JP2023078307A - 創傷治癒薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】創傷治癒の促進に使用するためのD-デオキシリボース糖を提供する。【解決手段】D-デオキシリボース糖であって、前記糖が、担体中に用意され、前記担体が生体適合性マトリックス材料またはヒドロゲルである、D-デオキシリボース糖、並びに該D-デオキシリボース糖を含む生体適合性マトリックス材料を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、一般に、皮膚および毛の回復の分野に関する。より詳細には、本発明は、創
傷治癒、血管新生(angiogenesis)、血管化(vascularisati
on)、および毛の再成長を促進する化学組成物の用途に関する。
傷治癒、血管新生(angiogenesis)、血管化(vascularisati
on)、および毛の再成長を促進する化学組成物の用途に関する。
創傷床における血管新生を促進する方法を検討する多くの研究がある。全ての血管新生
因子の中で、生体材料の開発に一般的に用いられる最も強力な因子は、血管内皮成長因子
(VEGF)である(Zhang et al., Biomaterials. 20
15; Miyagi et al., Biomaterials. 2011; K
hojasteh et al., Materials Science and E
ngineering: C. 2016; Johnson et al., Adv
ances in Wound Care. 2014)。この成長因子は、組換え技術
によって産生され得、多くの研究において批判的に調査されてきた(Neufeld e
t al., The FASEB journal. 1999; Long et
al., Journal of theoretical biology. 201
3; Xin et al., Cell. 2016)。しかしながら、成長因子が単
独で加えられると、急速に分解または希釈されて洗い流されるため、結果は概して期待外
れであった。より最近の戦略は、生体材料に結合したVEGFを送達するものとなった。
生体材料は、ヒドロゲル、足場、または粒子が挙げられる種々の形態をとることができる
(Chiu et al., Biomaterials. 2010; Cakir-
Ozkan et al., Journal of Oral and Maxill
ofacial Surgery. 2017; Zhang et al., ACS
Biomaterials Science & Engineering. 201
6; Zhao et al., Advanced healthcare mate
rials. 2016)。
因子の中で、生体材料の開発に一般的に用いられる最も強力な因子は、血管内皮成長因子
(VEGF)である(Zhang et al., Biomaterials. 20
15; Miyagi et al., Biomaterials. 2011; K
hojasteh et al., Materials Science and E
ngineering: C. 2016; Johnson et al., Adv
ances in Wound Care. 2014)。この成長因子は、組換え技術
によって産生され得、多くの研究において批判的に調査されてきた(Neufeld e
t al., The FASEB journal. 1999; Long et
al., Journal of theoretical biology. 201
3; Xin et al., Cell. 2016)。しかしながら、成長因子が単
独で加えられると、急速に分解または希釈されて洗い流されるため、結果は概して期待外
れであった。より最近の戦略は、生体材料に結合したVEGFを送達するものとなった。
生体材料は、ヒドロゲル、足場、または粒子が挙げられる種々の形態をとることができる
(Chiu et al., Biomaterials. 2010; Cakir-
Ozkan et al., Journal of Oral and Maxill
ofacial Surgery. 2017; Zhang et al., ACS
Biomaterials Science & Engineering. 201
6; Zhao et al., Advanced healthcare mate
rials. 2016)。
MacNeilのグループを含むいくつかのグループは、材料に結合したヘパリンから
VEGFを送達しようとしてきた。なぜなら、ヘパリンは、体内で創傷内に高濃度にて存
在する天然のグリコサミノグリカンであり、VEGFおよび他の血管新生促進因子に結合
するように作用するためである(Wu et al., Biomacromolecu
les. 2016; Gigliobianco et al., Journal
of biomaterials applications. 2015)。ゆえに、
MacNeilのグループは、ヘパリンを、静電的にヒドロゲルに(Gilmore e
t al., Biotechnology and bioengineering.
2013)、または電界紡糸足場の層ごとのコーティング内に固定化できる材料を開発
してきた(Gigliobianco et al., Journal of bio
materials applications. 2015; Easton et
al., Journal of Materials Chemistry B. 2
014). In vivo heparin binds and releases
VEGF and other pro-angiogenic mitogens
(Ferrara N et al., Nature medicine. 2003
)。VEGFは、正常組織および腫瘍組織の双方において内皮細胞の増殖および移動を活
性化して、新しい血管の急速な生成をもたらす(Harmey JH. Springe
r Science & Business Media; 2004; Hickli
n et al., Journal of clinical oncology.
2005)。したがって、血管新生が必要とされる材料の調製、例えば、全層熱傷の処置
のための合成真皮の調製において(Tan et al., Journal of t
issue engineering and regenerative medic
ine. 2014; Xie et al., Acta biomateriali
a. 2013; Guo R et al., Biomaterials. 201
1)、そして微小血管構造が損なわれる糖尿病性潰瘍等の慢性の非治癒性創傷における創
傷治癒を促進するために、VEGFの潜在性が調査されてきた。
VEGFを送達しようとしてきた。なぜなら、ヘパリンは、体内で創傷内に高濃度にて存
在する天然のグリコサミノグリカンであり、VEGFおよび他の血管新生促進因子に結合
するように作用するためである(Wu et al., Biomacromolecu
les. 2016; Gigliobianco et al., Journal
of biomaterials applications. 2015)。ゆえに、
MacNeilのグループは、ヘパリンを、静電的にヒドロゲルに(Gilmore e
t al., Biotechnology and bioengineering.
2013)、または電界紡糸足場の層ごとのコーティング内に固定化できる材料を開発
してきた(Gigliobianco et al., Journal of bio
materials applications. 2015; Easton et
al., Journal of Materials Chemistry B. 2
014). In vivo heparin binds and releases
VEGF and other pro-angiogenic mitogens
(Ferrara N et al., Nature medicine. 2003
)。VEGFは、正常組織および腫瘍組織の双方において内皮細胞の増殖および移動を活
性化して、新しい血管の急速な生成をもたらす(Harmey JH. Springe
r Science & Business Media; 2004; Hickli
n et al., Journal of clinical oncology.
2005)。したがって、血管新生が必要とされる材料の調製、例えば、全層熱傷の処置
のための合成真皮の調製において(Tan et al., Journal of t
issue engineering and regenerative medic
ine. 2014; Xie et al., Acta biomateriali
a. 2013; Guo R et al., Biomaterials. 201
1)、そして微小血管構造が損なわれる糖尿病性潰瘍等の慢性の非治癒性創傷における創
傷治癒を促進するために、VEGFの潜在性が調査されてきた。
VEGFは血管新生を刺激するが、非常に高価であり(Sigma-Aldrichの
50μgに930ドル)、かつ不安定である(Simon-Yarza et al.,
Theranostics. 2012; Thompson et al., Ox
ford Textbook of Vascular Surgery: Oxfor
d University Press; 2016)。新しい血管の形成に関与する他
の血管新生促進成長因子が知られているが、低酸素状態に応じて生成かつ放出される因子
の複雑なカスケードが存在する。
50μgに930ドル)、かつ不安定である(Simon-Yarza et al.,
Theranostics. 2012; Thompson et al., Ox
ford Textbook of Vascular Surgery: Oxfor
d University Press; 2016)。新しい血管の形成に関与する他
の血管新生促進成長因子が知られているが、低酸素状態に応じて生成かつ放出される因子
の複雑なカスケードが存在する。
皮膚のバリア機能の喪失は、生命を脅かす虞がある(Chua et al., Bu
rns & trauma. 2016; Blais et al., Stem c
ells translational medicine. 2013)。第一選択処
置は通常、自己由来中間層皮膚移植の使用であるが、ひどく火傷した患者において、バリ
ア層の迅速な回復を達成するには、利用できる移植では不十分である(Yi et al
., Plastic and reconstructive surgery. 2
015)。当該分野での30年間の研究にも拘らず、全層創傷が30%を超える患者を管
理する際に外科医を支援するための機能的かつ費用対効果の高い永久皮膚代用品が未だ必
要とされている(Chua et al., Burns & trauma. 201
6)。
rns & trauma. 2016; Blais et al., Stem c
ells translational medicine. 2013)。第一選択処
置は通常、自己由来中間層皮膚移植の使用であるが、ひどく火傷した患者において、バリ
ア層の迅速な回復を達成するには、利用できる移植では不十分である(Yi et al
., Plastic and reconstructive surgery. 2
015)。当該分野での30年間の研究にも拘らず、全層創傷が30%を超える患者を管
理する際に外科医を支援するための機能的かつ費用対効果の高い永久皮膚代用品が未だ必
要とされている(Chua et al., Burns & trauma. 201
6)。
火傷が全身の表面積の30%または40%超に及ぶ場合、火傷外科医は、天然材料およ
び合成材料を用いて、直ちに創傷を覆って、真皮および表皮の双方の最終的な置換を支援
しようとすることとなる(Sharma et al., Burns. 2014)。
創傷床上に首尾よく「載る」こととなる分層植皮片(表皮の全て、および真皮の一部を含
有する)と同等の組織工学的材料を製造することは、技術的に非常に難しいままである(
Bottcher-Haberzeth et al., Burns. 2010)。
主な課題は、ラボでの材料の製造ではなく(Boyce et al参照)、創傷床上で
の生着に耐える組織工学的材料にあり、そのためには基礎をなす創傷床からの新しい血管
の急速な内方成長が必要とされる(Boyce et al., Annals of
surgery. 2002; Supp et al., Clinics in d
ermatology. 2005)。実際問題として、移植片の生存は、内在するいか
なる血管構造も欠く組織工学的材料中への、基礎をなす創傷床からの新しい血管の成長に
完全に依存している(Laschke et al., Tissue enginee
ring. 2006; Hacker et al., Scientific re
ports. 2016)。
び合成材料を用いて、直ちに創傷を覆って、真皮および表皮の双方の最終的な置換を支援
しようとすることとなる(Sharma et al., Burns. 2014)。
創傷床上に首尾よく「載る」こととなる分層植皮片(表皮の全て、および真皮の一部を含
有する)と同等の組織工学的材料を製造することは、技術的に非常に難しいままである(
Bottcher-Haberzeth et al., Burns. 2010)。
主な課題は、ラボでの材料の製造ではなく(Boyce et al参照)、創傷床上で
の生着に耐える組織工学的材料にあり、そのためには基礎をなす創傷床からの新しい血管
の急速な内方成長が必要とされる(Boyce et al., Annals of
surgery. 2002; Supp et al., Clinics in d
ermatology. 2005)。実際問題として、移植片の生存は、内在するいか
なる血管構造も欠く組織工学的材料中への、基礎をなす創傷床からの新しい血管の成長に
完全に依存している(Laschke et al., Tissue enginee
ring. 2006; Hacker et al., Scientific re
ports. 2016)。
実際には、全層熱傷は通常、2段階で処置される(自家移植が不十分な場合)。血管化
された真皮代替物を提供するための材料が用いられてから、真皮が十分に血管化されてい
る場合、この上に(多くの場合、一旦治癒した最初のドナー部位から更なる皮膚移植片を
採取することによって、または血管化された真皮を覆って培養細胞を配置することによっ
て)薄い分層植皮片が配置される。血管化された真皮を提供するために最も一般的に用い
られる2つの材料は、この目的のために開発された生体材料、Integra、およびド
ナーの死体皮膚である(Nguyen et al., Burns. 2010; W
eigert et al., Journal of Hand Surgery (
European Volume). 2011; Cleland et al.,
Burns. 2014)。Integraは、サメコンドロイチン硫酸を有し、この上
にシリコン膜が結合されている、ウシコラーゲンの基質で構成されている(Chua e
t al., Burns & trauma. 2016)。火傷した組織を臨床的に
切除して、Integraを適所に配置してから、血管化するまでそのままにしておく。
これは多くの場合、3週間以上かかる。この時点で、外科医はシリコンバリア膜を取り外
して、その上に薄い分層植皮片を配置することができる。用いられる代替材料は、死体皮
膚である。これを用いて(火傷した組織を一旦切除して)創傷を直ちに覆って、バリア機
能を回復させることができる。その後、数週間以内に血管化されてから、ドナーの血管化
された真皮を適所に残しつつ、ドナーの表皮を穏やかに除去することができる。そして表
皮バリアを、患者由来の分層植皮片または患者から培養した表皮細胞と置換する(Mac
Neil,Nature.2007において考察されている)。しかしながら、これらの
材料は、運営が適切なスキンバンク(ドナー皮膚用)がないため、またはIntegra
の購入が高すぎると見られているため、世界中の火傷外科医が常に利用できるとは限らな
い。
された真皮代替物を提供するための材料が用いられてから、真皮が十分に血管化されてい
る場合、この上に(多くの場合、一旦治癒した最初のドナー部位から更なる皮膚移植片を
採取することによって、または血管化された真皮を覆って培養細胞を配置することによっ
て)薄い分層植皮片が配置される。血管化された真皮を提供するために最も一般的に用い
られる2つの材料は、この目的のために開発された生体材料、Integra、およびド
ナーの死体皮膚である(Nguyen et al., Burns. 2010; W
eigert et al., Journal of Hand Surgery (
European Volume). 2011; Cleland et al.,
Burns. 2014)。Integraは、サメコンドロイチン硫酸を有し、この上
にシリコン膜が結合されている、ウシコラーゲンの基質で構成されている(Chua e
t al., Burns & trauma. 2016)。火傷した組織を臨床的に
切除して、Integraを適所に配置してから、血管化するまでそのままにしておく。
これは多くの場合、3週間以上かかる。この時点で、外科医はシリコンバリア膜を取り外
して、その上に薄い分層植皮片を配置することができる。用いられる代替材料は、死体皮
膚である。これを用いて(火傷した組織を一旦切除して)創傷を直ちに覆って、バリア機
能を回復させることができる。その後、数週間以内に血管化されてから、ドナーの血管化
された真皮を適所に残しつつ、ドナーの表皮を穏やかに除去することができる。そして表
皮バリアを、患者由来の分層植皮片または患者から培養した表皮細胞と置換する(Mac
Neil,Nature.2007において考察されている)。しかしながら、これらの
材料は、運営が適切なスキンバンク(ドナー皮膚用)がないため、またはIntegra
の購入が高すぎると見られているため、世界中の火傷外科医が常に利用できるとは限らな
い。
脱毛はヒトにおいて一般的な症状であり、頭または体からの毛量の損失または減少によ
って特徴付けられる。いくつかの様々な症状が、脱毛を伴う場合がある。感染症、薬物、
外傷、および妊娠が挙げられるいくつかのタイプの脱毛の原因が知られているが、他のタ
イプの脱毛の原因は知られていないままである。一部の脱毛についての従来の治療法とし
て、薬物療法、例えばミノキシジルまたはフィナステリド等の薬物によるものが挙げられ
得る。用いられる別の治療法として、植毛手術があり、これは、毛のある体の部分から毛
繊維を有する毛包を収穫して、毛のない体の部分に毛包を移動させることを含む。
って特徴付けられる。いくつかの様々な症状が、脱毛を伴う場合がある。感染症、薬物、
外傷、および妊娠が挙げられるいくつかのタイプの脱毛の原因が知られているが、他のタ
イプの脱毛の原因は知られていないままである。一部の脱毛についての従来の治療法とし
て、薬物療法、例えばミノキシジルまたはフィナステリド等の薬物によるものが挙げられ
得る。用いられる別の治療法として、植毛手術があり、これは、毛のある体の部分から毛
繊維を有する毛包を収穫して、毛のない体の部分に毛包を移動させることを含む。
重度な火傷の管理において十分に血管化された真皮基質を提供するための新しく効果的
かつ手頃な価格の生体材料が必要とされている。重要な問題は、現在の材料はいずれも、
内在するいかなる血管構造も含有していないため、血管の内方成長が、基礎をなす創傷床
内の血管に完全に依存することである(Supp et al., Clinics i
n dermatology. 2005; Sahota et al., Woun
d repair and regeneration. 2003)。血管化を向上さ
せて、移植後の生存率を向上させ得る真皮基質が必要とされている。
かつ手頃な価格の生体材料が必要とされている。重要な問題は、現在の材料はいずれも、
内在するいかなる血管構造も含有していないため、血管の内方成長が、基礎をなす創傷床
内の血管に完全に依存することである(Supp et al., Clinics i
n dermatology. 2005; Sahota et al., Woun
d repair and regeneration. 2003)。血管化を向上さ
せて、移植後の生存率を向上させ得る真皮基質が必要とされている。
一態様において、本発明は、創傷治癒を促進するのに用いられるD-デオキシリボース
糖を提供し、糖が、担体内に用意され、担体が、生体適合性マトリックス材料またはヒド
ロゲルである。好ましくは、D-デオキシリボースが、2-デオキシリボースである。
糖を提供し、糖が、担体内に用意され、担体が、生体適合性マトリックス材料またはヒド
ロゲルである。好ましくは、D-デオキシリボースが、2-デオキシリボースである。
一実施形態において、担体が生分解性担体である。
一実施形態において、マトリックス材料が、電界紡糸された足場である。好ましくは、
電界紡糸された足場が、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(乳酸-
co-グリコール酸)(PLGA)、またはポリ(3-ヒドロキシブチラート-co-3
-ヒドロキシバレラート)PHBVの少なくとも1つを含む。
電界紡糸された足場が、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(乳酸-
co-グリコール酸)(PLGA)、またはポリ(3-ヒドロキシブチラート-co-3
-ヒドロキシバレラート)PHBVの少なくとも1つを含む。
一実施形態において、ヒドロゲルが架橋ヒドロゲルである。好ましくは、ヒドロゲルが
、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、
またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む。一実施形態において、ヒドロゲ
ルは、キトサンおよびコラーゲンを含む。加えて、ヒドロゲルが、ポリビニルアルコール
、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを
含んでよい。一実施形態において、ヒドロゲルが、キトサンおよびポリビニルアルコール
を含む。
、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、
またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む。一実施形態において、ヒドロゲ
ルは、キトサンおよびコラーゲンを含む。加えて、ヒドロゲルが、ポリビニルアルコール
、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを
含んでよい。一実施形態において、ヒドロゲルが、キトサンおよびポリビニルアルコール
を含む。
一実施形態において、担体が抗菌剤をさらに含む。
一実施形態において、創傷が慢性創傷である。
一実施形態において、創傷が全層創傷である。
一実施形態において、創傷が火傷である。
一態様において、本発明は、D-デオキシリボース糖を含む生体適合性マトリックス材
料を提供する。
料を提供する。
一実施形態において、マトリックス材料が、電界紡糸された足場である。好ましくは、
電界紡糸された足場が、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(乳酸-
co-グリコール酸)(PLGA)、またはポリ(3-ヒドロキシブチラート-co-3
-ヒドロキシバレラート)PHBVの少なくとも1つを含む。
電界紡糸された足場が、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(乳酸-
co-グリコール酸)(PLGA)、またはポリ(3-ヒドロキシブチラート-co-3
-ヒドロキシバレラート)PHBVの少なくとも1つを含む。
一態様において、本発明は、D-デオキシリボース糖を含むヒドロゲルを提供する。
一実施形態において、ヒドロゲルが架橋ヒドロゲルである。好ましくは、ヒドロゲルが
、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、
またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む。一実施形態において、ヒドロゲ
ルが、キトサンおよびコラーゲンを含む。加えて、ヒドロゲルが、ポリビニルアルコール
、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを
含んでよい。一実施形態において、ヒドロゲルが、キトサンおよびポリビニルアルコール
を含む。
、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、
またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む。一実施形態において、ヒドロゲ
ルが、キトサンおよびコラーゲンを含む。加えて、ヒドロゲルが、ポリビニルアルコール
、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを
含んでよい。一実施形態において、ヒドロゲルが、キトサンおよびポリビニルアルコール
を含む。
一態様において、本発明は、創傷治癒の促進に用いられる、または脱毛症の処置に用い
られる、前述の態様または実施形態のいずれか1つの生体適合性材料を提供する。
られる、前述の態様または実施形態のいずれか1つの生体適合性材料を提供する。
一態様において、本発明は、創傷治癒の促進に用いられる、または脱毛症の処置に用い
られる、前述の態様または実施形態のいずれか1つのヒドロゲルを提供する。
られる、前述の態様または実施形態のいずれか1つのヒドロゲルを提供する。
一態様において、本発明は、創傷床における血管化を増大させ、または誘導する方法に
用いられる、前述の態様または実施形態のいずれか1つの生体適合性材料を提供する。
用いられる、前述の態様または実施形態のいずれか1つの生体適合性材料を提供する。
一態様において、本発明は、創傷床における血管新生を増大させ、または誘導する方法
に用いられる、前述の態様または実施形態のいずれか1つのいずれか1つのヒドロゲルを
提供する。
に用いられる、前述の態様または実施形態のいずれか1つのいずれか1つのヒドロゲルを
提供する。
一態様において、本発明は、脱毛症の処置に用いられるD-デオキシリボース糖を提供
し、糖が、担体内に用意され、担体が、生体適合性マトリックス材料またはヒドロゲルで
ある。好ましくは、D-デオキシリボースが、2-デオキシリボースである。
し、糖が、担体内に用意され、担体が、生体適合性マトリックス材料またはヒドロゲルで
ある。好ましくは、D-デオキシリボースが、2-デオキシリボースである。
一実施形態において、担体が生分解性担体である。
一実施形態において、マトリックス材料が、電界紡糸された足場である。好ましくは、
電界紡糸された足場が、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(乳酸-
co-グリコール酸)(PLGA)、またはポリ(3-ヒドロキシブチラート-co-3
-ヒドロキシバレラート)PHBVの少なくとも1つを含む。
電界紡糸された足場が、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(乳酸-
co-グリコール酸)(PLGA)、またはポリ(3-ヒドロキシブチラート-co-3
-ヒドロキシバレラート)PHBVの少なくとも1つを含む。
一実施形態において、ヒドロゲルが架橋ヒドロゲルである。好ましくは、ヒドロゲルが
、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、
またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む。一実施形態において、ヒドロゲ
ルが、キトサンおよびコラーゲンを含む。加えて、ヒドロゲルが、ポリビニルアルコール
、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを
含んでよい。一実施形態において、ヒドロゲルが、キトサンおよびポリビニルアルコール
を含む。
、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、
またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む。一実施形態において、ヒドロゲ
ルが、キトサンおよびコラーゲンを含む。加えて、ヒドロゲルが、ポリビニルアルコール
、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを
含んでよい。一実施形態において、ヒドロゲルが、キトサンおよびポリビニルアルコール
を含む。
一実施形態において、担体が抗菌剤をさらに含む。
一態様において、本発明は、毛の再生を促進する非治療的方法を提供し、前記方法が、
D-デオキシリボース糖の投与を含み、糖が、担体内に用意され、担体が、生体適合性マ
トリックス材料またはヒドロゲルである 好ましくは、D-デオキシリボースが、2-デ
