KR102516009B1 - 양막 분말 및 상처 치유 및 조직 공학 구축물에서의 그의 용도 - Google Patents

양막 분말 및 상처 치유 및 조직 공학 구축물에서의 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상처 치유 및 조직 재생을 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 본 발명의 조성물은 양막 분말을 포함한다. 본 발명의 조성물은 양막 분말 및 스캐폴드를 포함한다. 본 발명의 방법은 본 발명의 조성물을 대상체에게 적용하여 상처 치유 및 조직 재생을 유도하는 것을 포함한다.

Description

양막 분말 및 상처 치유 및 조직 공학 구축물에서의 그의 용도 {AMNIOTIC MEMBRANE POWDER AND ITS USE IN WOUND HEALING AND TISSUE ENGINEERING CONSTRUCTS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2014년 10월 2일 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/058,969 우선권 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
광범위한 화상 및 전층 피부 상처는 환자에게 엄청난 손상을 가할 수 있고, 심지어 치료된 경우에도 그러하다. 미국에서는 매년 500,000여 명이 화상 치료를 받는 것으로 추정되고 있다 (문헌 [Cherry et al., 2008, Natl. Health Stat. Report: 1-39]; [Pitts et al., 2008, Natl. Health Stat. Report: 1-38]). 1998년부터 2007년까지 화상으로 인한 전체 사망률은 4.9%였고, 화상 치료를 위한 의료비는 매년 20억 달러에 달한다 (문헌 [Miller et al., 2008, J. Burn Car. Res., 29: 862-871]). 전세계적으로, 이러한 통계치는 매년 손상이 1,100만 건까지 증가한다 (문헌 [Peck, 2011, Burns, 37: 1087-1100]). 화상 이외에도, 전층 만성 상처가 다수의 환자 기반을 구성하고, 치료 기술이 발전했음에도 불구하고, 치유율은 여전히 성공률이 50% 미만으로 유지되고 있다 (문헌 [Kurd et al., 2009, Wound Repair Regen., 17: 318-325]). 이러한 비치유 만성 상처는 미국에서 매년 700만 명의 사람들에게 영향을 미치는 것으로 추정되며, 연간 비용은 250억 달러에 달한다 (문헌 [Sen et al., 2009, Wound Repair Regen., 17: 763-771]). 이러한 유형의 손상들 중 임의의 것을 앓는 환자는 상처를 완전히 봉합하고, 보호하는 신속한 치료로부터 이익을 얻게 된다. 특히, 지연 치료를 받은 화상 환자는 대개 광범위한 흉터 형성의 대상이 되며, 이는 장기간 생리학상 부정적인 효과를 초래할 수 있다.
상처 치유 치료에서 최적 표준(gold standard)은 자가 유래의 부분 층 피부 이식이다. 이는 환자에 대한 제2 수술 부위로부터 피부 조각을 적출하고, 상기 이식편을 상처 또는 화상 부위에 재적용시키는 것을 포함한다. 이러한 치료는 합리적인 임상적 결과를 초래하지만, 상처가 광범위할 경우에는 공여 부위의 개수 및 크기는 제한이 된다. 동종이식은 추가 옵션이며, 이는 이식에 대한 면역 거부를 막기 위해 면역억제성 약물을 필요로 하는 것을 동반한다. 따라서, 이러한 한계는 비-세포성 진피 대체재의 개발로 이어졌는데, 이는 대개 중합체 스캐폴드로 구성되고, 제조 비용이 높으며, 미용상 비교적 불량한 결과를 초래한다.
따라서, 당업계에서는 임상적 효율이 높은 상처 치유 및 재생 의학 생성물이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 충족되지 못한 요구를 충족시켜 준다.
본 발명은 상처 치유 및 조직 재생을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 양막 분말을 포함하는 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 양막 분말은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 양으로 전체 단백질을 포함한다. 다른 실시양태에서, 양막 분말은 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 양으로 엘라스틴을 추가로 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 양막 분말은 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 양으로 콜라겐을 추가로 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 양막 분말은 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 양으로 글리코사미노글리칸을 추가로 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 양막 분말은 30 ㎍/g 내지 1,000 ㎍/g 범위의 양으로 트롬보스폰딘-1 (TSP-1)을 추가로 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 양막 분말은 0.1 ㎍/g 내지 50 ㎍/g 범위의 양으로 펜트락신 3 (PTX-3)을 추가로 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 양막 분말은 1.5 ng/g 미만인 양으로 종양 괴사 인자-자극 유전자 6 (TSG-6)을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 양막 분말 및 스캐폴드를 포함하는 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 스캐폴드는, 양막 분말이 히드로겔 내에 도입되어 있는 것인, 히드로겔이다. 다른 실시양태에서, 양막 분말은 히알루론산 (HA) 기반 히드로겔 내에 도입되어 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 스캐폴드는 히알루론난, 키토산, 알기네이트, 콜라겐, 덱스트란, 펙틴, 카라기난, 폴리리신, 젤라틴 및 아가로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 생체중합체를 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 스캐폴드는 (메트)아크릴레이트-올리고락티드-PEO-올리고락티드-(메트)아크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEO), 폴리(프로필렌 글리콜) (PPO), PEO-PPO-PEO 공중합체 (플루로닉(Pluronics)), 폴리(포스파젠), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(N-비닐피롤리돈), PL(G)A-PEO-PL(G)A 공중합체, 폴리(에틸렌 이민), 및 폴리(에틸 글리콜) 디아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 합성 중합체를 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체 치료 부위에 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 상처 치유 및 조직 재생을 유도하는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 대상체 상처부에 직접 도포된다. 조성물은 에어로졸 스프레이, 겔, 크림, 또는 연고로서 도포된다.
추가의 또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 상처 치유 및 조직 재생을 유도하기 위한 키트 팩을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트 팩은 미리 결정된 양의 히드로겔 전구체 물질을 함유하는 제1 구획 및 미리 결정된 양의 양막 분말을 포함하는 조성물 및 가교제를 포함하는 조성물을 함유하는 제2 구획을 포함한다. 다른 실시양태에서, 키트 팩는 미리 결정된 양의 히드로겔 전구체 물질을 함유하는 제1 구획 및 양막 분말을 포함하는 조성물 및 미리 결정된 양의 가교제를 포함하는 조성물을 함유하는 제2 구획을 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 키트 팩은 양막 분말, 수용성 물질에 의해 코팅된 히드로겔 전구체 물질, 및 가교제가 건조되어 있는 것인, 양막 분말, 수용성 물질에 의해 코팅된 히드로겔 전구체 물질, 및 가교제를 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 키트 팩은 양막 분말, 히드로겔 전구체 물질, 및 수용성 물질에 의해 코팅된 가교제가 건조되어 있는 것인, 미리 결정된 양의 양막 분말, 히드로겔 전구체 물질, 및 수용성 물질에 의해 코팅된 가교제를 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 키트 팩은 히드로겔 전구체 물질 및 가교제가 pH <7인 용액으로부터 건조되어 있는 것인, 미리 결정된 양의 양막 분말, 히드로겔 전구체 물질, 및 가교제를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 대한 하기의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽고 파악할 때 더욱 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위해, 현재 바람직한, 도면 실시양태로 제시된다. 그러나, 본 발명은 도면에 제시된 실시양태의 바로 그 처리 방식 및 수단으로 제한되는 것은 아님을 이해하여야 한다.
도 1은 본 연구에서 동물의 준비, 상처 행성, 치료 수행 및 보호 붕대 감기에 관여하는 단계를 도시한 것이다.
도 2는 영상화 및 조직 수거 단계를 도시한 영상 세트이다. 패널 a-c는 조직 수거 단계를 도시한 것이다. 패널 d 및 e는 생체외 분석을 도시한 것이다.
도 3은 영상 분석 방법을 도시한 것이다. 패널 a는 각 시점에 타투 (보라색)로 규정된 부위의 수축을 도시한 것이다. 수축비는 상처 수축 동안 발생하는 형상의 변화를 측정한 것이다. 패널 b는 개방창 (open wound) (적색), 미성숙한 상피 (황색), 및 성숙 상피 (녹색)의 면적을 측정함으로써 측정된 상처 봉합 및 상피형성을 도시한 것이다.
도 4는 다른 처리하의 다른 시점에서의 돼지 1로부터의 상처를 도시한 영상 세트이다.
도 5는 다른 처리하의 다른 시점에서의 돼지 2로부터의 상처를 도시한 영상 세트이다.
도 6은 다른 처리하의 다른 시점에서의 돼지 3으로부터의 상처를 도시한 영상 세트이다.
도 7은 다른 처리하의 다른 시점에서의 돼지 4로부터의 상처를 도시한 영상 세트이다.
도 8은 다른 처리하의 다른 시점에서의 돼지 5로부터의 상처를 도시한 영상 세트이다.
도 9는 다른 처리하의 다른 시점에서의 돼지 6으로부터의 상처를 도시한 영상 세트이다.
도 10은 다른 처리하의 다른 시점에서의 상처 부위 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 다른 처리하의 다른 시점에서의 상처 수축 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 다른 처리하의 다른 시점에서의 수축비 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 다른 처리하의 다른 시점에서의 상피형성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 14는 치유 동안 상처 부위의 각 개별 성분의 조합을 도시한 그래프 세트이다. 상처 크기 (적색) , 상피형성 (녹색) 및 수축 면적 (청색)이 제시되어 있다. 결과는 가장 우수한 치유 (상단)에서부터 가장 불량한 치유 (하단)까지로 순위화되어 있다.
도 15는 돼지 1-3에 대한 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색된 조직학적 영상을 도시한 영상 세트이다.
도 16은 돼지 4-6에 대한 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(Eosin) (H&E) 염색된 조직학적 영상을 도시한 영상 세트이다.
도 17은 조직의 펜타크롬(Pentachrome) 염색을 도시한 영상 세트이다.
도 18은 편광으로 관측된 조직의 시리우스 레드(Sirius Red) 염색을 도시한 영상 세트이다.
도 19는 뮤신/GAG를 시각화하는 알시안 블루(Alcian 청색) 염색을 도시한 영상 세트이다.
도 20은 뮤신/GAG를 시각화하는 철 콜로이드 염색을 도시한 영상 세트이다. 이 염색은 알시안 블루 염색보다 더욱 특이적이고, 초기 관찰 결과를 뒷받침하였다.
도 21은 DAPI 핵 대조염색 (청색)을 이용한 I형 콜라겐 (적색) 및 III형 콜라겐 (녹색)에 대한 면역 염색을 도시한 영상 세트이다.
도 22는 헤마톡실린 핵 대조염색 (청색)을 이용한 호중구 (갈색)에 대한 면역 염색을 도시한 영상 세트이다.
도 23은, 패널 a는 상이한 처리하의 비치유 상처의 염증성 마커 IL1알파를 도시한 것이고; 패널 b는 상이한 처리하의 비치유 상처의 염증성 마커 IL1베타를 도시한 것이고; 패널 c는 상이한 처리하의 비치유 상처의 염증성 마커 IP10을 도시한 것인, 3개의 그래프로 이루어진 한 세트이다.
도 24는, 패널 a는 상이한 처리하의 단핵구 관련 염증성 마커 MCP-1을 도시한 것이고; 패널 b는 상이한 처리하의 단핵구 관련 염증성 마커 MIP1베타를 도시한 것이고; 패널 c는 상이한 처리하의 단핵구 관련 염증성 마커 IL8을 도시한 것인, 3개의 그래프로 이루어진 한 세트이다.
도 25는, 패널 a는 상이한 처리하의 치유된 상처의 항-염증성 마커인 IL5를 도시한 것이고; 패널 b는 상이한 처리하의 치유된 상처의 항-염증성 마커인 IL4를 도시한 것이고; 패널 c는 상이한 처리하의 치유된 상처의 항-염증성 마커인 IL2를 도시한 것인, 3개의 그래프로 이루어진 한 세트이다.
도 26은 시간 경과에 따른 본원에 기술된 양막 분말 (AMP) 대 쳉(Tseng) (US 2007/0071740 A1; 이하 "쳉 생성물(Tseng Product)")으로부터의 누적 단백질 방출량을 도시한 그래프이다.
도 27은 티올화된 성분을 다기능성 가교 결합제 (가교제)로부터 분리된 상태로 유지시키면서, 2부 히알루론산 (HA) 히드로겔을 이중 챔버 시린지 내로 로딩할 수 있다는 도시한 영상이다.
도 28은 두 히드로겔로부터의 누적 단백질 방출량을 도시한 그래프이다. 하나는 말레이미드 작용기가 있는 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 가교제 (PEGDMal)를 포함하고; 나머지 다른 하나는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA)를 포함한다.
도 29는 PEGDMal 및 PEGDA에 의해 제조된 히드로겔의 종창 특징을 도시한 그래프이다.
도 30은 본 연구에서의 4가지 샘플에 대한 영상 세트이다. 상처에 직접 분말을 적용시킨 후, 1 mL 멸균 염수를 적용시켰다. 히드로겔을 2부 시린지 시스템으로 제조하고, 단독으로, 양막 분말 상에 적층시키거나, 분말과 미리 혼합하고, 시린지의 각 챔버 내로 상처에 직접 가교 결합시켰다.
도 31은 히드로겔을 2부 시린지 시스템으로 제조한 방법을 도시한 영상이다.
도 32는 상처가 다른 처리하에서 시간 경과이 경과함에 따라 어떻게 치유되었는지를 도시한 영상 세트이다 (돼지 7).
도 33은 상처가 다른 처리하에서 시간 경과이 경과함에 따라 어떻게 치유되었는지를 도시한 영상 세트이다 (돼지 8).
도 34는 상처가 다른 처리하에서 시간 경과이 경과함에 따라 어떻게 치유되었는지를 도시한 영상 세트이다 (돼지 9).
도 35는 시간 경과에 따른 상처 봉합을 도시한 그래프이다.
도 36은 다른 처리하에서의 시간 경과에 따른 상처 수축 변화를 도시한 그래프이다.
도 37은 다른 처리하에서의 시간 경과에 따른 상처 수축비를 도시한 그래프이다.
도 38은 다른 처리하에서의 시간 경과에 따른 원 상처 크기에 대한 상대적인 비율 변화를 도시한 그래프이다.
도 39는 다른 처리하에서의 시간 경과에 따른 수축된 상처 크기의 비율(%)을 도시한 그래프이다.
도 40은 상처 치유 결과 비교를 도시한 것이다. 패널 a는 상처를 처리하지 않고 방치하였을 때의, 치유 동안의 상처 부위의 상처 크기 (적색), 상피형성 (녹색) 및 수축 면적 (청색)의 조합을 도시한 것이다. 패널 b는 상처를 히드로겔로 처리하였을 때의, 치유 동안의 상처 부위의 상처 크기 (적색), 상피형성 (녹색) 및 수축 면적 (청색)의 조합을 도시한 것이다. 패널 c는 상처를 히드로겔 하에 적층된 양막 분말로 처리하였을 때의, 치유 동안의 상처 부위의 상처 크기 (적색), 상피형성 (녹색) 및 수축 면적 (청색)의 조합을 도시한 것이다. 패널 d는 상처를 양막 분말로 처리하였을 때의, 치유 동안의 상처 부위의 상처 크기 (적색), 상피형성 (녹색) 및 수축 면적 (청색)의 조합을 도시한 것이다. 패널 e는 상처를 히드로겔과 혼합된 양막 분말로 처리하였을 때의, 치유 동안의 상처 부위의 상처 크기 (적색), 상피형성 (녹색) 및 수축 면적 (청색)의 조합을 도시한 것이다.
도 41은 돼지 7, 8, 및 9에 대한 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색된 조직학적 영상을 도시한 영상 세트이다.
도 42는 다른 처리하에서의 조직의 대표적인 펜타크롬 염색을 도시한 영상 세트이다.
도 43은 편광으로 관측된 조직의 대표적인 시리우스 레드를 도시한 영상 세트이다.
도 44는 재생된 피부의 기계적 특성을 측정하는 압축 시험을 도시한 개략적 다이어그램이다.
도 45는 재생 돼지 피부에 대한 대표적인 비선형 응력-변형(stress-strain) 곡선을 도시한 그래프이다: 압축 강도 (적색 화살표), 기울기가 압축에 대한 영률(Young's modulus)을 제시하는 것인, 탄성 영역 (녹색 선), 및 물질이 그 지점 초과에서는 손상되고, 가소성 방식으로 작용하는 것인 항복점 (청색 화살표).
도 46은 양막 분말이 피부 압축 강도에 미치는 효과를 도시한 것이다. 패널 a는 5개의 실험 조건으로부터의 재생된 피부 샘플의 최대 압축 강도를 도시한 것이다. 패널 b는 양막 분말을 사용하지 않은, 및 양막 분말을 사용한 컴파일링된 군의 최대 압축 강도를 도시한 것이다 (p < 0.05).
도 47은 양막 분말이 피부 영률에 미치는 효과를 도시한 것이다. 패널 a는 5개의 실험 조건으로부터의 재생된 피부 샘플의 영률을 도시한 것이다. 패널 b는 5개의 실험 조건하의 탄성 한계에서의 응력을 도시한 것이다.
도 48은 상처 수축 비교 결과를 도시한 것이다. 패널 a는 생체내 연구 1에서의 비처리군 및 양막 분말 처리군 사이의 상처 수축을 도시한 것이다. 패널 b는 생체내 연구 2에서의 비처리군 및 양막 분말 처리군 사이의 상처 수축을 도시한 것이다.
본 발명은 일반적으로 상처 치유 및 조직 재생을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 양막 분말을 포함하는 조성물을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 무세포이며, 이로써, 그를 투여받은 대상체에서의 잠재적인 염증 반응을 최소화시킨다. 본 발명의 상처 치유 생성물은 세포 성분을 필요로 하지 않으면서, 높은 임상적 효능을 가지지만, 본 발명의 상처 치유 생성물은 세포 치료의 생체활성을 보유한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 양막 함유 조성물을 대상체에게 적용시켜 상처 치유를 유도하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 조성물을 대상체의 상처에 직접 적용시킨다. 특정 실시양태에서, 조성물은 에어로졸 스프레이, 겔, 크림, 또는 연고로서 적용된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 양막 기반 스캐폴드를 포함한다. 한 실시양태에서, 스캐폴드는, 양막 분말이 히드로겔 내에 도입되어 있는 것인, 히드로겔이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 양막 기반 스캐폴드는 조직 재생을 증진시킨다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 양막 기반 스캐폴드는 조직 수축을 감소시킨다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 양막 기반 스캐폴드는 조직 재생시 혈관 발생을 증진시킨다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 양막 기반 스캐폴드를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 조직 재생을 촉진시키는 방법을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 양막 분말은 히알루론산 (HA) 기반 히드로겔 내에 도입되어 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련가에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 등가인 임의의 방법 또는 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질을 기술한다.
본원에서 사용되는 바, 하기 용어들은 각각 본 섹션에서 그와 연관된 의미를 가진다.
본원에서 "하나"("a" 및 "an")라는 관사는 상기 관사의 문법적 대상이 나 또는 1개의 초과 (즉, 1개 이상)인 것을 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, "한 요소"란, 요소 1개 또는 1개 초과의 요소를 의미한다.
측정가능한 값, 예컨대, 양, 시간적 기간 등을 언급할 때 본원에서 사용되는 바, "약"이란, 명시된 값으로부터의 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게, ±5%, 더욱더 바람직하게, ±1%, 및 더욱더 바람직하게, ±0.1%의 편차를 포함하는 것을 의미하는데, 이는 상기와 같은 편차가 개시된 방법을 수행하는 데 적절하기 때문이다.
본원에서 사용되는 바, "앰니오그래프트(AMNIOGRAFT)®"라는 용어는 바이오-티슈, 인크.(Bio-Tissue, Inc.)에 의해 판매되는 양막 동종 이식편이다.
