JPH04332561A - 培養皮膚用マトリックス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は培養皮膚用マトリックス
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、広範囲重症熱傷患者の治療におい
て、培養表皮の技術が有効であることが報告されている
。例えば、不溶性コラ−ゲンとコンドロイチン６硫酸の
混合共沈澱物から調製したマトリックス上で表皮細胞を
増殖させて培養皮膚を作製し、患部に移植する方法が報
告されている（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ
．，２２：９３９〜９５７，１９８８）。本発明者等は
、さきに線維芽細胞を組み込んだコラ−ゲンを骨格とす
るマトリックス上で表皮細胞を増殖させて培養皮膚を作
製し、これを皮膚欠損部に移植して皮膚を再建する方法
について報告した［日本形成外科学会会誌、第１０巻、
第３号、１６５〜１８０頁（１９９０年３月発行）］。

【０００３】即ち、免疫拒絶反応の少ないアテロコラ−
ゲンのシ−ト状スポンジをマトリックスとして用い、そ
の片面に線維芽細胞を播種して培養し、他の面に表皮細
胞を培養し重層化することにより培養皮膚を作製し、得
られた培養皮膚を皮膚の欠損部に移植し生着させる方法
について報告した。しかし、この方法による培養皮膚の
生着率は必ずしも満足し得るものではなく生着率の一層
の向上が望まれた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は皮膚欠損部に
移植した場合に、優れた生着率で皮膚を再建することの
できる培養皮膚の作製に好適なマトリックスを提供する
ことを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の目的
を達成するために検討した結果、培養皮膚の生着率を向
上させるためには、移植後、生体内から表皮細胞への栄
養分の供給が円滑に行われることが必要であり、このた
めには、栄養分が効率よくマトリックスを通過して細胞
へ供給されること、並びにマトリックスが移植後早期に
分解吸収されることが重要であることを明かにした。本
発明は上記の知見に基づいて更に検討を重ねた結果達成
されたものである。即ち、本発明の要旨は、複数個の貫
通孔を設けたコラ−ゲンスポンジを骨格とするシ−トを
、ゲル状の生体繊維状高分子材料で被覆してなる培養皮
膚用マトリックスに存する。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。なお、以
下の説明では、生体繊維状高分子材料としてコラ−ゲン
又はフイブリンを使用した場合について述べる。図１は
本発明の培養皮膚用マトリックスの一例の垂直断面略図
であり、図２は図１の培養皮膚用マトリックスを構成す
るコラ−ゲンスポンジを骨格とするシ−トの垂直断面略
図である。図中、１は培養皮膚用マトリックスを示し、
２はコラ−ゲンスポンジを骨格とするシ−トを示し、３
はシ−ト２に設けた貫通孔を示し、４は貫通孔３内のゲ
ル状のコラ−ゲン又はフイブリンを示し、５はシ−ト２
の表面を被覆するゲル状のコラ−ゲン又はフイブリンを
示す。

【０００７】本発明の培養皮膚用マトリックス１は、例
えば、以下に述べる方法により作製することができる。 先ず、コラ−ゲンを周知の方法により酵素処理して抗原
性の少ないアテロコラ−ゲンを調製し、次にアテロコラ
−ゲンの１％水溶液を調製し、その粘度が最大となるｐ
Ｈ４としてホモジナイザ−によりクリ−ム状の溶液とす
る。次いで、予め底面にアテロコラ−ゲン水溶液（ｐＨ
４）を塗布して風乾し、薄膜をコ−トした容器に上記ク
リ−ム状溶液を薄層状に流し込み、アルカリ性雰囲気下
で靜置して気泡を含んだ状態でゲル化させた後、急速凍
結させ真空乾燥して厚さ１〜２ｍｍ程度のコラ−ゲンス
ポンジを骨格とするシ−トを作製する。

【０００８】１５ワットの紫外線ランプを用い、上記シ
−トの両面に夫々１時間ずつ紫外線を照射して部分的に
分子間架橋を導入した後、複数の貫通孔３を窄設し、次
いでエチレンオキシドガスにより滅菌する。貫通孔の大
きさ及び数は特に限られるものではないが、通常直径約
０．５〜１ｍｍ程度の貫通孔を２〜４個／ｃｍ２程度設
けるのが望ましく、例えば、直径０．５ｍｍの貫通孔を
４ｍｍ間隔で窄設する。　　貫通孔３を窄設したシ−ト
２に、組織培養タイプのアテロコラ−ゲンを含む中性溶
液を含浸させ、インキュベ−タ中に靜置してゲル化（コ
ラ−ゲン分子の集合による繊維形成）させることにより
、貫通孔３内及びシ−ト２の表面がゲル状コラ−ゲン特
にアテロコラ−ゲンにより被覆されて図１に示す本発明
の培養皮膚用マトリックスが作製される。

