CN110141681B - 细胞悬液移植用创面修复材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞悬液移植用创面修复材料及其制备方法，所述创面修复材料包括胶原基层，所述胶原基层由三维多孔的胶原海绵经压片处理制得，所述胶原海绵由包括胶原基复合液的原料经交联处理制得，所述胶原基复合液包括I型胶原蛋白和复合料，所述复合料为弹性蛋白或阴离子粘多糖。本发明的细胞悬液移植用创面修复材料中胶原基层可作为表皮细胞粘附、增值和迁移的支撑支架，为创面愈合提供适合的微环境，该创面修复材料联合自体表皮细胞悬液可快速封闭供皮区、大面积烧伤患者浅度烧伤创面和慢性皮肤溃疡浅层创面，在细胞悬液移植中具有较好的应用前景。

Description

细胞悬液移植用创面修复材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学创面修复技术领域，尤其是涉及一种细胞悬液移植用创面修复材料及其制备方法。
背景技术
为解决大面积烧伤患者自体皮来源短缺的问题，多年来运用网状植皮、邮票植皮、小皮片移植及微粒皮移植等技术来扩大皮肤覆盖面积，但这些方法皮肤扩增面积仍然有限。随着组织工程技术的发展，近年来又兴起了表皮细胞培养和移植技术，但细胞膜片的机械性能差，对操作者水平要求较高，且与创面粘附性差，培养周期长，这大大限制了其临床应用范围。非培养的自体表皮细胞悬液制备简便，能够迅速应用于创面修复，扩展比例大，在一定程度上能解决自体皮源紧缺的问题，且无需特殊的实验技术人员及器械，由临床医生操作即可，费用较低，临床应用前景较好。目前，表皮细胞悬液移植方法有一步法和两步法。两步法是指先在创面上移植胶原膜或脱细胞真皮基质，待其血管化后再进行细胞悬液的移植。两步法移植相对可靠，但两次移植间隔周期长。一步法即为将细胞悬液直接移植至创面，操作简便，省时省力。然而，单纯表皮细胞悬液一步法移植流动性大，不能很好地局限于创面并在创面上均匀分布，且移植后的表皮细胞也可能因摩擦而出现脱落，从而不能最大地发挥作用，最终影响创面愈合的速率和质量。所以要寻找一种合适的覆盖物，为表皮细胞移植提供机械支撑和适宜的微环境，从而达到快速恢复皮肤连续性的目的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种细胞悬液移植用创面修复材料及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种细胞悬液移植用创面修复材料，包括胶原基层，所述胶原基层由三维多孔的胶原海绵经压片处理制得，所述胶原海绵由包括胶原基复合液的原料经交联处理制得，所述胶原基复合液包括I型胶原蛋白和复合料，所述复合料为弹性蛋白或阴离子粘多糖。胶原海绵经压片处理后得到的胶原基层轻而薄，仍保持较高的吸收容量，可充分吸收渗液减少感染几率。经压片处理后，胶原基层抗拉性能得到很大程度的提高，使其既具有保护性能，又具有贴合性能。最重要的是，胶原海绵压片后，其表观形貌更利于表皮细胞的粘附、增值和迁移，从而能够缩短胶原基层下方细胞融合时间，进而促进创面更早地闭合。所述创面修复材料中的胶原基层可以直接覆盖于创面，与表皮细胞悬液直接接触吸附，同时因胶原基层纵向结构的压缩又不会过分吸附，细胞仍可与创面相接触从而上皮化。
在一些优选的实施例中，所述交联处理为热交联处理，在100～120℃、真空条件下进行热交联处理。
优选地，所述I型胶原蛋白来源于动物跟腱、尾腱、真皮、骨骼、韧带、角膜中的一种。
优选地，所述阴离子粘多糖(anionic polysaccharide)为海藻酸钠、肝素钠、硫酸软骨素、透明质酸中的至少一种。胶原在酸性溶液中带正电荷，而阴离子粘多糖带负电荷，两类物质在酸性溶液中通过分子间的氢键和静电相互作用发生复合作用，其中静电相互作用主要是阴离子粘多糖电离的羧基或硫酸基与胶原蛋白中赖氨酸的ε-氨基或精氨酸的胍基之间的静电相互作用，通过上述复合作用能够增强胶原蛋白的力学强度和抗降解能力。