본원에서 사용되는 바, "양막 기반 스캐폴드"라는 용어는 양막 분말 또는 양막액과 함께 사용될 수 있는 스캐폴드를 의미한다. 예를 들어, 상기 스캐폴드는 사용 이전에 양막 분말과 혼합될 수 있거나, 또는 상처에 이미 적용된 양막 분말 또는 양막액 위의 상처에 적용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "양막 분말 조성물"이라는 용어는 양막 분말을 포함하는 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "생체적합성"이란, 임의의 물질이 포유동물에 이식되었을 때, 포유동물에서 유해한 반응을 일으키지 않는다는 것을 의미한다. 생체적합성 물질은 개체 내로 도입되었을 때, 상기 개체에게 비독성이거나, 유해하지 않거나, 또는 포유동물에서 물질의 면역학적 거부를 유도하지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 본원에서 사용되는 바, "세포 적출된" 또는 "세포 적출"이라는 용어는 생체구조물 (예컨대, 기관 또는 기관의 일부)로부터 세포 및 조직 내용물이 제거되어 무손상(intact) 무세포 하위구조가 남아있는 상태를 의미한다. 신장과 같은 기관은 다양한 분화 조직으로 구성된다. 기간의 분화 조직 구조, 또는 실질은 기관과 연관된 특정 기능을 제공한다. 기관의 지지 섬유 네트워크는 기질이다. 대부분의 기관은 분화 조직을 지지하는, 미분화 결합 조직으로 구성된 기질 골격을 가진다. 세포 적출 프로세스를 통해 분화 조직을 적출하게 되면, 결합 조직의 복잡한 3차원 네트워크가 남게 된다. 결합 조직 하위구조는 주로 콜라겐으로 구성된다. 세포 적출된 구조는 상이한 세포 집단이 그 위에 주입될 수 있는 생체적합성 기판을 포함한다. 세포 적출된 생체구조물은 그의 형상을 변경시킬 수 있는 능력이 있는 것으로서, 강성, 또는 반강성일 수 있다. 본 발명의 측면에서 유용한 세포 적출된 기관의 예로는 심장, 신장, 간, 췌장, 비장, 방광, 수뇨관 및 요도, 연골, 골, 뇌, 척수, 말초 신경을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 "~로부터 유래된"이라는 용어는 명시된 공급원으로 기원하였음을 의미하는 것으로 사용된다.
"질환"은 동물이 항상성을 유지할 수 없고, 질환이 호전되지 않을 경우에는 동물의 건강은 계속해서 악화되는 것인, 동물의 건강 상태이다.
그에 반해, 동물에서 "장애"란, 동물이 항상성은 유지할 수 있지만, 동물의 건강 상태는 장애가 없는 경우보다는 더 바람직한 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치할 경우, 장애는 동물의 건강 상태를 반드시 추가로 감소시키는 것은 아니다.
화합물의 "유효량" 또는 "치료학상 유효량"이란, 화합물을 투여받게 되는 대상체에게 유익한 효과를 제공하는 데 충분한 화합물의 양이다. 전달 비히클의 "유효량"은 화합물을 효과적으로 결합 또는 전달하는 데 충분한 양이다.
본원에서 사용되는 바, "일렉트론스펀 패치(Electrospun Patch)"라는 용어는, 그 안에 양막을 함유하지 않는, 양막 유래의 물질을 가진 전자 회전 덱스트란을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "내인성"이란, 유기체, 세포 또는 시스템 내부로부터의 임의 물질 또는 그 내부에서 생산된 것을 의미한다.
"외인성"이란, 유기체, 세포 또는 시스템 외부로부터의 도입되거나, 또는 그 외부에서 생산된 임의 물질을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "세포외 매트릭스 조성물"은 가용성 및 불용성 분획 또는 그의 임의의 일부분, 둘 모두를 포함한다. 불용성 분획은 지지체 또는 스캐폴드 상에 증착된, 분비된 ECM 단백질 및 생물학적 성분을 포함한다. 가용성 분획은 그 안에서 세포가 배양되었고, 그 안으로 세포가 활성제(들)를 분비한 배양 배지를 의미하는 것을 포함하겨, 이는 스캐폴드 상에 증착되지 않은 단백질 및 생물학적 성분을 포함한다. 상기 두 분획 모두 본원에 기술된 바와 같이 다양한 적용에서 개별적으로 또는 조합하여 수집될 수 있고, 임의적으로, 추가로 프로세싱될 수 있고, 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "겔"이라는 용어는 그 자체가 특정 액체 중에서는 불용성이지만, 다량의 액체를 흡착시키고, 유지시켜 안정적이고, 대개는 연성이고, 유연하지만, 항상 어느 정도는 형상을 보존하는 구조를 형성할 수 있는 3차원 중합체 구조체를 의미한다. 액체가 물일 경우, 겔은 히드로겔로서 지칭된다. 달리 명확하게 언급되지 않는 한, "겔"이라는 용어는 본 출원 전역에 걸쳐 물 이외의 다른 액체를 흡착한 중합체 구조체, 및 물을 흡착한 중합체 구조체, 둘 모두를 지칭하는 것으로 사용되며, 이는 중합체 구조체가 단순히 "겔" 또는 "히드로겔"인지 여부에 관한 맥락으로부터 당업자에게 쉽게 자명해질 것이다.
본원에서 사용되는 바, "이식편"은 전형적으로는, 결손을 대체, 보정, 또는 다르게는 극복하기 위해 개체 내로 이식되는 세포, 조직, 또는 기관을 지칭한다. 이식편은 추가로 스캐폴드를 포함할 수 있다. 조직 또는 기관은 같은 개체로부터 기원하는 세포로 이루어질 수 있고; 이러한 이식편은 본원에서 하기 호환 용어로 지칭된다: "자가 이식편", "자가 유래의 이식물", "자가 유래의 임플란트" 및 "자가 유래의 이식편". 같은 종의 유전적으로 상이한 개체로부터의 세포를 포함하는 이식편은 본원에서 하기 호환 용어로 지칭된다: "동종 이식편," "동종이계 이식물," "동종이계 임플란트," 및 "동종이계 이식편." 한 개체와 동일한 쌍둥이 개체로부터의 이식편은 본원에서 "동계이식편(isograft)," "동계 이식물," "동계 임플란트" 또는 "동계 이식편(syngeneic graft)"으로 지칭된다. "이종이식편," "이종계 이식물," 또는 "이종계 임플란트"란, 한 개체와 다른 또 다른 종으로부터의 이식편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "그래프트재킷(GRAFTJACKET)®"은 라이트 메디컬 테크놀러지, 인크.(Wright Medical Technology, Inc.)에 의해 판매되는 스캐폴드를 지칭한다. 콜라겐 I형, III형, IV형, 및 VII형, 엘라스틴, 콘드로이틴 술페이트, 프로테오글리칸, 히알루론산, 라미닌, 테나신, 및 섬유모세포 성장 인자를 비롯한, 생물학적 기판 성분을 포함한다.
본원에서 사용되는 바 "성장 인자"는 피코그램/ml 내지 밀리그램/ml 수준의 농도로 하기의, 성장 호르몬, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인터류킨 3, 인터류킨 6, 인터류킨 7, 대식세포 콜로니 자극 인자, c-키트 리간드/줄기 세포 인자, 오스테오프로테게린 리간드, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 신경 성장 인자, 섬모 신경영양성 인자, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 형질전환 성장 인자 (TGF-베타), 간세포 성장 인자 (HGF), 및 골 형성 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 비제한적인 인자를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바, "히드로겔 전구체 물질"이라는 용어는, 전구체 물질을 가교제와 반응시켜 히드로겔을 제조하는 데 사용되는, 친수성 생체중합체 또는 합성 중합체, 또는 그의 혼합물을 지칭한다. 친수성 생체중합체 또뜬 합성 중합체는 가교 반응이 더욱 잘 일어날 수 있도록 촉진시키기 위해 변형될 수 있다. 변형의 한 비제한적인 예로는 티올화 (예컨대, 티올 작용기 도입)가 있다.
본원에서 사용되는 바, "천연 세포"란, 태반막에 대하여 천연인, 고유한, 또는 내인성인 세포, 즉, 외부에서 태반막에 첨가되지 않은 세포를 의미한다.
"환자," "대상체," "개체"라는 용어 등은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 시험관내에서든 또는 계내에서든 상관없이, 본원에 기술된 방법을 치료할 수 있는 임의 동물, 또는 그의 세포를 지칭한다. 특정의 비제한적인 실시양태에서, 환자, 대상체, 또는 개체는 포유동물이고, 다른 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
"증식"이란, 본원에서 특히 세포의 복제 또는 유사 형태의 번식을 의미하는 것으로 사용된다. 즉, 증식은 더 많은 개수의 세포를 생산하는 것을 포함하며, 이는 특히, 간단하게 세포 개수를 계수함으로써, 세포 내로의 3H-티미딘의 도입을 측정함으로써 및 그 밖의 방법으로 측정될 수 있다.
"세포 주기의 진행 또는 세포 주기를 거치는 진행"이란, 본원에서 세포가 유사 분열 및/또는 감수 분열을 준비하고/거나, 그 단계로 진입하는 과정을 의미하는 것으로 사용된다. 세포 주기를 거치는 진행은 G1 기, S 기, G2 기, 및 M 기를 거치는 진행을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "스캐폴드"란, 세포 부착 및 증식에 적합한 표면을 제공하는 생체적합성 물질을 포함하는 구조물을 지칭한다. 스캐폴드는 기계적 안정성 및 지지하는 힘을 추가로 제공할 수 있다. 스캐폴드는 증식 세포 집단이 취하는 3차원 형성 또는 형태에 영향을 주거나, 또는 그의 범위를 정하기 위하여 특정 형상 또는 형태일 수 있다. 상기 형상 또는 형태로는 필름 (예컨대, 3차원보다 실질적으로 더 큰 2차원 규모의 형태), 리본, 코드, 시트, 평평한 디스크, 실린더형, 구형, 3차원 무정형 형상 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 스캐폴드의 한 비제한적인 예는 히드로겔이다.
"치료학적" 처치는 병상 징후를 감소 또는 제거하기 위한 목적으로, 상기 징후를 보이는 대상체에게 시행되는 처치이다.
본원에서 사용되는 바, "질환 또는 장애를 치료하는"이란, 환자가 질환 또는 장애 증상을 경험하게 되는 빈도수를 감소시킨다는 것을 의미한다. 질환 및 장애는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, "조직 공학"이란, 조직 대체 또는 재건에서 사용하기 위한 생체외 조직 생성 프로세스를 의미한다. 조직 공학은 생체조작된 물질 및 기술과 함께 세포, 유전자, 또는 다른 생물학적 빌딩 블록을 도입시킴으로써 조직 및 기관을 수복 또는 대체시키는 접근법을 포함하는 것인 "재생 의학"의 한 예이다.
본원에서 사용되는 바, "조직 이식" 및 "조직 재건"이라는 용어는 둘 모두 이식편을 개체 내로 이식하여 조직 결손, 예컨대, 폐 결손 또는 연조직 결손을 치료 또는 완화시키는 것을 의미한다.
"이식물"이란, 이식시키고자 하는 생체적합성 격자 또는 공여 조직, 기관 또는 세포를 의미한다. 이식물의 예로는 피부 세포 또는 조직, 골수, 및 고형 기관, 예컨대, 심장, 췌장, 신장, 폐 및 간을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "상처"라는 용어는 화상을 비롯한 외상 및 수술에 의해 가해를 입은 것을 포함하는 모든 유형의 조직 손상 뿐만 아니라, 예컨대, 죽상동맥경화증, 혈관 질환, 또는 당뇨병와 같은, 만성 의학적 병태로부터의 손상을 의미한다. 본원에 기술된 조성물은 내부 조직 및 외부 조직에 대한 상처를 비롯한, 모든 유형의 상처를 치료하는 데 유용하다. 상처 드레싱은 피부 3개 층 (즉, 표피, 진피, 및 피하 층)을 이환시키는 상처의 다양한 병인을 치료하고자 하는 것으로 의도된다.
범위: 본 개시내용 전역에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면으로 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷으로 기술하는 것은 단지 편의상 및 간결하게 하기 위함이며, 본 발명의 범주를 변경없이 고정되게 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 범위를 기술되는 것은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위 범위 뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 수치 값을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 예컨대, 1 내지 6과 같이 범위로 기술된 것은 예컨대, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같이, 구체적으로 개시된 하위 범위 뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 수치, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위 폭에 상관없이 적용된다.
조성물
본 발명은 상처 치유 및 조직 재생 적용에서 사용하기 위한 양막 분말을 포함하는 양막 조성물을 포함한다. 양막(amniotic membrane), 또는 양막(amnion)은 양막낭의 벽을 형성하는 얇은 조직이다. 임신 기간 동안 양막은 발생 배아를 감싸고, 보호한다. 양막은 두꺼운 기저막 및 무혈관 기질 매트릭스를 포함한다.
한 측면에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 양으로 전체 단백질을 포함한다. 적합하게, 상기 양은 40 mg/g 내지 450 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 50 mg/g 내지 400 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 50 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 60 mg/g 내지 350 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 70 mg/g 내지 300 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 80 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 90 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 100 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 110 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 120 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 130 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 140 mg/g 내지 250 mg/g 범위이다.
또 다른 측면에서, 조성물은 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 양으로 엘라스틴을 포함한다. 적합하게, 상기 양은 5 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 10 mg/g 내지 95 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 15 mg/g 내지 90 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 20 mg/g 내지 85 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 25 mg/g 내지 80 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 30 mg/g 내지 75 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 35 mg/g 내지 70 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 40 mg/g 내지 65 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 40 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 40 mg/g 내지 55 mg/g 범위이다.
추가의 또 다른 측면에서, 조성물은 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 양으로 콜라겐을 포함한다. 적합하게, 상기 양은 10 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 50 mg/g 내지 750 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 100 mg/g 내지 700 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 150 mg/g 내지 650 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 200 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 250 mg/g 내지 550 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 300 mg/g 내지 500 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 350 mg/g 내지 450 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 400 mg/g 내지 550 mg/g 범위이다.
추가의 또 다른 측면에서, 조성물은 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 양으로 글리코사미노글리칸을 포함한다. 적합하게, 상기 양은 0.2 mg/g 내지 3.5 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 0.3 mg/g 내지 3.0 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 0.4 mg/g 내지 2.5 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 0.5 mg/g 내지 2.0 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 0.6 mg/g 내지 1.8 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 0.7 mg/g 내지 1.5 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 0.8 mg/g 내지 1.4 mg/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 0.9 mg/g 내지 1.3 mg/g 범위이다.
추가의 또 다른 측면에서, 조성물은 30 ㎍/g 내지 1,000 ㎍/g 범위의 양으로 트롬보스폰딘-1 (TSP-1)을 포함한다. 적합하게, 상기 양은 50 ㎍/g 내지 950 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 50 ㎍/g 내지 400 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 75 ㎍/g 내지 900 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 100 ㎍/g 내지 850 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 125 ㎍/g 내지 800 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 150 ㎍/g 내지 750 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 175 ㎍/g 내지 700 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 200 ㎍/g 내지 650 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 225 ㎍/g 내지 600 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 250 ㎍/g 내지 550 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 275 ㎍/g 내지 500 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 300 ㎍/g 내지 450 ㎍/g 범위이다.
추가의 또 다른 측면에서, 조성물은 0.1 ㎍/g 내지 50 ㎍/g 범위의 양으로 펜트락신 3 (PTX-3)을 포함한다. 적합하게, 상기 양은 1 ㎍/g 내지 45 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 1 ㎍/g 내지 40 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 2 ㎍/g 내지 40 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 3 ㎍/g 내지 35 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 4 ㎍/g 내지 40 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 5 ㎍/g 내지 35 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 6 ㎍/g 내지 30 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 7 ㎍/g 내지 25 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 8 ㎍/g 내지 25 ㎍/g 범위이다. 적합하게, 상기 양은 9 ㎍/g 내지 20 ㎍/g 범위이고; 적합하게, 상기 양은 10 ㎍/g 내지 15 ㎍/g 범위이다.
추가의 또 다른 측면에서, 조성물은 1.5 ng/g 미만인 양으로 종양 괴사 인자-자극 유전자 6 (TSG-6)을 포함한다. 적합하게, TSG-6의 양은 1.3 ng/g 미만이고; 적합하게, TSG-6의 양은 1.1 ng/g 미만이고; 적합하게, TSG-6의 양은 1.0 ng/g 미만이고; 적합하게, TSG-6의 양은 0.7 ng/g 미만이고; 적합하게, TSG-6의 양은 0.5 ng/g 미만이고; 적합하게, TSG-6의 양은 0.3 ng/g 미만이고; 적합하게, TSG-6의 양은 0.1 ng/g 미만이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 전체 단백질, 및 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴을 포함한다. 적합하게, 전체 단백질의 양은 50 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 5 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고; 적합하게, 전체 단백질의 양은 100 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 20 mg/g 내지 60 mg/g 범위이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 전체 단백질, 및 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐을 포함한다. 적합하게, 전체 단백질의 양은 50 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 콜라겐은 10 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고; 적합하게, 전체 단백질의 양은 100 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 콜라겐은 100 mg/g 내지 600 mg/g 범위이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 전체 단백질, 및 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 적합하게, 전체 단백질의 양은 50 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 4 mg/g 범위이고; 적합하게, 전체 단백질의 양은 100 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 2 mg/g 범위이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 및 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 적합하게, 콜라겐의 양은 10 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 4 mg/g 범위이고; 적합하게, 콜라겐의 양은 100 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 2 mg/g 범위이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 및 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴을 포함한다. 적합하게, 콜라겐의 양은 10 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 5 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고; 적합하게, 콜라겐의 양은 100 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 20 mg/g 내지 60 mg/g 범위이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 및 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴을 포함한다. 적합하게, 글리코사미노글리칸의 양은 0.5 mg/g 내지 4 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 5 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고; 적합하게, 글리코사미노글리칸의 양은 0.5 mg/g 내지 2 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 20 mg/g 내지 60 mg/g 범위이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 및 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐을 포함한다. 적합하게, 전체 단백질의 양은 50 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 5 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고, 콜라겐은 10 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고; 적합하게, 전체 단백질의 양은 100 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 20 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고, 콜라겐은 100 mg/g 내지 600 mg/g 범위이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 및 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 적합하게, 전체 단백질의 양은 50 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 5 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 4 mg/g 범위이고; 적합하게, 전체 단백질의 양은 100 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 of 20 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 2 mg/g 범위이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 전체 단백질, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 및 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 적합하게, 전체 단백질의 양은 50 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 콜라겐은 10 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 4 mg/g 범위이고; 적합하게, 전체 단백질의 양은 100 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 콜라겐은 100 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 2 mg/g 범위이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 및 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 적합하게, 엘라스틴의 양은 5 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고, 콜라겐은 10 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 4 mg/g 범위이고; 적합하게, 엘라스틴의 양은 20 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고, 콜라겐은 100 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 2 mg/g 범위이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 및 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸을 포함한다. 적합하게, 전체 단백질의 양은 50 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 5 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고, 콜라겐은 10 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 4 mg/g 범위이고; 적합하게, 전체 단백질의 양은 100 mg/g 내지 250 mg/g 범위이고, 엘라스틴은 20 mg/g 내지 60 mg/g 범위이고, 콜라겐은 100 mg/g 내지 600 mg/g 범위이고, 글리코사미노글리칸은 0.5 mg/g 내지 2 mg/g 범위이다.
특정 실시양태에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 및 30 ㎍/g 내지 1,000 ㎍/g 범위의 트롬보스폰딘-1 (TSP-1)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 및 0.1 ㎍/g 내지 50 ㎍/g 범위의 펜트락신 3 (PTX-3)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 및 1.5 ng/g 미만의 종양 괴사 인자-자극 유전자 6 (TSG-6)을 포함한다.
추가의 또 다른 측면에서, 조성물은 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 30 ㎍/g 내지 1,000 ㎍/g 범위의 트롬보스폰딘-1 (TSP-1), 0.1 ㎍/g 내지 50 ㎍/g 범위의 펜트락신 3 (PTX-3), 및 1.5 ng/g 미만의 종양 괴사 인자-자극 유전자 6 (TSG-6)을 포함한다.
양막 분말 및 양막 분말을 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 2013년 9월 10일 출원된 PCT/US13/58940에 개시되어 있으며, 상기 출원의 개시내용은 그의 전문이 본원에 포함된다.
본 발명은 또한 양막 분말을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 본원 다른 곳에도 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명은 양막이 상처 치유 및 조직 재생을 증진시킨다는 발견에 기초한다. 제제는 추가 성분, 예를 들어, 통상의 부형제, 즉, 상처 또는 치료 부위에 투여하기에 적합한, 제약상 허용되는 유기 또는 무기 담체 물질과 함께 사용될 수 있다. 제약 조성물은 멸균될 수 있고, 원하는 경우, 보조제, 예컨대, 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 및/또는 방향 물질 등과 함께 혼합될 수 있다. 이는 또한 원하는 경우, 다른 활성제, 예컨대, 다른 진통제와 함께 조합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "추가 성분"으로는 하기: 부형제; 계면활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 착색제; 보존제; 생리학적으로 분해 가능한 조성물, 예컨대, 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 오일성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산화제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 제약상 허용되는 중합체 또는 소수성 물질 중 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 제약 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가 성분"은 당업계에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 문헌 [Genaro, ed. (1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA)] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
본 발명의 조성물은 조성물 총 중량 기준으로 약 0.005중량% 내지 2.0중량%의 보존제를 포함할 수 있다. 보존제는 환경내 오염 물질에 노출되는 경우, 부패를 막기 위해 사용된다. 본 발명에 따라 유용한 보존제의 예로는 벤질 알콜, 소르브산, 파라벤, 이미드우레아 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 보존제는 약 0.5% 내지 2.0% 벤질 알콜 및 0.05% 내지 0.5% 소르브산의 조합이다.
