JP2010130913A - グルコース消費量測定による細胞成長因子の活性評価方法 - Google Patents
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Abstract
従来、培養基材に含有された細胞成長因子の活性を測定するためには破壊的な方法しかなく、同じサンプルを用いて経時的に活性を測定することができなかった。本発明は、組織再生用基材に含まれる細胞成長因子の活性をin vitroで非破壊的にかつ、簡便に、しかも経時的に測定することが可能な新規な方法を提供するものである。
【解決手段】
本発明は細胞成長因子を含む組織再生用基材に細胞を播種し、一定期間培養後に、培養液中のグルコース消費量を測定することによって細胞成長因子の活性を測定することを特徴とする。
【選択図】 図1
Description
ブタ腱由来I型コラーゲンとブタ皮膚由来ゼラチンとを混合して水溶液とした。コラーゲンとゼラチンの質量比は、100:0(コラーゲンスポンジ)および90:10(10%ゼラチン/コラーゲンスポンジ)とした。水溶液を型枠に流し込み、−40℃で凍結した。これを凍結乾燥した後、真空減圧下、110℃で24時間熱脱水架橋を加えた後、0.2%グルタルアルデヒド溶液に24時間浸漬することにより化学架橋を導入した。これを再び凍結乾燥してゼラチン/コラーゲンスポンジを得た。
48ウェル培養プレートに、前記(1)で作製したゼラチン/コラーゲンスポンジ(直径10mmに打ち抜いたもの)を敷き詰め、bFGFが5.5μg含浸するようbFGF水溶液55μLをスポンジに滴下し、4℃下で一晩放置することで、ゼラチン/コラーゲンスポンジにbFGFを複合化させた。
前記(2)で作製したbFGFを含浸させたゼラチン/コラーゲンスポンジにクロネティクス社から購入したヒト線維芽細胞をDME培地(血清不含)に懸濁し、このスポンジ上に3.5×105cellsを播種し、細胞が接着するまで37℃、5%CO2雰囲気下で2時間培養した。その後、DME培地(血清不含、3.0mL)中に、このヒト線維芽細胞を播種したゼラチン/コラーゲンスポンジを浸漬し、さらに37℃、5%CO2雰囲気下で3日間培養した。
前記(3)で作製したヒト線維芽細胞を播種したゼラチン/コラーゲンスポンジ(培養0日目および3日目)を、0.5mg/mL濃度のMTT溶液(1.0mL)中で3時間培養した後、生細胞中に蓄積された青紫色のMTTホルマザンをイソプロパノール(4.0mL)にて抽出し、570nmの吸光度を測定した。
前記(3)の方法でヒト線維芽細胞を播種したゼラチン/コラーゲンスポンジを3日間培養した際の培養液を回収し、市販のグルコース濃度測定用のキット(グルコースCII−テストワコー、和光純薬製)を用いて、グルコース消費量を測定した。
上記の方法で得られた試験結果を図1および図2に示す。図1にはゼラチン/コラーゲンスポンジ中で繊維芽細胞を3日間培養したときの培養液中グルコース消費量を示す。図2にはゼラチン/コラーゲンスポンジ中で繊維芽細胞を培養したときの、繊維芽細胞数(培養0日目および3日目)を示した。
Claims (2)
- 細胞成長因子を含有する組織再生用基材上に細胞を播種して培養液中で培養し、前記培養液中のグルコース消費量を測定することによって、非破壊的に前記組織再生用基材に含有されている細胞成長因子の活性を評価する方法。
- 培養液中のグルコース消費量を経時的に自動計測することを特徴とする請求項1に記載の方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2014188761A1 (ja) * | 2013-05-24 | 2014-11-27 | 三井造船株式会社 | バラスト水質の暫定的判定方法、バラスト水の処理方法、生物組成の暫定的判定方法、生物活性の評価方法及び生物濃度の推定方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007068884A (ja) * | 2005-09-09 | 2007-03-22 | Gunze Ltd | 組織再生用基材 |
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Title |
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JPN6013045647; 化学工学シンポジウムシリーズ 診断・治療システムにおける化学工学 Vol. 79, 20050120, p. 84-88 * |
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