷嘴部喷射液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在工序c1中形成的层上，由此制造成型体；工序e，在工序d1之后，在工序c1中形成的层及在工序d1中形成的成型体上形成含有粉末的层；及工序f(在工序f中，上述液滴着落于与在工序d1中形成的明胶成型体的上表面的外周区域对应的区域、以及被在工序d1中形成的成型体包围的区域的内部区域上)，通过从喷嘴部喷射液滴并使其飞翔，且使上述液滴着落于在上述工序e中形成的层上，由此制造成型体。
＜8＞去除粉末的工序
本发明中，还能够设置去除形成明胶成型体时未使用的粉末的工序g。所谓去除粉末，是指从成型体的表面去除粉末。
通过去除形成成型体时未使用的明胶粉末，能够回收成型为所期望的形状的成型体。
去除形成成型体时未使用的明胶粉末的方法并未特别限定，例如可以使用压缩空气来进行。
＜9＞使成型体固化的工序
本发明中，在去除形成成型体时未使用的明胶粉末的工序g之后，还能够设置通过对成型体进行加热来使成型体固化的工序h。
通过进行上述工序h，能够提高成型体的强度。
通过对成型体进行加热来使成型体固化的工序h，能够通过通常在50℃～300℃、优选为100℃～250℃，更优选为120℃～200℃的温度下对成型体进行加热来进行。其中，T〔开尔文：K〕＝t〔摄氏度：℃〕+273.15。成型体的加热能够在空气、非活性气体、真空等环境下进行，但是优选在低氧环境中进行。其中，从加热均匀性的观点考虑，优选在氮气等的非活性气体中进行加热。
加热时间并无特别限定，但是通常为1小时至72小时，优选为2小时至48小时，更优选为4小时至28小时。
本发明中，在通过加热来使成型体固化的工序h之后，还能够设置用网格等的支撑体包裹成型体的工序i。通过工序i，维持润湿环境下的成型体的形状变得容易。
网格等支撑体的材料并无特别限定，但是在应用于活体的情况下，优选使用具有活体适应性的材料，例如可以使用高分子。
该成型体中，即使在成型体因润湿环境等而无法维持形状的情况下，若由网格等的支撑体包围成型体，则也能够维持形状。并且，网格等的支撑体在与外部连通的状态下支撑成型体，在将用该网格等的支撑体包裹的成型体移植到活体中的情况下，周围的活体组织能够通过支撑体，进入成型体中。
＜10＞将细胞接种到成型体的工序
本发明中，还能够设置将细胞接种到成型体的工序j。
关于本发明中的成型体的用途，如后述，是指再生医疗用支架材料或组织修复材料等，假设将细胞接种到成型体而使用的情况、及不将细胞接种到成型体而使用的情况。
所接种的细胞的种类并无特别限定，能够根据使用目的来适当选择。
作为所使用的细胞，优选动物细胞，更优选源自脊椎动物的细胞，尤其优选源自人的细胞。源自脊椎动物的细胞(尤其是源自人的细胞)的种类可以是多能细胞、成体干细胞、前体细胞或成熟细胞的任一种。作为多能细胞，例如能够使用胚胎干(ES)细胞、生殖干(GS)细胞或人工多能性干(iPS)细胞。作为成体干细胞，例如能够使用间充质干细胞(MSC)、造血干细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、源自骨髓的细胞、心肌干细胞、源自脂肪的干细胞或神经干细胞。作为前体细胞及成熟细胞，例如能够使用源自皮肤、真皮、表皮、肌肉、心肌、神经、骨、软骨、内皮、脑、上皮、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、脾脏、口腔内、角膜、骨髓、脐带血、羊膜或毛发的细胞。作为源自人的细胞，例如能够使用ES细胞、iPS细胞、MSC、软骨细胞、成骨细胞、成骨前体细胞、间充质细胞、成肌细胞、心肌细胞、心脏成肌细胞、神经细胞、肝细胞、β细胞、成纤维细胞、角膜内皮细胞、血管内皮细胞、角膜上皮细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、源自骨髓的细胞或造血干细胞。并且，细胞的来源可以是自体细胞或异体细胞的任一种。
＜11＞通过本发明的方法制造的明胶成型体的用途
通过基于本发明的明胶成型体的制造方法制造的明胶成型体的用途，并无特别限定，但是优选再生医疗用支架材料或组织修复材料。关于明胶成型体的用途，在本说明书中在后面进行叙述。
[2]明胶成型体
本发明还提供一种明胶成型体，其通过上述[1]中所记载的基于本发明的明胶成型体的制造方法来制造。
本发明的明胶成型体能够以高造型精度制造。