한 실시양태에서, 조성물은 양막 분말의 하나 이상의 성분의 분해를 억제시키기 위해 킬레이팅제 및 항산화제를 포함한다. 일부 화합물에 대해 바람직한 항산화제는 조성물 총 중량 기준으로 약 0.01중량% 내지 0.3중량%의 바람직한 범위의 BHT, BHA, 알파-토코페롤 및 아스코르브산, 및 더욱 바람직하게, 0.03중량% 내지 0.1중량% 범위의 BHT이다. 바람직하게, 킬레이팅제는 조성물 총 중량 기준으로 0.01중량% 내지 0.5중량%의 양으로 존재한다. 특히 바람직한 킬레이팅제로는 조성물 총 중량 기준으로 약 0.01중량% 내지 0.20중량%의 중량 범위의, 및 더욱 바람직하게, 0.02중량% 내지 0.10중량% 범위의 에데테이트 염 (예컨대, 디소듐 에데테이트) 및 시트르산을 포함한다. 킬레이팅제는 제제의 저장 수명에 유해할 수 있는, 조성물 중의 금속 이온을 킬레이트화하는 데 유용하다. BHT 및 디소듐 에데테이트가 각각 일부 화합물에 대해서는 특히 바람직한 항산화제 및 킬레이팅제이지만, 당업자에게 공지되어 있는 바, 그러므로, 다른 적합하고, 등가인 항산화제 및 킬레이팅제로 치환될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼 형태로 제조, 패키징, 또는 판매될 수 있다. 오일상은 식물성 오일, 예컨대, 올리브유 또는 땅콩유, 광유, 예컨대, 액체 파라핀, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 조성물은 하나 이상의 유화제, 예컨대, 자연적으로 발생된 검, 예컨대, 아카시아 검 또는 트라가칸트 검, 자연적으로 발생된 포스파티드, 예컨대, 대두 또는 레시틴 포스파티드, 예컨대, 소르비탄 모노올레이트와 같은, 헥시톨 무수물과 지방산의 조합으로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르, 및 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트와 같은, 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 에멀젼은 또한 예를 들어, 감미제 또는 향미제를 비롯한, 추가 성분을 함유할 수 있다.
물질에 화학 조성물을 주입하거나, 또는 물질을 화학 조성물로 코팅시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이는 화학 조성물을 표면 상에 증착 또는 결합시키는 방법, 물질을 합성하는 동안 화학 조성물을 물질의 구조 내도 도입시키는 방법 (즉, 예컨대, 생리학상 분해 가능한 물질의 경우), 및 수성 또는 오일성 용액 또는 현탁액을 흡착성 물질 내로 흡착시키고, 이어서, 건조시키거나, 또는 건조시키지 않는 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에서, 본 발명의 조성물이 가지는 한가지 이점은 불규칙적이고, 심층부에 있는 상처를 충전시킬 수 있는 능력을 가진다는 점이다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 제약 조성물은 조직 재생을 필요로 하는 부위에 또는 상처에 국소적으로 적용될 수 있다.
국소 투여에 적합한 제제는 액체 또는 반액체 제제, 예컨대, 도포제, 로션, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 예컨대, 크림, 연고 또는 페이스트, 및 액제 또는 현탁제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 비록 활성 성분의 농도는 용매 중 활성 성분의 용해 한도 만큼 높을 수도 있지만, 국소적으로 투여가능한 제제는 예를 들어, 약 1% (w/w) 내지 약 10% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다. 국소 투여용 제제는 본원에 기술된 추가 성분들 중 하나 이상의 것을 추가로 포함할 수 있다.
투과 증진제가 사용될 수 있다. 상기 물질은 피부를 통과하는 약물의 침투 속도를 증가시킨다. 당업계에서 전형적인 증진제로는 에탄올, 글리세롤 모노라우레이트, PGML (폴리에틸렌 글리콜 모노라우레이트), 디메틸술폭시드 등을 포함한다. 다른 증진제로는 올레산, 올레일 알콜, 에톡시디글리콜, 라우로카프람, 알칸카르복실산, 디메틸술폭시드, 극성 지질, 또는 N-메틸-2-피롤리돈을 포함한다.
본 발명의 조성물 중 일부의 국소 전달을 위한 한 허용되는 비히클은 리포솜을 함유할 수 있다. 리포솜 조성물 및 그의 용도는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,323,219 참조).
대안적 실시양태에서, 국소 투여에 적합한 제제는 임의적으로 다른 성분, 예컨대, 애주번트, 항산화제, 킬레이팅제, 계면활성제, 기포제, 습윤제, 유화제, 증점제, 완충화제, 보존제 등과 함께 조합될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 투과 또는 침투 증진제가 조성물에 포함되고, 이는 투과 증진제를 포함하지 않는 조성물과 비교하였을 때, 양막 성분의 각질층 내로의 및 그를 통과하는 경피적 침투를 개선시키는 데 효과적이다. 올레산, 올레일 알콜, 에톡시디글리콜, 라우로카프람, 알칸카르복실산, 디메틸술폭시드, 극성 지질, 또는 N-메틸-2-피롤리돈을 비롯한, 각종 투과 증진제가 당업자에게 공지되어 있다. 또 다른 측면에서, 조성물은, 각질층 구조내 무질서를 증가시키는 작용을 하고, 이로써, 각질층을 통과하는 수송을 증가시킬 수 있는 것인, 친수 가용화제를 추가로 포함할 수 있다. 각종 친수 가용화, 예컨대, 이소프로필 알콜, 프로필렌 글리콜, 또는 소듐 크실렌 술포네이트가 당업자에게 공지되어 있다.
국소 투여에 적합한 제제는 원하는 변화에 영향을 미치는 데 효과적인 양으로 적용되어야 한다. 본원에서 사용되는 바 "효과적인 양"이란, 변화가 요구되는 피부 표면 부위를 도포하는 데 충분한 양을 의미하여야 한다. 활성 화합물은 조성물 부피 기준으로 약 0.0001중량% 내지 약 15중량%인 양으로 존재하여야 한다. 더욱 바람직하게, 조성물의 약 0.0005% 내지 약 5%인 양으로 존재하여야 하고; 가장 바람직하게, 조성물의 약 0.001% 내지 약 1%인 양으로 존재하여야 한다. 상기 화합물은 합성된 것이거나, 또는 천연적으로 유도된 것일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 양막 분말을 포함하는 제약 조성물은 붕대 또는 드레싱에 적용될 수 있고, 이어서, 대상체의 상처 또는 치료 부위에 적용된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 드레싱을, 양막 분말을 포함하는 액체 용액 또는 액체 현탁액에 침지시킨다. 또 다른 실시양태에서, 양막 분말을 포함하는 연고를 드레싱 또는 붕대 표면에 적용시킨다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 분말화된 양막을 포함하는, 에어로졸형 또는 분무형 용액 또는 현탁액을 포함한다. 상기 에어로졸형, 또는 분산된 경우, 에어로졸형 제제는 바람직하게, 약 0.1 내지 약 200 nm 범위의 평균 입자 또는 소적 크기를 가지며, 상기 제제는 본원에 기술된 추가 성분들 중 하나 이상의 것을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 제제의 예는 완전한 것은 아니며, 본 발명은 상기 제제, 및 본원에 기술되지는 않았지만, 당업자에게 공지되어 있는 다른 제제의 추가 변형을 포함한다는 것을 이해하여야 한다.
양막 기반 스캐폴드
본 발명은 상처 치유 및 조직 재생에 유용한 양막 기반 스캐폴드를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 양막 분말이 스캐폴드 내에 도입되어 있다. 일부 경우에서, 양막 분말은 스캐폴드 표면 상에 적용되거나, 또는 현상에서 스캐폴드와 혼합된다. 한 실시양태에서, 스캐폴드는 양막 분말 위에 상처 부위에 적용되거나, 또는 양막 분말 및 스캐폴드를 포함하는 조성물은 상처 부위에 적용된다. 예를 들어, 스캐폴드가 히드로겔일 때, 히드로겔은 양막 분말 위에 직접 상처 부위에 적용되거나, 또는 양막 분말을 포함하는 조성물은 상처 부위에 적용된다. 본 발명의 스캐폴드는 당업계에 공지된 임의 유형의 것일 수 있다. 상기 스캐폴드의 비제한적인 예로는 히드로겔, 전자 회전 스캐폴드, 폼, 메쉬, 시트, 패치, 및 스폰지를 포함한다.
한 실시양태에서, 스캐폴드는 적합한 점도, 분자량 및 다른 바람직한 특성을 가진, 글리코사미노글리칸 (GAG) 또는 글루코사미노글리칸을 비롯한, 임의의 다당류를 포함할 수 있다. 글리코사미노글리칸이란, 반복 이당류 단위 (단, 그 중 하나는 항상 아미노 당이다)와 함께 비분지형 다당류 쇄를 포함하는 임의의 글리칸 (즉, 다당류)를 지칭한다. 한 부류로서 상기 화합물은 높은 음 전화를 보유하고, 친수성이 강하고, 통상 뮤코다당류로 불린다. 상기 다당류 군은 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 케라탄 술페이트, 및 히알루론산을 포함한다. 상기 GAG는 주로 세포 표면 상에서 및 세포외 매트릭스에서 발견된다. 글루코사미노글리칸은 또한 알콜성 히드록실 기가 아미노 기 또는 다른 작용기, 예컨대, 술페이트 또는 포스페이트에 의해 대체된, 주로 단당류 유도체를 함유하는 임의의 글리칸 (즉, 다당류)인 것으로 의도된다. 글루코사미노글리칸의 예로는 폴리-N-아세틸 글루코사미노글리칸이 있으며, 이는 통상 키토산으로 지칭된다. 본 발명에서 유용할 수 있는 다당류의 예로는 덱스트란, 헤파란, 헤파린, 히알루론산, 알기네이트, 아가로스, 카라기난, 아밀로펙틴, 아밀로스, 글리코겐, 전분, 셀룰로스, 키틴, 키토산 및 각종의 황산화된 다당류, 예컨대, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 덱스트란 술페이트, 데르마탄 술페이트, 또는 케라탄 술페이트를 포함한다. 명확하게 하기 위해, 비록 스캐폴드 그 자체가 히드로겔일 수는 있지만, 스캐폴드가 반드시 히드로겔이어야 할 필요는 없다.
(a) 히드로겔
한 실시양태에서, 본 발명은 히드로겔 및 양막 분말을 포함하는 조성물을 포함한다. 히드로겔은 일반적으로 다량의 유체를 흡수할 수 있고, 평형시에는 전형적으로 60-99%의 유체 및 단지 1-40%의 중합체로만 구성된다. 일부 경우에서, 히드로겔의 수분 함량은 약 99%이다. 다른 경우에서, 히드로겔의 수분 함량은 약 70-90%이다. 히드로겔은 가교 결합된 중합체 네트워크의 고유한 생체적합성에 기인하여 특히 유용하다 (문헌 [Hill-West, et al.,1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5967-5971]). 히드로겔 생체적합성은 다량의 생물학적 유체를 흡수할 수 있는 능력 및 친수성에 기인하는 것일 수 있다 (문헌 [Brannon-Peppas. Preparation and Characterization of Cross-linked Hydrophilic Networks in Absorbent Polymer Technology, Brannon-Peppas and Harland, Eds. 1990, Elsevier: Amsterdam, pp 45-66]; [Peppas and Mikos. Preparation Methods and Structure of Hydrogels in Hydrogels in Medicine and Pharmacy, Peppas, Ed. 1986, CRC Press: Boca Raton, Fla., pp 1-27]). 히드로겔은 친수성 생체중합체 또는 합성 중합체, 또는 그 둘 모두를 가교 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 다시 말해, 히드로겔은 전구체 물질을 가교제와 반응시킴으로써 제조되고, 여기서, 전구체 물질은 친수성 생체중합체 또는 합성 중합체, 또는 그 둘 모두이다. 친수성 생체중합체의 물리적 또는 화학적 가교 결합으로부터 형성되는 히드로겔의 예로는 히알루론난, 키토산, 젤라틴, 알기네이트s, 콜라겐, 덱스트란, 펙틴, 카라기난, 폴리리신, 젤라틴 또는 아가로스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (문헌 [W. E. Hennink and C. F. van Nostrum, 2002, Adv. Drug Del. Rev. 54, 13-36] 및 [A. S. Hoffman, 2002, Adv. Drug Del. Rev. 43, 3-12] 참조). 상기 물질은 선형 또는 분지형 다당류 또는 폴리펩티드로 제조된 고분자량 골격 쇄로 이루어진다. 화학적 또는 물리적 가교 결합 합성 중합체에 기반한 히드로겔의 예로는 (메트)아크릴레이트-올리고락티드-PEO-올리고락티드-(메트)아크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEO), 폴리(프로필렌 글리콜) (PPO), PEO-PPO-PEO 공중합체 (플루로닉), 폴리(포스파젠), 폴리(메타크릴레이트), 폴리(N-비닐피롤리돈), PL(G)A-PEO-PL(G)A 공중합체, 폴리(에틸렌 이민) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (문헌 [A. S Hoffman, 2002 Adv. Drug Del. Rev, 43, 3-12] 참조).
본 발명에서 히드로겔을 제조하는 데 사용될 수 있는 많은 유형의 가교제가 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Fei, et al., 2000, Journal of Applied Polymer Science, 78: 278-283]; [Hennink, et al., 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 13-36]; [Janik, et al., 2008, Nuclear Instruments & Methods in Physics Research Section B-Beam Interactions with Materials and Atoms, 208: 374-379]; [Liu, et al., 2005, Radiation Physics and Chemistry 72: 635-638]; [Nagasawa, et al., 2004, Carbohydrate Polymers, 58: 109-113]; [Onuki, et al, 2008, International Journal of Pharmaceutics, 349: 47-52]; [Shen, et al., 2006, Polymer Bulletin, 56: 137-143]; [Shu, et al., 2004, Biomaterials, 25: 1339-1348]). 특정 실시양태에서, 하나 이상의 가교제는 히드로겔을 제조하는 데 사용될 수 있다. 상기 가교제로는 글루타르알데히드, 에폭시드 (예컨대, 비스-옥시란), 산화된 덱스트란, p-아지도벤조일 히드라지드, N-[α-말레이미도아세톡시]숙신이미드 에스테르, p-아지도페닐 글리옥살 일수화물, 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디술피드, 비스[술포숙신이미딜]수베레이트, 디티오비스[숙신이미딜 프로프리오네이트, 디숙신이미딜 수베레이트, 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC), N-히드록시숙신이미드 (NHS), 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA), PEGDMal 및 당업자에게 공지된, 다른 이작용성 가교 결합 시약을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 히드로겔의 기계적 특성은 가교 결합 시간 및 가교 결합제의 양에 의해 크게 영향을 받는다는 것을 당업자는 이해하여야 한다. 한 실시양태에서, 가교제는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA)이고; 또 다른 실시양태에서, 가교제는 말레이미드 작용기를 포함하는, 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 가교제 (PEGDMal)이다.
한 실시양태에서, 히드로겔은 1종 이상의 생체중합체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 히드로겔 스캐폴드는 2종 이상의 생체중합체를 추가로 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 히드로겔 스캐폴드는 1종 이상의 생체중합체 및 1종 이상의 합성 중합체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 히드로겔은 히알루론산, 젤라틴, 및 PEGDMal을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 히드로겔의 성분은 변형된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 단량체는 메타크릴산 무수물 (MA)로 변형될 수 있고; 또 다른 실시양태에서, 단량체 또는 히드로겔 전구체 물질은 티올화될 수 있다 (예컨대, 티올 작용기 도입).
본 발명에서 사용될 수 있는 히드로겔 및 그의 제조 방법은 2013년 9월 10일 출원된 특허 출원 PCT/US13/58940 (상기 출원은 그 전문이 본원에 포함된다)에 개시되어 있다.
히드로겔은 자연 생(natural living) 세포외 매트릭스와 매우 유사하다 (문헌 [Ratner and Hoffman. Synthetic Hydrogels for Biomedical Applications in Hydrogels for Medical and Related Applications, Andrade, Ed. 1976, American Chemical Society: Washington, D. C., pp 1-36]). 히드로겔은 또한 PLA, PLGA 또는 PGA 중합체를 도입함으로써 생체내에서 분해될 수 있도록 제조될 수 있다. 또한, 히드로겔은 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 또는 예를 들어, 표면 변형을 위해 RGD로 변형될 수 있으며, 이는 세포 부착 및 증식을 촉진시킬 수 있다 (문헌 [Heungsoo Shin, 2003, Biomaterials 24: 4353-4364]; [Hwang et al., 2006 Tissue Eng. 12: 2695-706]). 실제로, 분자량, 블록 구조, 분해 가능한 연결부 및 가교 결합 모드를 변경시킴으로써 본 히드로겔의 강도, 탄성 및 분해 특성에 영향을 줄 수 있다 (문헌 [Nguyen and West, 2002, Biomaterials 23(22): 4307-14]; [Ifkovits and Burkick, 2007, Tissue Eng. 13(10): 2369-85]).
다양한 단백질 (예컨대, 콜라겐) 또는 화합물, 예컨대, 치료제를 공유적으로 부착시키기 위해 히드로겔을 또한 작용기로 변형시킬 수 있다. 매트릭스에 연결될 수 있는 치료제로는 진통제, 마취제, 항진균제, 항생제, 항염증제, 구충제, 해독제, 제토제, 항히스타민제, 항고혈압제, 항말라리아제, 항미생물제, 항정신병제, 해열제, 방부제, 항관절염제, 항결핵제, 진해제, 항바이러스제, 심장작용제, 하제, 화학요법제, 착색 또는 형광 영상화제, 코르티코이드제 (예컨대, 스테로이드제), 항우울제, 저하제, 진단 보조제, 이뇨제, 효소, 거담제, 호르몬제, 최면제, 미네랄, 영양 보충제, 부교감 신경 흥분제, 칼륨 보충제, 방사선 감작제, 방사성 동위원소, 진정제, 술폰아미드, 자극제, 교감 신경 흥분제, 신경 안정제, 비뇨계 항감염제, 혈관 수축제, 혈관확장제, 비타민, 크산틴 유도체 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 치료제는 또한 다른 유기 소분자, 천연적으로 단리된 엔티티 또는 그의 유사체, 유기금속 작용제, 킬레이트화된 금속 또는 금속 염, 펩티드 기반 약물, 또는 펩티드성 또는 비-펩티드성 수용체 표적화 또는 결합 작용제일 수 있다. 치료제의 매트릭스에의 연결이 프로테아제 감수성 링커 또는 다른 생체분해성 연결부를 통해 이루어질 수 있다는 것이 고려된다. 히드로겔 매트릭스 내로 도입될 수 있는 분자로는 비타민 및 다른 영양 보충제; 당단백질 (예컨대, 콜라겐); 피브로넥틴; 펩티드 및 단백질; 탄수화물 (단순 및/또는 복합 탄수화물, 둘 모두); 프로테오글리칸; 항원; 올리고뉴클레오티드 (센스 및/또는 안티센스 DNA 및/또는 RNA); 항체 (예를 들어, 감염체, 종양, 약물 또는 호르몬에 대한 항체); 및 유전자 요법 시약을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 안정화된 가교 결합된 히드로겔 매트릭스는 하나 이상의 증강제 첨가를 통해 추가로 안정화되고, 증강될 수 있다. "증강제" 또는 "안정화제"란, 추가의 안정성 또는 기능성 이점을 제공함으로써 히드로겔 매트릭스를 증강시키는 것인, 고분자량 성분 이외의, 히드로겔 매트릭스에 첨가되는 임의의 화합물인 것으로 의도된다. 고분자량 성분과 혼합되고, 히드로겔 매트릭스 내에 분산되는 데 적합한 증강제로는 상기 논의된 열가역성 매트릭스와 관련하여 이전에 기술된 다수의 첨가제를 포함한다. 증강제로는, 가교 결합된 히드로겔 매트릭스 내로 도입되었을 때, 추가의 안정성 또는 기능성 이점을 제공함으로써 히드로겔 매트릭스를 증강시키는 임의의 화합물, 특히, 극성 화합물을 포함할 수 있다.
안정화된 가교 결합된 히드로겔 매트릭스와 함께 사용하는 데 바람직한 증강제로는 극성 아미노산, 아미노산 유사체, 아미노산 유도체, 무손상 콜라겐, 및 2가 양이온 킬레이터, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 또는 그의 염을 포함한다. 극성 아미노산은 티로신, 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하는 것으로 의도된다. 바람직한 극성 아미노산은 L-시스테인, L-글루탐산, L-리신, 및 L-아르기닌이다. 각각의 특히 바람직한 증강제의 적합한 농도는 열가역성 히드로겔 매트릭스와 관련하여 상기 언급된 바와 같이 동일하다. 극성 아미노산, EDTA, 및 그의 혼합물이 바람직한 증강제이다. 증강제는 고분자량 성분의 가교 결합 이전에 또는 그 동안에 매트릭스 조성물에 첨가될 수 있다.