【０００９】上記の方法で作製された本発明のマトリッ
クスの貫通孔３には、図１に示すように、ゲル状のアテ
ロコラ−ゲン４が組み込まれている。このため、後述す
る方法により、このマトリックス上で細胞を培養する際
に細胞が貫通孔から落下して逸脱する恐れはない。また
、マトリックス面に表皮細胞を増殖重層化して得られた
培養皮膚を皮膚の欠損部に移植した後は、体内の栄養分
がこの貫通孔を通って表皮細胞層へ円滑に供給される利
点がある。

【００１０】更に、マトリックスの表面はゲル状のアテ
ロコラ−ゲン５により被覆されているので、マトリック
ス面への線維芽細胞層及び表皮細胞の接着が極めて良好
であるため、作製された培養皮膚を移植した場合、培養
皮膚の生着率を著しく向上させることができる。なお、
コラ−ゲンスポンジを骨格とするシ−ト２の架橋は紫外
線の照射による部分的分子間架橋のため、培養皮膚移植
後の比較的早い時期にシ−ト２が消失し、分解反応に伴
う炎症反応が早期に終息する利点がある。なお、上記と
同様の方法で、コラ−ゲンスポンジ骨格の貫通孔及び表
面をゲル状フイブリンで被覆したものも培養皮膚のマト
リックスとして有効である。更に、播種した細胞のマト
リックスへの接着を促進するために、ゲル状のコラ−ゲ
ン又はフイブリンで被覆した表面に、細胞接種因子であ
るフイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等をコ
−トしたものは、培養皮膚のマトリックスとして極めて
有効である。

【００１１】以上のようにして作製された本発明のマト
リックスを用いて培養皮膚を作製するには、先ず皮膚片
を周知の方法により処理して表皮と真皮を剥離し、真皮
の結合組織を分解して線維芽細胞を採取し、一方表皮か
ら表皮細胞を採取して夫々培養する。本発明のマトリッ
クスの片面に線維芽細胞を所定の濃度で播種し、周知の
方法により培養するとマトリックス面に線維芽細胞の単
層が形成される。次いで、マトリックスを裏返し、その
上に予め増殖させた表皮細胞を所定の濃度で播種し、周
知の方法により培養すると重層化した表皮細胞層がマト
リックス上に形成された培養皮膚が作製される。

【００１２】上記方法で得られた培養皮膚を、例えばヌ
−ドマウス皮膚の欠損部に移植し、抗菌剤を含有するポ
リウレタン膜で被覆し、更に包帯で被覆し、時間の経過
に伴う生着状態を観察したところ、移植後２週間後には
創面は乾燥し、創面での拘縮は認められず、またマトリ
ックスは完全に消失し、時間の経過と共に表皮細胞層の
重層化が認められた。更に、４週間後の組織の観察結果
によれば、表皮細胞の角化が進みほぼ完全な表皮と真皮
類似層が再建されていた。

【００１３】

【実施例】以下本発明を実施例について更に詳細に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限りこれ等の実施
例に限定されるものではない。

【００１４】実施例１ 培養皮膚用マトリックスの作製：牛皮由来のコラ−ゲン
を酵素処理して調製したアテロコラ−ゲン（高研社製）
の１％水溶液をｐＨ４に調整し、ホモジナイザ−で１５
０００ｒｐｍで３分間攪拌してクリ−ム状とした。予め
０．５％のアテロコラ−ゲン水溶液（ｐＨ４）０．５ｍ
ｌを底面に塗布して風乾させたポリスチレン容器（６ｃ
ｍ×９．５ｃｍ）に、上記クリ−ム状の溶液１５ｍｌを
流し込みアンモニア雰囲気下に１時間静置してゲル化さ
せた。次いで充分に水洗した後、−７０℃で急速凍結さ
せ真空乾燥してシ−ト状のスポンジを作製した。

【００１５】１５Ｗの紫外線ランプを用いて上記シ−ト
状スポンジの両面に１５ｃｍの距離で紫外線を夫々１時
間ずつ照射して部分的に分子間架橋を導入した後、直径
０．５ｍｍの貫通孔を４ｍｍ間隔で窄設した。ついでこ
のシ−トをポリスチレン容器に入れ、エチレンオキシド
ガスにより滅菌し、Ｈａｎｋ’ｓ溶液（緩衝液）で洗浄
し気泡を除去した後、０．２％の組織培養用タイプＩの
アテロコラ−ゲン中性Ｈａｎｋ’ｓ溶液［高研社ＣＥＬ
ＬＧＥＮ（登録商標）］を２ｍｌ添加し、３７℃で２時
間インキュベ−タ中に靜置してゲル化させて、貫通孔内
及びシ−ト表面がゲル状アテロコラ−ゲンで被覆された
本発明の培養皮膚用マトリックスを得た。