优选地，所述胶原基层的孔径为10～100μm，进一步优选所述胶原基层的孔径为10～50μm。
优选地，该细胞悬液移植用创面修复材料还包括硅橡胶层。单纯胶原蛋白海绵孔隙较大、易降解，易引起创面干燥和外部细菌入侵，进而易引起创面感染，最终导致植皮存活率低等问题。因此，创面修复材料在使用时胶原基层上一般会设置有敷面结构，优选敷面结构为硅橡胶层，一方面给胶原基层提供有效地力学支撑，另一方面可有效地保护创面、预防感染和透气保湿。使用过程中待胶原基层完全降解后，揭除硅橡胶层即可实现创面的完全封闭。
进一步地，所述硅橡胶层的水蒸气透过率为1.0～2.5mg·cm-2·h-1。该硅橡胶层可发挥屏障作用，兼顾了透气、阻菌。
进一步地，所述硅橡胶层还设置有若干贯穿孔，若干所述贯穿孔的孔径为0.25～2mm，孔间距为2～8mm。在硅橡胶层上打孔能够有效地促进渗液的排出。
在一些优选的实施例中，硅橡胶层的厚度为60～150μm。
本发明还提供一种上述的细胞悬液移植用创面修复材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取I型胶原蛋白溶于溶剂得到胶原蛋白溶液；
(2)在所述胶原蛋白溶液中加入弹性蛋白或阴离子粘多糖得到胶原基复合液；
(3)取所述胶原基复合液，冷冻干燥，后进行交联处理和压片。
优选地，步骤(3)具体为：取所述胶原基复合液，冷冻干燥，后进行交联处理得到胶原海绵；取或制备硅橡胶，将所述胶原海绵与硅橡胶进行粘合和压片。此步骤中可以采用将交联处理得到的胶原海绵与硅橡胶进行粘合后再进行压片，也可以采用将交联处理后得到的胶原海绵进行压片后再与硅橡胶进行粘合。经该步骤处理后，胶原基面局部仍较为粗糙，利于表皮细胞的粘附固定，能够防止表皮细胞悬液流失；此外，经压片之后，胶原基层的纵向贯穿结构被很大程度地压缩，致使整个胶原基面又相对较为平整，利于表皮细胞向四周横向增值迁移，而不是沿着支架的纵向孔贯穿长入，适用于表皮细胞悬液一步法移植。
在一些优选的实施例中，步骤(3)中压片时的压力为4～25MPa。
在一些优选的实施例中，经上述制备步骤后，胶原基层的厚度为50～500μm；吸收容量为20～80倍；在体内降解时间为5～10天；拉伸强度为0.06MPa～14MPa。
优选地，步骤(2)中胶原基复合液中，弹性蛋白的加入量为2～8wt％，阴离子粘多糖的加入量为2～15wt％。
优选地，步骤(1)中胶原蛋白溶液的pH为3.2～4.8。
优选地，步骤(1)中胶原蛋白溶液中I型胶原蛋白的质量分数为0.25～0.55wt％。
上述的创面修复材料或由上述方法制备的创面修复材料在细胞悬液移植中具有较好的应用前景，譬如可以应用在供皮区、大面积烧伤患者浅度烧伤创面、慢性皮肤溃疡浅层创面等创伤面进行细胞悬液一步法移植的场景中。此外，该创面修复材料也可用于烧伤创面切痂后的临时覆盖。
本发明的有益效果是：
细胞悬液可联合创面修复材料一步法移植使用，使表皮细胞在创面继续增殖，既缩短了创面闭合时间，也减少了表皮细胞体外培养时间。而为了解决单纯表皮细胞悬液移植流动性大，不能在创面均匀分布从而影响治疗过程的问题，作为自体表皮细胞悬液的覆盖物，既要具备一定的生物活性，与创面紧密连接，妥善固定表皮细胞；又要能够覆盖适宜的时间，为表皮细胞的成活提供合适的微环境，还要能为增值的表皮细胞提供扩展空间，不能形成明显的占位效应。本发明提供一种细胞悬液移植用创面修复材料，经压片处理后形成的胶原基层保持有较高的吸收容量，抗拉强度得到了很大程度地提高，压片后形成的胶原基层的微观形貌更有利于表皮细胞的粘附、增值和迁移，从而显著降低了细胞融合时间，并且，体内降解时间与细胞融合时间相适宜。