증강제는 그가 매트릭스 내에서 촉진시키는 고유한 특성 때문에, 안정화된 가교 결합된 생체활성 히드로겔 매트릭스에서 특히 중요하다. 히드로겔 매트릭스는 이하 기술되는 추가 실시양태를 통해 더욱 자명해지는 내인성 생체활성을 보인다. 내인성 생체활성은 증강성 및 강화성 극성 아미노산 뿐만 아니라, 다른 증강제의 존재하에서 가교 결합된 거대분자의 독특한 입체화학의 기능인 것으로 여겨진다.
한 실시양태에서, 양막 분말은 히드로겔 내로 도입된다. 예를 들어, 양막 분말은 겔의 겔화 또는 중합화 이전에 히드로겔 용액에 첨가되거나, 또는 그와 혼합될 수 있다. 양막 분말은 원하는 효과를 일으키는 데 바람직한 임의의 양으로 히드로겔 용액에 첨가될 수 있다. 한 실시양태에서, 유효량의 양막 분말이 상처에 직접 적용된 후, 히드로겔이 양막 분말 위에 적용된다. 일부 실시양태에서, 히드로겔은 양막 성분이 히드로겔 내로 및 그 전역에 걸쳐 확산될 수 있도록 허용한다.
(b) 스캐폴드를 형성하는 방법
본 발명과 함께 사용될 수 있는 스캐폴드를 제조하는 방법은 2013년 9월 10일 출원된 특허 출원 PCT/US13/58940 (상기 출원은 그 전문이 본원에 포함된다)에 개시되어 있다.
치료제
한 적용에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 사용하여 환자에서의 상처 봉합을 촉진시키는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 임상적 및 개인 상처 관리 및 연조직 재생에 유용하다. 본 발명에 따라, 양막 분말을 포함하는 조성물을 상처로 옮겨 놓는다. 본 방법은 외부 (예컨대, 표면) 및 내부 상처, 둘 모두의 봉합을 촉진시킨다. 본 발명의 방법이 봉합시키는 데 유용한 상처로는 찰과상, 박리, 파열성 상처(blowing wound), 화상 상처, 타박상, 총상, 절창, 개방창, 관통상, 천공창, 자창, 관선 상처, 자상, 외과적 창상, 피하 상처, 또는 접선창을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 방법은 상처의 완전한 치유 또는 봉합을 달성할 필요는 없으며, 본 발명이 상처 봉합을 어느 정도 촉진시키는 역할을 하면 충분하다. 이와 관련하여, 본 방법은 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 상처 조직을 치유시키는 다른 방법에 대한 보조 기법으로 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 양막 분말을 포함하는 조성물은 대상체의 상처 또는 치료 부위에 직접 적용된다. 본원 다른 곳에도 기술되어 있는 바와 같이, 양막 분말은 국소용 연고, 크림, 에어로졸 스프레이 등을 비롯한, 제약 제제 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 본원 다른 곳에도 기술되어 있는 바와 같이, 외부 피부 상처를 위한 상처 드레싱 또는 이식편으로서 양막 기반 스캐폴드를 사용하는 것을 포함한다. 임상적 환경에서, 스캐폴드는 외상, 화상, 궤양, 찰과상, 열상, 수술, 또는 다른 손상으로부터 초래된 상처를 치료하는 데 사용될 수 있다. 외과의는 상처 부위를 도포하고, 보호하기 위해, 손실 또는 손상된 피부 조직를 일시적으로 대체하기 위해, 및 손상된 부위로의 새로운 조직 생성 및 상처 치유를 유도하기 위해 상기 스캐폴드를 사용할 수 있다. 임상적 환경에서, 일부 실시양태에서, 봉합사, 접착제, 또는 중복 붕대를 사용하여 스캐폴드를 상처 부위에 고정시킬 수 있다. 스캐폴드는 상처 크기에 맞게 절단될 수 있거나, 또는 상처 가장자리와 오버랩될 수 있다. 일부 경우에서, 스캐폴드는 심층부의 상처에 의해 형성된 공동 내로 침투될 수 있도록 형상화될 수 있다.
한 실시양태에서, 히드로겔은 유동성 상태로 상처 또는 치료 부위에 적용된다. 일부 경우에서, 히드로겔은 상처 또는 치료 부위에서 중합화된다. 한 실시양태에서, 히드로겔은 사용 직전에 예를 들어, PEGDMal을 통해 중합화되도록 유도된다. 또 다른 실시양태에서, 히드로겔은, 한 챔버는 가교제를 함유하는 반면, 나머지 다른 한 챔버는 생체중합체 또는 합성 중합체, 또는 그 둘 모두를 함유하는 것인 이중 챔버 시린지 등을 사용하여 치료 부위에서 즉석에서 형성된다. 또 다른 실시양태에서, 히드로겔은, 양막 분말을 포함하는 조성물을 상처에 적용한 이후 즉시 상처에 적용된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 상처 치유 및 조직 재생을 유도하기 위한 키트 팩을 포함한다. 팩은 2개의 구획과, 그를 분리시키는 장벽 등을 가진다. 다시 말해, 팩은 1개의 밀폐공간과, 밀폐공간을 2개의 구획으로 분리시키는 1개의 장벽을 가진다. 한 실시양태에서, 두 구획의 크기는 동일한다. 또 다른 실시양태에서, 두 구획의 크기는 상이하다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 한 구획이 나머지 다른 한 구획을 봉입한다. 한 실시양태에서, 팩의 한 구획은 미리 결정된 양의 히드로겔 전구체 물질을 함유하고; 나머지 다른 한 구획은 미리 결정된 양의, 양막 분말을 포함하는 조성물 및 가교제를 포함하는 조성물을 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 팩의 한 구획은 미리 결정된 양의 양막 분말 및 히드로겔 전구체 물질을 포함하는 조성물을 함유하고, 나머지 다른 한 구획은 가교제를 포함하는 조성물을 함유한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 한 구획은 미리 결정된 양의 수화된 히드로겔 전구체 물질 및 양막 분말을 포함하는 조성물을 함유하고; 나머지 다른 한 구획은 가교제를 포함하는 조성물을 함유한다.
장벽은 통상적으로 취급하는 동안 구획 사이의 밀봉을 유지시킬 수 있을 정도로 충분히 강력하여야 한다. 동시에, 장벽은 사용시 파열 수단에 감수성이어야 한다. 장벽 파열은 팩 가운데를 단단히 붙잡고, 양쪽 끝으로부터 빠르게 잡아당기거나, 또는 갑자기 잡아당김으로써 달성된다. 대안적으로, 장벽은 압착시키거나, 캡을 비틀거나, 플런저를 압착시키거나, 구획을 왕성하게 진탕시키거나, 니딩함으로써 파열될 수 있다. 일단 장벽이 파열되고 나면, 한 구획 내의 양막 분말은 그 안의 히드로겔과 혼합될 수 있거나, 또는 계내에서 형성될 수 있다.
대안적으로, 장벽은 사용 직전 장벽을 개방하여 팩 외부를 제어하는 밸브와 같이 작용한다. 이 경우, 장벽은 파열될 필요는 없다.
또 다른 실시양태에서, 팩은 한 구획을 가진다. 상기 구획은 미리 결정된 양의 양막 분말, 수용성 물질로 코팅된 히드로겔 전구체 물질, 및 가교제를 포함한다. 상기 성분들은 모두, 수용성 물질로 코팅된 히드로겔 전구체 물질이 가교제와 반응하지 않도록 건조된 상태이다. 사용 직전에 물이 팩에 첨가되고, 이는 코팅제를 용해시킨다. 이어서, 노출된 히드로겔 전구체 물질은 가교제와 반응하여 히드로겔을 형성한다. 한 비제한적인 예에서, 수용성 코팅 물질은 젤라틴이다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 팩은 한 구획을 가진다. 상기 구획은 미리 결정된 양의 양막 분말, 히드로겔 전구체 물질, 및 수용성 물질로 코팅된 가교제를 포함한다. 상기 성분들은 모두, 히드로겔 전구체 물질이 수용성 물질로 코팅된 가교제와 반응하지 않도록 건조된 상태이다. 사용 직전에 물이 팩에 첨가되고, 이는 코팅제를 용해시킨다. 이어서, 가교제는 히드로겔 전구체 물질과 반응하여 히드로겔을 형성한다. 한 비제한적인 예에서, 수용성 코팅 물질은 젤라틴이다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 팩은 또한 한 구획을 가진다. 구획은 미리 결정된 양의 양막 분말, 히드로겔 전구체 물질, 및 가교제를 포함한다. 히드로겔 전구체 물질 및 가교제는 pH가 7 미만인 용액으로부터 건조된다. 특정 실시양태에서, pH 범위는 0.1 내지 6.5이다. 한 예에서, pH는 6; 또는 5; 또는 4; 또는 3; 또는 2; 또는 1이다. 사용 직전에, 염기성 물을 팩에 첨가하여 생성된 용액을 대략 pH=7로 중화시키고, 이때, 히드로겔 전구체 물질 및 가교제는 반응하여 히드로겔을 형성한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 팩은 진공 포장되고, 건조제 물질을 추가로 포함한다.
키트 팩은 보관 기간을 연장시키는 데, 적합한 보관 온도를 유지시키는 데, 생체활성 성분을 유지시키는 데, 및 히드로겔을 형성하고, 생성물을 대상체에게 적용시키는 데 편리한 시간을 제공하는 데 유익하다.
한 실시양태에서, 밀폐공간은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르 알루미늄, 알루미늄 처리된 중합체 필름, 및 다른 종래 플라스틱 또는 본 발명에 적합한 다른 패키징 물질로 제조된다.
한 실시양태에서, 장벽은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르 알루미늄, 알루미늄 처리된 중합체 필름, 젤라틴 및 다른 종래 플라스틱 또는 본 발명에 적합한 다른 패키징 물질로 제조된다.
한 실시양태에서, 키트 팩은 장벽 등의 파열에 관해 지시하는 인디케이터를 가진다. 한 경우에서, 인디케이터는 pH 의존성 염료 (예컨대, 페놀 레드)이다. 혼합시, pH는 pH 7로 평형화되고, 그 결과로 색상 보정이 이루어진다.
실험부 실시예
이제 본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 기술된다. 본 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명은 어느 방식으로든 이러한 실시예로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하며, 오히려, 본원에서 제공하는 교시의 결과로서 자명해지게 되는 임의의 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
양막 분말을 제조하는 일반 방법
기증받은 인간 태반을 수집하고, 추가 사용시까지 4℃에서 보관하였다. 양막 (무혈관/내부)을 장막 (혈관/외부)으로부터 수동으로 절개하였다. 존재하는 임의의 혈전을 제거하였다. 막을 500-1,000 mL 멸균 염수로 세척하였다.
멸균 가위 및 집게를 사용하여 양막을 대략 5 x 5 cm 조각으로 절단하였다. 이어서, 양막 조각을 멸균 500 mL 용기로 옮겨 놓고, 100 mL 멸균 염수로 5회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 조각을 500 mL 멸균수로 세척하였다.
양막 조각을 50 mL 튜브로 옮겨 놓았다. 옮겨 놓는 동안, 각 조각으로부터 가능한 많은 양의 물을 제거하기 위해 조각을 500 mL 용기 가장자리를 따라 드래깅하였다. 각 50 mL 튜브를 최대 25 mL로 충전시켰다. 이어서, 양막 조각을 함유하는 50 mL 튜브를 12-24시간 동안 -80℃에서 유지시켰다.
50 mL 튜브 뚜껑을 제거하고, 튜브를 파라필름으로 덮었다. 포킹하여 파라필름 내에 수개의 작은 구멍을 만들었다. 튜브를 미리 냉각시킨 유리 동결건조기 용기에 놓고, 48-72시간 동안 동결건조시켰다.
스펙스® 샘플프렙®8970(SPEX® SAMPLEPREP®8970) 냉동 장치/분쇄기를 액체 질소로 충전시켰다. 동결건조된 양막 조각을 냉동 장치/분쇄기 챔버 내에 놓았다. 막 조각을 5분 냉각, 5분 분쇄로 3 사이클을 진행하여 분쇄시켰다. 이어서, 분말에 1시간 동안 1 메가래드로 감마 방사선을 조사한 후, 추가 사용시까지 분취량으로 -80℃에서 보관하였다.
비교 실험
본 발명의 양막 분말 (이하 "AMP")과 US 2007/0071740 A1 (쳉 등)에 기술된 양막-유래 생성물 (이하 "쳉 생성물") 사이의 비교 연구를 수행하였다.
AMP 제조 단계:
1. 기증받은 인간 태반을 수집한다. 사용시까지 4℃에서 보관한다.
2. 양막 (무혈관/내부)을 장막 (혈관/외부)으로부터 수동으로 절개한다.
3. 임의의 혈전을 제거하고, 막을 500-1,000 mL 멸균 염수로 세척한다.
4. 멸균 가위 및 집게를 사용하여 양막을 대략 5 x 5 cm 조각으로 절단한다.
5. 양막 조각을 멸균 500 mL 용기로 옮겨 놓고, 100 mL 멸균 염수로 5회에 걸쳐 세척한다.
6. 500 mL 멸균수로 세척을 수행한다.
7. 500 mL 용기 가장자리를 따라 드래깅하여 각 조각으로부터 가능한 많은 양의 물을 제거하면서, 양막 조각을 50 mL 튜브로 옮겨 놓는다.
8. 각 50 mL 튜브를 최대 25 mL로 충전시킨다.
9. 양막 조각을 함유하는 50 mL 튜브를 12-24시간 동안 -80℃에 놓는다.
10. 50 mL 튜브 뚜껑을 제거하고, 파라필름으로 덮는다. 포킹하여 파라필름 내에 수개의 작은 구멍을 만든다.
11. 튜브를 미리 냉각시킨 유리 동결건조기 용기에 놓고, 24-48 hr 동안 동결건조시킨다.
12. 스펙스 샘플프렙 6870 냉동 장치/분쇄기를 액체 질소로 충전시킨다.
13. 동결건조된 양막을 냉동 장치/분쇄기 챔버 내에 놓고, 5분 냉각, 5분 분쇄로 3 사이클을 진행하여 분쇄시킨다.
14. 분말 중량을 측정하고, -80℃에서 보관한다.
(US 2007/0071740 A1의 청구범위 및 [0095] 단락에 준한) 쳉 제조 단계
1. 태반을 수집하고, 상업적으로 이용가능한 -80℃ 초저온 냉동 장치에서 냉동시킨다 (보관 기간은 48시간 내지 7일 범위일 수 있다).
2. 태반을 24시간 동안 4℃ 환경 (냉장고)으로 옮겨 놓는다.
3. 4시간 동안 생리 식염수 첨가하에 또는 그의 부재하에서 실온으로 이동시킨다.
4. 해동된 태반으로부터 양막 물질을 단리시킨다.
5. HBSS (인비트로겐(Invitrogen) 카탈로그 번호 14175) 중에서 세척하고, 멸균 원심분리기 튜브에 놓고, 4℃에서 5분 동안 5,000 rpm으로 원심분리시킨다.
6. 유체를 제거하고, 양막 물질 중량을 측정한다.
7 및 8 단계는 임의적이지만, 수행하였다.
7. 양막을 바이오풀버라이저(Biopulverizer)의 배럴에 맞게 작은 조각으로 슬라이스한다.
8. 액체 질소에서 냉동시키고, 미세 분말로 분쇄하고, 중량을 측정한다.
9. 프로테아제 억제제 (프로테아제 억제제 칵테일 P8340, 시그마(Sigma), 및1 mM PMSF로 보충) 및 포스파타제 억제제 (50 mM 플루오르화나트륨 및 0.2 mM 바나듐산나트륨)를 함유하는, 냉 1 x PBS 완충제 (pH 7.4)를 제조한다.
10. 완충제를 분말에 1:1 (mL/g)로 첨가한다.
11. 얼음상에서 유지시키고, 매회 1분 동안 5회에 걸쳐 티슈 테어러(Tissue Tearor) (바이오스펙트(Biospec) 제품)로 균질화시키고, 각 회 중간에 2분간 냉각시킨다.
12. 상기 수용성 추출물을 "전체" 양막 추출물 (AME)로 명명한다.
13. 전체 AME를 추가 분석을 위해 보관한다.
초기 관찰 결과
쳉에 개시된 프로토콜은 다회에 걸쳐 수행되는 연장된 냉동/해동 단계를 포함하며, 그 결과로 양막 물질을 4℃ 또는 실온에서 장기간 동안 보관하게 된다. 비교해보면, AMP는 가능한 빨리 단리되고, 동결건조에 의해 보존하기 전에 -80℃에서 즉시 냉동된다. 본 방법을 통해서 생성물의 감수성이고, 잠재적으로 생체활성인 성분을 확실히 보존할 수 있다. AMP는 실온에서 안정적이고, 그의 분말 상태를 유지한다. 쳉 생성물은 단지 8 단계에서 그를 액체 질소로부터 제거한 후 잠시 동안 분말과 유사하다. 상기 단계 후, 분말은 신속하게 액체 슬러리로 "용융된다," 추가로, 반복으로 철저하게 수행되는 세척 단계가 없는 바, 이에, 생성물은 혈액 및 다른 생물학적 오염 물질로 오염되고, 그 결과, 적색을 띠는 최종 생성물이 출현하게 되는 반면, AMP는 외관상 백색/베이지색을 띠게 된다.
검정
동일한 중량의 생성물을 사용하여 모든 검정을 수행하였다. 최종 쳉 생성물은 1 g/mL 쳉 '분말'을 포함하는 액체 형태이다. 그러므로, 적합한 부피의 쳉 생성물을 사용하여 AMP 중량과 일치시켰다. 사용된 검정법으로는 전체 단백질, 콜라겐, 엘라스틴 및 GAG를 측정하기 위한 비색검정법 (피어스(PIERCE)®/시르콜(SIRCOL)®), TSG-6, PTX-3, 및 TSP-1을 측정하기 위한 콴티카인(QUANTIKINE)® ELISA 키트 (R&D 시스템즈(R&D systems), 마이바이오소스(MyBiosource))를 포함하였다. 실시간 PCR을 수행하여 유전자 발현을 측정하였다. 7일 동안의 AMP 및 쳉 생성물로부터의 단백질 방출량을 사정하였다 (도 26). 25 mg씩의 각 물질을 미세원심분리기 튜브에 놓고, PBS를 이용하여 최대 200 uL까지 표면을 덮었다. 매일, 튜브를 5분 동안 6,000 rpm으로 원심분리하여 불용성 물질 및 상청액을 분리시켰다. 상청액을 수집하고, 추가 분석을 위해 냉동시키고, 200 uL의 신선한 PBS를 다시 각 튜브에 첨가하였다. 진탕기 상에서 37℃에서 인큐베이션을 수행하였다. 모든 검정은 각 양막 생성물에 대한 3개의 별개의 양막 단리물에 대하여 형성되었고 (n=3), 비색 검정법 및 플레이트 기반 ELISA에 대한 표준 곡선 작성에 사용된 양성 대조군 표준을 사용하여 수행하였다. 모든 검정법을 위해 출발 물질을 제안된 최대 중량으로 사용하되, 단, 예외적으로 TSG-6 ELISA는 그렇지 않았다.
TSG-6을 사정할 때, 제안된 최대 중량으로 출발 물질을 사용한 1차 시도 결과, 시험된 모든 샘플은 검출 한도보다 더 낮은 성분을 가지는 것으로 나타났다. 제안된 최대 출발 물질을 배가시켜 2차 검정을 수행하였고, 쳉 생성물은 낮은, 그러나, 검출가능한 TSG-6을 가졌다. AMP에서는 TSG-6이 검출되지 않았다. 본 검정 웰에서 공간상의 제한으로 출발 물질의 부피를 추가로 증가시키는 것이 불가능하였다.
결과
각 조성물 중의 성분의 평균 양에 대한 요약은 하기 표 1에 열거되어 있다. 본 결과는 AMP 중의 전체 단백질의 양은 쳉 생성물 중의 것보다 약 10배 더 높고; AMP 중의 엘라스틴의 양은 쳉 생성물 중의 것보다 약 15배 더 높고; AMP 중의 콜라겐의 양은 쳉 생성물 중의 것보다 약 100배 더 높다는 것을 입증한다. AMP 중의 글리코사미노글리칸의 양은 약 1 mg/g인 반면, 쳉 생성물 중에서는 검출가능한 글리코사미노글리칸은 없었다.
RT-PCR 결과를 통해 두 샘플 모두 증폭될 수 있는 무손상 RNA를 함유하였지만 (GAPDH); TSG-6 유전자 발현은 검출되지 않은 것으로 입증되었다.
RNA 및 DNA 제거는, 물을 AMP에 첨가하여 용액을 제조하고; RNase 및 DNase를 용액에 첨가하고; 적합한 반응 조건하에서 인큐베이션시킨 후, 생성된 용액을 동결건조시키는 임의적 단계에서 달성될 수 있다.