关于本发明的明胶成型体的用途，并无特别限定，但是例如能够用作再生医疗用支架材料、再生医疗等产品(在体外组织培养的产品)或组织修复材料，能够优选用作再生医疗用支架材料或组织修复材料，能够尤其优选用作骨再生用组织修复材料。
所谓本发明中的组织修复材料，是指通过埋植在活体体内而有助于在该所埋植的部位上形成组织的材料，可以包含细胞，也可以不包含细胞。并且，可以包含如生长因子、药剂那样的促进活体的反应的成分，也可以不包含该成分。而且，本发明的明胶成型体可以与羟磷灰石等无机材料混合而使用，也可以作为与上述无机材料的复合材料而使用。所谓本发明中的组织修复材料，不仅有助于形成通常存在于埋植部位上的正常组织的材料，而且还包含促进形成包含疤痕组织等的非正常组织的材料。
作为组织修复材料的具体例，并无特别限定，但是能够举出软骨、半月板、皮肤或骨的修复材料。即，本发明的明胶成型体能够用作用于软骨、半月板、皮肤或骨的再生的治疗剂。只要需要进行上述再生，则并不限定疾病，但是作为一例，作为伴随软骨缺损的疾病，能够举出变形性关节炎、骨软骨缺损、剥脱性骨软骨炎、外伤性软骨损伤、骨关节炎、复发性多发软骨炎、软骨发育不全症、椎间盘损伤、椎间盘突出等。
本发明的明胶成型体即使通过与移植细胞或骨诱导药剂同时使用，也能够用作骨再生治疗剂。作为骨诱导药剂，例如可举出BMP(骨形成因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，但是并无特别限定。
本发明的明胶成型体能够用作组织修复材料，因此组织的修复方法、伴随组织的损伤的疾病等的治疗方法也包含在本发明中。本发明中的组织的修复方法包括在对象组织发生缺损或损伤的部位应用作为明胶成型体的组织修复材料，可以根据需要包含其他工序。作为其他工序，例如可举出将移植细胞和/或骨诱导剂应用于应用组织修复材料的前后、或同时应用组织修复材料的部位。
作为在对象组织发生缺损或损伤的部位应用明胶成型体的方法，能够使用切开、注射、关节镜、内窥镜等。
本发明的明胶成型体的孔隙率并无特别限定，通常为10～90％，优选为10～70％，更优选为20～40％，进一步优选为25～35％。孔隙率能够通过如下方式来求出：对明胶成型体进行微焦点CT分析，并在厚度方向的上中下的位置上，分别测量2个点、总计6个点的部位的填充率，并由所测量的填充率，且根据下述式而求出。
孔隙率＝100％-填充率
优选本发明的明胶成型体具有与外部空间连通的孔。在将具有上述孔的明胶成型体移植到活体的情况下，细胞容易进入明胶成型体的内部。更优选与外部空间连通的孔贯穿成型体的内部，且在孔的两端与外部空间连通。
与外部空间连通的孔的代表直径，并无特别限定，但是优选为300μm～2000μm。代表直径的定义及测量方法如下。
相对于从成型体的外缘部延伸至内部的孔，取垂直的截面，在其形状能够近似圆形的情况下，设为直径，在近似椭圆形为适当的情况下，设为短边。在四边形的情况下，也设为短的一边的长度。实际的孔在孔的深度方向上有波动，但是在波动比较小的情况下，由在成型体的外缘部看得见的孔的大小代表。在设计上改变孔径的情况下，将最小处的直径设为代表直径。在孔位于死角的情况下，从死角至100m处不进行测量。
在深度方向上波动大的情况下，测量收缩处的直径并将其作为代表直径。
在测量成型体的外缘部的情况下，用能够测量的显微镜进行测量。在测量内部的情况，用切片机等切出切片，以免成型体变形，并利用显微镜测量孔径。可以根据微焦点CT的截面数据进行测量。在该情况下，微焦点CT的截面数据的长度的绝对精度低，因此用显微镜测量成型体的全长的长度及标记附近并参考数据等，求出孔径。
所谓与外部空间连通的孔，表示孔从成型体的一处表面形成至成型体的内部空间。即，孔的内部空间与外部空间连通。
所谓“与外部空间连通的孔贯穿成型体的内部，其在孔的两端与外部空间连通”，表示孔从成型体的某处的表面形成至成型体的内部空间，而且通过成型体的另一处的表面而与外部空间连通。
根据以下实施例对本发明进行进一步具体的说明，但是本发明并不受实施例限定。
实施例
[重组明胶]
作为重组明胶，准备了以下CBE3(记载于国际公开WO2008/103041号公报中)。
CBE3：分子量：51.6kD结构：GAP[(GXY)63]3G氨基酸数：571个
RGD序列：12个亚氨基酸含量：33％大致100％的氨基酸为GXY的重复结构。在CBE3的氨基酸序列中不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。