此外，本发明在创面修复材料中引入阴离子粘多糖，能够与胶原共沉淀得到具有立体网状结构的多孔胶原基层，还能够实现以下目的：1、调节降解速率。虽然可通过控制胶原蛋白的交联程度来调节胶原的降解速率，但高度交联的胶原蛋白是一个硬而脆的物质，不利于临床使用，通过共沉淀的方法引入阴离子粘多糖能够使得制备得到的胶原基层具有更强的抗降解能力，使其具有与表皮细胞悬液增殖相适宜的降解速率，及时为表皮细胞增殖提供扩展空间。2、改善胶原基层的力学强度。胶原和阴离子粘多糖形成的复合物具有更高的弹性模量和断裂能，能够在降解过程中仍具有足够的力学强度，并且利于表皮细胞粘附增值过程中，胶原基敷料支架支撑作用得以保持。3、优化孔结构。胶原和阴离子粘多糖复合形成的胶原基层比单纯的胶原膜具有更显著的孔贯通结构。而在创面修复材料中引入弹性蛋白，则能够减少伤口愈合早期肉芽组织的形成，并减少伤口挛缩。
另外，本发明在创面修复材料中还可引入弹性蛋白，一方面，弹性蛋白可提高胶原材料的顺应性和抗拉强度；另一方面，可同时发挥两种天然高分子材料各自的优势，更好地促进细胞粘附、生长及增值；最为重要的是，弹性蛋白的存在可减少伤口愈合早期肉芽组织的形成，还可减少肌成纤维细胞的表达，继而减少伤口挛缩，最终提高创面修复的质量。
本发明的创面修复材料中胶原基层能够与创面紧密贴附，吸收渗液，细胞悬液可以被胶原基层吸附而达到固定及均匀分布的目的，胶原基层可作为表皮细胞粘附、增值和迁移的支撑支架，为创面愈合提供适合的微环境，该创面修复材料联合表皮细胞悬液可一步法快速封闭供皮区、大面积烧伤患者浅度烧伤创面和慢性皮肤溃疡浅层创面。
附图说明
图1为实施例1创面修复材料中胶原基层、硅橡胶层表观形貌以及创面修复材料截面的SEM图；
图2为效果实施例中HaCaT细胞接种于未压片支架和压片支架4d后SEM图差异性对比。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种创面修复材料，按以下步骤制备：将I型胶原蛋白水溶，配制50gpH为4.68、质量分数为0.35wt％的胶原蛋白水溶液。将4.86mL、3.6mg/mL的硫酸软骨素水溶液缓慢滴加到上述胶原蛋白水溶液中，得到质量投料比为10:1的胶原基复合液，其中硫酸软骨素的加入量为9.09wt％。将上述胶原基复合液分装后，于4℃、8000rpm转速下冷冻离心10min，得到半透明的凝胶状沉淀，用上清液稀释至25.5g。将稀释后的凝胶状沉淀转移至铝制模具中，并刮平，于-60℃超低温冰箱预冷后转移至-50℃冻干机冷冻干燥18h。取出后，转移至真空度为-0.1MPa、温度为120℃的真空干燥箱中，进行脱水热交联处理24h，得到厚度为2.4mm、面密度为2.35mg/cm2、孔隙率为97％的胶原海绵。
采用CO2激光打孔技术，在厚度为0.12mm、水蒸气透过率为2mg·cm-2·h-1的医用硅橡胶上制备等距离排列的贯穿圆孔，孔径大小为0.5mm、孔间距为5mm。
用硅凝胶将上述胶原海绵和医用打孔硅橡胶黏合在一起，待黏合紧密后，将其转移至压片机进行压片，压力大小为10MPa，制成厚度为320mm、孔径为20～80um、吸收容量为40倍、拉伸强度为9.36MPa的胶原基层-硅橡胶层活性创面修复材料。
对上述制备的创面修复材料中胶原基层、硅橡胶层以及创面修复材料的截面进行SEM观察，如图1所示：其中，a表示胶原基层，整个表面较为粗糙，利于表皮细胞的粘附固定，以防表皮细胞悬液流失；此外，经压片之后，胶原海绵的纵向贯穿结构被很大程度地压缩，致使整个胶原基层面又相对较为平整，利于表皮细胞向四周横向增值迁移，而不是沿着支架的纵向孔贯穿长入。b表示硅橡胶层，贯穿圆孔清晰可见，而周边较为致密，透过贯穿圆孔，可见胶原基面的多孔结构，这些孔隙利于创面渗液的排出。c表示创面修复材料的截面，可清晰观察到胶原基层和硅橡胶层，而胶原基层由片层的胶原紧密堆叠在一起，一方面可防止胶原海绵因孔隙较大引起创面干燥，另一方面也如图1中a所述，利于引导表皮细胞沿着胶原基表面铺展开来。总之，胶原海绵与硅橡胶压片之后，形成的胶原基层利于表皮细胞的粘附、增值和迁移，而硅橡胶层可以透气阻菌，并利于渗液的排出。