쳉 생성물과 비교하였을 때, 유의적으로 증가된 양의 단백질이 AMP로부터 방출되었다는 것이 생성된 누적 방출 곡선 (도 26)을 통해 입증되었다. 이러한 차이는 모든 시점에서 유의적이었다 (p < 0.001).
상기 각 검정의 결과는 하기 표 1에 요약되어 있다.
Figure 112017042427607-pct00001
생체내 연구 1
연구/방법 개요
동물:
특정 병원체 부재 (specific pathogen free: SPF) 요크셔(Yorkshire) 돼지 6마리를 구입하고, 필요한 2주 기간 동안 순응시켰다. 연구 출발 시점에 돼지 체중은 대략 40-50 kg인 것으로 측정되었다. 본 연구는 웨이크 포레스트 대학교(Wake Forest University) 실험 동물 운영 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 검토되었고, 그로부터 승인을 받았다 (돼지에서의 상처 치유를 위한 A13-015-양막 생성물).
새들 훈련 (saddle training):
수술 전, 플라스틱 새들에 내성을 띠도록 동물을 훈련시켰다. 오락 및 인간 접촉을 위한 유인 도구로서 동물용 크래커를 제공하였다. 먼저, 동물을 플라스틱 냄새에 순응시켰다. 일단 순응시키고 나면, 감독하에 새들을 일정 기간 동안 동물 위에 얹고, 동물이 얹힌 새들을 편안하게 느낄 때까지 무기한으로 그 기간을 점차 연장시켰다. 동물이 완전히 플라스틱에 익숙해질 때까지 새들을 얹힌 기간을 점차 연장시켰다. 이 프로세스는 전형적으로 2-3주 소요된다 (이는 원 2주 기간의 일부일 수 있다).
전층 (full thickness) 상처:
동물을 케타민, 크실라진, 아세프로마진의 조합을 이용하여 진정시키고, 마취시키고, 기관내 튜브를 통하여 흡입식 이소플루란을 사용하여 마취 상태로 유지시켰다. 마취된 돼지의 등을 면도하여 털을 뽑아 내었다. 동물을 고정시키고, 등이 보이게 위치시켰다. 등 부분 위에 8개의 4 x 4 cm 타투를 이용하여 동물에 타투를 새겨 절제 상처 부위를 표시하였다. 등쪽 피부를 물 및 비누로 세정하고, β-아이오딘 및 70% 알콜로 멸균하였다. 결손을 생성하기 위해, 흉부 및 요추 부위를 따라 등 중앙부에서 4 x 4 cm로 전층 피부를 적출하여 8개의 피부 상처 부위를 생성하였다. 수술용 칼로 피부밑 근육층까지 상처 가장자리를 따라 절개하고, 덮여 있는 피부를 절제하였다 (도 1).
상처 치료:
이어서, 상처 부위를 상업적으로 이용가능한 제품을 이용하여 제조사의 설명서에 따라, 또는 본 발명의 양막-유래 생성물을 이용하여 유사한 방식으로 처리하였다. 추가 군은 치료받지 못했다. 상처 위치 차이를 대조하기 위해 8개의 피부 결손부에 걸쳐 6개의 실험 옵션을 분포시키고, 그 결과로 총 8개로 각 생성물을 적용시켰다. 6마리의 돼지를 2 라운드의 실험으로 처리하였는데, 여기서, 제2 라운드의 치료는 제1 라운드의 안락사 이후에 시작되었다. 각 실험 라운드는 30일 동안 진행되었고, 그 동안 매주 2회에 걸쳐 상처를 1) 상처 크기, 상피재형성, 및 봉합 기록, 및 2) 세정, 항생제 투여, 및 붕대 감기 재실행에 대해 검사하였다.
히드로겔 제조:
본 생체내 연구 1에서 사용된 양막 히드로겔은 하기 단계에 따라 제조하였다:
1. 아이그라큐어(IRGACURE)® 2959 광개시제 (4-(2-히드록시에톡시)페닐-(2-프로필)케톤, 시그마: 미국 미주리주 세인트 루이스)를 멸균수에 용해시켜 0.05% w/v 용액을 제조하였다. 헤프라실(HEPRASIL)® (티올화되고, 헤파린 처리된 HA-유도체) 및 겔린-S(GELIN-S)® (티올화된 젤라틴)를 물에 용해시켜 2% w/v 용액을 제조하였다. 엑스트라링크(EXTRALINK)®, 페그다(PEGDA) 가교제를 물에 용해시켜 4% w/v 용액을 제조하였다.
2. 이어서, 헤프라실®, 겔린-S®, 및 엑스트라링크® 용액을 2:2:1의 부피비로 혼합한다.
주석: 생성된 용액은 15-30분 동안에 걸쳐 마이클(Michael) 유형의 추가 티올-아크릴레이트 반응에 의해 자발적으로 가교 결합한다. 이러한 유형의 가교 결합은 제조사에 의해 기술되는 일반 가교 결합 방법이다. 상기 시간 프레임 속도는 너무 느리기 때문에 상처 관리를 효율적으로 실행할 수 없다. 대신, 하기 가교 결합 방법을 사용한다.
3. 상기 3개 성분을 함께 혼합하고, 와동시키고, 액체로서 원하는 표적 부위에 적용시키고, UV 광 (365 nm, 18 w/㎠)을 조사하여 훨씬 더 빠른 티올렌 단계식 가교 결합 반응을 개시시킨다.
군:
1. 비처리군
2. 앰니오그래프트® (바이오-티슈, 인크.)
3. 그래프트재킷® (라이트 메디컬 테크놀러지, 인크.)
4. 본 발명에 기술된 방법에 따라 제조된 양막 분말.
5. 양막 히드로겔
6. 일렉트론스펀 패치.
Figure 112017042427607-pct00002
붕대 감기:
치료 적용 후 및 계획에 따라 붕대 교체를 위해, 상처 실험 프로토콜에 따라, 상처 부위를, 상처 위에 확실하게 보호 장벽이 그대로 남아 있도록 하는 데 도움을 주는 드레싱 물질로 도포하였다. 물질은 국소용 항생제 크림, 테가덤(TEGADERM)® (3M 컴퍼니(3M Company)), 캐스트 패딩, 점착성 붕대, 스토키네트, 보호용 플라스틱 새들, 및 마지막으로, 붕대를 고정시키기 위한 특수 고안된 재킷을 포함하였다. 돼지 목을 보호하기 위해 새들 정면부를 따라 다공성 외과용 테이프를 이용하여 새들 가장자리를 커버하였다. 벨코(VELCO)® 스트랩 4개를 사용하여 새들을 돼지에 고정시키기 위한 수단으로서 새들 상에 신축성 스트랩을 배치시켰다.
안락사:
치료 전 30일째, 연구를 종료하고, 상처 부위를 수거하였다. 동물을 케타민, 크실라진, 아세프로마진을 이용하여 진정시켰다. 이어서, 동물을 부검실로 데리고 갔다. 정맥내 주사에 의해 뷰사나시아를 치사 과용량으로 제공하였다. 각 동물로부터의 상처를 각각 ¼씩 4개로 분할하였는데: 둘은 조직학법 및 면역조직화학법을 위한 것이고, 하나는 상처 치유 바이오마커에 대한 PCR 분석을 위한 것이고, 하나는 단백질 검정법을 위한 것이었다 (도 2).
영상 분석:
소프트웨어 이미지J(ImageJ)를 사용하여 타투가 새겨진 사각형 표시부 안쪽 면적을 측정함으로써 각 시점에 수축을 측정하고, 원래의 타투 크기에 대한 상대적인 값으로 표시하였다. 이전 연구에서는 수축된 상처를 기술하는 추가 수단으로서 상처 수축비가 사용되어 왔다. 앞서 논의된 상처 수축 면적 측정 이외에도, 상처 수축비는 상처가 초기의 사각형 모양의 상처로부터 형상을 바꾼 정도를 기술한다. 상피재형성에 의해 치유된 상처는 보통 약간 대칭적으로 수축하면서, 그의 초기의 사각형 모양의 형상을 유지한다. 그러나, 크게 수축된 상처는 보통 상처 가장자리로부터 수축되어 그 결과로 상처는 별 형상을 띠게 된다. 이미지J를 사용하여 상처 봉합 및 상피형성을 측정하여 개방창, 성숙한 상피, 및 미성숙한 상피 면적을 측정하였는데, 이는 치유된 상처의 색상 및 텍스처에 의해 확인할 수 있다. 일반적으로, 개방창은 암적색이고, 광택이 났고, 미성숙한 상피는 연한 적색이고, 불투명/무광이었고 (얇은 표피 층에 기인함), 성숙한 상피는 백색/분홍색이고, 불투명/무광이었다. 상기 성분을 측정하고, 원래의 상처 크기에 대한 상대적인 개별 측정값으로서 표시하고, 이를 조합하여 시간 경과에 따른 모든 성분의 상처 치유에의 기여도를 입증하였다 (도 3).
조직학법 및 IHC:
1) H&E 염색
2) 콜라겐, 뮤신/GAG, 엘라스틴 및 성숙한 섬유에 대한 펜타크롬 염색
3) 성숙한 및 미성숙한 콜라겐에 대한 시리우스 레드 염색
4) 뮤신/GAG에 대한 알시안 블루 염색
5) 뮤신/GAG에 대한 철 콜로이드
6) 콜라겐 I형 및 콜라겐 III형에 대한 면역조직화학법
7) 호중구 침윤에 대한 면역조직화학법.
상처 치유 바이오마커 :
비치유 상처의 염증성 마커 (IL1 알파, IL1 베타 및 IP-10), 단핵구 관련 염증성 마커 (MCP-1, MIP-1 베타 및 IL-8) 및 치유된 상처의 항-염증성 마커 (IL2, IL-4 및 IL-5)를 비롯한, 치유 및 비치유 상처에 대한 바이오마커에 대하여 정량적 PCR을 수행하였다. 상기 마커는 상처 치유를 예측하는 데 있어서의 그의 성공 여부 또는 인간 환자에서의 괴사 조직 제거의 필요성에 기인하여 선택되었다. 모든 치료로부터의 유전자 발현은 정상적인 건강한 피부에 대한 상대적인 값으로 표시하였다.
바이오마커는 공개 문헌상의 데이터에 기초하여 선택되었다: 문헌 [Hawksworth, J.S. et al. Inflammatory biomarkers in combat wound healing. Ann Surg 250, 1002-1007 (2009].
단백질 분석:
수거된 조직의 ¼에 상응하는 피부 섹션으로부터 단백질을 단리시켰다.
결과
일반 관찰 결과
모든 외과적 절차는 합병증 없이 수행되었다. 비록 사각형 모양의 피부 섹션 적출 후, 피부의 일부 '새깅 (sagging)'이 관찰되기는 하였지만, 균일한 크기 및 깊이로 상처가 생성되었다. 상처 치료 생성물을 투여하는 것을 일반적으로 용이하였다. 앰니오그래프트®는 상기 생성물이 얇고, 부서지기 쉬운 성질, 및 백킹 페이퍼(backing paper)로부터 제거하기가 어려운 난점으로 인하여 적용시키는 것이 가장 어려웠다. 상기 생성물은 그 자체가 확실하게 말리지 않도록 하거나, 접히지 않도록 하는 데 4명의 일손이 필요하였는데, 이는 수회에 걸쳐 일어났다. 그래프트재킷®은 그 두께에 기인하여 투여하기는 좀 더 쉬웠지만, 상기 생성물의 크기는 달랐고, 배치 및 봉합이 어려웠다. 일렉트론스펀 패치는 두께 및 강성이 중간 정도인 경우, 3개의 "패치형" 생성물 중 투여가 가장 용이하였다. 일렉트론스펀 패치 생성물 중에서, 특히 마지막 4개의 패치를 받은 경우에 (2 라운드 동물에게 적용된 것) 유의적인 변화가 관찰되었다. 상기 패치에는 일관성이 없는 착색 부위가 있었고, 짙은 반점은 반건조된 액체와 유사하였다. 양막 히드로겔은 1명의 인원이 적용시키는 것도 용이하였고, 상처와의 어떤 접촉도 필요하지 않았다. 양막 액체를 한손으로 시린지에 의해 적용시키고, 상처 표면 위 대략 5 cm 정도 위치에서 UV 광을 유지시켰다. 예상대로, 액체는 상처 내에서 빠르게 겔을 형성하였고, 10-15초 경과 후, 전체 상처 부위를 충전시켰다. 양막 분말이 투여가 가장 용이한 생성물이었다. 상처에 걸쳐 완만하게 튜브를 탭핑하여 측정된 용량의 분말을 고르게 분포시킨 후, 1 mL의 멸균 염수를 적용시켜 분말을 습윤화시켰다. 하기 기술되는 생체내 연구 2에서는 분말을 적용 이전에 1 mL 염수 중에 현탁시킨 후, 액체로서 3마리 돼지 상처에 직접 적용시켰다. 임의의 측정되는 파라미터에 대해서는 각 전달 방법 사이에 있어 어떤 차이도 검출되지 않았다.
영상 분석:
각 시점에 (0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24 및 28일째) 디지털 사진을 촬영하고, 8개의 상처 각각에 대하여 컴파일링하였다 (도 4-9). 주석: 상처-치유 분포는 상기 표 2에 기술되어 있다. 치료 옵션은 쉬운 비교를 위해 각 동물에 대해 같은 순서로 유지된다. 각 돼지 상의 하단의 2개의 치료는 상기 돼지에 대하여 반복된 2개의 치료 옵션이다.
상처 봉합:
상처 봉합은 성공적인 상처 치유와 상관관계가 있다. 상처 봉합률이 높을수록, 치유 결과는 더욱 우수하다. 각 시점에 대해 상처 봉합을 측정하였고, 원래의 상처 부위에 대해 상대적인 값으로서 존재하는 상처 비율(%)로서 표시하였다 (도 10). 도 10의 그래프는 양막 히드로겔가 가장 잘 상처 봉합을 수행하였고; 양막 분말이 두번째로 가장 잘 수행하였으며; 비처리군, 일렉트론스펀 패치 및 앰니오그래프트®이 중간 정도이고, 그래프트재킷®이 수행능이 가장 불량하다는 것을 입증한다. 평균 상처 크기는 17.6 ㎠이었고, 치료군 사이에 또는 돼지들 사이에 유의적인 차이는 없었다. 상기 면적은 상처 절개 이후 늘어진 피부에 기인하여 타투가 새겨진 부위의 초기 면적 16 ㎠보다 약간 더 컸다. 이러한 작은 차이는 치료 시행에 어떤 영향도 주지 못했다. 상처 치료 후 즉시, 이 시점에서는 상처의 신축/늘어짐에 기인하여 비처리군, 그래프트재킷®, 앰니오그래프트® 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처의 상처 부위가 초기에는 증가하였다. 이는 상기와 같은 치료 적용이 상처 부위를 바로 안정화시키는 것은 아니라는 것을 제안한다. 그에 반해, 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처는 상처 크기에 있어 어떤 유의적인 증가도 보이지 않았다. 히드로겔은 상처 부위를 안정화시키는 역할을 할 가능성도 있지만, 양막 분말 군에서는 상기 효과에 대한 이유가 되지 못한다. 상기 군의 경우 조기 시점에 관찰된, 보다 이른 조기 시점의 과립화 개시가 상기 관찰 결과의 이유가 될 수도 있다. 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리군은 0일째 상처 부위가 일관되게 감소된 것으로 나타났고, 모든 다른 군에서는 4-7일째부터 계속해서 감소되었다. 그래프트재킷® 처리된 부위는 상처 봉합 속도가 가장 느린 것으로 나타났고, 상기 생성물은 상처 내에서 딱딱한 딱지와 유사한 구조를 형성하여 봉합을 막았다. 시간이 경과함에 따라, 상기 생성물은 분해되거나, 또는 건조되고 상처로부터 떨어지고, 연구 종료시까지 대략 50% 정도로 봉합을 촉진시켰다. 앰니오그래프트® 처리된 상처는 약간 지연된 상처 봉합 속도를 가지는 것으로 보였지만, 14일째까지는 비처리군 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처 (~50%)와 유사한 상처 봉합을 보였다. 이들 3가지 생성물은 계속해서 상처 봉합을 촉진시켜, 결과적으로는 연구 종료시 상처 부위는 대략 10% 정도였다. 양막 분말 처리된 상처는 14일째부터 계속해서 앰니오그래프트®, 비처리군 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처와 비교하였을 때, 상처 봉합이 10-15% 가속화된 상태로 상기 생성물과 비교하여 개선된 상처 봉합을 보였다. 양막 히드로겔 처리된 상처는 11일째 내지 24일째 양막 분말 처리된 상처보다 더 우수한 성능을 보였으며, 14일째 상처 부위는 25%인 것으로 나타났다. 28일째까지, 양막 분말 및 양막 히드로겔 처리군, 둘 모두 거의 100%의 상처 봉합을 보였으며, 그 다음으로 우수한 성능을 보인 생성물보다는 10% 개선된 것이고, 최소의 최고 성능 생성물에 비하여는 50% 개선된 것이었다.
상처 수축:
상처 수축은 상처 치유 효능과 상관관계가 있다. 수축률이 높을수록, 치유 결과는 더욱 불량하다. 타투 경계 내의 면적을 측정하고, 원래의 타투 면적에 대해 상대적인 면적 비율(%)로서 표시함으로써 각 시점에 대한 상처 수축을 측정하였다 (도 11). 도 11의 그래프는 비처리군 및 일렉트론스펀 패치가 가장 크게 수축되고; 양막 히드로겔 및 앰니오그래프트®가 중간 정도로 수축되고; 양막 분말이 양막 히드로겔 및 앰니오그래프트®보다 더 적게 수축되고; 그래프트재킷®이 가장 적게 수축된다는 것을 입증한다.
상처 봉합 데이터와 관련하여, 처음 7일간에 걸쳐 상처/타투 면적의 초기 증가가 관찰되었다. 이는 대략 10% 정도로 초기에 (-)의 수축률을 초래하였다. 비처리군 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처는 가장 크게 수축되었고, 4일째 내지 11일째 사이에 빠르게 수축이 일어났고, 이는 원래의 타투 면적의 대략 40%에 달하였다. 최종 시점에, 상기 생성물은 50-60% 수축을 보였다. 상기 측정 결과는 연구 전 기간 동안 걸쳐 관찰된 결과와 일치하였고, 이들 치료는 거의 모든 시점에 걸쳐 상처를 유의적으로 수축시킨 것으로 보였다.
다음 생성물 군은 양막 히드로겔 및 앰니오그래프트® 처리된 상처였는데, 이는 비처리군 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처와 유사한 경향을 보였지만, 지연된 수축 증가 및 7일째 내지 11일째 사이에는 더 짧은 단기간의 덜 신속한 수축 기간을 보였으며, 수축은 20-30%에 도달하였다. 최종 시점에, 상기 생성물은 35-45% 수축을 보였다. 양막 분말은 상기 생성물들보다 더욱 우수한 성능을 보였고, 11일째까지 대략 10% 수축, 및 28일째까지 30% 수축을 나타내었다.
그래프트재킷® 처리된 상처는 대부분의 시점에 걸쳐 최소량의 수축을 보였다. 그러나, 이는 상처 봉합 및 수축, 이 둘 모두를 방해하는, 생성물에 의해 형성된 강성의 딱지와 유사한 구조에 기인하는 것이다.
상처 수축비:
상기 현상을 측정하기 위해, 모든 시점에 걸쳐 수회에 걸쳐 상처를 측정하였다 (도 12). 상처의 좌측 가장자리에서부터 좌측의 상처 두 코너 사이의 중심점까지의 거리를 측정하고, 상기 코너 사이의 전체 거리의 비로서 표시하였다. 이 비는 상처 형상 변화량를 대략적으로 설명한다. 참조를 위해, 수축되지 않은 사각형 모양의 상처의 비는 0에 가까웠고, 크게 수축된 "별" 형상의 상처의 비는 0.2에 가까웠다. 수축 데이터를 확인한 바, 비처리군 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처의 비는 28일 동안에 걸쳐 대략 0.2까지 증가하였다. 양막 분말, 양막 히드로겔 및 앰니오그래프트® 처리된 상처 모두 더 작게 증가된 반면, 그래프트재킷® 처리된 상처만이 단독으로 수축비가 중간 정도로 증가된 것으로 나타났다.