オキシリボースである。
D-デオキシリボース糖の投与を含み、糖が、担体内に用意され、担体が、生体適合性マ
トリックス材料またはヒドロゲルである 好ましくは、D-デオキシリボースが、2-デ
オキシリボースである。
一実施形態において、担体が生分解性担体である。
一実施形態において、マトリックス材料が、電界紡糸された足場である。好ましくは、
電界紡糸された足場が、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(乳酸-
co-グリコール酸)(PLGA)、またはポリ(3-ヒドロキシブチラート-co-3
-ヒドロキシバレラート)PHBVの少なくとも1つを含む。
電界紡糸された足場が、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(乳酸-
co-グリコール酸)(PLGA)、またはポリ(3-ヒドロキシブチラート-co-3
-ヒドロキシバレラート)PHBVの少なくとも1つを含む。
一実施形態において、ヒドロゲルが架橋ヒドロゲルである。好ましくは、ヒドロゲルが
、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、
またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む。一実施形態において、ヒドロゲ
ルが、キトサンおよびコラーゲンを含む。加えて、ヒドロゲルが、ポリビニルアルコール
、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを
含んでよい。一実施形態において、ヒドロゲルが、キトサンおよびポリビニルアルコール
を含む。
、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、
またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む。一実施形態において、ヒドロゲ
ルが、キトサンおよびコラーゲンを含む。加えて、ヒドロゲルが、ポリビニルアルコール
、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを
含んでよい。一実施形態において、ヒドロゲルが、キトサンおよびポリビニルアルコール
を含む。
一実施形態において、担体が抗菌剤をさらに含む。
一態様において、本発明は、前述の態様または実施形態のいずれか1つに従う生体適合
性マトリックス材料を含む創傷包帯を提供する。
性マトリックス材料を含む創傷包帯を提供する。
一態様において、本発明は、前述の態様または実施形態のいずれか1つに従うヒドロゲ
ルを含む創傷包帯を提供する。
ルを含む創傷包帯を提供する。
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して、以下でさらに説明される。
PCL電界紡糸繊維の光学顕微鏡画像および走査型電子顕微鏡(SEM)画像を示す。(a)D-デオキシロボースを含まない、そして(b)D-デオキシロボースを含む繊維シートの光学画像。10000倍の倍率での、(c)D-デオキシリボースを含まない、そして(d)D-デオキシリボースを含む繊維のSEM顕微鏡写真。
ヒドロゲルの物理的外観(左)およびそのSEM顕微鏡写真(右)を示す。(a)TEOFを含まない凍結乾燥ヒドロゲル;(b)16%TEOFを含む凍結乾燥ヒドロゲル;(c)TEOFを含まないヒドロゲル上での糖の物理的担持;(d)16%TEOFを含むヒドロゲル上での糖の物理的担持;(a1)TEOFを含まないヒドロゲルのSEM顕微鏡写真、倍率500倍、(b1)16%TEOFを含むヒドロゲルのSEM顕微鏡写真、倍率500倍、(c1)TEOFを含まない糖担持ヒドロゲルのSEM顕微鏡写真、倍率500倍、(d1)16%TEOFを含む糖担持ヒドロゲルのSEM顕微鏡写真、倍率500倍。
キトサン/コラーゲンヒドロゲルの写真を示し、その強度、形状、柔軟性、および折畳み能力を示している。
ヒドロゲルの断面図を示す、架橋CS/コラーゲン足場の走査型電子顕微鏡(SEM)写真を示す。ヒドロゲルの多孔性構造を示す顕微鏡写真、倍率200倍;(a)対照(糖なし)、(b)D-デオキシリボース担持ヒドロゲル、(c)L-デオキシリボース担持ヒドロゲル、(d)D-デオキシラムノース担持ヒドロゲル、(e)L-デオキシラムノース担持ヒドロゲル、(f)D-デオキシフコース担持ヒドロゲル、(g)D-デオキシフコース担持ヒドロゲル。
様々な合成材料のFTIRスペクトルを示す。[A]電界紡糸繊維、(a)PCL繊維、(b)D-リボース担持電界紡糸PCL繊維、(c)D-デオキシリボース;[B]CS/PVAヒドロゲルのFTIRスペクトル、(d)TEOF TEOFを含まない対照、(e)16%TEOFを含むD-デオキシリボース担持ヒドロゲル;[C]CS/コラーゲン/TEOFヒドロゲルのFTIR、(f)D-デオキシフコース担持ヒドロゲル、(g)L-デオキシラムノース担持ヒドロゲル、(h)D-デオキシラムノース担持ヒドロゲル、(i)L-デオキシリボース担持ヒドロゲル、(j)D-デオキシリボース担持ヒドロゲル、(k)対照(糖なし)。
[A]D-リボース担持電界紡糸繊維およびヒドロゲルの血管新生潜在性の評価、(a)D-デオキシリボースを含まないPCL e-紡糸繊維、(b)D-デオキシリボースを含むPCL e-紡糸繊維、(c)16%TEOFを含むD-デオキシリボース担持CS/PVAヒドロゲル;[B]足場を貫通する血管の数を示す統計ヒストグラムを示す。足場から1mm離れたところに円を描いて、円の内側の血管の数をカウントした。各研究について、8個の卵に足場を移植して、平均5羽の雛が生存した。結果は、5個の卵の平均±S.Dである。
CAMアッセイを用いたCS/コラーゲン/TEOFヒドロゲルの血管新生促進潜在性を示す。[A]足場を、受精の8日目にCAM上に配置した。図は、受精の14日目のCAM上の足場の光学顕微鏡画像を示す。(a)対照(糖なし)、(b)D-デオキシリボース担持ヒドロゲル、(c)L-デオキシリボース担持ヒドロゲル、(d)D-デオキシラムノース担持ヒドロゲル、(e)L-デオキシラムノース担持ヒドロゲル、(f)D-デオキシフコース担持ヒドロゲル、(g)L-デオキシフコース担持ヒドロゲル。図はまた、各写真の左下隅にそれぞれの外植ヒドロゲルを示す。各実験について、10個の卵にそれぞれ足場を移植して、そのうち7羽の雛が生存した。[B]写真の下部は、各ヒドロゲルについての血管数の統計分析を示す。(a)対照(糖なし)、(b)D-デオキシリボース担持ヒドロゲル、(c)L-デオキシリボース担持ヒドロゲル、(d)D-デオキシラムノース担持ヒドロゲル、(e)L-デオキシラムノース担持ヒドロゲル、(f)D-デオキシフコース担持ヒドロゲル、(g)D-デオキシフコース担持ヒドロゲル。統計的p値を、グラフバーの上に示す。示す値は、各足場について7羽の雛の平均±S.Dである。
創傷治癒がD-デオキシリボース担持足場によって促進されたことを示す。20mmの領域をマークしてから、外科用ハサミを用いて麻酔下で切除を実行することによって、全層創傷を生じさせた。それぞれの材料を創傷に当てて、適所で縫合して、最初にMepore(Sweden)絆創膏で、そして最後に綿包帯で覆った。全てのラットに、創傷の3日後に除去したのと同じ包帯を着けた。特定の時点にて各創傷をデジタル写真撮影して、Image Jソフトウェアを用いてさらに定量化した。創傷後3、9、11、14、および17日目の創傷、対照ヒドロゲル(架橋CS/コラーゲン足場)、およびD-リボース-担持ヒドロゲルの代表的な巨視的写真を示す。
17日にわたる創傷領域をヒストグラムで示す。全層創傷を、20mmの円形領域に印を付けてから、外科用ハサミで切除することによって生じさせた。実際に開いた創傷であり、かつ自然治癒するままにした陰性対照を用いた。対照は、いかなる糖も担持しないCS/コラーゲン足場を含有し、D-Rは、D-デオキシリボースを担持したCS/コラーゲン足場であった。実験の各タイプについて、3頭のラットを用いて、創傷治癒を、完全な創傷閉鎖まで観察した。創傷の平均直径を、Image Jを用いて判定した。各カラムは、各サンプルについての4つの創傷から記録した、独立した計算の平均±S.Dを表す。統計分析は、9、11、14、および17日目までに見られるように、非担持ヒドロゲルが創傷治癒を有意に促進し、そしてD-デオキシリボースの添加が、創傷治癒を大幅に促進することを示した。p<0.0001。
17日目のH&EおよびGoldrenのトリクローム画像を示す。0.2mmのスケールバー。
17日目の免疫染色画像を示す。0.2mmのスケールバー。
盲検スコアリングシステムを用いた免疫染色データの評価を示す。0=不在;1=軽く存在;2=大きく存在;3=豊富;4=大いに豊富。示す結果は、平均±SD、n=10である。多重比較についての統計、およびM2/M1比も示す。
物質の直接付与の工程、およびCAM上への物質放出足場の移植の工程の概略図を示す。図は、EDD0から始まるex-ovo CAMアッセイの基本的な方法論を示す。
CAMの大血管系(A)および微小血管系(B)の定量化方法を説明する工程を示す。
CAMアッセイを用いて評価したE2および2dDRに対する血管新生応答の比較を示す。(A)分岐点の数、(B)平均血管長。****P≦0.0001、*
**P≦0.001、**P≦0.01、*P≦0.05、nsP≧0.05、n=9±SD。E2および2dDRの様々な濃度に応じて見られる分岐点の数および平均マクロ血管長を算出して、4日にわたってPBS対照と比較した(C)。値は平均±SDを表す。
PBSの付与(対照)と比較した、大血管系および微小血管系に及ぼすE2(200ng/日)および2dDR(200μg/日)の影響の説明を示す。VEGFを陽性対照として、そしてスニチニブを陰性対照として含めた。2dDRを200μg/日、そしてE2を200ng/日として付与した。全ての統計的比較を、PBSに対して行う。****P≦0.0001、***P≦0.001。スケールバーは、大血管(上部)および微小血管(中央)の画像について、それぞれ1mmおよび50μmを表す。n=9±SD。
足場のSEM画像を示す。(A)プレーンPHBV、(B)PHBV+25mg E2、(C)PHBV+50mg E2、(D)PHBV+250mg 2dDR、(E)PHBV+500mg 2dDR。左下隅のグラフは、各足場についての繊維径の分布を示す。****P≦0.0001、***P≦0.001。スケールバーは100μmを表す。
30日にわたるPHBV足場からの(A)2dDRおよび(B)E2の放出を示す。n=6±SD。
(A)UTS、(B)剛性、および(C)足場上の液滴保持時間の比較を示す。****P≦0.0001、***P≦0.001、**P≦0.01、*P≦0.05、n=6±SD。
PHBV足場と比較した、2dDR(250mgおよび500mg)放出足場およびE2(25mgおよび50mg)放出足場の血管新生潜在性を説明する代表的な画像を示す。左下のグラフは、これらの実験由来の定量データを示す-平均血管数、*
***P≦0.0001。スケールバーは3mmを表す。n=6±SD。
足場ありの、または足場なしのインキュベーションの7日後のCAMの組織学的分析を、異なる倍率で示す。足場、CAM外胚葉(*)、中胚葉(**)、および内胚葉(***)の層の向きを画像中に示した。矢印は血管を示す。スケールバー=0.2mm(10×)、0.1mm(20×)、0.05mm(40×)。
各群についての合計6つの異なるスライドおよび各スライド由来の6つの異なる注目領域からの、10倍の倍率での、足場に隣接する識別可能な血管の定量化を示す。
本発明者らは、驚くべきことに、d-デオキシリボースまたはL-デオキシ糖が担持さ
れた生体材料が、新しい血管の迅速な形成を支援し、かつ創傷治癒を補助することを見出
した。デオキシリボースが担持されたヒドロゲルはまた、in vivo創傷モデルにお
いて治癒を促進した。創傷治癒は、新しい血管形成を伴った。創傷治癒を促進するd-デ
オキシリボースの能力は、2-デオキシ-D-グルコース等の他のD-デオキシ糖が、血
管新生を阻害することが知られていることを考えると、特に驚くべきことである(Mer
chan J. et al., PLoS ONE 5(10): e13699)。
れた生体材料が、新しい血管の迅速な形成を支援し、かつ創傷治癒を補助することを見出
した。デオキシリボースが担持されたヒドロゲルはまた、in vivo創傷モデルにお
いて治癒を促進した。創傷治癒は、新しい血管形成を伴った。創傷治癒を促進するd-デ
オキシリボースの能力は、2-デオキシ-D-グルコース等の他のD-デオキシ糖が、血
管新生を阻害することが知られていることを考えると、特に驚くべきことである(Mer
chan J. et al., PLoS ONE 5(10): e13699)。
示されるデータは、2-デオキシ-D-リボースが担持された生体材料が、7日以内に
新しい血管の形成を支援したことを示している。デオキシリボースのこの血管新生特性は
、調査された他の2つのデオキシ糖、すなわちデオキシフコースおよびデオキシラムノー
スによって、有用であるといえるほども共有されなかった。しかし、3つの糖全てのL異
性体は、血管新生が強かったが、デオキシリボースのD異性体のみ、血管新生が強かった
。2-デオキシ-D-リボースまたはL-デオキシ糖を用いてVEGF生成を刺激するい
くつかの利点がある。例えば、これらは安定しており、かつ安価であり、生体材料中に導
入すると、数日にわたって持続放出されて、新しい血管の成長を刺激することができる。
また、ほとんどの細菌は、デオキシリボースを代謝するのが困難であることがわかってい
る(Christensen et al., Journal of bacteri
ology. 2003)。
新しい血管の形成を支援したことを示している。デオキシリボースのこの血管新生特性は
、調査された他の2つのデオキシ糖、すなわちデオキシフコースおよびデオキシラムノー
スによって、有用であるといえるほども共有されなかった。しかし、3つの糖全てのL異
性体は、血管新生が強かったが、デオキシリボースのD異性体のみ、血管新生が強かった
。2-デオキシ-D-リボースまたはL-デオキシ糖を用いてVEGF生成を刺激するい
くつかの利点がある。例えば、これらは安定しており、かつ安価であり、生体材料中に導
入すると、数日にわたって持続放出されて、新しい血管の成長を刺激することができる。
また、ほとんどの細菌は、デオキシリボースを代謝するのが困難であることがわかってい
る(Christensen et al., Journal of bacteri
ology. 2003)。
本発明者らはまた、一般的なグラム陽性病原体が、試験した3つのデオキシ糖(デオキ
シリボース、デオキシフコース、およびデオキシラムノース)のD異性体またはL異性体
のいずれも代謝できないが、これらの糖の一部が、グラム陰性病原種によって代謝され得
ることを見出した。
シリボース、デオキシフコース、およびデオキシラムノース)のD異性体またはL異性体
のいずれも代謝できないが、これらの糖の一部が、グラム陰性病原種によって代謝され得
ることを見出した。
本発明者らは、2-デオキシ-D-リボースが担持されたキトサン/コラーゲンのヒド
ロゲルが、in vivoラット皮膚創傷モデルの治癒を刺激することを実証した。創傷
治癒は、新しい血管形成を伴った。
ロゲルが、in vivoラット皮膚創傷モデルの治癒を刺激することを実証した。創傷
治癒は、新しい血管形成を伴った。
本発明者らは、生体材料からの2-デオキシ-D-リボースの漸次放出が、新しい血管
の生成を促進することとなるので、創傷治癒に価値があることを実証した。本発明者らは
、D糖である2-デオキシ-D-リボースを導入して、血管新生促進性を証明できるかを
確かめ、そしてこれが、臨床的に関連する広範な生体材料を用いてなされ得るかどうかを
評価した。したがって、このD-デオキシ糖が、3つの生分解性生体材料、電界紡糸PC
Lナノファイバ、キトサン/PVAのヒドロゲル、およびキトサン/コラーゲンのヒドロ
ゲル中に担持された。
の生成を促進することとなるので、創傷治癒に価値があることを実証した。本発明者らは
、D糖である2-デオキシ-D-リボースを導入して、血管新生促進性を証明できるかを
確かめ、そしてこれが、臨床的に関連する広範な生体材料を用いてなされ得るかどうかを
評価した。したがって、このD-デオキシ糖が、3つの生分解性生体材料、電界紡糸PC
Lナノファイバ、キトサン/PVAのヒドロゲル、およびキトサン/コラーゲンのヒドロ
ゲル中に担持された。
データは、このD糖、2-デオキシ-D-リボースが、3つの異なる生体材料中に容易
に組み込まれ得ることを示しており、本発明者らは、CAMアッセイを用いて実際に血管
新生促進性であることを確認した。また、このアッセイを用いて、本発明者らは、デオキ
シリボースのD異性体の血管新生特性がどの程度、他のデオキシ糖と共有されるかを調査
した。ここで、本発明者らは、デオキシ糖の3つのL異性体(リボース、フコース、およ
びラムノース)が全て、血管新生促進性であるが、デオキシリボースのD異性体のみが、
有意に血管新生性であることを見出した。
に組み込まれ得ることを示しており、本発明者らは、CAMアッセイを用いて実際に血管
新生促進性であることを確認した。また、このアッセイを用いて、本発明者らは、デオキ
シリボースのD異性体の血管新生特性がどの程度、他のデオキシ糖と共有されるかを調査
した。ここで、本発明者らは、デオキシ糖の3つのL異性体(リボース、フコース、およ
びラムノース)が全て、血管新生促進性であるが、デオキシリボースのD異性体のみが、
有意に血管新生性であることを見出した。
細菌の代謝基質として作用するこれらの糖の能力に注目して、本発明者らは、黄色ブド
ウ球菌(Staphylococcus aureus)の3つの株を調べたが、これら
の株はいずれも、これらの糖を代謝することができなかった。このことは、これらの糖が
細菌の栄養源ではないため、これらの糖を含有する生体材料の開発を試みる上で心強いニ
ュースである。
ウ球菌(Staphylococcus aureus)の3つの株を調べたが、これら
の株はいずれも、これらの糖を代謝することができなかった。このことは、これらの糖が
細菌の栄養源ではないため、これらの糖を含有する生体材料の開発を試みる上で心強いニ
ュースである。
キトサン/コラーゲンヒドロゲルを用いて、創傷治癒に対するデオキシリボースのD異
性体の寄与をin vivoで評価した。このために、本発明者らは、ラット皮膚創傷モ
デルを用いた。本発明者らは、驚くべきことに、キトサン/コラーゲンヒドロゲルへのD
-デオキシ-リボースの添加が、CD34陽性細胞についての染色によって検出される血
管化の増大を伴う皮膚創傷治癒を大きく促進することを見出した。このモデルから、キト
サンコラーゲンゲル自体が、創傷治癒を刺激するが、これは、D糖の添加によって大幅に
増大することが明らかであった。17日目までに、D糖で処置した創傷は完全に閉じられ
、そして組織構造は、非常に成熟した毛包の存在を示した。この証拠に基づいて、本発明
者らは、キトサン/コラーゲンゲルからのD糖の放出が、血管新生を刺激すると結論付け
、そして創傷治癒の増大が、自然な結果であることを提唱する。
性体の寄与をin vivoで評価した。このために、本発明者らは、ラット皮膚創傷モ
デルを用いた。本発明者らは、驚くべきことに、キトサン/コラーゲンヒドロゲルへのD
-デオキシ-リボースの添加が、CD34陽性細胞についての染色によって検出される血
管化の増大を伴う皮膚創傷治癒を大きく促進することを見出した。このモデルから、キト
サンコラーゲンゲル自体が、創傷治癒を刺激するが、これは、D糖の添加によって大幅に
増大することが明らかであった。17日目までに、D糖で処置した創傷は完全に閉じられ
、そして組織構造は、非常に成熟した毛包の存在を示した。この証拠に基づいて、本発明
者らは、キトサン/コラーゲンゲルからのD糖の放出が、血管新生を刺激すると結論付け
、そして創傷治癒の増大が、自然な結果であることを提唱する。
デオキシ糖に対するマクロファージ応答の調査により、建設的リモデリングを示す17
日目までに、M1マクロファージよりもM2マクロファージが僅かに優勢であることが示
された。動物実験の実施において、最初のヒドロゲルは、扱うのに非常に丈夫であり、か
つ実際に適所に縫合することができた。3日目の動物実験の観察では、ヒドロゲルが非常
によく付着していることが明らかとなり、細胞の内方成長もまた明らかであった(図8)
。周囲組織とのヒドロゲルの付着は、糖担持ヒドロゲルの場合に、より良好であった。9
日目では、対照ヒドロゲルおよびD-デオキシリボース担持ヒドロゲルは、まだ無傷であ
った。ヒドロゲルは徐々に吸収されて、11日目までに創傷面積の50%超が、D-デオ
キシリボースヒドロゲルで治癒された(図9参照)が、残りのヒドロゲルはまだ創傷上に
存在していた(図8)。14日目までに、創傷上にD-デオキシ糖ヒドロゲルが残ってい
る兆候はなかった。17日目までに、D-デオキシリボース移植創傷は、完全に治癒して
いた。このヒドロゲルは、動物によって完全に吸収されるようであり、触診すると、治癒
した皮膚の内側に感じることができなかった。対照ヒドロゲルは、動物研究の終わりまで
、その完全性を維持した。
日目までに、M1マクロファージよりもM2マクロファージが僅かに優勢であることが示
された。動物実験の実施において、最初のヒドロゲルは、扱うのに非常に丈夫であり、か
つ実際に適所に縫合することができた。3日目の動物実験の観察では、ヒドロゲルが非常
によく付着していることが明らかとなり、細胞の内方成長もまた明らかであった(図8)
。周囲組織とのヒドロゲルの付着は、糖担持ヒドロゲルの場合に、より良好であった。9
日目では、対照ヒドロゲルおよびD-デオキシリボース担持ヒドロゲルは、まだ無傷であ
った。ヒドロゲルは徐々に吸収されて、11日目までに創傷面積の50%超が、D-デオ
キシリボースヒドロゲルで治癒された(図9参照)が、残りのヒドロゲルはまだ創傷上に
存在していた(図8)。14日目までに、創傷上にD-デオキシ糖ヒドロゲルが残ってい
る兆候はなかった。17日目までに、D-デオキシリボース移植創傷は、完全に治癒して
いた。このヒドロゲルは、動物によって完全に吸収されるようであり、触診すると、治癒
した皮膚の内側に感じることができなかった。対照ヒドロゲルは、動物研究の終わりまで
、その完全性を維持した。
これらのデオキシ糖放出ヒドロゲルは、慢性の非治癒創傷において血管新生を刺激し、
そしてまた、広範囲の全層熱傷の管理における真皮代替材料として作用する、有望なアプ
ローチである。
そしてまた、広範囲の全層熱傷の管理における真皮代替材料として作用する、有望なアプ
ローチである。
このD-糖を用いてVEGF生成を刺激するいくつかの利点がある;D-糖は安定して
おり、かつ安価であり、生体材料中に導入すると、数日にわたって持続放出されて、新し
い血管の成長を刺激することができる。
おり、かつ安価であり、生体材料中に導入すると、数日にわたって持続放出されて、新し
い血管の成長を刺激することができる。
本発明者らは、D-デオキシリボースを放出するキトサンベースのヒドロゲルが、新し
い血管の内方成長を刺激し、そして薄い皮膚移植片または自己由来培養ケラチノサイトに
よるその後の移植のための血管化された創傷床を提供して、永続的な皮膚バリア層を提供
することとなるため、真皮の代替物として作用し得ることを見出した。
い血管の内方成長を刺激し、そして薄い皮膚移植片または自己由来培養ケラチノサイトに
よるその後の移植のための血管化された創傷床を提供して、永続的な皮膚バリア層を提供
することとなるため、真皮の代替物として作用し得ることを見出した。
D-デオキシリボースのプラスの効果は、2010年にMerchan et al.
が2-デオキシ-D-グルコース(2-DG)の抗血管新生活性を報告しているので、驚
くべきものである。Merchan et al.は、2-DGが内皮毛細血管の形成お
よび内皮細胞の移動をin vitroで阻害することを報告した[.R. Merch
an, K. Kovacs, J.W. Railsback, M. Kurtog
lu, Y. Jing, Y. Pina, N. Gao, T.G. Murra
y, M.A. Lehrman, T.J. Lampidis, Antiangi
ogenic activity of 2-deoxy-D-glucose, PL
oS One. 5 (2010). doi:10.1371/journal.po
ne.0013699]。
が2-デオキシ-D-グルコース(2-DG)の抗血管新生活性を報告しているので、驚
くべきものである。Merchan et al.は、2-DGが内皮毛細血管の形成お
よび内皮細胞の移動をin vitroで阻害することを報告した[.R. Merch
an, K. Kovacs, J.W. Railsback, M. Kurtog
lu, Y. Jing, Y. Pina, N. Gao, T.G. Murra
y, M.A. Lehrman, T.J. Lampidis, Antiangi
ogenic activity of 2-deoxy-D-glucose, PL
oS One. 5 (2010). doi:10.1371/journal.po
ne.0013699]。
本明細書で示されるデータは、臨床的に有用な生成物について、移植後の迅速な(5日
以内の)新血管化が重要であることを示している。200μmを超えるあらゆるTE構築
体がin vivoで生き残り得るのに、血管の急速な内方成長および浸潤が不可欠であ
る[C.K. Griffith, C. Miller, R.C.A. Sains
on, J.W. Calvert, N.L. Jeon, C.C.W. Hugh
es, S.C.George, Diffusion Limits of an i
n Vitro Thick Prevascularized Tissue, Ti
ssue Eng. 11 (2005) 257-266. doi:10.1089
/ten.2005.11.257]。本発明者らは、組織工学的担体を血管新生促進物
質で官能化させることによって、この障壁を克服した。
以内の)新血管化が重要であることを示している。200μmを超えるあらゆるTE構築
体がin vivoで生き残り得るのに、血管の急速な内方成長および浸潤が不可欠であ
る[C.K. Griffith, C. Miller, R.C.A. Sains
on, J.W. Calvert, N.L. Jeon, C.C.W. Hugh
es, S.C.George, Diffusion Limits of an i
n Vitro Thick Prevascularized Tissue, Ti
ssue Eng. 11 (2005) 257-266. doi:10.1089
/ten.2005.11.257]。本発明者らは、組織工学的担体を血管新生促進物
質で官能化させることによって、この障壁を克服した。
本発明者らは、組織工学的構築物の移植後に一般的に見られる新血管化の遅延を克服す
る組織工学的担体を生成した。
る組織工学的担体を生成した。
本発明者らは、2dDR担持CS/コラーゲンヒドロゲルを、3日目までに、ラットに
おける全層切除創(20mm)の創床にしっかりと付着させた。2dDRで処置した創傷
は、17日目までに完全に閉じ、発毛が明確であった。一方、対照創傷は開いたままであ
り、上皮組織または発毛の証拠はなかった。17日目に犠牲にした全動物の創傷床の組織
構造は、2dDR処置創傷の場合に、完全な治癒を示し、毛包が十分発達していた。そし
て、治癒した創傷内の新しい血管の存在が、CD34染色で確認された。[M. Yar
, L. Shahzadi, M. Azra, M.I. Raheem, S.
Roman, A.A. Chaudhry, I. ur Rehman, C.W.
I. Douglas, S. MacNeil, Deoxy-sugar rele
asing biodegradable membranes and hydrog
els promote angiogenesis and stimulate w
ound healing, Mater Today Commun.13 (201
7) 295-305. doi:10.1016/j.mtcomm.2017.10
.015]。
炭水化物は、アノマー炭素から最も遠いキラル炭素の配置によって決定されるD-およ
びL-鏡像異性配置を有し得る。炭水化物の直線状形態がフィッシャー投影として描かれ
る場合、キラル炭素に結合したヒドロキシル基は、炭素の左側または右側のいずれかに配
置され得る。ヒドロキシルがキラル炭素の右側にあれば、炭水化物はD-炭水化物として
注釈が付けられ、ヒドロキシル基がキラル炭素の左側にあれば、炭水化物はL-炭水化物
として注釈が付けられる。以下の例は、グルコースのD-およびL-鏡像異性体の構成を
示す。
おける全層切除創(20mm)の創床にしっかりと付着させた。2dDRで処置した創傷
は、17日目までに完全に閉じ、発毛が明確であった。一方、対照創傷は開いたままであ
り、上皮組織または発毛の証拠はなかった。17日目に犠牲にした全動物の創傷床の組織
構造は、2dDR処置創傷の場合に、完全な治癒を示し、毛包が十分発達していた。そし
て、治癒した創傷内の新しい血管の存在が、CD34染色で確認された。[M. Yar
, L. Shahzadi, M. Azra, M.I. Raheem, S.
Roman, A.A. Chaudhry, I. ur Rehman, C.W.