【００１６】実施例２ 実施例１において使用した組織培養用タイプＩのアテロ
コラ−ゲン中性溶液２ｍｌの代りに、１ｍＭのエチレン
ジアミン４酢酸ナトリウムを含有させた血液を２００　
ｒｐｍで遠沈させて得た血清２ｍｌを使用し、これを実
施例１と同一のシ−ト状スポンジに添加し、０．１ｍＭ
の塩化カルシウム水溶液を加えて３７℃で２時間インキ
ュベ−タ中に靜置してゲル化させて、貫通孔内及びシ−
ト表面がゲル状のフイブリンで被覆された本発明の培養
皮膚用マトリックスを得た。

【００１７】参考例１ 培養皮膚の作製と移植試験：実施例１の方法により作製
したマトリックスを予めＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’
ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ
）＋１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）培地で置換した。ポリ
スチレン容器に入れた上記マトリックス（６ｃｍ×９．
５ｃｍ）上にラットの皮膚片から採取した線維芽細胞を
２×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、ＤＭ
ＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地を用いインキュベ−タ−内で３
７℃で２日間培養した。このマトリックスを裏返して培
地を除去し、同一の皮膚片から採取した表皮細胞を、２
×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、表皮細
胞増殖培地を用いインキュベ−タ−内で３７℃で７日間
培養して培養皮膚を作製した。この培養皮膚はｉｎｖｉ
ｔｒｏでは観察では表皮細胞が３〜４層に重層化してい
た。

【００１８】上述の方法により作製した培養皮膚をヌ−
ドマウスの背部皮膚全層欠損層（２×３ｃｍ）に移植し
、この上をゲンタマイシン（抗菌剤）を含有するポリウ
レタン膜で被覆し、更にガ−ゼをのせ弾性包帯で固定し
、時間の経過に伴う生着状態を観察した。移植２週間後
には、肉眼的には創面は乾燥しており、浸出液の貯留は
認められず、創面での拘縮も認められなかった。またマ
トリックスは完全に消失していた。更に表皮細胞の重層
化が増大し５〜８層の表皮細胞層が観察された。移植４
週間後の組織を観察すると、表皮細胞の角化が進み、ほ
ぼ完全な表皮と真皮類似層が再建されていた。なお、実
施例１の方法により作製したマトリックスの代りに、実
施例２の方法で作製したマトリックスを用いて上記と同
様に培養皮膚を作製し、同様に移植した場合もほぼ同等
の結果が得られた。

【００１９】

【発明の効果】本発明の培養皮膚用マトリックスは、マ
トリックス上で細胞を培養する際に、細胞を効率よく接
着することができ、また表皮細胞をマトリックス上に重
層化して得た培養皮膚を、皮膚の欠損部に移植した後は
、体内の栄養分を表皮細胞層へ円滑に供給して培養皮膚
の生着率を著しく向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の培養皮膚用マトリックスの一例の垂直
断面略図である。

【図２】図１に示す培養皮膚用マトリックスを構成する
コラ−ゲンスポンジを骨格とするシ−トの垂直断面略図
である。

【符号の説明】

１　　培養皮膚用マトリックス ２　　コラ−ゲンスポンジを骨格とするシ−ト３　　シ
−ト２に設けた貫通孔 ４　　貫通孔３内のゲル状コラ−ゲン又はフイブリン５
　　シ−ト２の表面を被覆するゲル状コラ−ゲン又はフ
イブリン

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　複数個の貫通孔を設けたコラ−ゲンス
   ポンジを骨格とするシ−トを、ゲル状の生体繊維状高分
   子材料で被覆してなる培養皮膚用マトリックス。
2. 【請求項２】　　ゲル状の生体繊維状高分子材料がコラ
   −ゲン及びフイブリンから選ばれる請求項１記載の培養
   皮膚用マトリックス。
3. 【請求項３】　　ゲル状のコラ−ゲンがアテロコラ−ゲ
   ンである請求項２記載の培養皮膚用マトリックス。
4. 【請求項４】　　複数個の貫通孔を設けたコラ−ゲンス
   ポンジを骨格とするシ−トを、ゲル状の生体繊維状高分
   子材料で被覆し、更にその表面を細胞接着因子で被覆し
   てなる培養皮膚用マトリックス。
5. 【請求項５】　　細胞接着因子がフイブロネクチン、ビ
   トロネクチン及びラミニンから選ばれる請求項４記載の
   培養皮膚用マトリックス。