创面修复实验：以SD大鼠背部全层皮缺损创面为模型，制备大小为2cm×2cm的创面，采用同体对照。用Recel技术制备自体表皮细胞悬液，稀释至1.0×105个/cm2。其中试验组处理方式：创面喷淋自体细胞悬液，并同步覆盖上述胶原基层-硅橡胶层活性创面修复材料，再覆盖凡士林纱布和普通医用纱布，最后用网状绷带打包固定；对照组处理方式：创面单纯喷淋自体细胞悬液，再覆盖凡士林纱布和普通医用纱布，最后用网状绷带打包固定。手术后3d观察创面，7d后处死，对比观察创面愈合情况。实验结果显示：术后3d，试验组手术部位明显可见浸润的胶原蛋白膜-硅橡胶活性创面修复材料；对照组创面裸露。术后7d处死的大鼠，试验组揭除硅橡胶层，胶原基层未明显可见，创面上形成薄薄的透明上皮，创面未见明显挛缩；对照组创面肉芽化，创面明显挛缩。本发明实施例的创面修复材料孔径大小为20～100um，利于表皮细胞粘附，在表皮细胞增殖和迁移过程中起到支撑作用，并且具有很好的吸收渗液的能力，吸收容量达40倍。硅橡胶打孔利于渗液排出，进一步促进自体表皮细胞的粘附，在细胞悬液的一步法移植中具有较好的效果。
本发明实施例的创面修复材料既保留了传统胶原蛋白海绵覆盖物用作医用创面敷料的优势，如生物相容性好、低免疫原性、可生物降解、能为表皮细胞的迁移及增殖提供支架等，又克服了传统胶原蛋白海绵创面易干燥、细菌易入侵等缺点。更重要的是，可根据临床需要，通过阴离子粘多糖或弹性蛋白的加入、胶原基干态海绵的重量及胶原基层厚度的控制调整其降解速率，制备不同厚度、面密度、吸收容量的胶原基层。
实施例2
本实施例提供一种创面修复材料，按以下步骤制备：取I型胶原蛋白水溶后配制pH为3.2、质量分数为0.55wt％的50g胶原蛋白水溶液。在上述胶原蛋白水溶液中缓慢滴加α-弹性蛋白水解液得到胶原基复合液，其中α-弹性蛋白的加入量为8wt％。将上述胶原基复合液转移至铝制模具中，并刮平，于-60℃超低温冰箱预冷后转移至-50℃冻干机冷冻干燥18h。取出后，转移至真空度为-0.1MPa、温度为105℃的真空干燥箱中，进行脱水热交联处理24h，得到厚度为2mm、面密度为1.95mg/cm2、孔隙率为98％的胶原海绵。
采用CO2激光打孔技术，在厚度为0.06mm、水蒸气透过率为2.5mg·cm-2·h-1的医用硅橡胶上制备等距离排列的贯穿圆孔，孔径大小为2mm、孔间距为8mm。
用硅凝胶将上述胶原海绵和医用打孔硅橡胶黏合在一起，待黏合紧密后，将其转移至压片机进行压片，压力大小为10MPa，制成厚度为265μm、孔径为20～100um、吸收容量为60倍、拉伸强度为11.97MPa的胶原基层-硅橡胶层活性创面修复材料。
将本实施例中制得的创面修复材料进行和实施例1中相同的创面修复实验，术后7d处死的大鼠，试验组揭除硅橡胶层，胶原基层未明显可见，创面上形成薄薄的透明上皮，创面未见明显挛缩。
效果实施例
本实施例取实施例1中制备的胶原海绵，对比研究胶原海绵压片前后表观形貌的差异对细胞粘附、增值和迁移的影响。本实施例试验中胶原海绵压片前记为未压片支架，压片后记为压片支架，具体试验步骤如下：(1)将未压片支架和压片支架制成直径为6mm的圆孔，紫外照射灭菌30min；(2)将灭菌的支架放入96孔板中，每孔加入100μL DMEM完全培养基，真空干燥箱中脱泡，吸去孔中的剩余培养基；(3)消化人永生化表皮细胞(HaCaT细胞)，计数，将细胞稀释成9×104个/mL，每孔取100μL接种于支架粗糙面，细胞接种密度为3.2×104个/cm2；(4)置于二氧化碳培养箱中培养，隔天换液；(5)分别于1d、3d、4d取出材料，PBS清洗后于4％甲醛溶液中室温固定2h，浓度为60％、70％、80％、90％、100％、100％的梯度酒精分别脱水5min后，真空干燥箱干燥过夜，制样用于SEM观察。