I. Douglas, S. MacNeil, Deoxy-sugar rele
asing biodegradable membranes and hydrog
els promote angiogenesis and stimulate w
ound healing, Mater Today Commun.13 (201
7) 295-305. doi:10.1016/j.mtcomm.2017.10
.015]。
炭水化物は、アノマー炭素から最も遠いキラル炭素の配置によって決定されるD-およ
びL-鏡像異性配置を有し得る。炭水化物の直線状形態がフィッシャー投影として描かれ
る場合、キラル炭素に結合したヒドロキシル基は、炭素の左側または右側のいずれかに配
置され得る。ヒドロキシルがキラル炭素の右側にあれば、炭水化物はD-炭水化物として
注釈が付けられ、ヒドロキシル基がキラル炭素の左側にあれば、炭水化物はL-炭水化物
として注釈が付けられる。以下の例は、グルコースのD-およびL-鏡像異性体の構成を
示す。
炭水化物のD-鏡像異性体は、自然界に存在することがわかっている最も一般的な形態
であり、多くは天然源から単離され得る。対照的に、炭水化物の天然に存在しないL-鏡
像異性体は、化学合成または酵素的合成によって製造するのに費用がかかり得る。しかし
ながら、一部の炭水化物のL-鏡像異性体もまた、自然界に存在することが知られている
。
であり、多くは天然源から単離され得る。対照的に、炭水化物の天然に存在しないL-鏡
像異性体は、化学合成または酵素的合成によって製造するのに費用がかかり得る。しかし
ながら、一部の炭水化物のL-鏡像異性体もまた、自然界に存在することが知られている
。
D-リボースのリン酸化形態は、アミノ酸合成に関与し、ペントースリン酸経路に用い
られ、そしてリボ核酸(RNA)の構成要素である。
られ、そしてリボ核酸(RNA)の構成要素である。
また、適切には、D-リボースは、例えば、2’、3’、4’、または5’位置にて脱
ヒドロキシル化され得る。脱ヒドロキシル化リボースの注目すべき一例が、2’位置にて
ヒドロキシル基が水素原子で置換されている2-D-デオキシリボースである。この糖は
、デオキシリボ核酸(DNA)の構成要素である。デオキシ-D-リボースは、直線状形
態ではなく、主に溶液中で環状形態として存在する。
デオキシリボースのD-鏡像異性体は、本発明での特定の用途が明らかとなる。
ヒドロキシル化され得る。脱ヒドロキシル化リボースの注目すべき一例が、2’位置にて
ヒドロキシル基が水素原子で置換されている2-D-デオキシリボースである。この糖は
、デオキシリボ核酸(DNA)の構成要素である。デオキシ-D-リボースは、直線状形
態ではなく、主に溶液中で環状形態として存在する。
デオキシ糖は、ヒドロキシル基が水素原子で置換された糖である。デオキシ糖の例とし
て、L-2デオキシリボース、L-フコース(6-デオキシ-L-ガラクトースの同等物
)、およびL-ラムノース(6-デオキシ-L-マンノースの同等物)が挙げられる。
て、L-2デオキシリボース、L-フコース(6-デオキシ-L-ガラクトースの同等物
)、およびL-ラムノース(6-デオキシ-L-マンノースの同等物)が挙げられる。
デオキシ糖のL-鏡像異性体は、本発明での特定の用途が明らかとなる。
本発明者らはまた、驚くべきことに、エストラジオール(E2)が担持された生体材料
が、新しい血管の迅速な形成を支援し、かつ創傷治癒を補助することを見出した。エスト
ラジオール(E2)は、月経周期中の新血管化に重要な役割を果たす[D.W. Los
ordo, J.M. Isner, Estrogen and Angiogene
sis: A Review, Arterioscler 30 Thromb Va
sc Biol. 21 (2001) 6-12. doi:10.1161/01.
ATV.21.1.6, Y. Matsubara, K. Matsubara,
Estrogen and progesterone play pivotal r
oles in endothelial progenitor cell prol
iferation, Reprod Biol Endocrinol. 10 (2
012) 2. doi:10.1186/1477-7827-10-2]。エストラ
ジオール(E2)は、骨粗鬆症および心臓病の処置に臨床的に用いられている[M.L.
Stefanick, Estrogens and progestins: Ba
ckground and history, trends in use, and
guidelines and regimens approved by the
US Food and Drug Administration, in: Am
J Med, 2005. doi:10.1016/j.amjmed.2005.
09.059]。さらに、エストロゲン受容体陽性腫瘍用のタモキシフェン等のアジュバ
ントによるE2受容体の遮断(高いエストロゲンが、癌細胞の増殖および拡散の一助とな
る)は、特に乳癌の処置用に、長年にわたって診療所で用いられている、腫瘍血管系を減
らす効果的な方法である[B. Fisher, J. Costantino, C.
Redmond, R. Poisson, D. Bowman, J. Cout
ure, N. V Dimitrov, N. Wolmark, D.L. Wic
kerham, E.R. Fisher, A randomized clinic
al trial evaluating tamoxifen in the tre
atment of patients with node-negative br
east cancer who have estrogen-receptor-p
ositive tumors., N Engl J Med. 320 (1989
) 479-84. doi:10.1056/NEJM19890223320080
2, Early Breast Cancer Trialists Collabo
rative Group, Tamoxifen for early breast
cancer: an overview of the randomised t
rials, Lancet. 351 (1998) 1451-1467. doi
:10.1016/S0140-6736(97)11423-4]。E2は、内皮細胞
の移動および増殖をin vitroで促進し[K. Nikhil, S. Shar
an, R. Wishard, S.R. Palla, R. Krishna P
eddinti, P. Roy, Pterostilbene carboxald
ehyde thiosemicarbazone, a resveratrol d
erivative inhibits 15 17β-Estradiol indu
ced cell migration and proliferation in
HUVECs, Steroids. 108 (2016) 17-30. doi:
10.1016/j.steroids.2016.01.020, G.M. Rub
anyi, A. Johns, K. Kauser, Effect of est
rogen on endothelial function and angiog
enesis, Vascul Pharmacol. 38 (2002) 89-9
8. doi:10.1016/S0306- 3623(02)00131-3]、か
つ新しい血管形成をin vitroおよびin vivoの双方で刺激することが示さ
れている[D.E. Morales, K.A. McGowan, D.S. Gr
ant, S. Maheshwari, D. Bhartiya, M.C. Ci
d, H.K. Kleinman, H. William Schnaper, E
strogen Promotes Angiogenic Activity in
Human Umbilical Vein Endothelial Cells I
n Vitro and in a Murine Model, Circulati
on. 91 (1995) 755-63]。本発明者らは、CAMアッセイを用いて
、E2を担持したポリ-L-乳酸(PLLA)足場が、高度に血管新生性であることを確
認した[N. Mangir, C.J. Hillary, C.R. Chappl
e, S. MacNeil, Oestradiol-releasing Biod
egradable 25 Mesh Stimulates Collagen Pr
oduction and Angiogenesis: An Approach t
o Improving Biomaterial Integration in P
elvic Floor Repair, Eur Urol Focus. (201
7). doi:10.1016/j.euf.2017.05.004]。
が、新しい血管の迅速な形成を支援し、かつ創傷治癒を補助することを見出した。エスト
ラジオール(E2)は、月経周期中の新血管化に重要な役割を果たす[D.W. Los
ordo, J.M. Isner, Estrogen and Angiogene
sis: A Review, Arterioscler 30 Thromb Va
sc Biol. 21 (2001) 6-12. doi:10.1161/01.
ATV.21.1.6, Y. Matsubara, K. Matsubara,
Estrogen and progesterone play pivotal r
oles in endothelial progenitor cell prol
iferation, Reprod Biol Endocrinol. 10 (2
012) 2. doi:10.1186/1477-7827-10-2]。エストラ
ジオール(E2)は、骨粗鬆症および心臓病の処置に臨床的に用いられている[M.L.
Stefanick, Estrogens and progestins: Ba
ckground and history, trends in use, and
guidelines and regimens approved by the
US Food and Drug Administration, in: Am
J Med, 2005. doi:10.1016/j.amjmed.2005.
09.059]。さらに、エストロゲン受容体陽性腫瘍用のタモキシフェン等のアジュバ
ントによるE2受容体の遮断(高いエストロゲンが、癌細胞の増殖および拡散の一助とな
る)は、特に乳癌の処置用に、長年にわたって診療所で用いられている、腫瘍血管系を減
らす効果的な方法である[B. Fisher, J. Costantino, C.
Redmond, R. Poisson, D. Bowman, J. Cout
ure, N. V Dimitrov, N. Wolmark, D.L. Wic
kerham, E.R. Fisher, A randomized clinic
al trial evaluating tamoxifen in the tre
atment of patients with node-negative br
east cancer who have estrogen-receptor-p
ositive tumors., N Engl J Med. 320 (1989
) 479-84. doi:10.1056/NEJM19890223320080
2, Early Breast Cancer Trialists Collabo
rative Group, Tamoxifen for early breast
cancer: an overview of the randomised t
rials, Lancet. 351 (1998) 1451-1467. doi
:10.1016/S0140-6736(97)11423-4]。E2は、内皮細胞
の移動および増殖をin vitroで促進し[K. Nikhil, S. Shar
an, R. Wishard, S.R. Palla, R. Krishna P
eddinti, P. Roy, Pterostilbene carboxald
ehyde thiosemicarbazone, a resveratrol d
erivative inhibits 15 17β-Estradiol indu
ced cell migration and proliferation in
HUVECs, Steroids. 108 (2016) 17-30. doi:
10.1016/j.steroids.2016.01.020, G.M. Rub
anyi, A. Johns, K. Kauser, Effect of est
rogen on endothelial function and angiog
enesis, Vascul Pharmacol. 38 (2002) 89-9
8. doi:10.1016/S0306- 3623(02)00131-3]、か
つ新しい血管形成をin vitroおよびin vivoの双方で刺激することが示さ
れている[D.E. Morales, K.A. McGowan, D.S. Gr
ant, S. Maheshwari, D. Bhartiya, M.C. Ci
d, H.K. Kleinman, H. William Schnaper, E
strogen Promotes Angiogenic Activity in
Human Umbilical Vein Endothelial Cells I
n Vitro and in a Murine Model, Circulati
on. 91 (1995) 755-63]。本発明者らは、CAMアッセイを用いて
、E2を担持したポリ-L-乳酸(PLLA)足場が、高度に血管新生性であることを確
認した[N. Mangir, C.J. Hillary, C.R. Chappl
e, S. MacNeil, Oestradiol-releasing Biod
egradable 25 Mesh Stimulates Collagen Pr
oduction and Angiogenesis: An Approach t
o Improving Biomaterial Integration in P
elvic Floor Repair, Eur Urol Focus. (201
7). doi:10.1016/j.euf.2017.05.004]。
E2は以前、多くのグループおよび本発明者らの研究グループによって、in vit
roおよびin vivoの双方で血管新生性であると報告された。Albrecht
et al.は、E2が、VEGFのアップレギュレーションを介して血管新生を促進す
ることを示唆した。Albrecht et al.は、卵巣切除したヒヒへのE2投与
によって、VEGF発現および細胞透過性が迅速に増大することを報告した[E.D.
Albrecht, J.S. Babischkin, Y. Lidor, L.D
. Anderson, L.C. Udoff, G.J. Pepe, Effec
t 15 of estrogen on angiogenesis in co-c
ultures of human endometrial cells and m
icrovascular endothelial cells., Hum Rep
rod. 18 (2003) 2039-2047. doi:10.1093/hu
mrep/deg415]。同様に、VEGF mRNA発現レベルの上昇が、Hyde
r et al.によって、E2処置後の卵巣切除ラットにおいて観察された[S.M.
Hyder, G.M. Stancel, C. Chiappetta, L.
Murthy, H.L. Boettger-Tong, S. Makela, U
terine expression of vascular endothelia
l growth factor is increased by estradio
l and 20 tamoxifen, Cancer Res. 56 (1996
) 3954-3960]。同様に、Morales et al.は、E2が、マトリ
ゲル上でのHUVECの移動および毛細血管様ネットワークの形成を促進することを報告
した[D.E. Morales, K.A. McGowan, D.S. Gran
t, S. Maheshwari, D. Bhartiya, M.C. Cid,
H.K. Kleinman, H. William Schnaper, Est
rogen Promotes Angiogenic Activity in Hu
man Umbilical Vein Endothelial Cells In
Vitro and in a Murine Model, Circulation
. 91 (1995) 755-63]。Pence et al.は、外因性E2が
、子宮内膜上皮細胞によるVEGFの内生生成を促進することを示した[J.C. Pe
nce, K.B.H. Clancy, B.A.C. Harley, The i
nduction of pro-angiogenic processes wit
hin a collagen scaffold via exogenous es
tradiol and endometrial epithelial cells
, Biotechnol Bioeng. 112 (2015) 2185-219
4. doi:10.1002/bit.25622]。より最近になって、本発明者ら
のグループは、生分解性(PLA [N. Mangir, C.J. Hillary
, C.R. Chapple, S. MacNeil, Oestradiol-r
eleasing Biodegradable 25 Mesh Stimulate
s Collagen Production and Angiogenesis:
An Approach to Improving Biomaterial Int
egration in Pelvic Floor Repair, Eur Uro
l Focus. (2017). doi:10.1016/j.euf.2017.
05.004])繊維および非分解性(PU [S. Shafaat, N. Man
gir, S.R. Regureos, C.R. Chapple, S. Mac
Neil, Demonstration of improved tissue i
ntegration and angiogenesis with an elas
tic, estradiol releasing polyurethane ma
terial designed for use in pelvic floor
repair, Neurourol Urodyn. (n.d.) n/a-n/a
. doi:10.1002/nau.23510])繊維の双方からE2が放出され、
双方の電界紡糸足場が、CAMアッセイにおいて、良好な血管新生促進活性を示すことを
実証した。
roおよびin vivoの双方で血管新生性であると報告された。Albrecht
et al.は、E2が、VEGFのアップレギュレーションを介して血管新生を促進す
ることを示唆した。Albrecht et al.は、卵巣切除したヒヒへのE2投与
によって、VEGF発現および細胞透過性が迅速に増大することを報告した[E.D.
Albrecht, J.S. Babischkin, Y. Lidor, L.D
. Anderson, L.C. Udoff, G.J. Pepe, Effec
t 15 of estrogen on angiogenesis in co-c
ultures of human endometrial cells and m
icrovascular endothelial cells., Hum Rep
rod. 18 (2003) 2039-2047. doi:10.1093/hu
mrep/deg415]。同様に、VEGF mRNA発現レベルの上昇が、Hyde
r et al.によって、E2処置後の卵巣切除ラットにおいて観察された[S.M.
Hyder, G.M. Stancel, C. Chiappetta, L.
Murthy, H.L. Boettger-Tong, S. Makela, U
terine expression of vascular endothelia
l growth factor is increased by estradio
l and 20 tamoxifen, Cancer Res. 56 (1996
) 3954-3960]。同様に、Morales et al.は、E2が、マトリ
ゲル上でのHUVECの移動および毛細血管様ネットワークの形成を促進することを報告
した[D.E. Morales, K.A. McGowan, D.S. Gran
t, S. Maheshwari, D. Bhartiya, M.C. Cid,
H.K. Kleinman, H. William Schnaper, Est
rogen Promotes Angiogenic Activity in Hu
man Umbilical Vein Endothelial Cells In
Vitro and in a Murine Model, Circulation
. 91 (1995) 755-63]。Pence et al.は、外因性E2が
、子宮内膜上皮細胞によるVEGFの内生生成を促進することを示した[J.C. Pe
nce, K.B.H. Clancy, B.A.C. Harley, The i
nduction of pro-angiogenic processes wit
hin a collagen scaffold via exogenous es
tradiol and endometrial epithelial cells
, Biotechnol Bioeng. 112 (2015) 2185-219
4. doi:10.1002/bit.25622]。より最近になって、本発明者ら
のグループは、生分解性(PLA [N. Mangir, C.J. Hillary
, C.R. Chapple, S. MacNeil, Oestradiol-r
eleasing Biodegradable 25 Mesh Stimulate
s Collagen Production and Angiogenesis:
An Approach to Improving Biomaterial Int
egration in Pelvic Floor Repair, Eur Uro
l Focus. (2017). doi:10.1016/j.euf.2017.
05.004])繊維および非分解性(PU [S. Shafaat, N. Man
gir, S.R. Regureos, C.R. Chapple, S. Mac
Neil, Demonstration of improved tissue i
ntegration and angiogenesis with an elas
tic, estradiol releasing polyurethane ma
terial designed for use in pelvic floor
repair, Neurourol Urodyn. (n.d.) n/a-n/a
. doi:10.1002/nau.23510])繊維の双方からE2が放出され、
双方の電界紡糸足場が、CAMアッセイにおいて、良好な血管新生促進活性を示すことを
実証した。
本明細書中で用いられる用語「創傷治癒の促進」は、皮膚組織の連続性の破壊(皮膚(
真皮および表皮)および/または基礎となる結合組織の、あらゆる疾患によって特徴付け
られる障害、障害、症候群、異常、病理、または異常な症状が挙げられる)を回復するも
のと理解されるべきである。例えば、創傷は、小さな切り傷または擦り傷;中間層創傷;
複合/全層創傷;外傷性創傷、例えば、擦傷、裂傷;手術創;手術後の切り傷;褥瘡(p
ressure sore)のような慢性/非治癒性創傷または非治癒性糖尿病性足創傷
;潰瘍、特に静脈性潰瘍、褥瘡(decubitus)、感染に起因する皮膚潰瘍、褥瘡
性潰瘍、または糖尿病性潰瘍;骨または軟骨のような結合組織の損傷;薬品損傷または熱
傷、特に第3度熱傷;偶発的な創傷;虚血性壊死のような壊死性創傷;感染創;全層植皮
片および分層植皮片のドナー部位;床擦れ;皮膚表面の創傷治癒の糖尿病誘発性の故障お
よび年齢誘発性の故障、ならびに瘢痕、例えば、ケロイド瘢痕、拘縮瘢痕、肥厚性瘢痕、
およびにきび瘢痕を含んでよい。創傷は、開放創であっても閉鎖創であってもよい。本明
細書中で用いられる「閉鎖」創は、1点にて開いており(例えば、外科的切開または偶発
的な切り傷)、そして縫合、ステープル、外科用接着剤等によって意図的に閉鎖されてい
る創傷を意味する。
真皮および表皮)および/または基礎となる結合組織の、あらゆる疾患によって特徴付け
られる障害、障害、症候群、異常、病理、または異常な症状が挙げられる)を回復するも
のと理解されるべきである。例えば、創傷は、小さな切り傷または擦り傷;中間層創傷;
複合/全層創傷;外傷性創傷、例えば、擦傷、裂傷;手術創;手術後の切り傷;褥瘡(p
ressure sore)のような慢性/非治癒性創傷または非治癒性糖尿病性足創傷
;潰瘍、特に静脈性潰瘍、褥瘡(decubitus)、感染に起因する皮膚潰瘍、褥瘡
性潰瘍、または糖尿病性潰瘍;骨または軟骨のような結合組織の損傷;薬品損傷または熱
傷、特に第3度熱傷;偶発的な創傷;虚血性壊死のような壊死性創傷;感染創;全層植皮
片および分層植皮片のドナー部位;床擦れ;皮膚表面の創傷治癒の糖尿病誘発性の故障お
よび年齢誘発性の故障、ならびに瘢痕、例えば、ケロイド瘢痕、拘縮瘢痕、肥厚性瘢痕、
およびにきび瘢痕を含んでよい。創傷は、開放創であっても閉鎖創であってもよい。本明
細書中で用いられる「閉鎖」創は、1点にて開いており(例えば、外科的切開または偶発
的な切り傷)、そして縫合、ステープル、外科用接着剤等によって意図的に閉鎖されてい
る創傷を意味する。
本明細書中で用いられる用語「全層創傷」は、真皮、組織の破壊、および真皮の血管の
破壊を指す。対照的に、「中間層創傷」は、真皮組織の破壊のみを指す。
破壊を指す。対照的に、「中間層創傷」は、真皮組織の破壊のみを指す。
D-デオキシリボースまたはE2の特定の一用途は、火傷による広範な全層創傷への使
用である。
用である。
本発明によれば、創傷治癒は、D-デオキシリボース糖またはE2を含む組成物の、創
傷床へのあらゆる適切な投与計画、手順、および/または投与経路を、対象に施すことに
よって達成され得る。
傷床へのあらゆる適切な投与計画、手順、および/または投与経路を、対象に施すことに
よって達成され得る。
本明細書中で用いられる用語「創傷床」は、皮膚組織の連続性の破壊が生じたときの身
体上の露出表面を指す。
体上の露出表面を指す。
創傷の回復は、創傷の完全な治癒または実質的に完全な治癒を意味し得、創傷組織は、
創傷以前と実質的に同じ状態に回復される。これ以外にも、創傷の回復は、創傷の部分的
な治癒を意味し得る。更なる選択肢において、創傷の回復は、線維性瘢痕組織の形成の引
下げを含み得る。創傷治癒は、治療目的に用いられても、非治療[美容]目的に用いられ
てもよい。
創傷以前と実質的に同じ状態に回復される。これ以外にも、創傷の回復は、創傷の部分的
な治癒を意味し得る。更なる選択肢において、創傷の回復は、線維性瘢痕組織の形成の引
下げを含み得る。創傷治癒は、治療目的に用いられても、非治療[美容]目的に用いられ
てもよい。
本明細書中で用いられる「誘発する」は、特定の現象を生じさせ、促進し、形成し、調
節し、または活性化する作用を指す。本明細書中で用いられる「増大させる」は、特定の
現象を促進または増強する作用を指す。
節し、または活性化する作用を指す。本明細書中で用いられる「増大させる」は、特定の
現象を促進または増強する作用を指す。
D-デオキシリボースまたはE2が、創傷床において血管新生を増大させ、または誘導
するのに用いられてもよい。これ以外にも、D-デオキシリボースまたはE2が、創傷床
において血管化を増大させ、または誘導するのに用いられてもよい。
するのに用いられてもよい。これ以外にも、D-デオキシリボースまたはE2が、創傷床
において血管化を増大させ、または誘導するのに用いられてもよい。
本明細書中で用いられる「血管化」は、未分化細胞または分化中の細胞に由来する血管
の新たな形成、成長、発達、または増殖を含む。適切には、血管は、内皮細胞の新たな生
成によって形成され得る。本明細書中で用いられる「血管新生」は、既存の血管構造から
の新しい血管構造(例えば、血管;例えば、静脈、動脈、細静脈、細動脈、毛細血管)の
形成を指す。例えば、血管新生は、既存の血管からの新しい血管の発芽(sprouti
ng)(血管新生の発芽)によって、かつ/または血管の分岐(branching)(
腸重積症の血管新生)によって起こり得る。特定の理論に縛られることを望むものではな
いが、D-デオキシリボースは、VEGFの誘導および/または刺激および/または生成
を介して、血管新生の化学的刺激を誘導し得る。VEGFは、血管新生の知られている化
学刺激因子である。
の新たな形成、成長、発達、または増殖を含む。適切には、血管は、内皮細胞の新たな生
成によって形成され得る。本明細書中で用いられる「血管新生」は、既存の血管構造から
の新しい血管構造(例えば、血管;例えば、静脈、動脈、細静脈、細動脈、毛細血管)の
形成を指す。例えば、血管新生は、既存の血管からの新しい血管の発芽(sprouti
ng)(血管新生の発芽)によって、かつ/または血管の分岐(branching)(
腸重積症の血管新生)によって起こり得る。特定の理論に縛られることを望むものではな
いが、D-デオキシリボースは、VEGFの誘導および/または刺激および/または生成
を介して、血管新生の化学的刺激を誘導し得る。VEGFは、血管新生の知られている化
学刺激因子である。
これ以外にも、D-デオキシリボースまたはE2が、脱毛の処置に用いられてもよい。
適切には、D-デオキシリボースまたはE2が、毛の再成長を増大させ、または誘導する
のに用いられ得る。D-デオキシリボースまたはE2が、脱毛を遅らせ、予防し、または
最小限に抑えるのに用いられてもよい。この目的のために、D-デオキシリボースが、治
療的用途および非治療的[美容]用途の双方を有してもよいことが意図される。
適切には、D-デオキシリボースまたはE2が、毛の再成長を増大させ、または誘導する
のに用いられ得る。D-デオキシリボースまたはE2が、脱毛を遅らせ、予防し、または
最小限に抑えるのに用いられてもよい。この目的のために、D-デオキシリボースが、治
療的用途および非治療的[美容]用途の双方を有してもよいことが意図される。
適切には、D-デオキシリボースまたはE2が、脱毛症を処置するのに用いられてもよ
い。本明細書中で用いられる「脱毛症」は、あらゆる形態の医療的脱毛を包含する一般用