等电点：9.34
GRAVY值：-0.682
1/IOB值：0.323氨基酸序列(序列表的序列号1)(与国际公开WO2008/103041号公报的序列号3相同。其中，将末尾的X修改为“P”)
GAP
(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[实施例中的平均粒径的测量方法]
对于明胶粉末，使用激光衍射/散射式粒径分布测量装置LA920(HORIBA)测量了粒径分布。另外，作为具体的步骤，将作为分散溶剂的无水特级乙醇(Wako Pure ChemicalCorporation)装满样品容器，一边施加超声波一边一点一点向其中添加欲测量的明胶粉末并使其分散，若成为规定的透光率的范围，则开始了测量。根据所获得的粒径分布数据，读取中值粒径，并将该值作为平均粒径。
(1)明胶粉末的制造
·经风干的明胶粉末
在50℃下将上述重组明胶溶解于注射用水中，而获得了20质量％水溶液。在减压下将该溶液脱泡之后，向12.5×8.5cm的聚丙烯制托盘中分别注入14mL，并在室温下干燥了72小时。将所获得的干燥膜裁剪成约2cm见方。接着，对于在上述中获得的明胶风干固体，首先，作为第一阶段的粉碎，使用作为高速旋转型磨机的1种的QUADRO COMIL U5(Powrexcorp.)粉碎成1mm以下之后，使用作为高速旋转型叶轮磨机的Dry Burst Mini(SuginoMachine Limited)进行了粉碎，以使其成为数十μm级别的所期望的平均粒径。
·经冷冻干燥的明胶粉末
在50℃下将上述重组明胶溶解于注射用水中，而获得了4质量％水溶液。在减压下将该溶液脱泡之后，向内径为4.5cm的聚(四氟乙烯)制托盘中分别注入8mL，并均匀地进行冷冻之后，在-20℃下冷冻干燥了72小时。将所获得的干燥体裁剪成约1cm见方。接着，对于在上述中获得的明胶风干固体，首先，作为第一阶段的粉碎，使用作为高速旋转型磨机的1种的QUADRO COMIL U5(Powrex corp.)粉碎成1mm以下之后，使用作为高速旋转型叶轮磨机的DryBurst Mini(Sugino Machine Limited)进行了粉碎，以使其成为数十μm级别的所期望的平均粒径。
(2)喷射液(油墨)
作为喷射液，使用了水或乙醇水溶液(50质量％的水及50质量％的乙醇)。
(3)成型体的制造(经风干的粉末与经冷冻干燥的粉末的比较)
在上述(1)中制造的明胶粉末导入到FUJIFILM Dimatix Inc.制造的DimatixMaterials Printer(DMP-2831机)，将液滴喷射量设为约10pL、将喷嘴设为5个、将喷射频率设为4kHz，在喷头主扫描方向上制造了4mm的成型体。将一边喷射喷头一边扫描移动的方向设为喷头主扫描方向，将与喷头主扫描方向垂直，且不喷射而移动扫描的方向设为喷头副扫描方向。将明胶粉末的层叠间距设为10μm。※图的X方向与喷头主扫描方向相同。在上述成型体的制作中，通过反复进行在基板上形成含有明胶粉末的层的工序、及通过将喷射液在液滴状态下从喷嘴部喷射，且使其着落于含有明胶粉末的层上，由此制造明胶成型体的工序，可制造规定大小的成型体。
将使用经风干的明胶粉末制造的成型体示于图1中，并将使用经冷冻干燥的明胶粉末制造的成型体示于图2中。图1中所示的成型体中，在垂直方向(Z方向)上，几乎不低于粉末的表面。并且，在平面的一方向(X方向)上缩小约20％。图2中所示的成型体中，若能看到容器的底部的程度，则整个膜比粉末的表面低约500μm左右。并且，在平面的一方向(X方向)上也缩小成一半左右(约50％)。
(4)对于粉末的平均粒径及水溶液组成与膜厚及收缩率之间的关系的评价
作为明胶粒子，使用了鱼明胶粒子(使用由鱼制成的明胶，与CBE3的情况同样地制造的粒子)(重组明胶模拟粒子)。使用平均粒径为21μm、54μm或68μm的鱼明胶和作为喷射液的水或乙醇水溶液(50质量％的水及50质量％的乙醇)，并使用FUJIFILM Dimatix Inc.制造的Dimatix Materials Printer(DMP-2831机)，将液滴喷射量设为约10pL、将喷嘴设为5个、将喷射频率设为4kHz，在喷头主扫描方向上，制作图3所示的各种膜厚的成型体，并测量了收缩率。
关于成型体的膜厚，在膜的截面方向上通过显微镜取5个点以上的平均并进行了测量。