상처 상피형성:
상처 상피형성은 성공적인 상처 치유와 상관관계가 있다. 상피형성률이 높을수록, 치유 결과는 더욱 우수하다. 색상 (성숙한 것: 백색, 미성숙한 것: 분홍색)에 의해 정의되는 성숙한 상피 및 미성숙한 상피, 및 상처 부위와 뚜렷이 다른 상피 코팅을 보이는 무광의 존재를 사용하여 모든 시점에 상피형성을 측정하였다. 도 13의 그래프는 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처가 가장 큰 양의 상피형성을 보였다는 것을 도시한 것이다. 모든 조직은 초기에 타투 선 안쪽에 형성된 절개 상처에 기인하여 어느 정도 수준의 상피형성을 보였다. 상기 초기 부위는 모든 치료 및 돼지 간에 걸쳐 일관되었다. 비처리군, 일렉트론스펀 패치 및 그래프트재킷® 처리된 상처는 모두 최소의 상처 상피형성을 보였으며, 상피형성 개시도 매우 느렸고 (14일째 ~2-3%), 연구 종료시 전체 상피형성도 낮았다 (~5-7%). 앰니오그래프트® 처리된 상처는 평균 수준의 상처 상피형성을 보였고, 초기 상피형성은 약간 느렸고 (14일째 5% ), 연구 종료시 대략 10%였다. 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처는 전체 상처 상피형성에 대하여 가장 우수한 성능을 보였고, 초기 상피형성은 신속하게 진행되어 14일째에는 대략 8-10%에 도달하였고, 연구 종료시에는 12%였다. 상기 군은 모든 시점에서 모든 다른 치료보다 유의적으로 더 우수하였다.
상처 부위, 수축 및 상피형성의 조합 분석:
상처 치유 메커니즘의 개별 성분을 분석함으로써 중요한 정보를 획득할 수 있지만, 이는 치유의 질을 정확하게 나타낸 것을 얻을 수 있는 치유 동안의 상처에 대한 전체 사진을 관찰함으로써만 이루어진다. 이를 달성하기 위해, 상처 부위 비율(%), 수축 비율(%) 및 상피형성 비율(%)로 나누어진 각 시점에서의 전체 상처 부위를 나타낸다 (도 14).
시간 경과에 따른 상처 치유를 전체적으로 기술하는 상기 3가지 측정 성분과 관련하여, 각 치료에 대한 수축 및 상피형성의 경쟁 메커니즘을 관찰할 수 있다. 각 치료를 가장 잘 치유한 것: 작은 상처 부위, 최소 수축, 및 가장 많은 상피형성에 대한 것을 기준으로 하여 순위화하였다. 가장 불량한 치유에 대한 기준은 큰 상처 부위, 최대 수축, 및 가장 적은 상피형성이었다. 도 14의 그래프는 양막 분말 및 양막 히드로겔이 다른 생성물과 비교하였을 때, 유의적으로 가장 적은 상처, 최소 수축, 및 가장 많은 상피형성을 보였다는 것을 입증한다.
이러한 데이터는, 수축이 상처 부위를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 미관손상, 흉터 형성 및 기능 상실을 일으키기 때문에, 상처 치유의 유형 및 질이 중요하다는 것을 강조하다. 이러한 이유에서, 상피재형성에 의한 상처 봉합이 가장 바람직한데, 그 이유는 그러한 상처 봉합이 피부 장벽을 신속하게 복원시키기 때문이며, 이로써, 미용상 및 기능상 최적의 결과를 얻을 수 있기 때문이다. 그래프트재킷® 처리된 상처는 최소 수축을 보였지만, 이는 또한 극소의 상피형성 또한 보였으며, 이는 지속적인 개방창 부위를 초래하였다. 이러한 이유에서, 그래프트재킷®은 시험된 생성물 중 마지막 순위에 등급하였다. 앰니오그래프트®, 일렉트론스펀 패치 및 비처리된 상처는 함께 다음으로 잘 수행한 생성물인 것으로 분류되었고, 앰니오그래프트®는 좀 더 빠른 상처 봉합 속도를 가졌으며, 이는 대략 50% 수축 및 50% 상피형성에 의해 구동된 것이었다. 일렉트론스펀 패치 및 비처리된 상처는 앰니오그래프트®과 비교하였을 때, 유사한 속도 및 정도의 상처 봉합을 보였지만, 상기 봉합 대부분은 수축에 의해 구동된 것이었다. 상기 기준을 사용하였을 때, 양막 분말 및 양막 히드로겔이 가장 우수한 성능의 생성물이었고, 상처를 가장 신속하고, 완전하게 봉합시켰으며, 이는 상피형성 증가 및 최소 수축에 의해 구동된 것이었다.
조직학적 분석
헤마톡실린 및 에오신 염색된 섹션을 사용하여 각 상처의 일반 구조 및 조성물을 평가하고, 비교하였다. 돼지 1-3으로부터의 대표적인 영상은 도 15에 제시되어 있고, 돼지 4-6으로부터의 것은 도 16에 제시되어 있다. 건강한 돼지 피부를 본 분석을 위한 대조군으로서 사용하였다. 돼지 1-3으로부터의 상처에 대한 분석 결과, 그래프트재킷®을 제외한, 대부분의 상처는 어느 정도 표피 층을 가지는 것으로 나타났다. 그래프트재킷® 처리된 상처는 일반적으로 노출된 진피를 가지거나, 또는 가변적으로 심층부의 딱지와 유사한 조직이 있는 층을 가졌다. 비처리군, 앰니오그래프트®, 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처는 일관성이 없는 층, 더 얇은 표피을 가지는 것으로 나타났고, 진피 부위로의 상피의 '손가락과 유사한' 돌출부 (망상 돌출)와 같은 주목할 만한 사항은 없었다. 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처로부터의 표피는 층, 두께, 및 망상 돌출 존재와 관련하여 건강한 피부와 유사한 것으로 보였다. 건강한 피부의 진피는 단지 최소의 무질서하고, 얇은 보라색 섬유와 함께, 연한 분홍색의 조직화된 큰 섬유로 이루어졌다. 그래프트재킷® 처리된 상처는 염증성 및 섬유성 세포 출현과 함께 다수의 작은 세포를 함유하는 것으로 보였다. 이는 상처 표면에서 두꺼운 섬유성 조직으로 이행되었다. 비처리군 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처는 조직화된 진피 섬유를 보이지 않았고, 완전하게 작은 보라색의 비조직화된 섬유로 이루어졌다. 앰니오그래프트® 처리된 상처는 진피 내에 일부 비조직화된 큰 분홍생 섬유가 존재하였지만, 상처 간에 및 또한 개별 상처 내에서도 일관성이 없었고, 일부 부위는 작은 보라색의 비조직화된 섬유가 지배적으로 나타났다. 양막 히드로겔 처리된 상처가 건강한 피부와 가장 유사한 것으로 보였으며, 단지 비조직화된 섬유가 약간 더 많았다. 양막 분말 처리된 상처는 큰 분홍색 섬유 존재하에 건강한 피부와 다소 유사한 것으로 보였지만, 상기 섬유의 조직화는 군들 사이에 일관성이 없었다.
돼지 4-6은 돼지 1-3과 매우 유사한 조직학적 외관을 가졌다. 본 분석을 통해 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처가 규칙적인 망상 돌출이 있는, 매우 성숙한 것으로 보이는 표피를 가졌다는 것을 확인하게 되었다. 일부 비처리된 상처는 일관된 표피를 가지지 않았지만, 일부 일렉트론스펀 패치 처리된 상처는 망상 돌출은 없었지만, 좀 더 두꺼운 표피 층을 보였다. 앰니오그래프트® 및 그래프트재킷® 처리된 상처는 처음 3마리의 돼지의 경우, 일관된 것으로 나타났다. 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처, 둘 모두는, 연한 분홍색의 고도로 조직화된 섬유, 및 단지 최소의 비조직화된 작은 섬유를 가지는 것으로, 건강한 피부의 것과 매우 유사한 진피를 가지는 것으로 보였다. 비처리군, 앰니오그래프트® 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처의 진피는 돼지 1-3에 대해 관찰된 것과 유사한 것으로 보였다. 전반적으로, 조직학상, 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처가 건강한 피부와 가장 유사한 것으로 보였다는 것이 명백해진다. 비처리군, 앰니오그래프트® 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처 모두 정상적인 치유로 진행되는 것으로 보였지만, 미성숙한 표피 및 비조직화된 진피를 가졌다. 그래프트재킷 처리된 상처는 염증성인 것으로 나타났고, 발생하는 표피 또는 진피에 대한 어떤 징후도 보이지 않았다.
펜타크롬 염색:
펜타크롬 염색을 수행하여 상처의 세포외 매트릭스 (ECM) 조성에 관한 개요를 수행하였다. 펜타크롬은 다중의 ECM 성분을 동시에 확인할 수 있는 염료이다. 펜타크롬 염색은 콜라겐은 황색으로, 성숙한 섬유는 적색으로, 뮤신 및 글리코사미노글리칸 (GAG)은 청색/녹색으로, 및 핵 및 탄성 섬유는 검은색으로 나타낸다. 도 17은 6개의 처리군 및 건강한 피부에 대한 대표적인 영상을 보여주는 것이다. 본 연구에서, 콜라겐 및 뮤신/GAG의 중복/인접부는 조직을 녹색으로 착색시켰다. 건강한 피부는 두꺼운 성숙한 콜라겐 섬유 (적색) 및 콜라겐 및 뮤신/GAG에 대해 양성을 띠는 황색 및 녹색 염색으로 이루어진 진피를 가졌다. 검은색 엘라스틴 또는 보라색의 염증성 또는 섬유증성 세포 침윤은 거의 관찰되지 않았다. 비처리군 및 그래프트재킷® 처리 조직은 주로 조밀하게 밀집된 핵을 보였고, 적색, 녹색, 또는 황색 염색은 거의 관찰되지 않았다. 이는 상기 부위가 침윤성 염증성 세포 및 섬유모세포로 구성된 과립 조직으로 이루어질 수 있다는 것을 제안한다. 앰니오그래프트® 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처 조직은 일부 콜라겐 및 뮤신/GAG를 보였지만, 적색으로 염색된 유섬유종/근육은 거의 보이지 않았고, 이는 정상적인 성숙한 진피 구조가 없다는 것을 시사하는 것이다. 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처는, 콜라겐, 뮤신 및 GAG로 이루어진 황색/녹색 배경으로 중간 정도 양의 두꺼운 성숙한 콜라겐 섬유 (적색)를 가지는 것으로, 건강한 피부와 매우 유사한 것으로 보였다. 이는 상기 조직이 건강한 피부와 유사한 조성을 가지지만, 성숙한 콜라겐 섬유는 약간 더 적게, 및 뮤신/GAG는 더 많이 함유한다는 것을 제안하는 것이다.
미성숙한 및 성숙한 콜라겐에 대한 시리우스 레드 염색:
시리우스 레드 염색은 편광으로 관측하였을 때의 미성숙한 콜라겐과 성숙한 콜라겐을 구별짓는다. 미성숙한 비조직화된 콜라겐 염색은 녹색으로 염색되고, 성숙한 조직화된 콜라겐은 황색/오렌지색으로 염색된다. 도 18은 6개의 처리군 및 건강한 피부에 대한 대표적인 영상을 보여주는 것이다. 건강한 피부는 녹색 및 오렌지색, 둘 모두로 강하게 염색된 것으로 보였는데, 좀 더 작은 콜라겐 섬유가 중간에 섞여 있는, 좀 더 큰 성숙한 콜라겐 섬유로 이루어진 조직화된 네트워크를 나타낸다. 그래프트재킷® 처리된 상처는 녹색 염색은 거의 나타내지 않았지만, 예외적으로 딱지 부위 내에서 관찰되었다. 반대로, 오렌지색으로 염색된 성숙한 콜라겐에 대해서는 양성으로 염색되었다. 그러나, 조직 전역에 걸쳐 배열된 작은 부위로 국재화되었다. 일렉트론스펀 패치 처리된 상처는 적지만, 여전히 관찰가능한 오렌지색으로 염색된 콜라겐을 보였다. 그러나, 일렉트론스펀 패치 군에서보다 녹색-오렌지색 비는 더 높았으며, 이는 ECM 재생 속도가 더 느리다는 것을 시사한다. 비처리군 및 앰니오그래프트® 처리군은 오렌지색 염색을 거의 나타내지 않는 정도에서부터 전혀 나타내지 않는 정도였고, 대개는 녹색으로 나타났으며, 이는 ECM 재생 속도가 더욱더 느리다는 것을 시사한다. 양막 히드로겔 처리된 상처는 오렌지색 및 녹색의 유사한 분포를 보이며, 건강한 피부와 유사한 것으로 나타났다. 양막 분말 처리된 상처는 오렌지색으로 염색된 조직화된 성숙한 콜라겐을 약간 더 적게 가지는 것으로 보였지만, 눈에 띄는 염색 강도 및 분포는 나타내지 못했다.
요약하면, 양막 히드로겔 처리된 상처 및 양막 분말 처리된 상처는 건강한 피부와 비교하였을 때, 성숙한 콜라겐 (적색) 및 미성숙한 콜라겐 (녹색)에 대하여 유사한 조직화된 염색을 보였다. 일렉트론스펀 패치 또한 미성숙한 콜라겐에 대해서는 일부 염색된 것으로 나타났지만, 조직화된 성숙한 콜라겐은 거의 나타내지 못했다. 비처리군 및 그래프트재킷®은 조직화된 콜라겐 구조에 대해 양성으로 염색되지 않았다.
뮤신 및 GAG에 대한 알시안 블루 및 철 콜로이드 염색:
알시안 블루는 뮤신 및 GAG를 청색으로 염색하고, 핵은 분홍색/적색으로 염색한다. 도 19는 6개의 처리군 및 건강한 피부에 대한 대표적인 영상을 보여주는 것이다. 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처는 건강한 피부와 비교하였을 때, 유사한 국재화 및 알시안 블루 염색 강도를 보인 반면, 그래프트재킷®은 딱지 부위 아래 강한 염색을 나타내었다. 불행하게도, 비특이 배경 염색이 상기 염색 해석을 어렵게 만들었다.
뮤신 및 GAG를 시각화하기 위한 대안적 방법으로서, 철 콜로이드 염색을 사용하였다. 철 콜로이드는 카복시화 및 황산화된 뮤신 및 GAG를 청색으로 염색하고, 세포질은 분홍색/적색으로 염색한다. 추가로, 진피 조직의 조직화를 나타내는 진피의 암적색 염색은 건강한 피부에서는 아주 선명하게 나타난다. 도 20은 6개의 처리군 및 건강한 피부에 대한 대표적인 영상을 보여주는 것이다. 그래프트재킷® 처리된 상처는 딱지에서 및 딱지 아래에서 무작위적인 방식으로 청색 염색을 보였다. 비처리군, 앰니오그래프트®, 및 일렉트론스펀 패치 처리된 조직은 청색 염색을 나타내지 않거나, 또는 최소로 확산된 청색 염색을 보였다. 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처는 건강한 피부와 비교하였을 때, 유사한 국재화 및 청색 염색 강도를 보였고 - 구체적으로, 청색 염색은 표피 바로 아래에서 관찰되었다. 양막 히드로겔 및 양막 분말 군에서는, 건강한 피부에서보다는 그 정도가 덜하지만, 유사한 암적색 염색 또한 관찰되었다. 일렉트론스펀 패치 처리군에서는 상기 적색 염색이 더 적게 관찰되었고, 비처리군, 앰니오그래프트®, 및 그래프트재킷® 처리군에서는 상기 적색 염색이 거의 관찰되지 않는 정도에서부터 전혀 관찰되지 않는 정도였다.
콜라겐 면역조직화학적 염색:
DAPI 세포 핵 대조염색을 이용하여 형광성 항체를 사용함으로써 콜라겐 I형 (적색) 및 III형 (녹색)의 면역조직화학적 염색을 수행하였다 (청색) (도 21). 6개의 처리군 및 건강한 피부 대조군으로부터의 생성된 염색된 조직 섹션은, 조직학적 염료와 조합하였을 때, 재생 조직 및 세포외 매트릭스의 질에 관한 통찰력을 제공하는, 다른 상대적 수준의 형광성 염색을 나타내었다. 형광성 영상을 포착하기 위해 사용된 카메라 노출 시점에서 (샘플 간에 일정하게 유지), 건강한 피부에서는 비록 콜라겐 I형 및 III형, 둘 모두가 존재하기는 하지만, 비교적 약하게 염색된 것으로 관찰되었다. 그래프트재킷® 처리군은 나머지 다른 군들 모두와는 눈에 띄게 다른 조직 형태를 보였다. 상기 상처에서 관찰된 과도한 딱지 형성에 기인하여, 핵 및 강한 콜라겐 III형의 비조직화된 스트리크와 함께 조밀하게 밀접된 부위로서 딱지가 관찰되었다. 딱지 아래에서는 콜라겐 III형이 거의 관찰되지 않는 정도에서부터 전혀 관찰되지 않는 정도였고, 콜라겐 I형은 소량이 관찰되었는데, 이는 다른 군과 비교하였을 때, 상기 군에서의 새로운 세포외 매트릭스 생산이 상당히 유의적으로 지연되었다는 것을 제안하는 것이다. 비처리군, 앰니오그래프트®, 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처에서, 콜라겐 III형 염색이 거의 관찰되지 않는 것과 함께, 강한 콜라겐 I형 염색이 관찰되었는데, 이는 콜라겐 I형 생산의 불균형, 및 잠재적으로는 섬유증성 조직의 생성을 제안하는 것의다. 역으로, 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처에서는, 비록 건강한 피부에서보다는 더 많지만, 이전의 3개의 섬유증성 군에서보다 더 적은 콜라겐 I형 염색이 관찰되었으며, 건강한 피부와 유사한 수준의 콜라겐 III형 염색이 관찰되었다. 이는 나머지 다른 치료보다는 양막 히드로겔 및 양막 분말 치료가 건강한 피부와 더욱 유사한 피부를 재생시킨다는 것을 제안하는 것이다.
요약하면, 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처는 약간 더 큰 I형 염색과 함께, 건강한 피부에서 관찰되는 것과 유사한 정도의 강도로 콜라겐 III형을 나타내었다. 비처리군, 앰니오그래프트®, 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처는 III형은 거의 나타내지 않으면서, 강한 I형 염색을 보였다. 그래프트재킷®은 딱지 부위에서 대개 III형을 나타내었다.
호중구 면역조직화학적 염색:
항체 및 HRP-스트렙트아비딘 염색을 사용하여 호중구의 면역조직화학적 시각화를 수행하였다. 6개의 처리군 및 건강한 피부 대조군으로부터의 생성된 염색된 조직 섹션 (도 22)은 조직 수거 시점에 존재하는 면역 반응의 수준에 관한 통찰력을 제공하는, 다른 상대적 수준의 갈색 염색을 나타내었다. 그래프트재킷® 처리된 상처는 딱지-조직 계면 아래에서 고밀도의 갈색으로 염색된 호중구를 보였다. 앰니오그래프트® 및 일렉트론스펀 패치 군은 주로 상처 표면 및/또는 적용된 처리 패치와의 계면에서, 국재화된 강한 갈색 염색 부위를 나타내었다. 추가로, 호중구는 진피 전역에 걸쳐 관찰되었다. 양막 히드로겔, 양막 분말, 및 비처리군은 건강한 피부에서도 또한 관찰되는 것과 같이, 유사한 수준으로 낮은 호중구가 존재하는 것으로 나타났다. 비특이 배경 염색이 낮은 수준으로 존재하였지만, 이는 상기 군들 간에 일관되게 나타났다. 상기 결과는 1) 치료하지 않으면 (비처리군), 호중구 면역 반응은 좀 더 빠른 시점에 발생할 수 있으며, 이로써, 8주째에는 관찰되지 못할 수 있고; 2) 양막 히드로겔 및 양막 분말은 반응을 허용하거나, 또는 이는 더욱 쉽게 재모델링되기 때문에, 면역 반응은 단축되는 반면, 앰니오그래프트®, 그래프트재킷®, 및 일렉트론스펀 패치는 그의 조성에 기인하여 또는 정상 ECM으로의 재모델링이 덜 쉽게 이루어지기 때문에, 연장된 반응을 허용하지 않는다는 것을 제안한다.
요약하면, 양막 히드로겔 처리된 상처, 양막 분말 처리된 상처 및 비처리된 상처는 건강한 피부에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 낮은 호중구가 존재하는 것으로 나타났다. 앰니오그래프트®, 및 일렉트론스펀 패치는 뚜렷하게는 상처 표면에서 국재화된 강한 염색 부위를 나타내었다. 그래프트재킷®은 기저부 딱지 부위에서 고밀도의 강하게 염색된 호중구를 나타내었다.