語である。脱毛症は、卵胞の欠如、破壊(瘢痕化である場合がある)、疾患、感染、収縮
、調節不全(毛周期の変化)、または完全なシャットダウン/休眠に起因し得る。これら
の変化は、一時的または永続的、部分的、地域的、かつ/または明らかに全体的なもので
あり得る。
い。本明細書中で用いられる「脱毛症」は、あらゆる形態の医療的脱毛を包含する一般用
語である。脱毛症は、卵胞の欠如、破壊(瘢痕化である場合がある)、疾患、感染、収縮
、調節不全(毛周期の変化)、または完全なシャットダウン/休眠に起因し得る。これら
の変化は、一時的または永続的、部分的、地域的、かつ/または明らかに全体的なもので
あり得る。
用語脱毛症の使用によって包含される特定のタイプの脱毛症の例が、以下からなる群か
ら選択される:アンドロゲン性脱毛症;円形脱毛症;完全脱毛症;全身性脱毛症;休止期
脱毛症;成長期脱毛症;外傷性脱毛症;ヘアスタイリングルーチン由来の機械的牽引性脱
毛症;化学物質誘発性脱毛症;熱誘発性脱毛症;放射線誘発性脱毛症;化学療法誘発性脱
毛症;瘢痕性脱毛症;自己免疫疾患誘発性脱毛症(例えば、円板状エリテマトーデスまた
は慢性皮膚エリテマトーデス由来);疾患関連脱毛症(例えば、甲状腺機能亢進症または
甲状腺機能低下症、鉄欠乏症由来);薬物誘発性脱毛症(例えば、抗生物質および抗真菌
薬;抗鬱薬、抗痙攣薬;抗凝固剤、例えばヘパリンおよび一部のLMWH;NSAID、
例えばアスピリン;降圧薬、ホルモン補充療法によって誘発される脱毛症)、および梅毒
性脱毛症。
ら選択される:アンドロゲン性脱毛症;円形脱毛症;完全脱毛症;全身性脱毛症;休止期
脱毛症;成長期脱毛症;外傷性脱毛症;ヘアスタイリングルーチン由来の機械的牽引性脱
毛症;化学物質誘発性脱毛症;熱誘発性脱毛症;放射線誘発性脱毛症;化学療法誘発性脱
毛症;瘢痕性脱毛症;自己免疫疾患誘発性脱毛症(例えば、円板状エリテマトーデスまた
は慢性皮膚エリテマトーデス由来);疾患関連脱毛症(例えば、甲状腺機能亢進症または
甲状腺機能低下症、鉄欠乏症由来);薬物誘発性脱毛症(例えば、抗生物質および抗真菌
薬;抗鬱薬、抗痙攣薬;抗凝固剤、例えばヘパリンおよび一部のLMWH;NSAID、
例えばアスピリン;降圧薬、ホルモン補充療法によって誘発される脱毛症)、および梅毒
性脱毛症。
この用語の下で考慮されることとなる他の症状の例は、以下の通りである:下垂体機能
不全、例えば、シモンズ病およびシーハン症候群;他の内分泌障害、例えば、甲状腺機能
低下症、糖尿病、副腎形成不全;慢性疾患、例えば、エリテマトーデス、腫瘍(neop
lasma);連珠毛;擬似連珠毛;頭皮の遺伝性貧毛シンプレックス(heredil
ary hypotrichosis simplex);側頭部先天性三角形脱毛症;
頭蓋縫合の脱毛症-ハラーマン・シュタイフ症候群;遺伝性瘢痕性脱毛症、例えばマリー
・ウンナ型全身性白癬、びまん性先天性瘢痕濾胞性角化症;表皮母斑-良性上皮過誤腫お
よび/または悪性腫瘍もしくは良性腫瘍;身体的外傷、例えば、自動車事故、スポーツ傷
害;術後;抗腫瘍剤、例えば細胞増殖抑制剤および/またはアルキル化剤;化学的外傷、
例えばチオグリコラート、代謝拮抗薬;電離放射線;有毒薬物、例えばタリウム、ビタミ
ンA;自傷的な身体的外傷、例えば抜毛症;細菌、例えば膿皮症(Pyodermiti
s)、ボクハートの膿痂疹;糸状菌/真菌、例えばカンジダ症、皮膚糸状菌症;偶発的な
外傷/摩擦、例えば帽子、美容院等。関連する用語は、毛の生産の低下として定義される
減毛症である。
不全、例えば、シモンズ病およびシーハン症候群;他の内分泌障害、例えば、甲状腺機能
低下症、糖尿病、副腎形成不全;慢性疾患、例えば、エリテマトーデス、腫瘍(neop
lasma);連珠毛;擬似連珠毛;頭皮の遺伝性貧毛シンプレックス(heredil
ary hypotrichosis simplex);側頭部先天性三角形脱毛症;
頭蓋縫合の脱毛症-ハラーマン・シュタイフ症候群;遺伝性瘢痕性脱毛症、例えばマリー
・ウンナ型全身性白癬、びまん性先天性瘢痕濾胞性角化症;表皮母斑-良性上皮過誤腫お
よび/または悪性腫瘍もしくは良性腫瘍;身体的外傷、例えば、自動車事故、スポーツ傷
害;術後;抗腫瘍剤、例えば細胞増殖抑制剤および/またはアルキル化剤;化学的外傷、
例えばチオグリコラート、代謝拮抗薬;電離放射線;有毒薬物、例えばタリウム、ビタミ
ンA;自傷的な身体的外傷、例えば抜毛症;細菌、例えば膿皮症(Pyodermiti
s)、ボクハートの膿痂疹;糸状菌/真菌、例えばカンジダ症、皮膚糸状菌症;偶発的な
外傷/摩擦、例えば帽子、美容院等。関連する用語は、毛の生産の低下として定義される
減毛症である。
適切には、D-デオキシリボース糖またはE2を含む組成物が、単離された毛包に塗布
されてもよい。本明細書中で用いられる用語「毛包」は、毛繊維が発達し得る表皮に由来
する管様構造を指す。毛包は典型的に、以下の構造で構成される:乳頭、マトリックス、
根鞘、皮脂腺、および場合によっては毛繊維(毛幹および毛根で構成される)。毛繊維は
、脱毛症の程度に応じて、または形成された毛包の発達の程度および段階に応じて、直径
が減少し得、またはまったく存在し得ない。
されてもよい。本明細書中で用いられる用語「毛包」は、毛繊維が発達し得る表皮に由来
する管様構造を指す。毛包は典型的に、以下の構造で構成される:乳頭、マトリックス、
根鞘、皮脂腺、および場合によっては毛繊維(毛幹および毛根で構成される)。毛繊維は
、脱毛症の程度に応じて、または形成された毛包の発達の程度および段階に応じて、直径
が減少し得、またはまったく存在し得ない。
適切には、D-デオキシリボースまたはE2には担体が提供されてもよい。担体は、好
ましくは、ゲル、より好ましくはヒドロゲル、または生体適合性マトリックス材料、好ま
しくは電界紡糸足場、粒子、創傷包帯、または綿棒から選択され、D-デオキシリボース
またはE2を含有する溶液が含浸される。担体は、定義された表面を持たず、特定の形状
または固体マトリックスを欠くアモルファス材料からなってもよい。
ましくは、ゲル、より好ましくはヒドロゲル、または生体適合性マトリックス材料、好ま
しくは電界紡糸足場、粒子、創傷包帯、または綿棒から選択され、D-デオキシリボース
またはE2を含有する溶液が含浸される。担体は、定義された表面を持たず、特定の形状
または固体マトリックスを欠くアモルファス材料からなってもよい。
適切には、D-デオキシリボースまたはE2を放出する担体が、新しい血管の内方成長
を刺激し、そして薄い皮膚移植片または自己由来培養ケラチノサイトによるその後の移植
のための血管化された創傷床を提供して、永続的な皮膚バリア層を提供することとなるた
め、真皮の代替物として作用し得る。
を刺激し、そして薄い皮膚移植片または自己由来培養ケラチノサイトによるその後の移植
のための血管化された創傷床を提供して、永続的な皮膚バリア層を提供することとなるた
め、真皮の代替物として作用し得る。
担体は、抗菌剤として作用する物質、例えば銀またはセリウムをさらに含んでもよい。
これらの担体は、創傷中へのD-デオキシリボースまたはE2の持続放出に適し得る。
D-デオキシリボースまたはE2と担体との調製物が、局所投与に特に適している。
D-デオキシリボースまたはE2と担体との調製物が、局所投与に特に適している。
適切には、D-デオキシリボースまたはE2は、生体適合性マトリックス材料と共に製
剤化されてもよいし、生体適合性マトリックス材料に結合されてもよい。本明細書中で用
いられるマトリックス材料は、細胞の動員、付着、増殖、および分化用の担体または足場
、ならびにD-デオキシリボースまたはE2の潜在的な送達および貯蔵デバイスを意味す
る。
剤化されてもよいし、生体適合性マトリックス材料に結合されてもよい。本明細書中で用
いられるマトリックス材料は、細胞の動員、付着、増殖、および分化用の担体または足場
、ならびにD-デオキシリボースまたはE2の潜在的な送達および貯蔵デバイスを意味す
る。
生体適合性マトリックス材料の調製は、当該分野において周知である。生体適合性マト
リックスは好ましくは、創傷治癒を支援し、かつ/または創傷床において血管新生もしく
は血管化を増大させ、もしくは誘導する。
リックスは好ましくは、創傷治癒を支援し、かつ/または創傷床において血管新生もしく
は血管化を増大させ、もしくは誘導する。
適切には、生体適合性マトリックス材料は、ポリマー材料を含んでよい。ポリマー材料
は、2つ以上の異なるポリマー物質のホモポリマーもしくはヘテロポリマー/コポリマー
、または2つの組み合わせを含んでよい。本明細書中で用いられる用語「ポリマー」は、
モノマーと呼ばれる5つ以上の同一の結合単位の化学結合によって形成される高分子、例
えば糖を指す。ポリマーは、天然由来[例えば、多糖類、例えば、デンプン、セルロース
、ペクチン、海藻ゴム、植物ゴム;ポリペプチド、例えば、カゼイン、アルブミン、グロ
ブリン、ケラチン、インスリン、DNA;および炭化水素]、合成[例えば、熱可塑性(
未加硫エラストマー、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポリ(フッ化ビニリデントリフルオロ
エチレン)直鎖状ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、アクリ
ラート樹脂);熱硬化性(例えば、加硫エラストマー、架橋ポリエチレン、フェノール、
アルキド、ポリエステル)、および半合成(例えば、セルロース系、例えば、レーヨン、
メチルセルロース、酢酸セルロース;および加工デンプン)であってもよい。用語「ホモ
ポリマー」は、単一のモノマーに由来する天然または合成ポリマーを指す。用語「ヘテロ
ポリマー」は、複数のモノマーサブユニットに由来する天然または合成ポリマー(すなわ
ちコポリマー)を指す。特に明記しない限り、用語「ポリマー」は、一般に、本明細書中
に記載されるホモポリマーおよびヘテロポリマー(すなわちコポリマー)の双方を指すの
に用いられる。
は、2つ以上の異なるポリマー物質のホモポリマーもしくはヘテロポリマー/コポリマー
、または2つの組み合わせを含んでよい。本明細書中で用いられる用語「ポリマー」は、
モノマーと呼ばれる5つ以上の同一の結合単位の化学結合によって形成される高分子、例
えば糖を指す。ポリマーは、天然由来[例えば、多糖類、例えば、デンプン、セルロース
、ペクチン、海藻ゴム、植物ゴム;ポリペプチド、例えば、カゼイン、アルブミン、グロ
ブリン、ケラチン、インスリン、DNA;および炭化水素]、合成[例えば、熱可塑性(
未加硫エラストマー、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポリ(フッ化ビニリデントリフルオロ
エチレン)直鎖状ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、アクリ
ラート樹脂);熱硬化性(例えば、加硫エラストマー、架橋ポリエチレン、フェノール、
アルキド、ポリエステル)、および半合成(例えば、セルロース系、例えば、レーヨン、
メチルセルロース、酢酸セルロース;および加工デンプン)であってもよい。用語「ホモ
ポリマー」は、単一のモノマーに由来する天然または合成ポリマーを指す。用語「ヘテロ
ポリマー」は、複数のモノマーサブユニットに由来する天然または合成ポリマー(すなわ
ちコポリマー)を指す。特に明記しない限り、用語「ポリマー」は、一般に、本明細書中
に記載されるホモポリマーおよびヘテロポリマー(すなわちコポリマー)の双方を指すの
に用いられる。
本明細書中で用いられる用語「生体適合性材料」または「生体適合性マトリックス材料
」は、マトリックス材料が、所望される創傷床に配置または移植された場合の重度の応答
または段階的応答とは対照的に、材料が応答を刺激しない、または軽度かつ/もしくは一
時的な応答のみを刺激することを意味する。
」は、マトリックス材料が、所望される創傷床に配置または移植された場合の重度の応答
または段階的応答とは対照的に、材料が応答を刺激しない、または軽度かつ/もしくは一
時的な応答のみを刺激することを意味する。
生体適合性マトリックス材料として、例えば、合成または天然に存在するマトリックス
、例えば、コラーゲン、無細胞マトリックス、架橋生体足場分子、組織ベースの生体工学
的構造フレームワーク、バイオ製造されたバイオプロテーゼ、ならびに他の移植構造、例
えば、創傷治癒の促進に有用な細胞浸潤および細胞増殖に適した血管移植片が挙げられ得
る。追加の適切な生体適合性マトリックス材料として、抗原性および免疫原性を引き下げ
るように化学的に修飾されたコラーゲン組織が挙げられ得る。他の適切な例として、創傷
包帯用コラーゲンシート、無抗原もしくは抗原低減無細胞マトリックス(Wilson
G J et al. (1990) Trans Am Soc Artif Int
ern 36:340-343)、または異種移植片材料に対する抗原応答を引き下げる
ように設計された他の生体適合性マトリックスが挙げられる。創傷治癒の促進に有用な他
のマトリックスとして、例えば、不溶性コラーゲンおよびエラスチンを含む加工処理され
たウシ心膜タンパク質(Courtman DW et al. (1994) J B
iomed Mater Res 28:655-666)、および組織再生を促進する
ための宿主細胞移動用の天然の微小環境を提供するのに有用であり得る他の無細胞組織(
Malone J M et al. (1984) J Vasc Surg 1:1
81-91)が挙げられ得る。
、例えば、コラーゲン、無細胞マトリックス、架橋生体足場分子、組織ベースの生体工学
的構造フレームワーク、バイオ製造されたバイオプロテーゼ、ならびに他の移植構造、例
えば、創傷治癒の促進に有用な細胞浸潤および細胞増殖に適した血管移植片が挙げられ得
る。追加の適切な生体適合性マトリックス材料として、抗原性および免疫原性を引き下げ
るように化学的に修飾されたコラーゲン組織が挙げられ得る。他の適切な例として、創傷
包帯用コラーゲンシート、無抗原もしくは抗原低減無細胞マトリックス(Wilson
G J et al. (1990) Trans Am Soc Artif Int
ern 36:340-343)、または異種移植片材料に対する抗原応答を引き下げる
ように設計された他の生体適合性マトリックスが挙げられる。創傷治癒の促進に有用な他
のマトリックスとして、例えば、不溶性コラーゲンおよびエラスチンを含む加工処理され
たウシ心膜タンパク質(Courtman DW et al. (1994) J B
iomed Mater Res 28:655-666)、および組織再生を促進する
ための宿主細胞移動用の天然の微小環境を提供するのに有用であり得る他の無細胞組織(
Malone J M et al. (1984) J Vasc Surg 1:1
81-91)が挙げられ得る。
適切には、生体適合性マトリックス材料は、足場を形成する電界紡糸によって形成され
得る。電界紡糸のプロセスは、ポリマーマトリックス材料を合成するために、射出可能な
ポリマー溶液に高電圧を印加することを含む。印加される高電圧は、ポリマー溶液の表面
張力を克服するのに十分であり、これがポリマー液滴を引き延ばすことによって、ランダ
ムな向きの不織布マトリックス、マット、またはメッシュを形成する微細繊維となる。電
界紡糸は典型的に、相互に関連する孔を備えた数百ナノメートルの範囲の繊維径を有する
不織(すなわちメッシュ)マトリックス(マットおよび/または足場とも呼ばれる)を生
成する。電界紡糸プロセスは典型的に、いかなるビーズ繊維も実質的に含まない滑らかな
表面の形成をもたらす。マトリックス繊維は、ランダムな、かつ/もしくはアラインされ
たナノ繊維、またはそれらの組合せの不織布メッシュを含んでもよい。適切には、D-デ
オキシリボース糖が担持されると、ナノ繊維は典型的に、直径が大きくなることとなる。
例えば、担持された繊維は、直径が約0.2ミクロンから約5.0ミクロンになり得る。
得る。電界紡糸のプロセスは、ポリマーマトリックス材料を合成するために、射出可能な
ポリマー溶液に高電圧を印加することを含む。印加される高電圧は、ポリマー溶液の表面
張力を克服するのに十分であり、これがポリマー液滴を引き延ばすことによって、ランダ
ムな向きの不織布マトリックス、マット、またはメッシュを形成する微細繊維となる。電
界紡糸は典型的に、相互に関連する孔を備えた数百ナノメートルの範囲の繊維径を有する
不織(すなわちメッシュ)マトリックス(マットおよび/または足場とも呼ばれる)を生
成する。電界紡糸プロセスは典型的に、いかなるビーズ繊維も実質的に含まない滑らかな
表面の形成をもたらす。マトリックス繊維は、ランダムな、かつ/もしくはアラインされ
たナノ繊維、またはそれらの組合せの不織布メッシュを含んでもよい。適切には、D-デ
オキシリボース糖が担持されると、ナノ繊維は典型的に、直径が大きくなることとなる。
例えば、担持された繊維は、直径が約0.2ミクロンから約5.0ミクロンになり得る。
電界紡糸ナノ繊維は、ポリカプロラクトンを含んでよい。有利には、ポリカプロラクト
ンは生分解性である。適切には、ポリカプロラクトンの代わりに他の生分解性ポリマーが
用いられてもよい。適切な代替品となり得る他の適切な生分解性ポリマーの例として、ポ
リ乳酸(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(P
LGA)、およびポリ(3-ヒドロキシブチラート-co-3-ヒドロキシバレラート)
PHBVが挙げられる。
ンは生分解性である。適切には、ポリカプロラクトンの代わりに他の生分解性ポリマーが
用いられてもよい。適切な代替品となり得る他の適切な生分解性ポリマーの例として、ポ
リ乳酸(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(P
LGA)、およびポリ(3-ヒドロキシブチラート-co-3-ヒドロキシバレラート)
PHBVが挙げられる。
本明細書中で用いられる用語「生分解性」材料は、標準的なインビボ生理的条件下で有
限期間にわたって、代謝または排泄され得、かつインビボで分解する際に有害な影響のな
い成分に分解することができるものである。
限期間にわたって、代謝または排泄され得、かつインビボで分解する際に有害な影響のな
い成分に分解することができるものである。
これ以外にも、担体は、ヒドロゲルであってもよい。ヒドロゲルは、天然または合成の
ポリマー骨格鎖に結合した親水性官能基のネットワークを構成する。ヒドロゲルは、水性
分散媒を有するコロイドゲルを含んでもよい。ポリマー鎖からの親水性官能基の突出によ
り、ヒドロゲルの吸収性が高くなり得る(水を99.9%超含有し得るものもある)。ヒ
ドロゲルの高い液体含有量により、ヒドロゲルは、天然組織に匹敵する程度の柔軟性を有
し得る。ヒドロゲルの吸収性により、ヒドロゲルは局所薬物送達用のリザーバとしても作
用し得る。ヒドロゲルは、架橋ヒドロゲルであってもよい。ヒドロゲルの架橋は、溶解を
防ぐことができる。架橋は、適切な架橋剤と反応させることによって達成され得る。適切
なヒドロゲルとして、例えば、水に不溶性であり、かつ膨潤によって水溶液と相互作用す
る架橋親水性ポリマーの三次元ネットワークが挙げられ得る。例示的なヒドロゲルは、高
度に適合性かつ透過性であり、その組成に応じて、様々な量の水溶液を吸収することがで
きる。適切には、ヒドロゲルは、処置部位に対して非粘着性であり得、または取外しが容
易になるように処理され得る。
ポリマー骨格鎖に結合した親水性官能基のネットワークを構成する。ヒドロゲルは、水性
分散媒を有するコロイドゲルを含んでもよい。ポリマー鎖からの親水性官能基の突出によ
り、ヒドロゲルの吸収性が高くなり得る(水を99.9%超含有し得るものもある)。ヒ
ドロゲルの高い液体含有量により、ヒドロゲルは、天然組織に匹敵する程度の柔軟性を有
し得る。ヒドロゲルの吸収性により、ヒドロゲルは局所薬物送達用のリザーバとしても作
用し得る。ヒドロゲルは、架橋ヒドロゲルであってもよい。ヒドロゲルの架橋は、溶解を
防ぐことができる。架橋は、適切な架橋剤と反応させることによって達成され得る。適切
なヒドロゲルとして、例えば、水に不溶性であり、かつ膨潤によって水溶液と相互作用す
る架橋親水性ポリマーの三次元ネットワークが挙げられ得る。例示的なヒドロゲルは、高
度に適合性かつ透過性であり、その組成に応じて、様々な量の水溶液を吸収することがで
きる。適切には、ヒドロゲルは、処置部位に対して非粘着性であり得、または取外しが容
易になるように処理され得る。
適切には、ヒドロゲルは好ましくは、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース
、メチルセルロース、コラーゲン、ヒアルロナン、またはそれらのあらゆる組合せの少な
くとも1つを含んでよい。好ましくは、ヒドロゲルは、キトサンおよびコラーゲンを含ん
でよい。これ以外にも、有機化学ヒドロゲルは、豊富な親水基を有するポリビニルアルコ
ール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリラートポリマー、およびコポリマーを含んでも
よい。
、メチルセルロース、コラーゲン、ヒアルロナン、またはそれらのあらゆる組合せの少な
くとも1つを含んでよい。好ましくは、ヒドロゲルは、キトサンおよびコラーゲンを含ん
でよい。これ以外にも、有機化学ヒドロゲルは、豊富な親水基を有するポリビニルアルコ
ール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリラートポリマー、およびコポリマーを含んでも
よい。
適切には、担体は、アスコルビン酸またはその誘導体、例えば、L-アスコルビン酸ま
たはアスコルビン酸2-リン酸を含む(Mangir et al Acta Biom
ater. 2016 Jan 1; 29: 188-197.doi: 10.1
016/j.actbio.2015.10.019)
たはアスコルビン酸2-リン酸を含む(Mangir et al Acta Biom
ater. 2016 Jan 1; 29: 188-197.doi: 10.1
016/j.actbio.2015.10.019)
用語「創傷包帯」は、創傷に局所的に当てるための包帯を指し、全身投与に適した組成
物を除外する。例えば、D-デオキシリボース糖またはE2は、織布または不織布の布地
材料等の創傷接触材料の固体シートの中または上に分散されてもよいし、ポリウレタンフ
ォーム等のフォームの層中に、またはヒドロゲル、例えば、ポリキトサンヒドロゲル、ポ
リビニルアルコール、ポリアクリラートヒドロゲル、ゼラチン、メチルセルロース、アガ
ロース、アルギナート、ヒアルロン酸ヒドロゲル、またはそれらのあらゆる組合せ中に、
例えばゲルまたは軟膏中に分散されてもよい。適切には、D-デオキシリボース糖または
E2は、創傷中への活性成分の持続放出を実現する生分解性シート材料、例えば凍結乾燥
キトサン/ポリビニルアルコール混合物のシートの中または上に分散される。
物を除外する。例えば、D-デオキシリボース糖またはE2は、織布または不織布の布地
材料等の創傷接触材料の固体シートの中または上に分散されてもよいし、ポリウレタンフ
ォーム等のフォームの層中に、またはヒドロゲル、例えば、ポリキトサンヒドロゲル、ポ
リビニルアルコール、ポリアクリラートヒドロゲル、ゼラチン、メチルセルロース、アガ
ロース、アルギナート、ヒアルロン酸ヒドロゲル、またはそれらのあらゆる組合せ中に、
例えばゲルまたは軟膏中に分散されてもよい。適切には、D-デオキシリボース糖または
E2は、創傷中への活性成分の持続放出を実現する生分解性シート材料、例えば凍結乾燥
キトサン/ポリビニルアルコール混合物のシートの中または上に分散される。
適切には、D-デオキシリボースもしくはE2は、直接塗布用の液体、半固体、もしく
は固体組成物の形態で提供されてもよく、または組成物は、固体接触層、例えば、創傷包
帯、ヒドロゲル、足場、もしくはマトリックスの表面に塗布され、もしくはその中に組み
込まれる。包帯組成物は、例えば、流体またはゲルの形態で提供されてもよい。
は固体組成物の形態で提供されてもよく、または組成物は、固体接触層、例えば、創傷包
帯、ヒドロゲル、足場、もしくはマトリックスの表面に塗布され、もしくはその中に組み
込まれる。包帯組成物は、例えば、流体またはゲルの形態で提供されてもよい。
適切なアモルファスヒドロゲル包帯は、例えば、水分を供与し、かつ湿った治癒環境を
維持し、かつ/または創傷部位を再水和するように設計された、水、ポリマー、および形
状のない他の成分の製剤を含んでよい。ヒドロゲルは、二次包帯カバーと併用されてもよ
い。
維持し、かつ/または創傷部位を再水和するように設計された、水、ポリマー、および形
状のない他の成分の製剤を含んでよい。ヒドロゲルは、二次包帯カバーと併用されてもよ
い。
ヒドロゲル包帯として、例えば、アモルファスヒドロゲルで飽和したガーゼおよび不織
スポンジ、ロープ、ならびにストリップが挙げられ得る。適切な含浸包帯として、例えば
、溶液、エマルジョン、油、ゲル、または他のいくつかの薬学的に活性な化合物もしくは
担体剤(例えば、生理食塩水、油、亜鉛塩、ペトロラタム、キセロホルム、およびスカー
レットレッド、ならびに本明細書中に記載される化合物が挙げられる)で飽和したガーゼ
および不織スポンジ、ロープ、ならびにストリップが挙げられ得る。
スポンジ、ロープ、ならびにストリップが挙げられ得る。適切な含浸包帯として、例えば
、溶液、エマルジョン、油、ゲル、または他のいくつかの薬学的に活性な化合物もしくは
担体剤(例えば、生理食塩水、油、亜鉛塩、ペトロラタム、キセロホルム、およびスカー
レットレッド、ならびに本明細書中に記載される化合物が挙げられる)で飽和したガーゼ
および不織スポンジ、ロープ、ならびにストリップが挙げられ得る。
適切なシリコーンゲルシート包帯として、例えば、メッシュもしくは布で強化された、
またはこれに結合された架橋ポリマーで構成されるソフトカバーが挙げられ得る。
またはこれに結合された架橋ポリマーで構成されるソフトカバーが挙げられ得る。
適切な液体包帯は、例えば、細胞外マトリックス内に見られる多タンパク質材料および
他の要素の混合物を含んでよい。溶液は、デブリードマンおよびクレンジング後の処置部
位に塗布されてから、吸収性包帯または非接着パッドで覆われてもよい。
他の要素の混合物を含んでよい。溶液は、デブリードマンおよびクレンジング後の処置部
位に塗布されてから、吸収性包帯または非接着パッドで覆われてもよい。
適切な透明フィルム包帯は、片面に接着剤でコーティングされた様々な厚さのポリマー
膜を含んでよい。透明なフィルムは、液体、水、および細菌に対して不浸透性であり得る
が、水蒸気および大気ガスに対して浸透性であり得る。フィルムの透明性は、処置部位の
視覚化を可能にし得る。
膜を含んでよい。透明なフィルムは、液体、水、および細菌に対して不浸透性であり得る
が、水蒸気および大気ガスに対して浸透性であり得る。フィルムの透明性は、処置部位の
視覚化を可能にし得る。
適切な充填剤包帯は、例えば、ビーズ、クリーム、フォーム、ゲル、軟膏、パッド、ペ
ースト、ピロー、粉末、ストランド、または他の製剤を含んでよい。充填剤は、非粘着性
であってもよいし、徐放性抗菌剤を含んでもよい。例示的な充填剤は、湿潤環境を維持す
るのに、滲出物を管理するのに、そして、例えば、中間層創傷および全層創傷、感染創傷
、排液性創傷、ならびにパッキングを必要とする深部創傷の処置に有用であり得る。
ースト、ピロー、粉末、ストランド、または他の製剤を含んでよい。充填剤は、非粘着性
であってもよいし、徐放性抗菌剤を含んでもよい。例示的な充填剤は、湿潤環境を維持す
るのに、滲出物を管理するのに、そして、例えば、中間層創傷および全層創傷、感染創傷
、排液性創傷、ならびにパッキングを必要とする深部創傷の処置に有用であり得る。
D-デオキシリボースまたはE2は、局所塗布用の従来の薬学的賦形剤と組み合わせて
提供されてもよい。適切な薬学的担体として:プルロニックゲル、ポラキサマーゲル、ヒ
ドロゲル(ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびそれらの混合物が挙げられ
るセルロース誘導体を含有する)、およびポリアクリル酸を含有するヒドロゲル(Car
bopols)が挙げられる。
提供されてもよい。適切な薬学的担体として:プルロニックゲル、ポラキサマーゲル、ヒ
ドロゲル(ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびそれらの混合物が挙げられ
るセルロース誘導体を含有する)、およびポリアクリル酸を含有するヒドロゲル(Car
bopols)が挙げられる。
また、他の適切な担体として、局所薬学的調製物に用いられるクリーム/軟膏、例えば
、セトマクロゴール乳化軟膏に基づくクリームが挙げられる。上記の担体は、アルギナー
ト(増粘剤または刺激剤として)、防腐剤、例えばベンジルアルコール、pHを制御する
バッファ、例えばリン酸水素二ナトリウム/リン酸二水素ナトリウム、浸透圧を調整する
剤、例えば塩化ナトリウム、および安定剤、例えばEDTAを含んでよい。
、セトマクロゴール乳化軟膏に基づくクリームが挙げられる。上記の担体は、アルギナー
ト(増粘剤または刺激剤として)、防腐剤、例えばベンジルアルコール、pHを制御する
バッファ、例えばリン酸水素二ナトリウム/リン酸二水素ナトリウム、浸透圧を調整する
剤、例えば塩化ナトリウム、および安定剤、例えばEDTAを含んでよい。
好ましい製剤として、局所投与用の製剤がある。また、創傷床への長期間にわたる制御
送達用のリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、微粒子、またはベシクル中へのD
-デオキシリボースまたはE2の組込みを含む組成物も含まれる。
送達用のリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、微粒子、またはベシクル中へのD
-デオキシリボースまたはE2の組込みを含む組成物も含まれる。
薬学的組成物は、先で記載されるように、好ましくはコラーゲン、ゼラチン、キトサン
、および/またはヒアルロナンを含む、生体適合性マトリックスと共に製剤化され、また
はこれに結合されたD-デオキシリボースまたはE2を含んでよい。薬学的組成物はまた
、上記のD-デオキシリボースまたはE2を有するヒドロゲルを含んでもよい。
、および/またはヒアルロナンを含む、生体適合性マトリックスと共に製剤化され、また
はこれに結合されたD-デオキシリボースまたはE2を含んでよい。薬学的組成物はまた
、上記のD-デオキシリボースまたはE2を有するヒドロゲルを含んでもよい。
薬学的組成物は、銀またはセリウム等の抗菌剤を含んでもよい。
特に、本発明は、医薬として用いられる薬学的組成物を提供する。特定の用途は、上記
の創傷治癒および/または血管新生の刺激である。別の用途は、上記の脱毛症および他の
関連障害の処置である。更なる選択肢は、脱毛の美容処置である。
の創傷治癒および/または血管新生の刺激である。別の用途は、上記の脱毛症および他の
関連障害の処置である。更なる選択肢は、脱毛の美容処置である。
また、特に、創傷を有する、またはそのような処置を必要とする対象への、例えば血管
新生を刺激する、in vivo方法の使用も提供される。