关于收缩率，在刚形成膜之后，用显微镜测量了膜的X方向上的边缘至边缘的距离、及所着落的痕迹所残留的边缘至边缘的距离。
将膜厚与收缩率之间的关系示于图3中。图3中，A～E表示以下。
A：平均粒径为68μm的鱼明胶粒子、喷射液为乙醇水溶液(50质量％的水及50质量％的乙醇)
B：平均粒径为68μm的鱼明胶粒子、喷射液为水
C：平均粒径为54μm的鱼明胶粒子、喷射液为水
D：平均粒径为21μm的鱼明胶粒子、喷射液为水
E：市售的淀粉(ZP12e，Z CORPORATION制造)、喷射液为水
在使用平均粒径为21μm的粒子的情况下，可知收缩率劣化(增加)。并且，即使在使用平均粒径为54μm或68μm的粒子的情况下也使用水来作为喷射液时，可知随着膜厚的增加而收缩率劣化。另一方面，在组合平均粒径为54μm或68μm的粒子和乙醇水溶液的情况下，即使膜厚增加，也可抑制收缩率的增加，可获得良好的结果。
(5)重涂性的评价
使用平均粒径为21μm、54μm或68μm的重组明胶模拟粒子，对重涂性进行了评价。具体而言，将使用粉末流动性试验机(Powder Flow Tester，Brookfield公司制造)，并根据压实应力(σ1)与无压屈服应力(σc)的比率确定的流动性指数(σ1/σc)为4以上的情况，评价为重涂性良好。
将重涂性的评价的结果示于以下表1中。
[表1]
| 粉末的平均粒径 | 重涂性 | 重涂性的详细内容 |
| 68μm | 良好 | 粉末表面大致平坦 |
| 54μm | 良好 | 粉末表面大致平坦 |
| 21μm | 不良 | 粉末附着于辊上等，而在粉末表面产生了凹凸。 |
(6)利用喷射液的层叠时的偏离的评价
使用平均粒径为48μm的CBE3粒子，并使用水或乙醇水溶液来作为喷射液，且使用Z-Printer310plus(3D Systems Corporation(旧Z Corporation))制造了明胶成型体。将所制造的明胶成型体示于图4中。
在使用水来作为喷射液的情况下，层叠时会发生层的偏离，但是在使用乙醇水溶液来作为喷射液的情况下，不会发生层的偏离。
(7)具有孔隙的成型体的制造
使用平均粒径为48μm的CBE3粒子、及作为喷射液的乙醇水溶液(50质量％的水及50质量％的乙醇)，并使用Z-Printer310plus(3D Systems Corporation(旧ZCorporation))，制造了具有孔隙的成型体。将层叠间距设为100μm。
将3D(三维)设计图和所制造的成型体的的照片示于图5及图6中。
(8)骨再生的评价试验
(8-1)CBE3冷冻干燥海绵的制作
将上述(1)明胶粉末的制造中的“经冷冻干燥的明胶粉末”的记载中所获得的经冷冻干燥的明胶粉末的上部和下部切除，而获得了厚度为1.5mm的多孔体。将其在氮气氛下以135℃加热28小时，而制成埋植评价用海绵。
(8-2)CBE3成型体(无孔)(热交联28小时：3小时后的酸残留率为78％)及CBE3成型体(有孔)(热交联28小时、3小时下的酸残留率为82％)的制作
制作了如图5所示的直径为4.3mm且厚度为1.7mm左右的CBE3成型体(无孔)和CBE3成型体(有孔)。
(8-3)骨再生的评价
使用CBE3冷冻干燥海绵(热交联28小时：3小时下的酸残留率为95％)、CBE3成型体(无孔)(热交联28小时：3小时后的酸残留率为78％)及CBE3成型体(有孔)(热交联28小时、3小时下的酸残留率为82％)，进行了骨再生的评价试验。
将CBE3冷冻干燥海绵、CBE3层叠成型体(无孔)或CBE3层叠成型体(有孔)移植到大鼠，并经过4周之后进行了显微CT(计算机断层摄影法：Computed Tomography)分析及病理分析。
遵照国际公开WO2011/027850号公报的实施例1的记载并以如下方式进行了海绵或成型物的移植。作为实验动物，使用了SD(Sprague-Dawley：斯普拉格-杜勒鼠)大鼠(雄性，10-12周龄，0.3-0.5kg)。通过将戊巴比妥(Nembutal(注册商标)，Dainippon SumitomoPharma Co.,Ltd.)0.8ml/kg施加到腹腔内而进行了麻醉。暴露大鼠的头顶骨，制作了直径为5mm的圆形骨缺损部。将约10mg的上述海绵或成型体填充到所制作的骨缺损部之后，缝合了皮肤。
将显微CT分析的结果示于图7中。图7的A～D表示下述。
A：控制(仅限缺损)