HaCaT细胞接种1d后电镜显示：压片支架随处可见零零散散黏附的细胞，但未见细胞的大量聚集，且细胞形态大多呈圆球型；而未压片支架只有局部可见少量圆球型细胞散落分布。HaCaT细胞接种3d后电镜显示，在压片支架上大部分区域可见HaCaT细胞已融合成片，但仍有部分尚未汇合的区域，多位于压片支架明显凸起部分；而未压片支架表面大部分区域仍未见细胞聚集。HaCaT细胞接种4d后SEM如图2所示：其中，a为未压片支架未接种细胞的空白对照放大200倍，支架为多孔结构，孔洞深且大，孔壁呈薄片状；b为压片支架未接种细胞的空白对照放大200倍，支架表面整体较为平整，局部来看又较为粗糙，未见明显深且大的孔洞；c、e分别为未压片支架接种HaCaT细胞4d后放大250倍和放大2000倍，可见局部细胞融合成片，但多处仍未见HaCaT细胞形成明显集落，支架孔洞处尤为显著；d、f分别为压片组接种HaCaT细胞4d后放大250倍和放大2000倍，HaCaT细胞与支架紧密黏附，基本在支架表面融合成片，呈铺路石样，可见活力较强的细胞伸出伪足。这说明当细胞接种密度为3.2×104个/cm2时，压片处理得到的胶原基层4天即可达到较好的细胞融合效果，相比未压片的胶原海绵，显著降低了细胞融合时间，利于表皮细胞的粘附、增值和迁移，进而利于创面的快速闭合，在细胞悬液移植中具有较好的应用前景。

Claims (10)

1.一种细胞悬液移植用创面修复材料，其特征在于，包括胶原基层，所述胶原基层由三维多孔的胶原海绵经压片处理制得，所述胶原海绵由包括胶原基复合液的原料经交联处理制得，所述胶原基复合液包括I型胶原蛋白和复合料，所述复合料为弹性蛋白或阴离子粘多糖；所述压片的压力为4～25MPa；所述胶原基层的孔径为10~100μm；所述胶原基层在体内降解时间为5~10天；拉伸强度为0.06MPa~14MPa；所述弹性蛋白的加入量为2~8wt%，所述阴离子粘多糖的加入量为2~15wt%。
2.根据权利要求1所述的细胞悬液移植用创面修复材料，其特征在于，所述阴离子粘多糖为海藻酸钠、肝素钠、硫酸软骨素、透明质酸中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的细胞悬液移植用创面修复材料，其特征在于，所述胶原基层的孔径为10~50μm。
4.根据权利要求1所述的细胞悬液移植用创面修复材料，其特征在于，所述胶原基层吸收容量为20~80倍。
5.根据权利要求1-4任一项所述的细胞悬液移植用创面修复材料，其特征在于，还包括硅橡胶层。
6.根据权利要求5所述的细胞悬液移植用创面修复材料，其特征在于，所述硅橡胶层的水蒸气透过率为1.0~2.5mg·cm-2·h-1。
7.根据权利要求5所述的细胞悬液移植用创面修复材料，其特征在于，所述硅橡胶层还设置有若干贯穿孔，若干所述贯穿孔的孔径为0.25~2mm，孔间距为2~8mm。
8.权利要求1-7任一项所述的细胞悬液移植用创面修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取I型胶原蛋白溶于溶剂得到胶原蛋白溶液；
（2）在所述胶原蛋白溶液中加入弹性蛋白或阴离子粘多糖得到胶原基复合液；
（3）取所述胶原基复合液，冷冻干燥，后进行交联处理和压片；
所述压片的压力为4～25MPa。
9.根据权利要求8所述的细胞悬液移植用创面修复材料的制备方法，其特征在于，步骤（3）具体为：取所述胶原基复合液，冷冻干燥，后进行交联处理得到胶原海绵；取或制备硅橡胶，将所述胶原海绵与硅橡胶进行粘合和压片。
10.根据权利要求8所述的细胞悬液移植用创面修复材料的制备方法，其特征在于，步骤（2）中胶原基复合液中，弹性蛋白的加入量为2~8wt%，阴离子粘多糖的加入量为2~15wt%。
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