新生を刺激する、in vivo方法の使用も提供される。
本明細書中で用いられる「局所投与」は、明確な表面への、例えば、直接的な創傷表面
への、または創傷が閉鎖されているならば、閉鎖部の周囲または閉鎖部内の領域への投与
を意味する。
への、または創傷が閉鎖されているならば、閉鎖部の周囲または閉鎖部内の領域への投与
を意味する。
本明細書中で用いられ、本発明の全ての態様に従う用語「対象」は、脊椎動物を指す。
対象は、好ましくは、ヒト、獣医動物または農場の動物、家畜またはペット、および臨床
研究に通常使用される動物(非ヒト霊長類、イヌ、ラット、およびマウスが挙げられる)
が挙げられる哺乳類動物を指す。より詳細には、本発明の対象はヒトであってもよい。
対象は、好ましくは、ヒト、獣医動物または農場の動物、家畜またはペット、および臨床
研究に通常使用される動物(非ヒト霊長類、イヌ、ラット、およびマウスが挙げられる)
が挙げられる哺乳類動物を指す。より詳細には、本発明の対象はヒトであってもよい。
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、文言「含む」および「含有する」、な
らびにそれらの変形は、「含むが、これに限定されない」を意味し、他の部分、付加物、
成分、整数、または工程を除外することが意図されない(そして除外しない)。本明細書
の記載および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈上別段の解釈が必要でない限り、
複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、本明細書は、文脈上別段の解釈が
必要でない限り、複数性および単数性を意図すると理解されるべきである。
らびにそれらの変形は、「含むが、これに限定されない」を意味し、他の部分、付加物、
成分、整数、または工程を除外することが意図されない(そして除外しない)。本明細書
の記載および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈上別段の解釈が必要でない限り、
複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、本明細書は、文脈上別段の解釈が
必要でない限り、複数性および単数性を意図すると理解されるべきである。
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載される特徴、整数、特性
、化合物、化学部分、または基は、本明細書中に記載される他のあらゆる態様、実施形態
、または実施例に、これらと矛盾しない限り、適用可能であると理解されるべきである。
本明細書(添付の特許請求の範囲、要約、および図面を全て含む)に開示される全ての特
徴、および/またはそこに開示されるあらゆる方法またはプロセスの全ての工程は、その
ような特徴および/または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組合せを除くあら
ゆる組合せで組み合わされてもよい。本発明は、前述のいかなる実施形態の詳細にも制限
されない。本発明は、本明細書(添付の特許請求の範囲、要約、および図面を全て含む)
に開示される特徴の新規なあらゆるもの、または新規なあらゆる組合せ、あるいはそのよ
うに開示されるあらゆる方法もしくはプロセスの工程の新規なあらゆるもの、または新規
なあらゆる組合せに及ぶ。
、化合物、化学部分、または基は、本明細書中に記載される他のあらゆる態様、実施形態
、または実施例に、これらと矛盾しない限り、適用可能であると理解されるべきである。
本明細書(添付の特許請求の範囲、要約、および図面を全て含む)に開示される全ての特
徴、および/またはそこに開示されるあらゆる方法またはプロセスの全ての工程は、その
ような特徴および/または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組合せを除くあら
ゆる組合せで組み合わされてもよい。本発明は、前述のいかなる実施形態の詳細にも制限
されない。本発明は、本明細書(添付の特許請求の範囲、要約、および図面を全て含む)
に開示される特徴の新規なあらゆるもの、または新規なあらゆる組合せ、あるいはそのよ
うに開示されるあらゆる方法もしくはプロセスの工程の新規なあらゆるもの、または新規
なあらゆる組合せに及ぶ。
読者は、本出願に関連する本明細書と同時に、または本明細書の前に提出されており、
かつ本明細書と共に公衆の閲覧に付された全ての論文および文書に留意し、そのような全
ての論文および文書の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
かつ本明細書と共に公衆の閲覧に付された全ての論文および文書に留意し、そのような全
ての論文および文書の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
[実験セクション1] 材料
ポリカプロラクトン(Mw:45,000)、L-ラムノース、およびNaOHを、S
igma-Aldrich(USA)から購入した。キトサン(CS)を、Mian S
cientific Company、Lahore、Pakistanから購入して、
本発明者らのラボにおいてさらに精製した(脱アセチル化度(DD)84%;Mw:87
047.26g/mol)(Farooq et al., Materials Sc
ience and Engineering: C. 2015)。コラーゲンを、M
ian ScientificのサプライヤーLahoreから購入した。ポリ(ビニル
アルコール)(PVA)(Mw:72,000、加水分解度98%)、塩酸(HCl)、
および硫酸(H2SO4)を、Merck(Germany)から購入した。オルトギ酸
トリエチル(98%)を、Alfa Aesar(Germany)から購入した。氷酢
酸(CH3COOH)を、AnalaR BDH Laboratory Suppli
es(UK)から購入した。エタノール(99.8%)を、Sigma-Aldrich
(Germany)から購入した。2-デオキシ-D-リボース、D-フコース、および
L-フコースを、それぞれSigma-Aldrich China、UK、およびSl
ovakiaから購入した。2-デオキシ-L-リボースおよびD-ラムノースは、Ca
rbosynth(UK)の製品であった。Brain Heart Infusion
ブロスおよびトリプトンソイブロス(1%w/v)を、Oxoid Ltdから購入した
。フェノールレッドを、Sigma-Aldrich UKから購入した。
ポリカプロラクトン(Mw:45,000)、L-ラムノース、およびNaOHを、S
igma-Aldrich(USA)から購入した。キトサン(CS)を、Mian S
cientific Company、Lahore、Pakistanから購入して、
本発明者らのラボにおいてさらに精製した(脱アセチル化度(DD)84%;Mw:87
047.26g/mol)(Farooq et al., Materials Sc
ience and Engineering: C. 2015)。コラーゲンを、M
ian ScientificのサプライヤーLahoreから購入した。ポリ(ビニル
アルコール)(PVA)(Mw:72,000、加水分解度98%)、塩酸(HCl)、
および硫酸(H2SO4)を、Merck(Germany)から購入した。オルトギ酸
トリエチル(98%)を、Alfa Aesar(Germany)から購入した。氷酢
酸(CH3COOH)を、AnalaR BDH Laboratory Suppli
es(UK)から購入した。エタノール(99.8%)を、Sigma-Aldrich
(Germany)から購入した。2-デオキシ-D-リボース、D-フコース、および
L-フコースを、それぞれSigma-Aldrich China、UK、およびSl
ovakiaから購入した。2-デオキシ-L-リボースおよびD-ラムノースは、Ca
rbosynth(UK)の製品であった。Brain Heart Infusion
ブロスおよびトリプトンソイブロス(1%w/v)を、Oxoid Ltdから購入した
。フェノールレッドを、Sigma-Aldrich UKから購入した。
電界紡糸
PCL(10wt%)を5ml DMF/DCM(4:1、10%w/v)中に溶解さ
せて、2-デオキシ-D-リボース(1.8wt%)をDMF(0.5mL)中に溶解さ
せた。双方の溶液を組み合わせて、ロッキングステーション上に一晩放置して、室温にて
均一な溶液が生じた。翌日、この溶液を、4×5mLシリンジを用いて電界紡糸した。こ
れを、プログラム可能なシリンジポンプ(Kent Scientific、USA)上
に水平に配置して、40μL/minの速度で放出した。シリンジには、高電圧電源(G
envolt、UK)を用いて、17kVを供給した。繊維状足場を、針先から17cm
の距離にて、直径16cm×6cmの回転ドラム上に収集した。このドラムを300rp
mにて回転させて、18×16cmのマットを生じさせた。足場を、約20℃の室温にて
製造した。
PCL(10wt%)を5ml DMF/DCM(4:1、10%w/v)中に溶解さ
せて、2-デオキシ-D-リボース(1.8wt%)をDMF(0.5mL)中に溶解さ
せた。双方の溶液を組み合わせて、ロッキングステーション上に一晩放置して、室温にて
均一な溶液が生じた。翌日、この溶液を、4×5mLシリンジを用いて電界紡糸した。こ
れを、プログラム可能なシリンジポンプ(Kent Scientific、USA)上
に水平に配置して、40μL/minの速度で放出した。シリンジには、高電圧電源(G
envolt、UK)を用いて、17kVを供給した。繊維状足場を、針先から17cm
の距離にて、直径16cm×6cmの回転ドラム上に収集した。このドラムを300rp
mにて回転させて、18×16cmのマットを生じさせた。足場を、約20℃の室温にて
製造した。
共有結合で架橋されたヒドロゲルの調製:D-デオキシ糖カプセル化用の可変量の架橋
剤を用いたキトサン/PVAヒドロゲル
CS(2.5%w/v)を酢酸(1%)溶液中に溶解させて、12時間磁気撹拌した。
別個のフラスコ内で、PVA(10%w/v)を、磁気撹拌下で80℃にて蒸留水中に溶
解させた。次に、2つの溶液をそれぞれ、CSおよびPVAの80:20の比率で混合し
て、さらに24時間撹拌した。次に、溶液を別々のペトリ皿に流し込んで、皿を-80℃
にて24時間冷凍した。サンプルを、凍結乾燥機内で-40℃にて24時間凍結乾燥させ
た。次に、凍結乾燥ヒドロゲルを再水和させて、硫酸(17%w/v)を有する様々な濃
度のTEOF(すなわち、0、4、8、および16%w/v)中に24時間浸した。次に
、ヒドロゲルをペトリ皿から取り出して、NaOH(12%w/v)で1時間処理してか
ら、蒸留水で3回洗浄して、24時間凍結乾燥させた。
剤を用いたキトサン/PVAヒドロゲル
CS(2.5%w/v)を酢酸(1%)溶液中に溶解させて、12時間磁気撹拌した。
別個のフラスコ内で、PVA(10%w/v)を、磁気撹拌下で80℃にて蒸留水中に溶
解させた。次に、2つの溶液をそれぞれ、CSおよびPVAの80:20の比率で混合し
て、さらに24時間撹拌した。次に、溶液を別々のペトリ皿に流し込んで、皿を-80℃
にて24時間冷凍した。サンプルを、凍結乾燥機内で-40℃にて24時間凍結乾燥させ
た。次に、凍結乾燥ヒドロゲルを再水和させて、硫酸(17%w/v)を有する様々な濃
度のTEOF(すなわち、0、4、8、および16%w/v)中に24時間浸した。次に
、ヒドロゲルをペトリ皿から取り出して、NaOH(12%w/v)で1時間処理してか
ら、蒸留水で3回洗浄して、24時間凍結乾燥させた。
凍結ゲル化による架橋CS/コラーゲン足場の調製
CSおよびコラーゲン(それぞれ0.5g)を、酢酸(0.5M、20mL)中に溶解
させて、完全に溶解して透明な溶液が得られるまで、室温にて撹拌した。これに、オルト
ギ酸トリエチル(4%v/v、0.8mL)を架橋剤として加えて、溶液をさらに一晩撹
拌して、材料の均一性および架橋性をより良好にした。次に、混合液をペトリ皿に注いで
、-20℃にて一晩凍結した。次に、凍結した膜を、予め冷却した水酸化ナトリウムのエ
タノール溶液(3M)中に浸して、再び-20℃にて24時間置いた。その後、凍結した
膜を、50%(v/v)エタノール溶液中で洗浄してから、蒸留水で洗浄して水酸化ナト
リウムを除去した。膜を最終的に無水エタノール中で15分間、2回洗浄して、室温にて
乾燥させて多孔質足場を得た。
CSおよびコラーゲン(それぞれ0.5g)を、酢酸(0.5M、20mL)中に溶解
させて、完全に溶解して透明な溶液が得られるまで、室温にて撹拌した。これに、オルト
ギ酸トリエチル(4%v/v、0.8mL)を架橋剤として加えて、溶液をさらに一晩撹
拌して、材料の均一性および架橋性をより良好にした。次に、混合液をペトリ皿に注いで
、-20℃にて一晩凍結した。次に、凍結した膜を、予め冷却した水酸化ナトリウムのエ
タノール溶液(3M)中に浸して、再び-20℃にて24時間置いた。その後、凍結した
膜を、50%(v/v)エタノール溶液中で洗浄してから、蒸留水で洗浄して水酸化ナト
リウムを除去した。膜を最終的に無水エタノール中で15分間、2回洗浄して、室温にて
乾燥させて多孔質足場を得た。
FTIR分析
赤外線(FT-IR)スペクトルを、Thermo-Nicolet 6700 P
FTIR Spectrometer(USA)で8cm-1の解像度にて、4000~
400cm-1の周波数範囲の光音響モードで、256回の連続スキャンにより記録した
。
赤外線(FT-IR)スペクトルを、Thermo-Nicolet 6700 P
FTIR Spectrometer(USA)で8cm-1の解像度にて、4000~
400cm-1の周波数範囲の光音響モードで、256回の連続スキャンにより記録した
。
走査電子顕微鏡(SEM)
複合マトリックスの表面形態を、SEM、モデルJEOL JSM 6480下で調査
した。サンプルを、金でスパッタコーティングしてから、広範な倍率にて試験した。
複合マトリックスの表面形態を、SEM、モデルJEOL JSM 6480下で調査
した。サンプルを、金でスパッタコーティングしてから、広範な倍率にて試験した。
足場におけるデオキシ糖担持
糖担持のために、ヒドロゲルを、37℃の2-デオキシ-D-リボース(1mg/ml
)の水溶液中に、全ての液体がヒドロゲルによって吸収されるまで浸した。-20℃にて
一晩保存した後に、ヒドロゲルを凍結乾燥機(Christ、Alpha 1-2 LD
plus、Germany)内で-40℃にて乾燥させてから、さらに特性評価した。
糖担持のために、ヒドロゲルを、37℃の2-デオキシ-D-リボース(1mg/ml
)の水溶液中に、全ての液体がヒドロゲルによって吸収されるまで浸した。-20℃にて
一晩保存した後に、ヒドロゲルを凍結乾燥機(Christ、Alpha 1-2 LD
plus、Germany)内で-40℃にて乾燥させてから、さらに特性評価した。
CAMアッセイを用いた生体材料の血管新生特性の評価
ニワトリ(Gallus domesticus)受精卵を、Big Bird(Ra
iwind road、Lahore、Pakistan)から購入して、加湿孵卵器(
HHD、435、China)内で受精2日目から8日目まで37℃にてインキュベート
した。8日目に、正方形の窓(1cm2)を殻中にカットして取り外し、2cm2片の電
界紡糸足場またはヒドロゲル(16%PCL電界紡糸足場/CS/PVAヒドロゲル/C
S/コラーゲンヒドロゲル)をCAM上に配置した。各卵に、1つの足場またはヒドロゲ
ルのみを移植した。
ニワトリ(Gallus domesticus)受精卵を、Big Bird(Ra
iwind road、Lahore、Pakistan)から購入して、加湿孵卵器(
HHD、435、China)内で受精2日目から8日目まで37℃にてインキュベート
した。8日目に、正方形の窓(1cm2)を殻中にカットして取り外し、2cm2片の電
界紡糸足場またはヒドロゲル(16%PCL電界紡糸足場/CS/PVAヒドロゲル/C
S/コラーゲンヒドロゲル)をCAM上に配置した。各卵に、1つの足場またはヒドロゲ
ルのみを移植した。
殻窓をパラフィルム(Bemis Flexible Packaging、USA)
で閉じて、粘着テープでシールした。移植後、卵を再び、40%加湿インキュベータ内に
、37℃にて14日目まで置いた。14日目に、生体材料を回収して、卵を犠牲にした。
血管新生を、足場回収の直前に光学顕微鏡写真を撮ることによって定量化し、その後、回
収した材料の組織学的画像を用いて、4人の評価者によって盲目的にスコア化した。移植
されて生存した卵の数を、各CAMアッセイ図のキャプション中に記載している。
で閉じて、粘着テープでシールした。移植後、卵を再び、40%加湿インキュベータ内に
、37℃にて14日目まで置いた。14日目に、生体材料を回収して、卵を犠牲にした。
血管新生を、足場回収の直前に光学顕微鏡写真を撮ることによって定量化し、その後、回
収した材料の組織学的画像を用いて、4人の評価者によって盲目的にスコア化した。移植
されて生存した卵の数を、各CAMアッセイ図のキャプション中に記載している。
全層切除ラット創傷モデル
in vivo実験のために、ヒドロゲルの直径20mmおよび厚さ1.2mmの円を
準備した。このサンプルを、エタノール(70%)溶液を用いて滅菌して、風乾させて、
PBS中で短時間平衡化させてから、創傷上に配置した。動物試験用に、体重140~1
70gの雄Sprague-Dawley(SD)ラットを研究に用いた。動物は、食物
および水を自由に摂取できるように、Molecular Biology (CEMB
)、Lahore内のCentre of Excellenceの動物ハウス施設内で
飼育した。全ての動物を、CEMB、Lahore、PakistanのInstitu
tional Animal Ethics Committeeによって承認された手
順に従って処置した。動物を、ケタミン(100mg/体重kg)およびキシラジン(1
0mg/体重kg)で麻酔してから、背側の毛をヘアトリマー(Dingling pr
ofessional hair clipper、RF-608、China)で除去
した。粘着テープ固定と包帯用に、ラットの背中を完全に剃毛した。剃毛後、背中をエタ
ノールできれいにし、その後、清潔な滅菌テーブルに移して、手術用ハサミ(Noora
ni Surgical Medical Supplies、Pakistan)で、
マークした3つの領域の皮膚を除去することによって、3つの円形の創傷を生じさせた。
切除プロセスの直後に、これらの創傷の一方を、滅菌した2-デオキシ-D-リボース担
持(70%エタノールを使用)膜円で覆い、他方を同じ材料膜で覆ったが、2-デオキシ
-D-リボースは全く含まなかった。移植した膜を双方とも、滅菌編み絹糸(Mersi
lk、直径220ミクロン)を用いて所定の場所に縫合した。足場を、絆創膏(Mepo
re、Sweden)で覆って、さらに綿ガーゼで覆って、最後に、白色の手術用粘着テ
ープ(日東電工株式会社、日本)で固定して、自己グルーミングによる破損を防いだ。こ
れらの創傷の1つを開いたままにして、包帯(Mepore、Sweden)のみで覆っ
て陰性対照として機能させた。
in vivo実験のために、ヒドロゲルの直径20mmおよび厚さ1.2mmの円を
準備した。このサンプルを、エタノール(70%)溶液を用いて滅菌して、風乾させて、
PBS中で短時間平衡化させてから、創傷上に配置した。動物試験用に、体重140~1
70gの雄Sprague-Dawley(SD)ラットを研究に用いた。動物は、食物
および水を自由に摂取できるように、Molecular Biology (CEMB
)、Lahore内のCentre of Excellenceの動物ハウス施設内で
飼育した。全ての動物を、CEMB、Lahore、PakistanのInstitu
tional Animal Ethics Committeeによって承認された手
順に従って処置した。動物を、ケタミン(100mg/体重kg)およびキシラジン(1
0mg/体重kg)で麻酔してから、背側の毛をヘアトリマー(Dingling pr
ofessional hair clipper、RF-608、China)で除去
した。粘着テープ固定と包帯用に、ラットの背中を完全に剃毛した。剃毛後、背中をエタ
ノールできれいにし、その後、清潔な滅菌テーブルに移して、手術用ハサミ(Noora
ni Surgical Medical Supplies、Pakistan)で、
マークした3つの領域の皮膚を除去することによって、3つの円形の創傷を生じさせた。
切除プロセスの直後に、これらの創傷の一方を、滅菌した2-デオキシ-D-リボース担
持(70%エタノールを使用)膜円で覆い、他方を同じ材料膜で覆ったが、2-デオキシ
-D-リボースは全く含まなかった。移植した膜を双方とも、滅菌編み絹糸(Mersi
lk、直径220ミクロン)を用いて所定の場所に縫合した。足場を、絆創膏(Mepo
re、Sweden)で覆って、さらに綿ガーゼで覆って、最後に、白色の手術用粘着テ
ープ(日東電工株式会社、日本)で固定して、自己グルーミングによる破損を防いだ。こ
れらの創傷の1つを開いたままにして、包帯(Mepore、Sweden)のみで覆っ
て陰性対照として機能させた。
膜移植の3日後に、外科用包帯を取り除いた。創傷後0、3、9、11、14および1
7日目に、創傷を測定し、そして写真を撮った。Image jソフトウェアを用いて、
創傷面積を定量化した。実験の終わりまでに、17日目にラットを過剰用量の麻酔で安楽
死させて、正常、偽、対照、および2-デオキシ-D-リボース担持足場処置群の移植部
位から組織切片を取り出した。サンプルを、3.7%パラホルムアルデヒド(Sigma
-Aldrich、USA)溶液中で室温にて24時間固定した。70%から100%の
種々の濃度のエタノールおよび水を用いて脱水して、パラフィンブロックを作製した。
7日目に、創傷を測定し、そして写真を撮った。Image jソフトウェアを用いて、
創傷面積を定量化した。実験の終わりまでに、17日目にラットを過剰用量の麻酔で安楽
死させて、正常、偽、対照、および2-デオキシ-D-リボース担持足場処置群の移植部
位から組織切片を取り出した。サンプルを、3.7%パラホルムアルデヒド(Sigma
-Aldrich、USA)溶液中で室温にて24時間固定した。70%から100%の
種々の濃度のエタノールおよび水を用いて脱水して、パラフィンブロックを作製した。
組織学
パラフィン包埋サンプルからミクロトーム(Leica TP 1020 Autom
atic Tissue Processor)で厚さ6μmの切片をカットして、Su
perfrost(登録商標)plusスライド(Menzel-Glaser、Den
mark)上に配置した。従来のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色およびG
ouldnerのトリクローム染色を実行してから(Yar et al., Inte
rnational Journal of Polymeric Materials
and Polymeric Biomaterials. 2016)、DPXマウ
ンティングメディア(Fisher Scientific)中にカバースリップと共に
マウントした。
パラフィン包埋サンプルからミクロトーム(Leica TP 1020 Autom
atic Tissue Processor)で厚さ6μmの切片をカットして、Su
perfrost(登録商標)plusスライド(Menzel-Glaser、Den
mark)上に配置した。従来のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色およびG
ouldnerのトリクローム染色を実行してから(Yar et al., Inte
rnational Journal of Polymeric Materials
and Polymeric Biomaterials. 2016)、DPXマウ
ンティングメディア(Fisher Scientific)中にカバースリップと共に
マウントした。
免疫組織化学用に、6μmの切片を、マウス/ウサギ特異的HRP/DAB(ABC)
検出IHCキット(Abcam)で処理した。再水和、抗原回復、およびタンパク質ブロ
ッキングの工程の後、切片を、3つの異なるモノクローナル抗体(ウサギ抗CD34(A
bcam)1:1000、マウス抗CD80(Santa Cruz)1:100、およ
びマウス抗CD163(AbD Serotec )1:300)(1%BSA(Sig
ma-Aldrich)中に希釈)と2時間インキュベートした。これに続いて、二次ビ
オチン化ヤギ抗多価抗体(Abcam Detection IHC Kit)と10分
間インキュベートした。アビジンおよびビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼとのイン
キュベーションの後、ペルオキシダーゼ基質およびDABクロモゲン(Abcam De
tection IHC Kit)中でのインキュベーションによって、標的タンパク質
を可視化した。次に、サンプルを、H&Eプロトコルに従って、ヘマトキシリンで対比染
色して、脱水させて、マウントした。対照は、一次抗体および二次抗体なしでインキュベ
ートしたサンプル、または二次抗体のみとインキュベートしたサンプルからなった。免疫
染色の程度の半定量的評価を、定性的等級スコアを用いて、盲検観察者ベースで実行した
;不在=0、軽く存在=1、大きく存在=2、豊富=3、大いに豊富=4。各時点での各
サンプル由来の5つの代表的な画像を、2人の盲検調査者が評価した(n=10)。0、
1、2、3、および4を示す例示的な写真を参照用に提供して、これらのスコア由来の中
央値を用いた。免疫染色の盲検スコアリング由来の値を用いて、それぞれについてM1/
M2比も算出した。
検出IHCキット(Abcam)で処理した。再水和、抗原回復、およびタンパク質ブロ
ッキングの工程の後、切片を、3つの異なるモノクローナル抗体(ウサギ抗CD34(A
bcam)1:1000、マウス抗CD80(Santa Cruz)1:100、およ
びマウス抗CD163(AbD Serotec )1:300)(1%BSA(Sig
ma-Aldrich)中に希釈)と2時間インキュベートした。これに続いて、二次ビ
オチン化ヤギ抗多価抗体(Abcam Detection IHC Kit)と10分
間インキュベートした。アビジンおよびビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼとのイン
キュベーションの後、ペルオキシダーゼ基質およびDABクロモゲン(Abcam De
tection IHC Kit)中でのインキュベーションによって、標的タンパク質
を可視化した。次に、サンプルを、H&Eプロトコルに従って、ヘマトキシリンで対比染
色して、脱水させて、マウントした。対照は、一次抗体および二次抗体なしでインキュベ
ートしたサンプル、または二次抗体のみとインキュベートしたサンプルからなった。免疫
染色の程度の半定量的評価を、定性的等級スコアを用いて、盲検観察者ベースで実行した
;不在=0、軽く存在=1、大きく存在=2、豊富=3、大いに豊富=4。各時点での各
サンプル由来の5つの代表的な画像を、2人の盲検調査者が評価した(n=10)。0、
1、2、3、および4を示す例示的な写真を参照用に提供して、これらのスコア由来の中
央値を用いた。免疫染色の盲検スコアリング由来の値を用いて、それぞれについてM1/
M2比も算出した。
細菌による糖の発酵。
この調査において研究したLおよびDデオキシ糖を代謝する細菌の能力を評価するため
に、糖を発酵して酸を生成する能力を判定した。
この調査において研究したLおよびDデオキシ糖を代謝する細菌の能力を評価するため
に、糖を発酵して酸を生成する能力を判定した。
細菌
5つの細菌株を本研究に採用した;黄色ブドウ球菌(Staphylococcus
aureus)の4株、および緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa
)の1株。黄色ブドウ球菌(S.aureus)株はS235であった-以前このラボか
ら報告した細菌感染皮膚モデルの開発に用いた最近の臨床分離株である(Shepher
d J et al., Tissue Engineering Part C: M
ethods. 2009)。NCTC 6571(Oxford)-抗生物質感受性試
験用の参照株として一般的に用いられる参照株である。ニューマン株-臨床株由来である
が、表面フィブロネクチン結合タンパク質に欠陥がある。L-9879-別の臨床分離株
であるが、親水性である。
5つの細菌株を本研究に採用した;黄色ブドウ球菌(Staphylococcus
aureus)の4株、および緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa
)の1株。黄色ブドウ球菌(S.aureus)株はS235であった-以前このラボか
ら報告した細菌感染皮膚モデルの開発に用いた最近の臨床分離株である(Shepher
d J et al., Tissue Engineering Part C: M
ethods. 2009)。NCTC 6571(Oxford)-抗生物質感受性試
験用の参照株として一般的に用いられる参照株である。ニューマン株-臨床株由来である
が、表面フィブロネクチン結合タンパク質に欠陥がある。L-9879-別の臨床分離株
であるが、親水性である。
増殖、および糖の発酵
細菌を、Brain Heart Infusionブロス内で37℃にて16時間増
殖させた。フェノールレッド(0.02%w/v;Sigma-Aldrich UK)
および適切な糖(1%最終濃度)を補充したトリプトンソイブロス(1%w/v)のアリ
コート(100ml)を、滅菌96ウェルプレートに加えた。次に、各細菌株の一晩ブロ
ス培養液5lをウェルに加えて、37℃にて16時間インキュベートした。各糖を発酵す
る各株の能力を、酸の生成およびフェノールレッドpH指示薬の変化によって判断した。
細菌を、Brain Heart Infusionブロス内で37℃にて16時間増
殖させた。フェノールレッド(0.02%w/v;Sigma-Aldrich UK)
および適切な糖(1%最終濃度)を補充したトリプトンソイブロス(1%w/v)のアリ
コート(100ml)を、滅菌96ウェルプレートに加えた。次に、各細菌株の一晩ブロ
ス培養液5lをウェルに加えて、37℃にて16時間インキュベートした。各糖を発酵す
る各株の能力を、酸の生成およびフェノールレッドpH指示薬の変化によって判断した。
統計
免疫染色についての群間差異を、ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定で検定し
て、個々の群間の多重比較を、ダン検定を用いて検定した。