상처 바이오마커 분석:
상처 치유를 예측하는 데 있어서의 그의 성공 여부 또는 인간 환자에서의 괴사 조직 제거의 필요성에 기인하여 상처 바이오마커를 선택하였다. 염증성 비치유 상처에 대한 바이오마커 (IL1 알파, IL1 베타 및 IP-10), 단핵구 관련 염증성 마커 (MCP-1, MIP-1 베타 및 IL-8) 및 치유된 상처의 항-염증성 마커 (IL2, IL-4 및 IL-5)를 정량적 PCR에 의해 분석하고, 정상 피부에 대한 상대적인 값으로 표시하였다. 그래프트재킷® 처리된 상처는 염증성 비치유 상처의 바이오마커를 일관되게 높게 발현하는 것으로 나타났지만, 일렉트론스펀 패치 처리된 상처 및 비처리된 상처는 염증성 바이오마커인 IL1알파 및 IL1베타를 각각 발현하는 것으로 나타났고, 이는 염증의 존재 및 잠재적으로 지연된 치유 결과를 제안하는 것이다 (도 23). 앰니오그래프트®, 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처는 모두 건강한 피부보다 더 크게 바이오마커 발현을 나타내었지만, 다른 처리군보다는 유의적으로 더 적었다. 그래프트재킷® 처리된 상처는 다시 단핵구 관련 염증성 마커의 바이오마커를 일관되게 높게 발현하는 것으로 나타났고, 이는 상기 조직에서 침윤성 염증성 세포에 대한 관찰 결과와 일치하였다 (도 24). 비처리된 상처는, 비록 단지 최소의 경향을 띠기는 하였지만, MIP1베타 및 IL8 발현이 증가된 것으로 나타났다. 일렉트론스펀 패치, 앰니오그래프트®, 양막 분말 및 양막 히드로겔 처리된 상처는 단핵구 관련 염증성 바이오마커를 낮게 발현시키는 것으로 나타났다. 상처 치유에 대한 항-염증성 마커의 발현은 일반적으로 낮고, 가변적이지만, 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처는 IL4 및 IL5에 대하여 다른 처리군보다 더 높은 경향을 보였다 (도 25). 비록 앰니오그래프트®, 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리군에서의 IL2 바이오마커의 발현이 다른 처리군과 비교하였을 때, 약간 증가된 것으로 나타나기는 하였지만, IL2에 대해서는 군들 간에 편차는 더 적었다.
요약하면, 동물들 간에 편차가 관찰되었고, 이들 마커에 대하여 뚜렷한 경향이 있는 것으로 관찰되었다. 그래프트재킷® 처리된 상처는 영상 분석과 일관되게, 비치유 상처의 모든 마커의 발현이 증가된 것으로 나타났다. 일렉트론스펀 패치 처리된 상처는 IL1 베타 또는 IP10을 제외한, IL1 알파의 발현이 증가된 것으로 나타났지만, 비처리된 상처는 IL1알파도 IP10도 제외한, IL1베타의 발현이 증가된 것으로 나타났다. 전반적으로, 앰니오그래프트® 처리된 상처, 양막 분말 처리된 상처 및 양막 히드로겔 처리된 상처는 비치유 상처의 모든 마커를 낮게 발현하는 것으로 나타났다.
요약
치료 투여의 용이함:
수술로부터 얻은 관찰 결과에 따르면, 패치 유형 치료를 적용하는 것은 생성물의 강도 및 가요성에 의해 영향을 받았고, 강도가 더 크고, 더욱 두꺼운 그래프트재킷®은 상처 부위에 잘 맞지 않았으며, 심지어 크기 및 형상이 단지 최소한도로 다른 경우에도 그러하다는 것이 밝혀졌다. 매우 얇고, 가요성을 띠는 앰니오그래프트®는 심지어 2명의 외과의가 수행하는 경우에도 취급이 어렵고, 상처 위에 배치하기 어려웠다. 좀더 두껍고, 강도가 높은 생성물이 취급 및 적용이 쉽지만, 이러한 특성은 상처 봉합 및 상피형성을 억제시키면서, 상처 치유에는 유해한 것으로 보였다. 양막 분말이 투여하기 가장 쉬운 생성물이었으며, 미리 측정된 중량의 분말은 간단하게 상처 부위 위에 뿌린 후, 1 mL 멸균 염수로 습윤화시켰다. 상처에 적용시키기 전에 먼저 상기 부피의 염수 중에 양막 분말을 현탁화시킴으로써 상기 분말을 적용시키는 것 또한 시험하였고, 이는 치료 결과를 손상시키지 않으면서, 상기 절차를 추가로 간소화시켰다는 것을 발견하게 되었다. 본 방법은 또한 바람직할 경우, 상처 부위에 따라 용량을 증가시키는 옵션을 제공한다. 양막 히드로겔은 투여하기가 매우 간단하였으며, 생성물이 상처 부위 내에서 겔화되는 데 대략 10-15초 정도 소요되었다. 상기 생성물은 UV 광 사용을 필요로 하였지만, 현재 상기 생성물의 개발은 이러한 요구 사항을 삭제하였다. UV 광을 삭제함에 따라, 양막 히드로겔 적용이 가장 용이하다.
상처 치유의 질:
상처 봉합, 수축 및 상피형성 분석 결과, 양막 히드로겔 및 양막 분말이 상처 봉합 및 상피형성에서 우수하였고, 수축을 방지하는 데 있어서 최상으로 수행하는 것들 중 하나라는 것이 입증되었다. 상처 치유에 대한 전반적인 분석을 수행하여 상처 치유의 메커니즘을 적절히 포함시키는 것이 중요하다. 양막 히드로겔 및 양막 분말은 상처 상피재형성을 유의적으로 가속화시켜 전체 상처 봉합 속도 및 정도를 가속화시켰다. 이는 상기 생성물을 사용하여 재생된 상처는 더 빠르게 치유될 뿐만 아니라, 성숙하고, 건강한 표피 층을 포함하여 치유될 것이며, 흉터 형성 및 수축은 더 적을 것이라는 것을 제안한다. 내인성 상처 치유 능력이 상당한 건강한 피부 모델에서 본 연구를 수행하였고, 상기 효과는 상피 성장 잠재능을 지연 또는 억제시킨 상처에서는 확대될 가능성이 있다. 흥미롭게도, 앰니오그래프트®는 그 다음으로 가장 우수한 성능을 보인 생성물이었고, 그 다음으로는 나머지 다른 두 양막 생성물 순이었다. 이는 상기 치료의 재생 잠재능은 원래의 양막 출발 물질과 관련이 있고, 히드로겔 및 분말을 제조하는 데 소요되는 프로세싱 단계는 상기 특성을 저하시키기보다는 치료학적 인자의 이용가능성/방출을 촉진시킨다는 것을 제안한다. 이는 상처에서 히드로겔 및 분말의 방출 프로파일과 관련이 있을 수 있으며, 양막의 천연 분해 프로파일과 비교해 볼 때, 상처 치유에는 더욱 유익할 수 있다. 영상 분석에 대하여 측정된 전반적인 모든 관찰 결과에 비추어 볼 때, 일렉트론스펀 패치는 비처리된 상처와 거의 동일한 성능을 보였고, 이는 상기 생성물이 상처 봉합, 수축 또는 상피형성에 대해서 유익한 효과도, 유해한 효과도 미치지 않는다는 것을 제안한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 두껍고, 강성인 그래프트재킷® 패치는 측정된 모든 관찰 결과에 있어서 불량한 성능을 보였고, 상처 봉합, 수축 및 상피형성을 억제시키는 것으로 나타났다. 이는 생성물의 분해 속도와 천연 상처 봉합 속도 사이의 불일치하는 것에 기인할 가능성이 있다. 이는 임상적으로 관련된 타임라인에 걸쳐 균일하게 지지하고, 재생 상처로 통합시키기 위해서는 상처 치유 생성물이 중요하다는 것을 강조한다. 예컨대, 겔과 같이, 상처 환경에 부합되도록 변형될 수 있는 생성물이 상처를 치료하기 어렵고, 다양한 봉합 속도를 크게 가속화시킬 것이다.
피부 질:
진피 관찰 결과, 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처는 큰 조직화된 콜라겐 섬유로 이루어진, 건강한 피부와 유사한 진피를 가졌다는 것으로 나타났다. 이는 진피가 기능적 및 기계적 특성이 건강한 피부와 유사한 상기 군에서 성숙화되었다는 것을 제안하였다. 상처 치유 동안 표피 층이 증가되었다는 관찰 결과는 조직의 조직학적 분석에 의해 확인하였다. 조기 시점에서는 조직 섹션 분석을 수행하지 않았지만, 진피 돌출부와 함께 두꺼운 성숙한 표피가 존재하는 것은 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리군에서 상피형성이 가속화되었다는 관찰 결과를 뒷받침한다. 다른 치료를 통해 표피 층이 생성되었지만, 이는 더 얇은 것으로 보였고, 상기의 진피 돌출부는 없었다. 이는 상기 조직 중의 표피는 덜 성숙한 상태이며, 아마도 추후 치유 기간 동안에 발생될 것이라고 제안된다. 상처 ECM의 질은 상처 치유에서 장기간의 성공을 거두는 데 있어서 매우 중요하다. ECM 조성은 상처 치유 특성 전반에 걸쳐 중요한 영향을 미친다. 정상적인 건강한 ECM은 정상적인 세포 및 기계적 특성을 촉진시키고, 비정상적인 ECM 조성은 흉터 형성, 수축 및 기능 상실을 유발한다. 이러한 이유에서, 상기 생성물에 대한 ECM의 조성물 및 조직에 대한 조직학적 성질에 관한 광범위한 특징 규명을 수행하였다. 조직학적 염색을 통해 초기 관찰 결과를 확인하였는데, 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처는, 더 소량의 미성숙한 콜라겐이 서로 얽혀있는 두꺼운 성숙한 콜라겐 섬유, 및 성숙한 피부와 일관된 국재화 및 염색 강도를 보이는 뮤신/GAG으로 이루어진, 진피 ECM 조성을 가지는 것으로 나타났다. IHC 콜라겐 염색에서, 다른 군과 비교하였을 때, 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리군에서는 더 소량의 I형 콜라겐이 관찰되었다. 이는, 전형적으로는 비조직화된 것인, 흉터와 유사한 섬유증성 콜라겐이 더 적다는 것을 시사하는 것일 수 있다. 재생 조직에서 비조직화된 콜라겐 I형 증착 속도를 저속화시키는 것이 조직화된 성숙한 콜라겐 섬유 형성을 저속화시킬 수 있지만, 더 많이 형성할 수 있고, 그의 조직은 실제로 섬유증성이 더 적은 것으로 보인다. 추가로, 다른 군과 비교하였을 때, 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리군에서 뮤신/GAG의 철 콜로이드 염색이 약간 증가한 것이 관찰되었다. 이는 추가로, 비조직화된 섬유증성 콜라겐 형성을 막음으로써, 성숙한 콜라겐 섬유 뿐만 아니라, 다른 ECM 성분, 예컨대, 히알루론산, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 및 건강한 매트릭스 및 조직에 중요한 다른 GAG/프로테오글리칸을 형성할 수 있다는 것을 제안하는 것일 수 있다. 다른 한편으로는, 비처리군, 앰니오그래프트®, 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처는 비조직화된 및 미성숙한 콜라겐, 및 확산된 뮤신/GAG로 이루어진 진피 ECM 조성을 보였다. 이는 콜라겐 III형 염색이 거의 동반되지 않는, 강한 콜라겐 I형 염색 관찰 결과에 의해 뒷받침되었으며, 이는 상기 조직에서 섬유증성 조직의 생성이 진행되고 있으며, 이는 수축 및 흉터 형성을 유도할 수 있다는 것을 제안하는 것이다.
면역 반응:
면역 기능이 손상된 동물에서 수행된 이전 연구에서와 같이, 인간 조직 유래의 물질이 상기 면역 적격 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는지 여부를 평가하는 것이 중요하였다. 흥미롭게도, 앰니오그래프트® 및 일렉트론스펀 패치 처리된 상처에서 염증성 세포 침윤 증가가 관찰되었다. 이는 앰니오그래프트®에서는 무손상 인간 세포가 존재하는 것에 기인할 수 있지만, 일렉트론스펀 패치의 조성은 알려지지 않은 바, 상기 군에서의 염증 원인은 비공지 상태이다. 예상대로, 비처리된 상처는 단지 건강한 피부와 유사한 정도의 낮은 수준으로 염증성 세포 침윤을 보였다. 그래프트재킷® 처리된 상처는 딱지 부위 내에서 및 기저 조직에서, 둘 모두에서 주된 염증성 반응을 나타내었다. 상기 반응이 인간 환자에서의 동종이계 적용에서도 또한 관찰되었는지 여부는 비공지 상태이다. 그러나, 이는 자극성 항원인 상기 생성물의 존재를 제안한다. 중요하게는, 조직 수거 시점에 양막 히드로겔 또는 양막 분말에서의 염증성 세포 침윤 증가는 관찰되지 않았고, 이는 상기 생성물이 다른 치료와 같은 정도로 이종계 환경에서 유해한 면역 반응을 자극하지 않는다는 것을 제안하는 것이다. 이는 동종이계 환경에서의 상기 생성물의 적용으로는 최소의 위험이 따른다는 것을 뒷받침한다. 염증성 바이오마커는 각종의 상처 치유 치료 전략법의 성공 또는 실패를 예측하는 데 다소 성공을 거두었다. 인간 상처에서 상처 치유 결과를 예측할 수 있는 그의 능력에 기초하여 9개의 바이오마커로 이루어진 패널을 선택하였다. 3가지 카테고리의 바이오마커 모두에 대해 강력한 경향이 관찰되었는데, 치유가 지연된 그래프트재킷®은 비치유 상처의 염증성 바이오마커를 높게 발현하는 것으로 나타났고, 치유 상처의 바이오마커는 낮게 발현하는 것으로 나타났다. 양막 히드로겔 및 양막 분말 처리된 상처를 분석하였을 때, 반대되는 결과가 관찰되었는데, 비치유 상처의 염증성 바이오마커는 낮게 발현하는 것으로 나타났고, 치유 상처의 바이오마커 발현은 증가된 것으로 나타났다. 이는 상기 모델에서 상처 치유를 예측하기 위해 상기 바이오마커를 사용하는 것을 뒷받침한다. 그러나, 상기 모델에서의 바이오마커 사용에 있어 몇가지 한계가 있었다. 첫째, 상기 건강한 동물 모델의 상처 치유에서, 대부분의 다른 치료는, 비록 다양한 수준의 효능으로 이루어지기는 하였지만, 궁극적으로는 완전하게 상처를 봉합한다. 진성의 비치유 상처와 비교하였을 때, 비록 관찰된 경향이 영상 및 조직학적 분석과 일치하기는 하였지만, 상기 치료 옵션 사이의 발현 수준의 차이는 더 작을 가능성이 있었다. 둘째, 조직을 본 연구의 최종 시점에 수집하였으며, 잠재적으로는 염증이 최고인 시점 이후에 수행하였다. 이는 본 실험에서 여러 마커에 대해 관찰된 전반적으로 낮은 발현 수준의 원인이 될 수 있다.
결론적으로, 양막 히드로겔 및 양막 분말이 돼지 모델에서 전층 상처에 투여하는 데 있어서는 가장 용이한 생성물이었다. 상기 생성물을 적용시킨 결과, 면역 거부 없이, 주로 새로운 상피형성에 의해 구동된, 가장 신속한 속도의 상처 봉합이 이루어졌다. 이러한 관찰 결과는, 상기 치료가 이들 전층 상처의 신속한 치유를 촉진시킴으로써, 건강한 피부와 유사한 조성을 가지는 성숙한 표피 및 진피를 형성한다는 것을 입증한, 조직학적 및 바이오마커 분석에 의해 뒷받침되었다.
생체내 연구 2
PEGDMal과 가교 결합된 새로운 히드로겔을 이용한 생체내 연구
본 연구의 목적은, 폴리에틸렌 (글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA) 가교제를 말레이미드 관능화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEGDMal)로 대체하는 것이 기본 히드로겔 특성을 변경시켰는지 여부를 평가하는 것이었다. 본 생체내 연구에서는 어느 생성물과 가교 결합되었든 그 히드로겔 사이에서는 어떤 유의적인 차이도 없는 것으로 입증되었다.
PEGDMal은 히드로겔의 티올 기와 말레이미드 사이에 안정적인 결합을 형성할 수 있는 반응성 PEG 유도체이다. 말레이미드-티올 반응은 종래의 아크릴레이트-티올 반응과 비교하였을 때, 가교 결합을 가속화시켜 가교 결합이 거의 히드로겔 성분 혼합, 그 즉시 이루어질 수 있게 하며, 따라서, 히알루로닉 히드로겔을 가교 결합시키기 위한 UV 광의 요구는 삭제된다.
한 시린지 피스톤에서는 PEGDMal 가교제를 양막 분말/용액 및 염수와 조합하고, 나머지 다른 한 피스톤에서는 HA 및 젤라틴을 조합함으로써 새로운 히드로겔 제제 또한 양막 분말 또는 가용화된 양막과 조합시킬 수 있다. 추가로, 개별 성분을 가교 결합 없이, 이중 챔버 시린지 내에서 무기한 냉동 보관할 수 있다. 해동 후, 작업 시간은, 티올-티올 디술피드 결합이 티올화된 HA 및 젤라틴 용액 내에서 형성되기 시작하기 전에, 최대 대략 8시간 정도인 것으로 나타났다.
동물 및 상처:
특정 병원체 부재 (SPF) 요크셔 돼지 3마리를 구입하고, 필요한 2주 기간 동안 순응시켰다. 연구 출발 시점에 돼지 체중은 대략 40-50 kg인 것으로 측정되었다. 본 연구는 웨이크 포레스트 대학교 실험 동물 운영 위원회에 의해 검토되었고, 그로부터 승인을 받았다 (돼지에서의 상처 치유를 위한 A13-015-양막 생성물). 모든 훈련, 상처 생성 및 붕대 감는 것은 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하면, 흉부 및 요추 부위를 따라 등 중앙부에서 4 x 4 cm로 전층 피부를 적출하여 8개의 피부 상처 부위를 생성하였다. 피부밑 근육층까지 상처 가장자리를 따라 절개하고, 덮여 있는 피부를 절제하였다.
상처 치료:
상처 부위를 상처 표면에 직접 적용된 88 mg 양막 분말로, 8 mL의 변형된 히알루론난 히드로겔 담체로만, 히드로겔 아래 적층된 양막 분말로, 또는 히드로겔과 함께 미리 혼합된 양막 분말로 처리하였다. 추가 군은 어떤 처리도 받지 못했다. 각 양막/히드로겔 제제로 처리된 상처에 대한 영상은 도 30 및 31에 제시되어 있다. 상처 위치 차이에 대해 대조하기 위해 5가지 실험 옵션을 8개의 피부 결함부 상에 분포시켰다. 실험 라운드를 28일 동안 진행하였고, 그동안 상처를 1) 상처 크기, 상피재형성, 및 봉합에 관한 기록, 및 2) 세척, 및 붕대 감기 재실행에 대해 매주 2회에 걸쳐 검사하였다.
히드로겔 제조
본 생체내 연구에서 사용되는 히드로겔 제조는 본원 생체내 연구 1에 기술된 것과 동일한 방법을 따라 진행되었으며, 단, 예외적으로, 가교제로서 PEGDMal을 사용하였다. HA:젤라틴:가교제 (PEGDMal)의 최종 농도는 생체내 연구 1에서의 HA:젤라틴:가교제 (PEGDA)와 동일하되, 단, 상기의 출발 농도 및 부피는, 증착을 위해 시린지 팁을 혼합하면서, 이중 시린지 내로 배치될 수 있는 2개의 동일 부피의 시약을 생성할 수 있도록 하기 위해 변경시켰다 (도 27). 14일 동안에 걸쳐 누적 단백질 방출량 및 겔 종창을 측정하였다 (도 28 및 도 29). 어느 생성물과 가교 결합되었든 그 히드로겔 사이에서는 어떤 유의적인 차이도 관찰되지 않았다.
군:
1. 비처리군
2. 히드로겔
3. 양막 분말
4. 양막 분말 + 히드로겔 (히드로겔 아래 적층된 분말)
5. 양막 히드로겔 중 분말 (적용 전 혼합).
Figure 112017042427607-pct00003
연구 분석:
치료 후 28일째, 연구를 종료하고, 상처 부위를 수거하였다. 상처를 ½씩 2개로 분할하였는데: 하나는 조직학법 및 면역조직화학법을 위한 것이고, 하나는 기계적 검사를 위한 것이었다. 기계적 검사를 수행한 후, 상기 조직을 다시 분할하고, 상처 치유 바이오마커의 PCR 분석 및 단백질 검정을 위한 잠재적 사용을 위해 보관하였다.