B：CBE3冷冻干燥海绵(热交联28小时、3小时下的酸残留率为95％)
C：CBE3层叠成型体(无孔)(热交联28小时、3小时下的酸残留率为78％)
D：CBE3层叠成型体(有孔)(热交联28小时、3小时下的酸残留率为82％)
显微CT分析中，在控制(仅限缺损)和移植了CBE3冷冻干燥海绵的情况下，观察到来自所移植的外周部的骨再生，但是未观察到如从CBE3粉末层叠物的外周部延伸的骨再生、移植物内部的骨再生。根据上述结果，显示了CBE3粉末层叠物的优越性。
(病理标本的制作)
试验期间结束之后，从放血致死的大鼠中回收头部，并去除皮肤、眼球、脑等软组织之后在盐酸脱钙液中进行了脱钙。从所获得的脱钙标本修剪埋植部，并进行了石蜡包埋。通过切片机从该包埋标本切出5μm厚度的切片，并进行了苏木素-伊红染色。
将病理分析的结果示于图8～图10中。在染色成紫红色的CBE3粒子之间观察到软组织的侵入，且显示成型体的良好的连通性。并且，在软组织中观察到多个管腔结构，且显示良好的血管侵入。在病理分析中，在所移植的CBE3粉末层叠物的内部也能够确认到骨再生。所再生的骨形成表面的细胞增厚，还观察到骨形成活化的状态。
(9)孔隙率的测量
如下测量了上述(8)的骨再生的评价试验中所使用的明胶成型体的填充率。
对于直径为20mm及厚度为3mm的盘的CBE3粉末层叠物(明胶成型体)，进行微焦点CT分析，在厚度方向上的上中下的位置，分别测量了2个点、总计6个点的部位(图11)的填充率。将填充率的测量结果示于图12～图14中。能够根据所测量的填充率，并通过下述式求出孔隙率。
孔隙率＝100％-填充率
明胶成型体的孔隙率为约30％。
冷冻干燥海绵中，孔隙率进一步变高。通常，对于孔隙率高的情况，细胞容易进入到成型体的内部，假设评价结果变高。但是，即使在低孔隙率下，通过本发明的方法制造的明胶成型体的评价结果也优异。
在二维的情况下，若成为路径的基础的圆点(在图15的情况下为着色圆点)成为50％～60％以上，则研究出不管在纵向上还是在横向上均产生路径来作为数学上的渗滤(percolation)理论。
在三维的情况下，约30％时形成路径。
层叠CBE3粉末而得的成型体中，显微CT分析中，确认到成为立体连接有孔隙率为30％且直径为100μm左右的孔的连通孔结构(图16)。认为这是即使在大鼠试验中使用不具有孔的成型体的情况下细胞也会渗透的原因。认为该孔隙取决于由CBE3粒子的附着力与质量的平衡来确定的体积密度。
参考例1：
将水(为了容易观察，进行了微量着色)或50质量％乙醇水溶液的液滴着落于明胶粉末上。将液滴刚落下之后及液滴着落经2分钟之后的状态示于图20中。
在水的情况下，即使在2分钟之后、甚至经过1小时，也未观察到渗透。若经过1小时左右，则从明胶粉末溶解的明胶进入水滴中，成为可在明胶粉末的表面上捏住的果冻状。
在50质量％乙醇水溶液的情况下，液滴着落后在1秒以内渗透。渗透极快。
参考例2：
使用纯水来作为喷射液(油墨)，并使用鱼明胶粉末(平均粒径为54μm)来作为粉末，通过Z-Printer310plus，在以下的条件下制作了成型体。
涂布量：圆点间距推断为喷头喷嘴间距300dpi。喷嘴为约300个。
Z间距：推断为100μm。
图案：40mm(X：主扫描)×30mm(Y：副扫描)×5mm(层叠)
将制作结果示于图21中。
50层中的前5层不是仅通过形成大液滴来结构化的。50层中的前15层左右因重涂而大幅偏离。若在粉中形成锚固下层，则可相对干净地进行描绘·层叠，但是在辊扫描方向上叠加了小的偏差。成型体具有可抬起程度的强度，但是若稍微触碰，则开始变形。
Claims (22)
1.一种明胶成型体的制造方法，其包括：工序a，在基板上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25μm～200μm的粉末的层；及工序b，相对于在工序a中形成的层，从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使所述液滴着落于在所述工序a中形成的层上，由此形成明胶成型体。
2.根据权利要求1所述的明胶成型体的制造方法，其中，
所述工序a中的明胶为动物明胶或重组明胶。
3.根据权利要求1或2所述的明胶成型体的制造方法，其中，