免疫染色についての群間差異を、ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定で検定し
て、個々の群間の多重比較を、ダン検定を用いて検定した。
結果
電界紡糸PLC膜中へのD-デオキシ糖の組込み
2-デオキシ-D-リボースを電界紡糸ナノファイバ中にカプセル化して、DCM中D
MFを電界紡糸用の溶媒として用いた。電界紡糸により、糖を担持した柔らかい繊維状材
料のシートを製造した(図1)。糖を含まないPCL繊維の平均直径は、224nm±8
2nmであったが、2-デオキシ-D-リボースを担持した繊維の平均直径は、323n
m±25nmに有意に増大した(40本のランダムな繊維の平均直径)(p≦0.05)
。しかしながら、両タイプの繊維は、相互関係のある孔と共にランダムに配向されており
、その表面は滑らかであり、いかなるビーズもなかった。糖担持後、膜の色は明るい青色
となった。
電界紡糸PLC膜中へのD-デオキシ糖の組込み
2-デオキシ-D-リボースを電界紡糸ナノファイバ中にカプセル化して、DCM中D
MFを電界紡糸用の溶媒として用いた。電界紡糸により、糖を担持した柔らかい繊維状材
料のシートを製造した(図1)。糖を含まないPCL繊維の平均直径は、224nm±8
2nmであったが、2-デオキシ-D-リボースを担持した繊維の平均直径は、323n
m±25nmに有意に増大した(40本のランダムな繊維の平均直径)(p≦0.05)
。しかしながら、両タイプの繊維は、相互関係のある孔と共にランダムに配向されており
、その表面は滑らかであり、いかなるビーズもなかった。糖担持後、膜の色は明るい青色
となった。
キトサン/PVAヒドロゲル中へのD糖の組込み
オルトギ酸トリエチル(TEOF)を用いてCSとPVAを架橋する方法は、2015
年に本発明者らのグループが以前に報告した(Yar et al., Materia
ls Science and Engineering: C. 2015; Sha
hzadi et al., Journal of biomaterials ap
plications. 2016)。本研究では、本発明者らは、2-デオキシ-D-
リボースを、物理的吸着によって、16%TEOFで架橋したCS/PVAヒドロゲル上
に担持させた。本研究では、2-デオキシ-D-リボースを担持した非架橋ヒドロゲルを
対照として用いた。SEM顕微鏡写真は、架橋と糖担持の双方が、このヒドロゲルの孔径
と形態に影響を与えるようであることを示した(図2)。架橋前に、ヒドロゲルは、相互
連結した孔ではなく層状構造を有した。平均孔径は、103μm±52μmであった。架
橋後、孔径は有意に縮小した(p≦0.05)。架橋の不在化で糖を加えると、層状構造
が、歪んだ孔に変化した。架橋と糖の双方の導入により、平均孔径は68μm±31μm
に有意に縮小した(p≦0.05)。これらの相互連結した新しい孔は、より均一な形態
を有しており、孔は、ヒドロゲルマトリックスの全体に十分に分布していた。
オルトギ酸トリエチル(TEOF)を用いてCSとPVAを架橋する方法は、2015
年に本発明者らのグループが以前に報告した(Yar et al., Materia
ls Science and Engineering: C. 2015; Sha
hzadi et al., Journal of biomaterials ap
plications. 2016)。本研究では、本発明者らは、2-デオキシ-D-
リボースを、物理的吸着によって、16%TEOFで架橋したCS/PVAヒドロゲル上
に担持させた。本研究では、2-デオキシ-D-リボースを担持した非架橋ヒドロゲルを
対照として用いた。SEM顕微鏡写真は、架橋と糖担持の双方が、このヒドロゲルの孔径
と形態に影響を与えるようであることを示した(図2)。架橋前に、ヒドロゲルは、相互
連結した孔ではなく層状構造を有した。平均孔径は、103μm±52μmであった。架
橋後、孔径は有意に縮小した(p≦0.05)。架橋の不在化で糖を加えると、層状構造
が、歪んだ孔に変化した。架橋と糖の双方の導入により、平均孔径は68μm±31μm
に有意に縮小した(p≦0.05)。これらの相互連結した新しい孔は、より均一な形態
を有しており、孔は、ヒドロゲルマトリックスの全体に十分に分布していた。
オルトギ酸トリエチル架橋キトサン/コラーゲンヒドロゲル中へのD-デオキシリボー
スの組込み
キトサンおよびコラーゲンを、オルトギ酸トリエチルを用いて架橋させ、その後、糖水
溶液(1mg/ml)中に浸して2-デオキシ-D-リボースを担持させた。生理食塩水
中に沈める前のヒドロゲルの平均厚さは、1.11mmであり、浸水24時間後は1.3
7mmに増大した。値は、3つの独立した実験の平均である。
スの組込み
キトサンおよびコラーゲンを、オルトギ酸トリエチルを用いて架橋させ、その後、糖水
溶液(1mg/ml)中に浸して2-デオキシ-D-リボースを担持させた。生理食塩水
中に沈める前のヒドロゲルの平均厚さは、1.11mmであり、浸水24時間後は1.3
7mmに増大した。値は、3つの独立した実験の平均である。
最終的に材料は、皮膚に当てるために外科医に引き渡されることとなるため、膜の物理
的安定性を評価することが重要である。膜の表面は滑らかであり、かついかなる亀裂もな
かった。以下の図3は、この膜の物理的外観、ならびに、創傷部位に当てる場合に外科手
術中に有利となろう強度、伸縮性、および折畳み能力の全ての重要なパラメータを示す。
さらに、当該膜は、メスまたはハサミで所望の形状に容易にカットされ得る。
的安定性を評価することが重要である。膜の表面は滑らかであり、かついかなる亀裂もな
かった。以下の図3は、この膜の物理的外観、ならびに、創傷部位に当てる場合に外科手
術中に有利となろう強度、伸縮性、および折畳み能力の全ての重要なパラメータを示す。
さらに、当該膜は、メスまたはハサミで所望の形状に容易にカットされ得る。
膜は強く、優れた柔軟性、伸縮性、および取扱い特性を示した。
様々な糖が、細胞の浸潤と増殖に重要な役割を果たすヒドロゲルの構造および形態にど
のように影響するかを調査するために、これらの糖担持ヒドロゲルの微視的構造を、SE
Mによって調査した(図4)。75.07±34.48μmの平均孔径のシート様構造が
、対照ヒドロゲルの場合に観察された(図4a)。DおよびL-デオキシリボースの平均
孔径は、それぞれ100.04±24.01μmおよび93.33±23.49μmであ
った(図4b、図4c)。L-デオキシラムノースの場合(図4e)、孔構造は、無傷、
均一、かつ等方性であり、平均孔径は110.89±20.56μmであり、D異性体と
有意差はなかった(平均孔径102.45±23.05μm)。DおよびL-フコースは
、それぞれ72.18±16.92μmおよび87.43±14.11μmの平均断面孔
径を示した。ゆえに、SEM顕微鏡写真は、全ての糖担持ヒドロゲルが、同様に高度に多
孔質の構造を有することを示した。
のように影響するかを調査するために、これらの糖担持ヒドロゲルの微視的構造を、SE
Mによって調査した(図4)。75.07±34.48μmの平均孔径のシート様構造が
、対照ヒドロゲルの場合に観察された(図4a)。DおよびL-デオキシリボースの平均
孔径は、それぞれ100.04±24.01μmおよび93.33±23.49μmであ
った(図4b、図4c)。L-デオキシラムノースの場合(図4e)、孔構造は、無傷、
均一、かつ等方性であり、平均孔径は110.89±20.56μmであり、D異性体と
有意差はなかった(平均孔径102.45±23.05μm)。DおよびL-フコースは
、それぞれ72.18±16.92μmおよび87.43±14.11μmの平均断面孔
径を示した。ゆえに、SEM顕微鏡写真は、全ての糖担持ヒドロゲルが、同様に高度に多
孔質の構造を有することを示した。
特性評価
FTIR
FTIR分光法を用いて、糖とPCLのマイクロ繊維との相互作用を調べた。図5Aは
、紡糸前に糖をポリマーに加えた場合に、約3400cm-1にて見られるDリボースの
主要なピークがPCL繊維において検出されたことを示す。PCLのカルボニルエステル
に対応する1720cm-1にて主要な吸収バンドが観察された。D糖とPCLの双方に
おけるアルキル基のピークは、2700~2900cm-1に吸収ピークを示した。D-
糖担持PCL繊維のスペクトルはまた、糖が電界紡糸混合物中に均一に分布したことも示
している。
FTIR
FTIR分光法を用いて、糖とPCLのマイクロ繊維との相互作用を調べた。図5Aは
、紡糸前に糖をポリマーに加えた場合に、約3400cm-1にて見られるDリボースの
主要なピークがPCL繊維において検出されたことを示す。PCLのカルボニルエステル
に対応する1720cm-1にて主要な吸収バンドが観察された。D糖とPCLの双方に
おけるアルキル基のピークは、2700~2900cm-1に吸収ピークを示した。D-
糖担持PCL繊維のスペクトルはまた、糖が電界紡糸混合物中に均一に分布したことも示
している。
架橋剤を含まない(図5d)、そして架橋剤を含む(図5e)CS/PVAヒドロゲルに
は、キトサンおよびPVAの特徴的なピークが含まれている(図5B)。2900cm-
1付近のピークは、C-H伸縮振動に割り当てられた(Islam et al., C
arbohydrate Polymers. 2012)。1530cm-1のピーク
は、PVAのO-H曲げ振動に割り当てられた(Li et al., Polymer
. 2000)。1400cm-1付近に現れたバンドは、C-H曲げ振動によるもので
あった。1099cm-1のピークは、C-O-C伸縮振動によるものであった。しかし
ながら、架橋ヒドロゲルスペクトルでは、O-HおよびN-H伸縮もまた、3400~3
200cm-1にて(Li et al., Polymer. 2000; Teli
et al., International journal of biolog
ical macromolecules. 2012)、幅広いピークとして現れたが
、このハンプの強度は有意に低下した。これは、新しい-C=N結合を形成する際にCS
の-NH2が利用されているためである可能性がある。イミン結合の新しいピークは、1
630cm-1にて現れた(Yar et al., Materials Scien
ce and Engineering: C. 2015; Li et al.,
Polymer. 2000; Rokhade et al., Carbohydr
ate Polymers. 2007)。
は、キトサンおよびPVAの特徴的なピークが含まれている(図5B)。2900cm-
1付近のピークは、C-H伸縮振動に割り当てられた(Islam et al., C
arbohydrate Polymers. 2012)。1530cm-1のピーク
は、PVAのO-H曲げ振動に割り当てられた(Li et al., Polymer
. 2000)。1400cm-1付近に現れたバンドは、C-H曲げ振動によるもので
あった。1099cm-1のピークは、C-O-C伸縮振動によるものであった。しかし
ながら、架橋ヒドロゲルスペクトルでは、O-HおよびN-H伸縮もまた、3400~3
200cm-1にて(Li et al., Polymer. 2000; Teli
et al., International journal of biolog
ical macromolecules. 2012)、幅広いピークとして現れたが
、このハンプの強度は有意に低下した。これは、新しい-C=N結合を形成する際にCS
の-NH2が利用されているためである可能性がある。イミン結合の新しいピークは、1
630cm-1にて現れた(Yar et al., Materials Scien
ce and Engineering: C. 2015; Li et al.,
Polymer. 2000; Rokhade et al., Carbohydr
ate Polymers. 2007)。
図5Cは、様々な糖を担持した架橋CS/コラーゲンスペクトルを示す。スペクトルは
、CSおよびコラーゲンの全ての特徴的なピークを示している。3200~3500cm
-1の広い吸収バンドは、主にO-H/N-H伸縮振動によるものであった。バンドの広
さは、分子間水素結合によるものであった。C-H伸縮振動のため、2600~2800
cm-1のピークが現れた。アミドIのピークが、1650cm-1に現れた。エーテル
結合のC-O-CおよびC-Oの伸縮振動もまた、1147cm-1および1053cm
-1にシフトした。糖担持は、おそらく、ポリマーマトリックス中の糖の濃度が非常に低
いため、ヒドロゲルのFTIRピークに影響しなかった。
、CSおよびコラーゲンの全ての特徴的なピークを示している。3200~3500cm
-1の広い吸収バンドは、主にO-H/N-H伸縮振動によるものであった。バンドの広
さは、分子間水素結合によるものであった。C-H伸縮振動のため、2600~2800
cm-1のピークが現れた。アミドIのピークが、1650cm-1に現れた。エーテル
結合のC-O-CおよびC-Oの伸縮振動もまた、1147cm-1および1053cm
-1にシフトした。糖担持は、おそらく、ポリマーマトリックス中の糖の濃度が非常に低
いため、ヒドロゲルのFTIRピークに影響しなかった。
絨毛膜尿膜(CAM)アッセイを用いた、デオキシ糖担持生体材料に対する血管新生促
進応答の評価
D-デオキシリボースを担持した電界紡糸繊維およびヒドロゲル
CAMアッセイを用いて、合成された材料の血管新生の潜在性を調査した。2-デオキ
シ-D-リボース担持繊維の場合、材料の下に広範な新しい血管の成長が観察された(図
6A(b)を参照)。これにより、2-デオキシ-D-リボース担持材料の化学誘引およ
び血管新生の潜在性が確認される。
進応答の評価
D-デオキシリボースを担持した電界紡糸繊維およびヒドロゲル
CAMアッセイを用いて、合成された材料の血管新生の潜在性を調査した。2-デオキ
シ-D-リボース担持繊維の場合、材料の下に広範な新しい血管の成長が観察された(図
6A(b)を参照)。これにより、2-デオキシ-D-リボース担持材料の化学誘引およ
び血管新生の潜在性が確認される。
D-デオキシ糖の水溶液中に浸漬することによって、2-デオキシ-D-リボースを、
キトサン/PVAオルトギ酸トリエチル架橋ヒドロゲル中に担持させた。凍結乾燥機内で
乾燥させた後に、8日目にヒドロゲルを受精卵中に移植して、14日目に卵を犠牲にした
。2-デオキシ-D-リボース担持足場は、対照材料と比較して、より多くの新しい血管
を観察することによって判断して、血管新生を促進することが観察された(図6A)。
キトサン/PVAオルトギ酸トリエチル架橋ヒドロゲル中に担持させた。凍結乾燥機内で
乾燥させた後に、8日目にヒドロゲルを受精卵中に移植して、14日目に卵を犠牲にした
。2-デオキシ-D-リボース担持足場は、対照材料と比較して、より多くの新しい血管
を観察することによって判断して、血管新生を促進することが観察された(図6A)。
DおよびL糖(3つの糖、6つの異性体)を担持したキトサン/コラーゲン架橋ヒドロ
ゲル
一般的に、血管の急速な成長および浸潤の一助となる生体材料は、血管新生の遅延およ
び炎症の継続を示す生体材料よりも優れた生体適合性を示すと考えられている(Wolf
et al., Biomaterials. 2014)。その結果、これは、組織
の生存を確実にするために組織工学的材料にとって絶対に不可欠な特性である。
ゲル
一般的に、血管の急速な成長および浸潤の一助となる生体材料は、血管新生の遅延およ
び炎症の継続を示す生体材料よりも優れた生体適合性を示すと考えられている(Wolf
et al., Biomaterials. 2014)。その結果、これは、組織
の生存を確実にするために組織工学的材料にとって絶対に不可欠な特性である。
3つのデオキシ糖(リボース、フコース、およびラムノース)のDおよびL異性体を、
多孔質凍結ゲル化オルトギ酸トリエチル(4%)共有結合架橋キトサン/コラーゲン(1
:1)ヒドロゲル上に担持させた。ヒドロゲルを糖の水溶液(1mg/ml)中に浸して
、さらに凍結乾燥させて、多孔質膜を生成した。電界紡糸足場に関して、8日目にヒドロ
ゲルを受精卵中に移植して、14日目の後に卵を犠牲にして、血管新生に及ぼす糖の影響
を調査した。
多孔質凍結ゲル化オルトギ酸トリエチル(4%)共有結合架橋キトサン/コラーゲン(1
:1)ヒドロゲル上に担持させた。ヒドロゲルを糖の水溶液(1mg/ml)中に浸して
、さらに凍結乾燥させて、多孔質膜を生成した。電界紡糸足場に関して、8日目にヒドロ
ゲルを受精卵中に移植して、14日目の後に卵を犠牲にして、血管新生に及ぼす糖の影響
を調査した。
図7からわかるように、L異性体の3つ全てが、血管新生を刺激したが、D異性体につ
いては、デオキシリボースのD異性体のみが、血管新生が強く、デオキシフコースのD異
性体に対する応答は有意でなく、そしてデオキシラムノースのD異性体に対する応答はほ
んの僅かであった。
いては、デオキシリボースのD異性体のみが、血管新生が強く、デオキシフコースのD異
性体に対する応答は有意でなく、そしてデオキシラムノースのD異性体に対する応答はほ
んの僅かであった。
ラット皮膚創傷モデルを用いた、D-デオキシリボース担持ヒドロゲルに対する創傷治
癒応答の評価
ラットにおける創傷治癒を、2-デオキシ-D-リボース-担持ヒドロゲルを当てるこ
とによって促進した。20mmの領域をマークしてから、外科用ハサミを用いて麻酔下で
切除を実行することによって、全層創傷を生じさせた。それぞれの材料を創傷に当てて、
適所で縫合して、最初にMepore(Sweden)絆創膏で、そして最後に綿包帯で
覆った。全てのラットに、創傷の3日後に除去したのと同じ包帯を着けた。特定の時点に
て各創傷をデジタル写真撮影して、Image Jソフトウェアを用いてさらに定量化し
た。創傷の代表的な巨視的写真を図8に示す。創傷後3、9、11、14、および17日
目の対照ヒドロゲル(架橋CS/コラーゲン足場)および2-デオキシ-D-リボース-
担持ヒドロゲルを示す。
癒応答の評価
ラットにおける創傷治癒を、2-デオキシ-D-リボース-担持ヒドロゲルを当てるこ
とによって促進した。20mmの領域をマークしてから、外科用ハサミを用いて麻酔下で
切除を実行することによって、全層創傷を生じさせた。それぞれの材料を創傷に当てて、
適所で縫合して、最初にMepore(Sweden)絆創膏で、そして最後に綿包帯で
覆った。全てのラットに、創傷の3日後に除去したのと同じ包帯を着けた。特定の時点に
て各創傷をデジタル写真撮影して、Image Jソフトウェアを用いてさらに定量化し
た。創傷の代表的な巨視的写真を図8に示す。創傷後3、9、11、14、および17日
目の対照ヒドロゲル(架橋CS/コラーゲン足場)および2-デオキシ-D-リボース-
担持ヒドロゲルを示す。
3日目に、2-デオキシ-D-リボース担持足場は、他の試験材料と比較して、周囲組
織に非常にしっかりと付着しており(図8)、手で伸ばすと、創傷の良好な機械的強度が
示された。9日目までに、D-デオキシリボースで処置された創傷は、創傷面積の約50
%であった(図9)。11日目と14日目に、創傷面積がさらに減少し、そして17日目
までにD-デオキシリボースで処置した創傷について、創傷は、対照の創傷およびヒドロ
ゲルのみで処置した創傷とは対照的に、完全に閉鎖された。
織に非常にしっかりと付着しており(図8)、手で伸ばすと、創傷の良好な機械的強度が
示された。9日目までに、D-デオキシリボースで処置された創傷は、創傷面積の約50
%であった(図9)。11日目と14日目に、創傷面積がさらに減少し、そして17日目
までにD-デオキシリボースで処置した創傷について、創傷は、対照の創傷およびヒドロ
ゲルのみで処置した創傷とは対照的に、完全に閉鎖された。
切除した創傷組織の組織学的および免疫組織化学的分析
全ての群由来のサンプルを17日目に収穫して、パラホルムアルデヒド中で一晩固定し
た。脱水後、サンプルをパラフィンで包埋してブロックを作製し、これを6μmにて切片
化した。次に、スライドを、H&E、Gouldnerのトリクローム、およびDABペ
ルオキシダーゼキット(3つの抗原(前駆内皮細胞についてCD34、M1マクロファー
ジについてCD80、そしてM2マクロファージについてCD163)の検出を調べる)
で染色した。最後に、スライドをDPX封入剤およびガラス製カバースリップで覆ってか
ら、光学顕微鏡で撮像した。偽(いかなる処置もしない創傷)群、対照(キトサンおよび
コラーゲン足場で処置した創傷)群、およびD-デキソリボース(2-デオキシ-D-リ
ボースを担持した足場で処置した創傷)群を、非処置ラット由来の正常な皮膚と比較した
。
全ての群由来のサンプルを17日目に収穫して、パラホルムアルデヒド中で一晩固定し
た。脱水後、サンプルをパラフィンで包埋してブロックを作製し、これを6μmにて切片
化した。次に、スライドを、H&E、Gouldnerのトリクローム、およびDABペ
ルオキシダーゼキット(3つの抗原(前駆内皮細胞についてCD34、M1マクロファー
ジについてCD80、そしてM2マクロファージについてCD163)の検出を調べる)
で染色した。最後に、スライドをDPX封入剤およびガラス製カバースリップで覆ってか
ら、光学顕微鏡で撮像した。偽(いかなる処置もしない創傷)群、対照(キトサンおよび
コラーゲン足場で処置した創傷)群、およびD-デキソリボース(2-デオキシ-D-リ
ボースを担持した足場で処置した創傷)群を、非処置ラット由来の正常な皮膚と比較した
。
17日目に、2-デオキシ-D-リボースで処置した群における創傷治癒は、本質的に
完了しており、外植組織の構造は、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色によっ
て示されるように、正常な皮膚と類似していた(図10)。Goldrenのトリクロー
ムは、コラーゲンを青/緑色に染色する一方、筋肉、上皮、毛包、および血管は、赤色に
染色されている。正常な群について示されているように、皮膚の下で染色された筋肉層は
別として、残りは、上皮および毛包が既に形成されたD-デオキシリボース処置群と非常
に類似しているように見える。対照的に、偽群および対照群は、17日目までに、組織化
されていない肉芽創傷組織をなお示した(図10)。
完了しており、外植組織の構造は、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色によっ
て示されるように、正常な皮膚と類似していた(図10)。Goldrenのトリクロー
ムは、コラーゲンを青/緑色に染色する一方、筋肉、上皮、毛包、および血管は、赤色に
染色されている。正常な群について示されているように、皮膚の下で染色された筋肉層は
別として、残りは、上皮および毛包が既に形成されたD-デオキシリボース処置群と非常
に類似しているように見える。対照的に、偽群および対照群は、17日目までに、組織化
されていない肉芽創傷組織をなお示した(図10)。
M1応答マーカーを発現するマクロファージは、移植片拒絶、および慢性炎症応答の活
性化に関連する一方、M2応答マーカーは、マクロファージによって、建設的リモデリン
グに関連する炎症応答を伴って発現される(Badylak et al., Tiss
ue Engineering Part A. 2008)。
性化に関連する一方、M2応答マーカーは、マクロファージによって、建設的リモデリン
グに関連する炎症応答を伴って発現される(Badylak et al., Tiss
ue Engineering Part A. 2008)。
予想どおり、正常な非創傷群について、M1マクロファージまたはM2マクロファージ
は染色されなかった(図11)。創傷後または動物中への材料の移植後に予想されるよう
に、いくつかのM1マクロファージおよびM2マクロファージが、他の群において見られ
た。図12に示す表は、ラボの研究スタッフが盲検化されて得られたマクロファージの存
在の程度の評価を示している。M2の、M1に対する存在比は、創傷動物、および非担持
キトサンで処置した動物について、約1であった。2-デオキシ-D-リボースを担持し
たキトサンで処置した群について、存在比は僅かに大きかった(統計的に有意ではない)
(図11)。
は染色されなかった(図11)。創傷後または動物中への材料の移植後に予想されるよう
に、いくつかのM1マクロファージおよびM2マクロファージが、他の群において見られ
た。図12に示す表は、ラボの研究スタッフが盲検化されて得られたマクロファージの存
在の程度の評価を示している。M2の、M1に対する存在比は、創傷動物、および非担持
キトサンで処置した動物について、約1であった。2-デオキシ-D-リボースを担持し
たキトサンで処置した群について、存在比は僅かに大きかった(統計的に有意ではない)
(図11)。
LおよびD-デオキシ糖を代謝する細菌の能力
調査中の6つの糖を、細菌代謝用の基質としての作用に関して、グルコースと比較した
。黄色ブドウ球菌(S.aureus)の4株および緑膿菌(Pseudomonas
aeruginosa)の1株を、創傷感染における一般的な病原体の代表として調査し
た。黄色ブドウ球菌(S. aureus)の全4株の結果は、全てが発酵用の基質とし
てグルコースを用いることができるという点で同じであったが、これらの株はいずれも、
調査中の3つのデオキシ糖のLまたはD異性体を用いることができなかった。しかしなが
ら、緑膿菌(P.aeruginosa)は、デオキシフコースおよびデオキシラムノー
スのL異性体を除く全ての糖を発酵させることができた。
調査中の6つの糖を、細菌代謝用の基質としての作用に関して、グルコースと比較した
。黄色ブドウ球菌(S.aureus)の4株および緑膿菌(Pseudomonas
aeruginosa)の1株を、創傷感染における一般的な病原体の代表として調査し
た。黄色ブドウ球菌(S. aureus)の全4株の結果は、全てが発酵用の基質とし
てグルコースを用いることができるという点で同じであったが、これらの株はいずれも、
調査中の3つのデオキシ糖のLまたはD異性体を用いることができなかった。しかしなが
ら、緑膿菌(P.aeruginosa)は、デオキシフコースおよびデオキシラムノー
スのL異性体を除く全ての糖を発酵させることができた。
細菌の基質として作用するこれらの糖の能力を調査する理由は、火傷または慢性創傷に
用いられるべき生体材料を調製するならば、細菌によって容易に代謝され得ない材料を用
いることが好ましいからである。
用いられるべき生体材料を調製するならば、細菌によって容易に代謝され得ない材料を用
いることが好ましいからである。
結論
本研究は、電界紡糸PCL繊維またはキトサンベースのヒドロゲルのいずれかで送達さ
れた場合の、2-デオキシ-D-リボースの血管新生促進能力を実証した。これは、試験
した2-デオキシ糖の3つ全てのL異性体が血管新生性であったものの、デオキシフコー
スまたはデオキシラムノースのD異性体によって共有されなかった。2-デオキシ-D-
リボースは、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)によって代謝さ
れ得たものの、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の4株
によって代謝され得なかった。キトサン/コラーゲンヒドロゲルへのD-デオキシ-リボ
ースの添加は、ラット内の全層創傷における創傷治癒および毛包の回復を促進した。
本研究は、電界紡糸PCL繊維またはキトサンベースのヒドロゲルのいずれかで送達さ
れた場合の、2-デオキシ-D-リボースの血管新生促進能力を実証した。これは、試験
した2-デオキシ糖の3つ全てのL異性体が血管新生性であったものの、デオキシフコー
スまたはデオキシラムノースのD異性体によって共有されなかった。2-デオキシ-D-
リボースは、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)によって代謝さ
れ得たものの、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の4株
によって代謝され得なかった。キトサン/コラーゲンヒドロゲルへのD-デオキシ-リボ
ースの添加は、ラット内の全層創傷における創傷治癒および毛包の回復を促進した。
[実験セクション2]
Ex-ovo CAMアッセイ
卵のインキュベーション
全てのCAM実験を、英国内務省のガイドラインに従って実行した。ex-ovo C
AMアッセイの概略図を図13に示す。ニワトリ(Gallus domesticus
)受精卵を、Henry Stewart & Co.(MedEggs、Norwic
h、UK)から購入した。ハンドペーパータオルを用いて、20%の工業用メチル化スピ
リット(IMS)溶液で卵を注意深く拭いて、殻から汚れおよび羽毛を取り除いた。次に
、卵を、加湿孵卵器(RCOM King SURO、P&T Poultry、Pow
ys、Wales)内に水平に配置して、胚発生日(EDD)3日目まで37.5℃にて
インキュベートした。
Ex-ovo CAMアッセイ
卵のインキュベーション
全てのCAM実験を、英国内務省のガイドラインに従って実行した。ex-ovo C
AMアッセイの概略図を図13に示す。ニワトリ(Gallus domesticus
)受精卵を、Henry Stewart & Co.(MedEggs、Norwic
h、UK)から購入した。ハンドペーパータオルを用いて、20%の工業用メチル化スピ
リット(IMS)溶液で卵を注意深く拭いて、殻から汚れおよび羽毛を取り除いた。次に
、卵を、加湿孵卵器(RCOM King SURO、P&T Poultry、Pow
ys、Wales)内に水平に配置して、胚発生日(EDD)3日目まで37.5℃にて
インキュベートした。
ペトリ皿中への胚の移動
EDD3に、卵の上面をフェルトペンでマークした。卵を水平に(マークした表面を上
にして)保持して、1000mlのガラスビーカーの端で割って、ペトリ皿の底面近くに
維持した。次に、胚を滅菌ペトリ皿中に静かに移して、38℃の加湿インキュベータ(B
inder、Tuttlingen、Germany)内に保管した。
EDD3に、卵の上面をフェルトペンでマークした。卵を水平に(マークした表面を上
にして)保持して、1000mlのガラスビーカーの端で割って、ペトリ皿の底面近くに
維持した。次に、胚を滅菌ペトリ皿中に静かに移して、38℃の加湿インキュベータ(B
inder、Tuttlingen、Germany)内に保管した。
CAM上への物質の付与
プラスチックリング(直径約6.5 mm)を、物質用のリザーバ、および移植領域用
のマーカーとして用いて、CAM上に配置して、20μl容量の物質をCAM上に1日2
回付与して、EDD7からEDD11の間に40μlの総容量を与えた。EDD11にデ
ジタル顕微鏡を用いてリングの画像を得、その後、20%レンズマメアグルチニン(le
ns culinaris agglutinin)(LCA)(Vector Lab
oratories、Peterborough、UK)を、解剖顕微鏡(Wild H
eerbrugg、Heerbrugg、Switzerland)下で30G針を用い
て循環系中に注射して、血管内内皮細胞を標識した。その後、CAMを取り出して、3.
7%ホルムアルデヒド溶液中で固定した。胚を、EDD11の終わりに犠牲にした。次に
、固定CAMサンプルを共焦点顕微鏡(Zeiss LSM 510 Meta、Jen
a、Germany)下で撮像して、CAMの微小血管構造に及ぼす物質の影響を調査し
た。
プラスチックリング(直径約6.5 mm)を、物質用のリザーバ、および移植領域用
のマーカーとして用いて、CAM上に配置して、20μl容量の物質をCAM上に1日2
回付与して、EDD7からEDD11の間に40μlの総容量を与えた。EDD11にデ
ジタル顕微鏡を用いてリングの画像を得、その後、20%レンズマメアグルチニン(le
ns culinaris agglutinin)(LCA)(Vector Lab
oratories、Peterborough、UK)を、解剖顕微鏡(Wild H
eerbrugg、Heerbrugg、Switzerland)下で30G針を用い
て循環系中に注射して、血管内内皮細胞を標識した。その後、CAMを取り出して、3.
7%ホルムアルデヒド溶液中で固定した。胚を、EDD11の終わりに犠牲にした。次に
、固定CAMサンプルを共焦点顕微鏡(Zeiss LSM 510 Meta、Jen
a、Germany)下で撮像して、CAMの微小血管構造に及ぼす物質の影響を調査し
た。
血管新生の定量化
識別可能な全ての血管を含むように画像を分割してから[C. Roma-Rodri
gues, A. Heuer-Jungemann, A.R. Fernandes
, A.G. Kanaras, P. V. Baptista, Peptide-
coated gold nanoparticles for modulation
of angiogenesis in vivo, IntJ Nanomedic
ine. 11 (2016) 2633-2639. doi:10.2147/IJ
N.S108661]、複数の画像加工処理工程を介して分岐点をカウントし、かつ平均
血管長を算出することによって[D. Ribatti, B. Nico,
A. Vacca, M. Presta, The gelatin s
ponge-chorioallantoic membrane assay, Na
t Protoc. 1 (2006) 85-91. doi:10.1038/np
rot.2006.13, P. Brooks, A.P. Montgomery,
D. Cheresh, Use of the 10-Day-Old Chick
Embryo Model for Studying Angiog
enesis, Integrin Protoc. 129 (1
999) 257-269. doi:10.1385/1-59259-249-
X:257]、血管を定量化した。最初に、リングの内部領域を切り取って、Adobe
Photoshop CS6(ADOBE Systems Inc.、San Jo
se、California、USA)を用いて、赤、緑、および青色のチャンネルを分
割した。次に、緑色のチャンネルを、ImageJ(Wayne Rasband、米国
国立衛生研究所)にインポートして、アンシャープマスクフィルタリング、ローカルコン
トラストの強調、ノイズ除去、およびセグメンテーションを含む更なる分析を行った。最
後に、定量化ソフトウェア(AngioTool、米国国立癌研究所)を用いて、分岐点
の数を定量化して(図14A)、バイナリ画像ヒストグラムを用いて、ImageJ(W
ayne Rasband、米国国立衛生研究所)内の既知のピクセル/mm比により平
均血管長を算出した。
識別可能な全ての血管を含むように画像を分割してから[C. Roma-Rodri
gues, A. Heuer-Jungemann, A.R. Fernandes
, A.G. Kanaras, P. V. Baptista, Peptide-
coated gold nanoparticles for modulation
of angiogenesis in vivo, IntJ Nanomedic
ine. 11 (2016) 2633-2639. doi:10.2147/IJ
N.S108661]、複数の画像加工処理工程を介して分岐点をカウントし、かつ平均
血管長を算出することによって[D. Ribatti, B. Nico,
A. Vacca, M. Presta, The gelatin s
ponge-chorioallantoic membrane assay, Na
t Protoc. 1 (2006) 85-91. doi:10.1038/np
rot.2006.13, P. Brooks, A.P. Montgomery,
D. Cheresh, Use of the 10-Day-Old Chick
Embryo Model for Studying Angiog
enesis, Integrin Protoc. 129 (1
999) 257-269. doi:10.1385/1-59259-249-
X:257]、血管を定量化した。最初に、リングの内部領域を切り取って、Adobe
Photoshop CS6(ADOBE Systems Inc.、San Jo
se、California、USA)を用いて、赤、緑、および青色のチャンネルを分
割した。次に、緑色のチャンネルを、ImageJ(Wayne Rasband、米国
国立衛生研究所)にインポートして、アンシャープマスクフィルタリング、ローカルコン
トラストの強調、ノイズ除去、およびセグメンテーションを含む更なる分析を行った。最
後に、定量化ソフトウェア(AngioTool、米国国立癌研究所)を用いて、分岐点
の数を定量化して(図14A)、バイナリ画像ヒストグラムを用いて、ImageJ(W
ayne Rasband、米国国立衛生研究所)内の既知のピクセル/mm比により平
均血管長を算出した。
図14Bに示すように、ローダミン標識レクチン注射CAMサンプルの共焦点画像を用
いて、CAMの微小血管系の血管面積パーセンテージ(VA%)を定量化した。これを行
うために、画像を、ImageJ(Wayne Rasband、米国国立衛生研究所)
にインポートして、フィルタリングプロセスおよび平滑化プロセスの後にバイナリ画像に
変換してから、定量化した。画像内の黒色および白色の面積のヒストグラムリストを用い
て、VA%を算出した。
いて、CAMの微小血管系の血管面積パーセンテージ(VA%)を定量化した。これを行
うために、画像を、ImageJ(Wayne Rasband、米国国立衛生研究所)
にインポートして、フィルタリングプロセスおよび平滑化プロセスの後にバイナリ画像に
変換してから、定量化した。画像内の黒色および白色の面積のヒストグラムリストを用い
て、VA%を算出した。
足場に担持させる前の、CAM上でのE2および2dDRの最適濃度の判定
特に記載がない限り、全ての化学物質をSigma Aldrichから購入した。組
換えVEGF165ストック溶液を、2ng/μl(VEGF-80ng)の濃度に希釈
した。E2をメタノール中に溶解させてから、ワーキングソルーションをリン酸緩衝生理
食塩水(PBS)で調製して、(a)100ng/日(E2-100ng)、(b)20
0ng/日(E2-200ng)、および(b)600ng/日(E2-600ng)の
濃度にした。PBS中に溶解させることによって、最終濃度が(a)20μg/日(2d
DR-20)、(b)200μg/日(2dDR-200)、および(c)1000μg
/日(2dDR-1000)になるように、2dDR溶液を調製した。リンゴ酸スニチニ
ブ(スニチニブ)をDMSO中に溶解させて、PBSで希釈して、50ng/μlの最終
濃度にした。全ての物質のワーキングソルーションを、EDD7の直前に調製した。様々
な物質濃度の血管新生効率を、物質をCAMに直接付与(2用量/日/胚)することによ
って評価した。分岐点の数を定量化し、かつ平均血管長を算出することによって、血管新
生活性を判定した。
特に記載がない限り、全ての化学物質をSigma Aldrichから購入した。組
換えVEGF165ストック溶液を、2ng/μl(VEGF-80ng)の濃度に希釈
した。E2をメタノール中に溶解させてから、ワーキングソルーションをリン酸緩衝生理
食塩水(PBS)で調製して、(a)100ng/日(E2-100ng)、(b)20
0ng/日(E2-200ng)、および(b)600ng/日(E2-600ng)の
濃度にした。PBS中に溶解させることによって、最終濃度が(a)20μg/日(2d
DR-20)、(b)200μg/日(2dDR-200)、および(c)1000μg
/日(2dDR-1000)になるように、2dDR溶液を調製した。リンゴ酸スニチニ
ブ(スニチニブ)をDMSO中に溶解させて、PBSで希釈して、50ng/μlの最終
濃度にした。全ての物質のワーキングソルーションを、EDD7の直前に調製した。様々
な物質濃度の血管新生効率を、物質をCAMに直接付与(2用量/日/胚)することによ
って評価した。分岐点の数を定量化し、かつ平均血管長を算出することによって、血管新
生活性を判定した。
CAM上のE2放出足場および2dDR放出足場の血管新生の潜在性の比較
E2および2dDRを担持したPHBV足場の電界紡糸
溶液の調製
E2および2dDRを担持したPHBV足場の電界紡糸
溶液の調製
10%(w/w)のPHBV担持溶液を調製してから、電界紡糸を行った。1gのPH
BV顆粒(Goodfellow、London、UK)を、ドラフト内で1gのメタノ
ール(Fisher Scientific、Massachusetts、USA)お
よび8gのDCM(Fisher Scientific、Massachusetts
、USA)中に溶解させた。4つの10%PHBV溶液を調製してから、物質を加えた。
最後に、1gのPHBVあたり25mgのE2、50mgのE2、250mgの2dDR
、および500mgの2dDRを、各溶液に加えた。混合液を一晩磁気撹拌した。
BV顆粒(Goodfellow、London、UK)を、ドラフト内で1gのメタノ
ール(Fisher Scientific、Massachusetts、USA)お
よび8gのDCM(Fisher Scientific、Massachusetts
、USA)中に溶解させた。4つの10%PHBV溶液を調製してから、物質を加えた。
最後に、1gのPHBVあたり25mgのE2、50mgのE2、250mgの2dDR
、および500mgの2dDRを、各溶液に加えた。混合液を一晩磁気撹拌した。
電界紡糸
溶液(約10ml)を、内径0.6mmのシリンジチップを取り付けた10mlシリン
ジ中にロードした。次に、シリンジを、シリンジポンプ(GenieTMPlus、Ke
ntScientific、Connecticut、USA)内に入れた。アルミニウ
ム箔をコレクタとして用いて、針先から17cm離して配置した。ポンプを40μl/分
にセットして、コレクタおよびチップの双方に17kVの電圧を印加した。電界紡糸を、
全てのポリマー溶液が使い切られるまで、室温にて行った。
溶液(約10ml)を、内径0.6mmのシリンジチップを取り付けた10mlシリン
ジ中にロードした。次に、シリンジを、シリンジポンプ(GenieTMPlus、Ke
ntScientific、Connecticut、USA)内に入れた。アルミニウ
ム箔をコレクタとして用いて、針先から17cm離して配置した。ポンプを40μl/分
にセットして、コレクタおよびチップの双方に17kVの電圧を印加した。電界紡糸を、
全てのポリマー溶液が使い切られるまで、室温にて行った。
走査電子顕微鏡(SEM)
E2放出足場および2dDR放出足場の表面形態を、SEM(Philips/FEI
XL-20 SEM;Cambridge、UK)下で観察した。サンプルを、金スパ
ッタ(EdwardsスパッタコーターS150B、Crawley、England)
を用いて金でコーティングしてから撮像した。ImageJを用いて繊維の直径および孔
径を測定した。
E2放出足場および2dDR放出足場の表面形態を、SEM(Philips/FEI
XL-20 SEM;Cambridge、UK)下で観察した。サンプルを、金スパ
ッタ(EdwardsスパッタコーターS150B、Crawley、England)
を用いて金でコーティングしてから撮像した。ImageJを用いて繊維の直径および孔
径を測定した。
足場からのE2および2dDRの放出
足場を、6ウェルプレート中にフィットするように断片に切り分けて、重量を量って、
4 mlのPBS中に沈めた。各群(25mg E2、50mg E2、250mg 2
dDR、500mg 2dDR)から放出されたE2および2dDRの濃度を、UV-V
IS分光光度計(Thermo Fischer Evolution 220、Mas
sachusetts、USA)を用いて、2dDRについて238nmにて、そしてE
2について220nmにて蛍光定量的に測定した。E2および2dDRの知られている濃
度の標準曲線を用いて、吸光度値を濃度に変換した。
足場を、6ウェルプレート中にフィットするように断片に切り分けて、重量を量って、
4 mlのPBS中に沈めた。各群(25mg E2、50mg E2、250mg 2
dDR、500mg 2dDR)から放出されたE2および2dDRの濃度を、UV-V
IS分光光度計(Thermo Fischer Evolution 220、Mas
sachusetts、USA)を用いて、2dDRについて238nmにて、そしてE
2について220nmにて蛍光定量的に測定した。E2および2dDRの知られている濃
度の標準曲線を用いて、吸光度値を濃度に変換した。
CAM上へのE2放出足場および2dDR放出足場の移植
足場を、レーザー切断機(Epilog Laser Cutter、Clevedo
n、UK)を用いて直径5.5mmの円にカットして、1時間UV光下で滅菌してから移
植した。2つの円形の足場を、EDD8にCAM上に配置した。足場の画像を、EDD1
2およびEDD14に、デジタル顕微鏡を用いて得た。循環系中へのローダミン標識レク
チンのマイクロインジェクションを実行して、CAMを取り出して、3.7%ホルムアル
デヒド溶液中で固定した。次に、胚を、EDD14の終わりに犠牲にした。移植片に向か
って収束した全ての血管をカウントすることによって、血管新生を定量化した。
足場を、レーザー切断機(Epilog Laser Cutter、Clevedo
n、UK)を用いて直径5.5mmの円にカットして、1時間UV光下で滅菌してから移
植した。2つの円形の足場を、EDD8にCAM上に配置した。足場の画像を、EDD1
2およびEDD14に、デジタル顕微鏡を用いて得た。循環系中へのローダミン標識レク
チンのマイクロインジェクションを実行して、CAMを取り出して、3.7%ホルムアル
デヒド溶液中で固定した。次に、胚を、EDD14の終わりに犠牲にした。移植片に向か
って収束した全ての血管をカウントすることによって、血管新生を定量化した。
CAM上のE2放出足場および2dDR放出足場の組織学的評価
ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を、標準的なプロトコル[47]を修正
することによって、細胞含浸足場に実行した。簡単に言えば、固定サンプルを、最適な切
断温度のOCT内に包埋して、液体窒素中で3分間凍結した。クリオスタット(Leic
a Biosystems Nussloch、Germany)を-20℃にて用いて
、切片を厚さ8~10μmにカットした。次に、切片を、ヘマトキシリンで90秒間、そ
してエオシンで5分間染色した。最後に、H&E画像を、光学顕微鏡(Motic DM
-B1、Xiamen、China)下で得た。足場に隣接する血管の総数を、H&E切
片内の血管をカウントすることによって定量化した[A. Minajeva, M.
Kase, M. Saretok, A. Adamson-Raieste, S.
Kase, K. Niinepuu, M Vardja, T. Asser,
J. Jaal, Impact of Blood Vessel Quantity
and Vascular Expression of CD133 and IC
AM-1 on Survival of Glioblastoma Patient
s, Neurosci J. 2017 (2017) 8 pages]。簡単に言
えば、足場に隣接する全ての識別可能な血管を、2人の独立した調査者が、2つの独立し
た顕微鏡を10倍の倍率で用いて、各群について合計6つの異なるスライド、および各ス
ライド由来の6つの異なる注目領域からカウントした。
ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を、標準的なプロトコル[47]を修正
することによって、細胞含浸足場に実行した。簡単に言えば、固定サンプルを、最適な切
断温度のOCT内に包埋して、液体窒素中で3分間凍結した。クリオスタット(Leic
a Biosystems Nussloch、Germany)を-20℃にて用いて
、切片を厚さ8~10μmにカットした。次に、切片を、ヘマトキシリンで90秒間、そ
してエオシンで5分間染色した。最後に、H&E画像を、光学顕微鏡(Motic DM
-B1、Xiamen、China)下で得た。足場に隣接する血管の総数を、H&E切
片内の血管をカウントすることによって定量化した[A. Minajeva, M.
Kase, M. Saretok, A. Adamson-Raieste, S.