所述工序b中的沸点为120℃以下的醇类是乙醇。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其在所述工序b之后还包括：工序c，在工序a中形成的层及在工序b中形成的明胶成型体上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25μm～200μm的粉末的层；及工序d，通过从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使所述液滴着落于在所述工序c中形成的层上，由此制造明胶成型体。
5.根据权利要求4所述的明胶成型体的制造方法，其中，
所述工序c中的明胶为动物明胶或重组明胶。
6.根据权利要求4或5所述的明胶成型体的制造方法，其中，
所述工序d中的沸点为120℃以下的醇类是乙醇。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其中，
工序b中，所制造的明胶成型体与所述基板接触。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其中，
工序b中，所制造的明胶成型体与所述基板接触，
在所述工序b之后，包括：工序c1，在工序a中形成的层及在工序b中形成的明胶成型体上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25μm～200μm的粉末的层；及工序d1，通过从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使所述液滴着落于在所述工序c1中形成的层上，由此制造明胶成型体，
所述工序d1中，所述液滴着落于与在工序b中形成的明胶成型体的上表面的外周区域对应的区域上，
在所述工序d1之后，包括：工序e，在工序c1中形成的层及在工序d1中形成的明胶成型体上形成含有经将明胶水溶液风干的粒子的平均粒径为25μm～200μm的粉末的层；及工序f，通过从喷嘴部喷射含有沸点为120℃以下的醇类的水溶液的液滴并使其飞翔，且使所述液滴着落于在所述工序e中形成的层上，由此制造明胶成型体，所述工序f中，所述液滴着落于与在工序d1中形成的明胶成型体的上表面的外周区域对应的区域以及被在工序d1中形成的明胶成型体包围的区域的内部区域上。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其还包括工序g，该工序g去除形成明胶成型体时未使用的粉末。
10.根据权利要求9所述的明胶成型体的制造方法，其在所述工序g之后包括工序h，该工序h通过对成型体进行加热来使成型体固化。
11.根据权利要求10所述的明胶成型体的制造方法，其中，
将成型体加热1小时至72小时。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其还包括工序i，该工序i用支撑体包裹所述明胶成型体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其还包括工序j，该工序j将细胞接种在所述明胶成型体上。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的明胶成型体的制造方法，其中，
明胶成型体为再生医疗用支架材料或组织修复材料。
15.一种明胶成型体，其通过权利要求1至14中任一项所述的明胶成型体的制造方法来制造。
16.根据权利要求15所述的明胶成型体，其为再生医疗用支架材料或组织修复材料。
17.根据权利要求15或16所述的明胶成型体，其为骨再生用组织修复材料。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的明胶成型体，其中，
孔隙率为20％～40％。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的明胶成型体，其具有与外部空间连通的孔。
20.根据权利要求19所述的明胶成型体，其中，
与外部空间连通的孔贯穿成型体的内部，且在孔的两端与外部空间连通。
21.根据权利要求19或20所述的明胶成型体，其中，
与外部空间连通的孔的代表直径为300μm～2000μm。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的明胶成型体，其用支撑体包裹表面。
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