Kase, K. Niinepuu, M Vardja, T. Asser,
J. Jaal, Impact of Blood Vessel Quantity
and Vascular Expression of CD133 and IC
AM-1 on Survival of Glioblastoma Patient
s, Neurosci J. 2017 (2017) 8 pages]。簡単に言
えば、足場に隣接する全ての識別可能な血管を、2人の独立した調査者が、2つの独立し
た顕微鏡を10倍の倍率で用いて、各群について合計6つの異なるスライド、および各ス
ライド由来の6つの異なる注目領域からカウントした。
E2放出足場および2dDR放出足場の機械的特性の比較
足場から20mm×10mmの断片をカットすることによって、生体力学的試験サンプ
ルを調製した。装置のクランプを互いに10mm離して配置して、各足場の幅および厚さ
を測定した。試験サンプルを、張力計(BOSE Electroforce Test
Instruments、Minnesota、USA)内の2つのグリップでクラン
プ留めした。各サンプルに、サンプルが破損するまで、0.1mm/秒の速度にて引張試
験を実行した(n=4)。これらの試験の生データを用いて、応力-歪みグラフおよび荷
重-変位グラフを描いた。極限引張強度(UTS)を、各サンプルの応力(σ)および応
力(ε)曲線から算出した一方、剛性を、荷重(F)および変位(ΔL)曲線から算出し
た。
足場から20mm×10mmの断片をカットすることによって、生体力学的試験サンプ
ルを調製した。装置のクランプを互いに10mm離して配置して、各足場の幅および厚さ
を測定した。試験サンプルを、張力計(BOSE Electroforce Test
Instruments、Minnesota、USA)内の2つのグリップでクラン
プ留めした。各サンプルに、サンプルが破損するまで、0.1mm/秒の速度にて引張試
験を実行した(n=4)。これらの試験の生データを用いて、応力-歪みグラフおよび荷
重-変位グラフを描いた。極限引張強度(UTS)を、各サンプルの応力(σ)および応
力(ε)曲線から算出した一方、剛性を、荷重(F)および変位(ΔL)曲線から算出し
た。
また、足場の濡れ性に及ぼすE2および2dDRの影響を確認するために、周囲ラボ条
件下で、液滴形状アナライザ(KrussDSA100、Germany)を用いて、薬
物放出電界紡糸足場の濡れ性試験を実施した。簡単に言うと、5μlの液滴を足場表面上
に落として、完全に吸収されるまでの足場上の液滴の保持時間を、記録した試験のムービ
ーから算出した。サンプルの各タイプについて、3つの異なる基板上での最低3滴につい
ての保持時間を測定した。
件下で、液滴形状アナライザ(KrussDSA100、Germany)を用いて、薬
物放出電界紡糸足場の濡れ性試験を実施した。簡単に言うと、5μlの液滴を足場表面上
に落として、完全に吸収されるまでの足場上の液滴の保持時間を、記録した試験のムービ
ーから算出した。サンプルの各タイプについて、3つの異なる基板上での最低3滴につい
ての保持時間を測定した。
統計
統計分析を、対応のないスチューデントt検定を用いて実行した。P値<0.05を統
計的に有意とみなし、有意性の程度を星の数で示した(****P≦0.0001、**
*P≦0.001、**P≦0.01、*P≦0.05、nsP≧0.05)。
統計分析を、対応のないスチューデントt検定を用いて実行した。P値<0.05を統
計的に有意とみなし、有意性の程度を星の数で示した(****P≦0.0001、**
*P≦0.001、**P≦0.01、*P≦0.05、nsP≧0.05)。
結果
CAMに対するE2および2dDRの血管新生活性の評価
CAMのマクロ画像の定量化により、E2-100ng、E2-200ng、およびE
2-600ngの群について、分岐点の数がそれぞれ1.3倍、1.5倍、1.4倍増大
し、そして全ての濃度について、平均血管長が、4日にわたって対照と比較して、1.2
倍増大することが示された。同様に、2dDR-20μgおよび2dDR-200μgに
ついて、分岐点の数がそれぞれ1.3倍および1.4倍増大した。双方の濃度について、
対照足場と比較して、平均血管長が1.2倍増大した一方、2dDR-1000μg群に
ついて、有意差はなかった。分岐点および平均血管長の定量化を、それぞれ図15Aおよ
び図15Bに示す。E2および2dDRの最も効果的な濃度でのCAMのマクロ画像を、
図16に示す。
CAMに対するE2および2dDRの血管新生活性の評価
CAMのマクロ画像の定量化により、E2-100ng、E2-200ng、およびE
2-600ngの群について、分岐点の数がそれぞれ1.3倍、1.5倍、1.4倍増大
し、そして全ての濃度について、平均血管長が、4日にわたって対照と比較して、1.2
倍増大することが示された。同様に、2dDR-20μgおよび2dDR-200μgに
ついて、分岐点の数がそれぞれ1.3倍および1.4倍増大した。双方の濃度について、
対照足場と比較して、平均血管長が1.2倍増大した一方、2dDR-1000μg群に
ついて、有意差はなかった。分岐点および平均血管長の定量化を、それぞれ図15Aおよ
び図15Bに示す。E2および2dDRの最も効果的な濃度でのCAMのマクロ画像を、
図16に示す。
CAMサンプルの微小血管評価では、4日にわたって対照と比較して、E2および2d
DRの付与群について、VA%が55.3%±3%からそれぞれ79.5%±5%および
71.7%±3%に増大することが示された(図16)。VEGFおよびスニチニブを、
陽性対照および陰性対照として用いた(図16)。
DRの付与群について、VA%が55.3%±3%からそれぞれ79.5%±5%および
71.7%±3%に増大することが示された(図16)。VEGFおよびスニチニブを、
陽性対照および陰性対照として用いた(図16)。
PHBV足場の微細構造に及ぼす、E2および2dDRを含めたことの影響
E2および2dDR放出PHBV足場のSEM画像を、図17に見ることができる。図
17の右下隅のグラフに示すように、繊維の直径は、PHBV対照群(0.66±0.1
6μm)と比較した場合、全ての群内に物質を加えることによって(25mg E2(0
.83±0.17μm)、50mg E2(0.98±0.35μm)、250mg 2
dDR(0.89±0.19μm)、500mg 2dDR(1.22±0.28μm)
をPHBV足場に加えた)、有意に増大した。
E2および2dDR放出PHBV足場のSEM画像を、図17に見ることができる。図
17の右下隅のグラフに示すように、繊維の直径は、PHBV対照群(0.66±0.1
6μm)と比較した場合、全ての群内に物質を加えることによって(25mg E2(0
.83±0.17μm)、50mg E2(0.98±0.35μm)、250mg 2
dDR(0.89±0.19μm)、500mg 2dDR(1.22±0.28μm)
をPHBV足場に加えた)、有意に増大した。
30日にわたるPHBV足場からのE2および2dDRの放出
図18に示すように、足場からのE2および2dDRの放出速度を、30日にわたって
評価した。7日目までに、足場からの2dDR放出は、250mgおよび500mgの2
dDR足場について、ポリマー溶液中に存在する2dDRのそれぞれ81.3%および8
6.5%であった(図18A)。対照的に、7日以内の足場からの総E2の放出は、25
mgおよび50mgのE2足場用のポリマー溶液中に存在する初期E2のそれぞれ1.3
%および1.6%を表した(図18B)。
図18に示すように、足場からのE2および2dDRの放出速度を、30日にわたって
評価した。7日目までに、足場からの2dDR放出は、250mgおよび500mgの2
dDR足場について、ポリマー溶液中に存在する2dDRのそれぞれ81.3%および8
6.5%であった(図18A)。対照的に、7日以内の足場からの総E2の放出は、25
mgおよび50mgのE2足場用のポリマー溶液中に存在する初期E2のそれぞれ1.3
%および1.6%を表した(図18B)。
足場の機械的特性に及ぼすE2および2dDRの影響の比較
図19Aからわかるように、全ての物質を加えると、プレーンなPHBV足場と比較し
た場合、PHBV足場のUTSが有意に増大した。UTSの最も有意な増大は、2dDR
250mg群について観察された。同様に、2dDRおよびE2を担持した足場の剛性
は、担持していないPHBV足場と比較して、有意に高かった。
図19Aからわかるように、全ての物質を加えると、プレーンなPHBV足場と比較し
た場合、PHBV足場のUTSが有意に増大した。UTSの最も有意な増大は、2dDR
250mg群について観察された。同様に、2dDRおよびE2を担持した足場の剛性
は、担持していないPHBV足場と比較して、有意に高かった。
図19Bに示すように、250mg 2dDR担持は、PHBV足場の剛性を最大限にま
で増大させた。薬物放出足場の濡れ性を、液滴形状分析器を用いて算出される液滴保持時
間により調査した。薬物放出足場上での水滴の保持時間を、図19Cに示した。これは、
2dDRを添加して足場の濡れ性がより高くなる一方、E2を加えて足場の濡れ性がより
低くなることを示した。
で増大させた。薬物放出足場の濡れ性を、液滴形状分析器を用いて算出される液滴保持時
間により調査した。薬物放出足場上での水滴の保持時間を、図19Cに示した。これは、
2dDRを添加して足場の濡れ性がより高くなる一方、E2を加えて足場の濡れ性がより
低くなることを示した。
CAM上のE2放出足場および2dDR放出足場の血管新生活性の評価
CAM上のE2放出足場および2dDR放出足場の評価により、図20においてわかる
ように、プレーンなPHBV足場と比較して、全ての群について、足場に向かって成長す
る識別可能な血管の数が少なくとも2倍になることが示された。25mg E2担持足場
および50mg E2担持足場についての平均血管数は、対照群(平均血管数:23.1
(±1.24))と比較した場合、それぞれ49.5(±0.92)(****P≦0.
0001)および37.9(±1.05)(****P≦0.0001)であった一方、
250mgおよび500mgの2dDR担持足場について、それぞれ48.6(±1.0
2)(****P≦0.0001)および37.1(±1.37)(****P≦0.0
001)であった。担持された物質はいずれも、胚生存率に影響せず、各群について75
%を超えた。
CAM上のE2放出足場および2dDR放出足場の評価により、図20においてわかる
ように、プレーンなPHBV足場と比較して、全ての群について、足場に向かって成長す
る識別可能な血管の数が少なくとも2倍になることが示された。25mg E2担持足場
および50mg E2担持足場についての平均血管数は、対照群(平均血管数:23.1
(±1.24))と比較した場合、それぞれ49.5(±0.92)(****P≦0.
0001)および37.9(±1.05)(****P≦0.0001)であった一方、
250mgおよび500mgの2dDR担持足場について、それぞれ48.6(±1.0
2)(****P≦0.0001)および37.1(±1.37)(****P≦0.0
001)であった。担持された物質はいずれも、胚生存率に影響せず、各群について75
%を超えた。
CAM上でのE2放出足場および2dDR放出足場の組織学的分析
足場に隣接する血管の平均数は、対照群およびCAMのみの群と比較した場合、E2放
出足場および2dDR放出足場の双方の全ての濃度に応じて、有意に増大した(図21お
よび図22参照)。
足場に隣接する血管の平均数は、対照群およびCAMのみの群と比較した場合、E2放
出足場および2dDR放出足場の双方の全ての濃度に応じて、有意に増大した(図21お
よび図22参照)。
血管新生促進剤を担持したか担持していないかに拘らず、全ての足場は、CAMへの良
好な付着を示し、そして全ての膜は、同様の細胞浸潤を示した。図21は、代表的な組織
構造の画像を示す。
好な付着を示し、そして全ての膜は、同様の細胞浸潤を示した。図21は、代表的な組織
構造の画像を示す。
結論
データから、2dDRおよびE2の直接的付与、ならびにPHBV繊維からのこれらの
因子の漸次放出の双方が、ex-ovo CAMアッセイにおいて血管新生を刺激したと
結論付けることができる。これらの2つの小さな安定因子は、例えば、組織工学的構築体
に用いられ、かつ血管新生をin vivoで促進するTE足場の官能化に用いられる高
い潜在性を有するような電界紡糸繊維中に容易に組み込まれた。
データから、2dDRおよびE2の直接的付与、ならびにPHBV繊維からのこれらの
因子の漸次放出の双方が、ex-ovo CAMアッセイにおいて血管新生を刺激したと
結論付けることができる。これらの2つの小さな安定因子は、例えば、組織工学的構築体
に用いられ、かつ血管新生をin vivoで促進するTE足場の官能化に用いられる高
い潜在性を有するような電界紡糸繊維中に容易に組み込まれた。
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本発明の特定の態様および実施形態が、以下のパラグラフにおいて記載される。
パラグラフ1.創傷治癒の促進に使用されるD-デオキシリボース糖および/またはエ
ストラジオール。
ストラジオール。
パラグラフ2.D-デオキシリボースは、2-デオキシリボースである、パラグラフ1
に従う使用用のD-デオキシリボース糖および/またはエストラジオール。
に従う使用用のD-デオキシリボース糖および/またはエストラジオール。
パラグラフ3.創傷治癒の促進に用いられるL-デオキシ糖。
パラグラフ4.L-デオキシ糖は、L-デオキシリボース、L-デオキシフコース、お
よびL-デオキシラムノースから選択される、パラグラフ3に従う使用用のL-デオキシ
糖、
パラグラフ5.糖は、局所投与用である、パラグラフ1~2のいずれか1つに従う使用
用のD-デオキシリボース糖および/もしくはエストラジオール、またはパラグラフ3も
しくは4に従う使用用のL-デオキシ糖。
パラグラフ4.L-デオキシ糖は、L-デオキシリボース、L-デオキシフコース、お
よびL-デオキシラムノースから選択される、パラグラフ3に従う使用用のL-デオキシ
糖、
パラグラフ5.糖は、局所投与用である、パラグラフ1~2のいずれか1つに従う使用
用のD-デオキシリボース糖および/もしくはエストラジオール、またはパラグラフ3も
しくは4に従う使用用のL-デオキシ糖。
パラグラフ6.糖は、担体中に用意される、前記パラグラフのいずれかに従う使用用の
D-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
D-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ7.担体は、生体適合性マトリックス材料である、パラグラフ6に従う使用
用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ8.マトリックス材料は、電界紡糸された足場である、パラグラフ7に従う
使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ9.電界紡糸された足場は、ポリカプロラクトン足場である、パラグラフ8
に従う使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
に従う使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ10.担体は、ヒドロゲルである、請求項6に記載の使用用のD-デオキシ
リボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
リボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ11.ヒドロゲルは、架橋ヒドロゲルである、パラグラフ10に従う使用用
のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ12.ヒドロゲルは、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メ
チルセルロース、ヒアルロナン、またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む
、パラグラフ10またはパラグラフ11に従う使用用のD-デオキシリボース糖、エスト
ラジオール、またはL-デオキシ糖。
チルセルロース、ヒアルロナン、またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む
、パラグラフ10またはパラグラフ11に従う使用用のD-デオキシリボース糖、エスト
ラジオール、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ13.ヒドロゲルは、キトサンおよびコラーゲンを含む、パラグラフ10~
12のいずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、または
L-デオキシ糖。
12のいずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、または
L-デオキシ糖。
パラグラフ14.ヒドロゲルは、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、
アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを含む、パラグラフ10~13の
いずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デ
オキシ糖。
アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを含む、パラグラフ10~13の
いずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デ
オキシ糖。
パラグラフ15.ヒドロゲルは、キトサンおよびポリビニルアルコールを含む、パラグ
ラフ10~14のいずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオー
ル、またはL-デオキシ糖。
ラフ10~14のいずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオー
ル、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ16.担体は、抗菌剤をさらに含む、パラグラフ6~15のいずれか1つに
従う使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
従う使用用のD-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ17.創傷は、慢性創傷である、前記パラグラフのいずれかに従う使用用の
D-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
D-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ18.創傷は、全層創傷である、前記パラグラフのいずれかに従う使用用の
D-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
D-デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ19.創傷は、火傷である、前記パラグラフのいずれかに従う使用用のD-
デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
デオキシリボース糖、エストラジオール、またはL-デオキシ糖。
パラグラフ20.D-デオキシリボース糖および/またはエストラジオールを含む生体
適合性マトリックス材料。
適合性マトリックス材料。
パラグラフ21.L-デオキシ糖を含む生体適合性マトリックス材料。
パラグラフ22.マトリックス材料は、電界紡糸された足場である、パラグラフ20ま
たはパラグラフ21に従う生体適合性マトリックス材料。
たはパラグラフ21に従う生体適合性マトリックス材料。
パラグラフ23.電界紡糸された足場は、ポリカプロラクトン足場である、パラグラフ
22に従う生体適合性マトリックス材料。
22に従う生体適合性マトリックス材料。
パラグラフ24.D-デオキシリボース糖および/またはエストラジオールを含むヒド
ロゲル。
ロゲル。
パラグラフ25.L-デオキシ糖を含むヒドロゲル。
パラグラフ26.ヒドロゲルは、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メ
チルセルロース、ヒアルロナン、またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む
、パラグラフ24またはパラグラフ25に従うヒドロゲル。
チルセルロース、ヒアルロナン、またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む
、パラグラフ24またはパラグラフ25に従うヒドロゲル。
パラグラフ27.ヒドロゲルは、キトサンおよびコラーゲンを含む、パラグラフ24~
26のいずれか1つに従うヒドロゲル。
26のいずれか1つに従うヒドロゲル。
パラグラフ28.ヒドロゲルは、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、
アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを含む、パラグラフ24~27の
いずれか1つに従うヒドロゲル。
アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを含む、パラグラフ24~27の
いずれか1つに従うヒドロゲル。
パラグラフ29.ヒドロゲルは、キトサンおよびポリビニルアルコールを含む、パラグ
ラフ24~28のいずれか1つに従うヒドロゲル。
ラフ24~28のいずれか1つに従うヒドロゲル。
パラグラフ30.創傷治癒の促進に使用され、または脱毛症の処置に使用される、パラ
グラフ20~23の生体適合性材料。
グラフ20~23の生体適合性材料。
パラグラフ31.創傷治癒の促進に使用され、または脱毛症の処置に使用される、パラ
グラフ24~29のヒドロゲル。
グラフ24~29のヒドロゲル。
パラグラフ32.創傷床において血管化を増大させ、または誘導する方法に使用される
、パラグラフ20~23の生体適合性材料。
、パラグラフ20~23の生体適合性材料。
パラグラフ33.創傷床において血管新生を増大させ、または誘導する方法に使用され
る、パラグラフ24~29のヒドロゲル。
る、パラグラフ24~29のヒドロゲル。
パラグラフ34.D-デオキシリボース糖および/またはエストラジオールを創傷に投
与することを含む、創傷床において血管新生を増大させ、または誘導する方法。
与することを含む、創傷床において血管新生を増大させ、または誘導する方法。
パラグラフ35.創傷にL-デオキシ糖を投与することを含む、創傷床において血管新
生を増大させ、または誘導する方法。
生を増大させ、または誘導する方法。
パラグラフ36.前記糖および/またはエストラジオールは、創傷床に局所投与される
、パラグラフ34またはパラグラフ35の方法。
、パラグラフ34またはパラグラフ35の方法。
パラグラフ37.脱毛症の処置に使用されるD-デオキシリボース糖および/またはエ
ストラジオール。
ストラジオール。
パラグラフ38.D-デオキシリボースは、2-デオキシリボースである、パラグラフ
37に従う使用用のD-デオキシリボース糖。
37に従う使用用のD-デオキシリボース糖。
パラグラフ39.脱毛症の処置に使用されるL-デオキシ糖。
パラグラフ40.L-デオキシ糖は、L-デオキシリボース、L-デオキシフコース、
およびL-デオキシラムノースから選択される、パラグラフ39に従う使用用のL-デオ
キシ糖。
およびL-デオキシラムノースから選択される、パラグラフ39に従う使用用のL-デオ
キシ糖。
パラグラフ41.糖は、局所投与用である、パラグラフ37~38のいずれか1つに従
う使用用のD-デオキシリボース糖および/もしくはエストラジオール、またはパラグラ
フ39~40に従う使用用のL-デオキシ糖。
う使用用のD-デオキシリボース糖および/もしくはエストラジオール、またはパラグラ
フ39~40に従う使用用のL-デオキシ糖。
パラグラフ42.糖は、担体中に用意される、パラグラフ37~38、もしくは41の
いずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖および/もしくはオエストラジオー
ル、またはパラグラフ39~41に従うL-デオキシ糖。
いずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖および/もしくはオエストラジオー
ル、またはパラグラフ39~41に従うL-デオキシ糖。
パラグラフ43.担体は、生体適合性マトリックス材料である、パラグラフ42に従う
使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキシ糖。
使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキシ糖。
パラグラフ44.マトリックス材料は、電界紡糸された足場である、パラグラフ43に
従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキシ糖。
従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキシ糖。
パラグラフ45.電界紡糸された足場は、ポリカプロラクトン足場である、パラグラフ
44に従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキ
シ糖。
44に従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキ
シ糖。
パラグラフ46.担体は、ヒドロゲルである、パラグラフ43に従う使用用のD-デオ
キシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキシ糖。
キシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキシ糖。
パラグラフ47.ヒドロゲルは、架橋ヒドロゲルである、パラグラフ46に従う使用用
のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキシ糖。
のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキシ糖。
パラグラフ48.ヒドロゲルは、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メ
チルセルロース、ヒアルロナン、またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む
、パラグラフ46またはパラグラフ47に従う使用用のD-デオキシリボース糖、および
エストラジオールまたはL-デオキシ糖。
チルセルロース、ヒアルロナン、またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む
、パラグラフ46またはパラグラフ47に従う使用用のD-デオキシリボース糖、および
エストラジオールまたはL-デオキシ糖。
パラグラフ49.ヒドロゲルは、キトサンおよびコラーゲンを含む、パラグラフ46~
48のいずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールま
たはL-デオキシ糖。
48のいずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールま
たはL-デオキシ糖。
パラグラフ50.ヒドロゲルは、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、
アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを含む、パラグラフ46~49の
いずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL
-デオキシ糖。
アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを含む、パラグラフ46~49の
いずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL
-デオキシ糖。
パラグラフ51.ヒドロゲルは、キトサンおよびポリビニルアルコールを含む、パラグ
ラフ42~36のいずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラ
ジオールまたはL-デオキシ糖。
ラフ42~36のいずれか1つに従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラ
ジオールまたはL-デオキシ糖。
パラグラフ52.担体は、抗菌剤をさらに含む、パラグラフ42~51のいずれか1つ
に従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキシ糖
。
に従う使用用のD-デオキシリボース糖、およびエストラジオールまたはL-デオキシ糖
。
パラグラフ53.毛の再生を促進する非治療的方法であって、D-デオキシリボース糖
および/またはエストラジオールを含む組成物の投与を含む方法。
および/またはエストラジオールを含む組成物の投与を含む方法。
パラグラフ54.前記方法は、D-デオキシリボース糖および/またはエストラジオー
ルを含む組成物の、単離された毛包への投与を含む、パラグラフ53に記載の毛の再生を
促進する非治療的方法。
ルを含む組成物の、単離された毛包への投与を含む、パラグラフ53に記載の毛の再生を
促進する非治療的方法。
パラグラフ55.D-デオキシリボースは、2-デオキシリボースである、パラグラフ
53またはパラグラフ54に記載の毛の再生を促進する非治療的方法。
53またはパラグラフ54に記載の毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ56.毛の再生を促進する非治療的方法であって、L-デオキシ糖を含む組
成物の投与を含む方法。
成物の投与を含む方法。
パラグラフ57.前記方法は、L-デオキシ糖を含む組成物の、単離された毛包への投
与を含む、パラグラフ56に記載の毛の再生を促進する非治療的方法。
与を含む、パラグラフ56に記載の毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ58.L-デオキシ糖は、L-デオキシリボース、L-デオキシフコース、
L-デオキシラムノースから選択される、パラグラフ46またはパラグラフ57に記載の
毛の再生を促進する非治療的方法。
L-デオキシラムノースから選択される、パラグラフ46またはパラグラフ57に記載の
毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ59.糖および/またはエストラジオールは、局所投与用である、パラグラ
フ53~58のいずれか1つに従う毛の再生を促進する非治療的方法。
フ53~58のいずれか1つに従う毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ60.糖またはエストラジオールは、担体中に用意される、パラグラフ53
~59のいずれか1つに従う毛の再生を促進する非治療的方法。
~59のいずれか1つに従う毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ61.担体は、生体適合性マトリックス材料である、パラグラフ60に従う
毛の再生を促進する非治療的方法。
毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ62.マトリックス材料は、電界紡糸された足場である、パラグラフ61に
従う毛の再生を促進する非治療的方法。
従う毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ63.電界紡糸された足場は、ポリカプロラクトン足場である、パラグラフ
62に従う毛の再生を促進する非治療的方法。
62に従う毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ64.担体は、ヒドロゲルである、パラグラフ63に従う毛の再生を促進す
る非治療的方法。
る非治療的方法。
パラグラフ65.ヒドロゲルは、架橋ヒドロゲルである、パラグラフ64に従う毛の再
生を促進する非治療的方法。
生を促進する非治療的方法。
パラグラフ66.ヒドロゲルは、キトサン、ゼラチン、アルギナート、アガロース、メ
チルセルロース、ヒアルロナン、またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む
、パラグラフ64またはパラグラフ65に従う毛の再生を促進する非治療的方法。
チルセルロース、ヒアルロナン、またはそれらのあらゆる組合せの少なくとも1つを含む
、パラグラフ64またはパラグラフ65に従う毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ67.ヒドロゲルは、キトサンおよびコラーゲンを含む、パラグラフ64~
65のいずれか1つに従う毛の再生を促進する非治療的方法。
65のいずれか1つに従う毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ68.ヒドロゲルは、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、
アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを含む、パラグラフ64~67の
いずれか1つに従う毛の再生を促進する非治療的方法。
アクリラートポリマー、またはそれらのあらゆる組合せを含む、パラグラフ64~67の
いずれか1つに従う毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ69ヒドロゲルは、キトサンおよびポリビニルアルコールを含む、パラグラ
フ64~68のいずれか1つに従う毛の再生を促進する非治療的方法。
フ64~68のいずれか1つに従う毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ70.担体は、抗菌剤をさらに含む、パラグラフ60~69のいずれか1つ
に従う毛の再生を促進する非治療的方法。
に従う毛の再生を促進する非治療的方法。
パラグラフ71.創傷治癒の促進に使用され、または脱毛症の処置に使用される、D-
デオキシリボース糖もしくはエストラジオール、またはその薬学的塩もしくは誘導体を含
む薬学的組成物。
デオキシリボース糖もしくはエストラジオール、またはその薬学的塩もしくは誘導体を含
む薬学的組成物。
パラグラフ72.創傷治癒の促進に使用され、または脱毛症の処置に使用される、L-
デオキシ糖、またはその薬学的塩もしくは誘導体を含む薬学的組成物。
デオキシ糖、またはその薬学的塩もしくは誘導体を含む薬学的組成物。
パラグラフ73.組成物は、抗菌剤をさらに含む、パラグラフ71またはパラグラフ7
2に従う薬学的組成物。
2に従う薬学的組成物。
パラグラフ74.組成物は、単離された毛包を含む、パラグラフ71~73のいずれか
1つに従う薬学的組成物。
1つに従う薬学的組成物。
パラグラフ75.パラグラフ20~23のいずれか1つに従う生体適合性マトリックス
材料を含む創傷包帯。
材料を含む創傷包帯。
パラグラフ76.パラグラフ24~29のいずれか1つに従うヒドロゲルを含む創傷包
帯。
帯。
パラグラフ77.パラグラフ71~74のいずれか1つに従う薬学的組成物を含む創傷
包帯。
包帯。
パラグラフ78.添付の図面を参照して本明細書中に実質的に記載される使用用のD-
デオキシリボース糖。
デオキシリボース糖。
パラグラフ79.添付の図面を参照して本明細書中に実質的に記載される使用用のL-
デオキシ糖。
デオキシ糖。
パラグラフ80.添付の図面を参照して本明細書中に実質的に記載されるヒドロゲル。
パラグラフ81.添付の図面を参照して本明細書中に実質的に記載されるヒドロゲル。
パラグラフ82.添付の図面を参照して本明細書中に実質的に記載される薬学的組成物
。
。
Claims (10)
- 創傷治癒を促進するのに使用されるD-デオキシリボース糖であって、前記糖が、担体内に用意され、前記担体が、生体適合性マトリックス材料またはヒドロゲルである、D-デオキシリボース糖。
- D-デオキシリボース糖を含む生体適合性マトリックス材料。
- D-デオキシリボース糖を含むヒドロゲル。
- 脱毛症の処置に使用されるD-デオキシリボース糖であって、前記糖が、担体内に用意され、前記担体が、生体適合性マトリックス材料またはヒドロゲルである、D-デオキシリボース糖。
- 毛の再生を促進する非治療的方法であって、前記方法が、D-デオキシリボース糖の投与を含み、前記糖が、担体内に用意され、前記担体が、生体適合性マトリックス材料またはヒドロゲルである、方法。
- 請求項2に記載の生体適合性マトリックス材料を含む創傷包帯。
- 請求項3に記載のヒドロゲルを含む創傷包帯。
- 創傷治癒を促進するのに使用されるエストラジオールであって、前記エストラジオールが、担体内に用意され、前記担体が、生体適合性マトリックス材料またはヒドロゲルである、エストラジオール。
- 脱毛症の処置に使用されるエストラジオールであって、前記エストラジオールが、担体内に用意され、前記担体が、生体適合性マトリックス材料またはヒドロゲルである、エストラジオール。
- 毛の再生を促進する非治療的方法であって、前記方法が、エストラジオールの投与を含み、前記エストラジオールが、担体内に用意され、前記担体が、生体適合性マトリックス材料またはヒドロゲルである、方法。
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