영상 분석:
소프트웨어 이미지J를 사용하여 타투가 새겨진 사각형 표시부 안쪽 면적을 측정함으로써 각 시점에 수축을 측정하고, 원래의 타투 크기에 대한 상대적인 값으로 표시하였다. 이전 연구에서는 수축된 상처를 기술하는 추가 수단으로서 상처 수축비가 사용되어 왔다. 상처 수축비는 상처가 초기의 사각형 모양의 상처로부터 형상을 바꾼 정도를 기술한다. 상피재형성에 의해 치유된 상처는 보통 약간 대칭적으로 수축하면서, 그의 초기의 사각형 모양의 형상을 유지한다. 크게 수축된 상처는 보통 상처 가장자리로부터 수축되어 그 결과로 상처는 별 형상을 띠게 된다. 이미지J를 사용하여 상처 봉합 및 상피형성을 측정하여 개방창, 성숙한 상피, 및 미성숙한 상피 면적을 측정하였는데, 이는 치유된 상처의 색상 및 텍스처에 의해 확인할 수 있다. 일반적으로, 개방창은 암적색이고, 광택이 났고, 미성숙한 상피는 연한 적색이고, 불투명/무광이었고 (얇은 표피 층에 기인함), 성숙한 상피는 백색/분홍색이고, 불투명/무광이었다. 상기 성분을 측정하고, 원래의 상처 크기에 대한 상대적인 개별 측정값으로서 표시하고, 이를 조합하여 시간 경과에 따른 모든 성분의 상처 치유에의 기여도를 입증하였다 (도 38).
조직학법 및 IHC:
1) H&E 염색
2) 콜라겐, 뮤신/GAG, 엘라스틴 및 성숙한 섬유에 대한 펜타크롬 염색
3) 성숙한 및 미성숙한 콜라겐에 대한 시리우스 레드 염색.
기계적 검사:
재생된 피부 상처의 기계적 특성을 분석하기 위해, 안락시에 절개된 각 상처½을 인스트론(Instron) 기계적 검사 장치를 사용하여 압축 시험에 의해 즉시 평가하였다. 샘플은 상처 가장 바깥쪽 가장자리에서부터 상처 중앙부까지로 이루어졌으며, 압축 장치는 도 44에 도시된 바와 같이 상기 경로를 따라 배향되었다. 각 샘플에 5 mm/분의 속도로 압축을 가하였고, 그동안 인스트론 장치에 첨부된 블루힐 소프트웨어 패키지(Bluehill Software package)를 사용하여 하중, 응력, 및 변형을 측정하고, 기록하였다.
데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (여기서, 모든 하류 분석이 수행되었다)에 입력하여 각 샘플에 대해 응력-변형 곡선을 컴파일링하였다. 일반적으로, 연조직은 완벽하게 탄성을 띠지 않는 바, 이 경우에는 비선형 응력-변형 곡선을 얻었다. 따라서, 대표적인 응력-변형 곡선은 도 45에 도시된 것과 유사하였다. 상기 곡선을 통해 하기 데이터를 얻었다 (이는 또한 도 45에도 도시되어 있다):
· 물질이 파괴(fail)된 최종 강도에 상응하는 것인 압축 강도. 이는 적색 화살표로 표시되어 있다.
· 곡선 초반에는 거의 선형부가 존재하는데, 이는 물질의 탄성 도메인을 나타내는 것이다. 상기 도메인에서, 물질을 신장되지만, 가해진 힘이 제거되면, 리바운드할 수 있는 능력을 가진다. 상기 선형부의 기울기는 압축 E에 대한 영률을 제공한다. 이는 녹색 선으로 표시되어 있다.
· 청색 화살표로 표시된, 탄성 도메인 종결부, 또는 초기의 선형부는 항복점이다. 상기 지점 위에서는 물질에 대해 손상이 가해지고, 이는 가소성 방식으로 작용하며, 그의 원 상태로는 돌아가지 않을 것이다.
결과
일반 관찰 결과
모든 외과적 절차는 합병증 없이 수행되었다. 균일한 크기 및 깊이로 상처가 생성되었다. 사각형 모양의 피부 섹션 적출 후, 피부의 일부 '새깅'이 관찰되었다. 상처에 걸쳐 완만하게 튜브를 탭핑하여 양막 분말을 고르게 분포시킨 후, 1 mL의 멸균 염수를 적용시켜 분말을 습윤화시켰다. 대안적으로, 먼저 염수와 혼합하여 분말을 적용시킬 수 있었다. 임의의 측정되는 파라미터에 대해서는 각 전달 방법 사이에 있어 어떤 차이도 없다는 것이 이전 연구에서 밝혀졌다. 새로운 히드로겔 제제를 수술 전 오전에 멸균 조건하에서 제조하고, 얼음상에 놓은 상태로 수술실로 수송하였다. 각 히드로겔 치료는 투여하기가 매우 용이하였는데, 단 1명의 일손만이 필요하였고, 그 결과, 상처 내에서 거의 바로 겔이 형성되었다. 드립 또는 물질 손실은 발생하지 않았다. 히드로겔 성분 중 양막 분말의 사전 혼합 및 이중 챔버 시린지를 통한 전달은 수행하기 쉬웠다. 비록 분말이 전달되는 농도에서 100% 가용성인 것은 아니지만, 히드로겔 치료에서 혼합된 분말은 생성물의 손실 없이 용이하게 전달되었다.
영상 분석:
각 시점에 (0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24 및 28일째) 디지털 사진을 촬영하고, 8개의 상처 각각에 대하여 컴파일링하였다 (도 32, 도 33, 및 도 34). 주석: 상처-치료 분포는 상기 표 3에 기술되어 있다. 치료 옵션은 쉬운 비교를 위해 각 동물에 대해 같은 순서로 유지된다. 각 돼지 상의 하단의 3개의 치료는 상기 돼지에 대하여 반복된 3개의 치료 옵션이다.
상처 봉합:
상처 봉합은 성공적인 상처 치유와 상관관계가 있다. 상처 봉합률이 높을수록, 치유 결과는 더욱 우수하다. 각 시점에 대해 상처 봉합을 측정하였고, 원래의 상처 부위에 대해 상대적인 값으로서 존재하는 상처 비율(%)로서 표시하였다 (도 35). 평균 상처 크기는 17.5 ㎠이었고, 치료군 사이에 또는 돼지들 사이에 유의적인 차이는 없었다. 상처 치료 후 즉시, 이 시점에서는 상처의 신축/늘어짐에 기인하여 양막 분말 처리된 상처 이외의 다른 모든 상처에 대해서는 상처 부위가 초기에는 증가하였다. 이는 양막 분말을 적용시키는 것이 상처 부위를 즉시 안정화시키는 데 도움이 된다는 것을 제안한다. 비처리군 및 히드로겔 처리된 상처가 조기 시점에 상처 크기가 가장 크게 확장된 것으로 나타났다. 양막 분말 처리군은 보다 빠른 이른 시점에 더욱 뚜렷한 과립화 개시를 나타내었다. 이는 주로 4일째 내지 11일째에 발생하였고, 양막 분말을 함유하는 모든 치료 제제에서 일어났다. 모든 군에서 7일째 내지 14일째 사이에 상처 부위가 신속하게 감소된 것으로 나타났고, 이 기간 동안 모든 군은 유사한 방식으로 성능을 발휘하였다. 그러나, 14일째 내지 28일째 사이에, 3개의 양막 분말 처리군은 가속화된 상처 봉합을 나타내었고, 24일까지 봉합이 거의 100% 이루어졌다. 이 시점에, 비처리군 및 히드로겔 처리된 상처는 여전히 대략 15-20%의 상처 부위를 보였다. 이러한 차이는 14일 후에는 모든 시점에서 관찰되었다. 본원의 두 생체내 연구 사이의 결과를 비교하기 위하여, 각 연구 (비처리군 및 양막 분말)로부터의 복제 군을 플롯팅하고, 비교하였다 (도 48). 본 비교 결과, 비록 상처 확장 및 수축 시점에 있어서 약간의 미세한 차이가 관찰되기는 하였지만, 상처 봉합 경향 및 속도는 분말 적용시 개선된 것과 같이, 매우 유사한 것으로 나타났다.
상처 수축:
상처 수축은 상처 치유 효능과 상관관계가 있다. 수축률이 높을수록, 치유 결과는 더욱 불량하다. 타투 경계 내의 면적을 측정하고, 원래의 타투 면적에 대해 상대적인 면적 비율(%)로서 표시함으로써 각 시점에 대한 상처 수축을 측정하였다 (도 36). 상처 봉합 데이터와 관련하여, 처음 7일간에 걸쳐 상처/타투 면적의 초기 증가가 관찰되었다. 이는 대략 20% 정도로 초기에 (-)의 수축률을 초래하였다. 비처리군 및 히드로겔 처리된 상처는 가장 크게 수축되었고, 7일째 내지 14일째 사이에 빠르게 수축이 일어났고, 이는 원래의 타투 면적의 대략 50%에 달하였다. 최종 시점에, 상기 생성물은 60% 수축을 보였다. 양막 분말, 분말 + 겔 및 겔 중 분말은 최소로 수축되었고, 분말 및 분말 + 겔이 가장 우수한 성능을 보였다. 상기 생성물은 지연된 수축 증가 및 7일째 내지 18일째 사이에는 더 짧은 단기간의 덜 신속한 수축 기간을 보였으며, 수축은 대략 30%에 도달하였다. 최종 시점에, 상기 생성물은 35% 수축을 보였다.
상처 수축비:
상기 현상을 측정하기 위해, 모든 시점에 걸쳐 수회에 걸쳐 상처를 측정하였다 (도 37). 상처의 좌측 가장자리에서부터 좌측의 상처 두 코너 사이의 중심점까지의 거리를 측정하고, 상기 코너 사이의 전체 거리의 비로서 표시하였다. 이 비는 상처 형상 변화량를 대략적으로 설명한다. 수축되지 않은 사각형 모양의 상처의 비는 0에 가까웠고, 크게 수축된 "별" 형상의 상처의 비는 0.2에 가까웠다. 수축 데이터를 확인한 바, 비처리군 및 히드로겔 처리된 상처의 비는 28일 동안에 걸쳐 대략 0.15까지 증가하였다. 모든 양막 분말 처리군은 연구 기간 동안에 걸쳐 비를 0.1 미만으로 유지시키면서, 그보다 더 적은 정도로 증가되었다.
상처 상피형성:
상처 상피형성은 성공적인 상처 치유와 상관관계가 있다. 상피형성률이 높을수록, 상처 치유 결과는 더욱 우수하다. 상처 부위와 뚜렷이 다른 상피 코팅을 보이는 무광의 존재에 의해 모든 시점에 상피형성을 측정하였다 (도 38). 상피형성은 각 시점에 상피로 피복된 원래의 상처 부위의 비율로서 기술된다. 그러므로, 남아있는 상처, 수축 및 상피형성의 비율은 대략 100%가 되어야 한다. 모든 조직은 초기에 타투 선 안쪽에 형성된 절개 상처에 기인하여 어느 정도 수준의 상피형성을 보였다. 상기 초기 부위는 타투 안쪽 면적의 대략 18-20% 정도였고, 모든 치료 및 돼지 간에 걸쳐 일관되었다. 비처리군, 및 히드로겔 처리된 상처는 최소의 상처 상피형성을 보였으며, 상피형성 개시도 매우 느렸고 (14-18일째까지 0% 증가), 연구 종료시 전체 상피형성도 낮았다 (~25-30%). 양막 분말 및 분말 + 겔 처리된 상처가 전체 상처 상피형성에 대하여 가장 우수한 성능을 보였고, 초기 상피형성은 신속하게 진행되어 14일째까지 대략 45%에 도달하였고, 연구 종료시에는 거의 70%였다. 히드로겔 중 양막은 다른 두 양막 분말 처리군과 비교하였을 때, 약간 더 적은 상피형성을 보였지만, 비처리군 및 히드로겔 군보다는 여전히 유의적으로 우 우수하였다. 상처 상피형성 면적을 수축된 타투 경계부 면적으로 나누어 상처 상피형성을 또한 수축된 상처 부위 대비로 분석하였다 (도 39). 이는 수축 경계부 내의 상처 조성에 관한 정보를 제공하며, 상처 봉합이 상피형성에 의해 영향을 받는다는 것을 나타낸다.
상처 부위, 수축 및 상피형성의 조합 분석:
상처 치유 메커니즘의 개별 성분을 분석함으로써 중요한 정보를 획득할 수 있지만, 이는 치유의 질을 정확하게 나타낸 것을 얻을 수 있는 치유 동안의 상처에 대한 전체 사진을 관찰함으로써만 이루어진다. 이를 달성하기 위해, 상처 부위 비율(%), 수축 비율(%) 및 상피형성 비율(%)로 나누어진 각 시점에서의 전체 상처 부위를 나타낸다 (도 40). 시간 경과에 따른 상처 치유를 전체적으로 기술하는 상기 3가지 측정 성분과 관련하여, 각 치료에 대한 수축 및 상피형성의 경쟁 메커니즘을 관찰할 수 있다. 각 치료를 가장 잘 치유한 것: 작은 상처 부위, 최소 수축, 및 가장 많은 상피형성에 대한 것을 기준으로 하여 순위화하였다. 가장 불량한 치유에 대한 기준은 큰 상처 부위, 최대 수축, 및 가장 적은 상피형성이었다. 상기 기준을 사용하였을 때, 3가지 양막 분말 처리군 모두 가장 우수한 성능의 생성물이었고, 상처를 가장 신속하고, 완전하게 봉합시켰으며, 이는 상피형성 증가 및 최소 수축에 의해 구동된 것이었다. 상기 군에서, 수축은 상처 봉합의 대략 30%를 차지하였고, 70%는 연구 종료시까지 상피형성에 의해 구동되었다. 비처리군 및 히드로겔 처리군은 가장 불량한 성능을 보였는데, 60-70% 수축, 20-30% 상피형성이고, 연구 종료시까지 10%의 개방창이 남아있었다. 이러한 데이터는, 수축이 상처 부위를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 미관손상, 흉터 형성 및 기능 상실을 일으키기 때문에, 상처 치유의 유형 및 질이 중요하다는 것을 강조하다. 이러한 이유에서, 상피재형성에 의한 상처 봉합이 가장 바람직한데, 그 이유는 그러한 상처 봉합이 피부 장벽을 신속하게 복원시키기 때문이며, 이로써, 미용상 및 기능상 최적의 결과를 얻을 수 있기 때문이다.
조직학적 분석
헤마톡실린 및 에오신 염색된 섹션을 사용하여 각 상처의 일반 구조 및 조성물을 평가하고, 비교하였다. 돼지 7-9로부터의 대표적인 영상은 도 41에 제시되어 있다. 건강한 돼지 피부를 본 분석을 위한 대조군으로서 사용하였다. 돼지 7-9로부터의 상처에 대한 분석 결과, 양막 분말, 양막 + 겔 및 겔 중 양막 처리된 상처로부터의 표피는 표피 층, 두께, 및 망상 돌출 존재와 관련하여 건강한 피부와 유사한 것으로 보였다고 나타났다. 비처리군 및 히드로겔 처리된 상처의 표피는 항상 존재하는 것은 아니었지만, 존재할 경우, 얇고, 미성숙하며, 진피와의 뚜렷한 경계도 없고, 망상 돌출도 존재하지 않았다. 건강한 피부의 진피는 단지 최소의 무질서하고, 얇은 보라색 섬유와 함께, 연한 분홍색의 조직화된 큰 섬유로 이루어졌다. 양막 분말, 양막 + 겔 및 겔 중 양막 처리된 상처는, 더 작은 섬유와 서로 얽혀있는 큰 조직화된 진피 섬유를 포함하는 유사한 조성으로, 건강한 피부와 유사한 것으로 나타났다. 비처리군 및 히드로겔 처리된 상처는 작고 짙은 섬유 및 과형성된 세포로 이루어진 조밀한 네트워크를 나타내었다. 전반적으로, 모든 양막 분말 처리군은 표피 및 진피, 둘 모두와 관련하여 건강한 피부와 가타 유사한 것으로 나타났다.
펜타크롬 염색:
펜타크롬 염색을 수행하여 상처의 세포외 매트릭스 (ECM) 조성에 관한 개요를 수행하였다. 펜타크롬은 다중의 ECM 성분을 동시에 확인할 수 있는 염료이다. 펜타크롬 염색은 콜라겐은 황색으로, 성숙한 섬유는 적색으로, 뮤신 및 글리코사미노글리칸 (GAG)은 청색/녹색으로, 및 핵 및 탄성 섬유는 검은색으로 나타낸다. 도 42는 5개의 처리군 및 건강한 피부에 대한 대표적인 영상을 보여주는 것이다. 건강한 피부는 두꺼운 성숙한 콜라겐 섬유 (적색) 및 콜라겐 및 뮤신/GAG에 대해 양성을 띠는 황색 및 녹색 염색으로 이루어진 진피를 가졌다. 일부 검은색 염색 또한 진피 상부에서 관찰되었다. 양막 분말, 양막 + 겔 및 겔 중 양막 처리된 상처는, 콜라겐, 뮤신 및 GAG로 이루어진 황색/녹색 배경으로 중간 정도 양의 두꺼운 성숙한 콜라겐 섬유 (적색)를 가지는 것으로, 건강한 피부와 매우 유사한 것으로 보였다. 엘라스틴 섬유 또한 모든 양막 분말 처리군에서 다양한 정도로 관찰되었다. 비처리된 상처는, GAG/뮤신 염색 (청색)과 함께, 주로 미성숙한 콜라겐 섬유 (황색)였다. 성숙한 콜라겐 염색은 거의 관찰되지 않았다. 히드로겔 처리된 상처는 성숙한 콜라겐에 대해 일부 염색을 보였지만, 이는 뚜렷하지 않고, 섬유는 여전히 작고, 비조직화된 것으로 보였다. 비처리군 및 히드로겔 처리된 상처, 둘 모두 세포 과형성을 보였다.
미성숙한 및 성숙한 콜라겐에 대한 시리우스 레드 염색:
시리우스 레드 염색은 편광으로 관측하였을 때의 미성숙한 콜라겐과 성숙한 콜라겐을 구별짓는다. 미성숙한 비조직화된 콜라겐 염색은 녹색으로 염색되고, 성숙한 조직화된 콜라겐은 황색/오렌지색으로 염색된다. 도 43은 5개의 처리군 및 건강한 피부에 대한 대표적인 영상을 보여주는 것이다. 건강한 피부는 녹색 및 오렌지색, 둘 모두로 강하게 염색된 것으로 보였는데, 좀 더 작은 콜라겐 섬유가 중간에 섞여 있는, 좀 더 큰 성숙한 콜라겐 섬유로 이루어진 조직화된 네트워크를 나타낸다. 모든 양막 분말 처리군은 진피 전역에 걸쳐 오렌지색 및 녹색의 유사한 분포를 보이며, 건강한 피부와 유사한 것으로 나타났다. 비처리군 및 히드로겔 처리군은 최소의 콜라겐 염색을 보였고, 단지 소량의 성숙한 (적색) 콜라겐만이 육안으로 관찰되었다.
압축 강도
압축 강도를 측정한 바, 분말, 분말 + 히드로겔, 및 히드로겔 중 분말 군 (각각 32.69, 31.93, 및 32.01 MPa; 도 46a)과 비교하였을 때, 일반적으로는 비처리군 및 히드로겔 군 (각각 40.72 및 42.35 MPa)에서 더 높은 것으로 나타났다. 비록 상기 차이가 유의적으로 상이하지는 않았지만, 이는 양막 분말을 포함하는 것이 압축 강도를 감소시켰다는 점에서 일관된 경향을 보이는 것이다. 실제로, 비처리군 및 히드로겔 실험 값을 조합하고, 분말을 포함하는 군들 모두를 조합하면, 이때, 양막 분말을 포함하는 것이 압축 응력을 유의적으로 감소시킨다 (각각 41.54 대 32.21 MPa; p < 0.05) (도 46b).
영률
영률은 비처리군에서 가장 낮았다 (9.78 MPa). 나머지 다른 군 - 히드로겔, 분말, 분말 + 히드로겔, 및 히드로겔 중 분말 -은 각각 11.10, 12.84, 10.07, 및 11.62 MPa로 더 높은 영률을 가졌다. 관찰된 차이 중 어느 것도 통계학상 유의적이지는 않았다 (도 47a).
항복점
항복 응력면에서 어느 군들 사이에서도 유의적인 차이는 관찰되지 않았다 (도 47b).
요약
치료 투여의 용이함:
변형된 히드로겔 시스템을 적용시키는 것은 최소의 제제, 및 멸균 적용을 위해서는 단 1명의 일손만을 필요로 하였다. 상기 히드로겔 시스템은 즉석 이중 챔버 시린지에서 냉동 보관될 수 있다. 적용을 위해서는 간단히 생성물을 해동시키고, 적용시킨다.
상처 치유의 질:
상처 봉합, 수축 및 상피형성 분석 결과, 양막 분말을 함유하는 군 모두가 상처 봉합 및 상피형성에서 우수하였고, 수축을 방지하는 데 있어서 최상으로 수행하였다는 것이 입증되었다. 비처리군 및 히드로겔 처리된 상처는 수축 증가, 상피형성 감소, 및 더욱 저속화된 상처 봉합 시간을 보였고, 히드로겔은 비처리군보다 현저하게 더욱 우수한 성능을 보였다. 양막 분말을 함유하는 치료는 상처 상피재형성을 유의적으로 가속화시켜 전체 상처 봉합 속도 및 정도를 가속화시켰다. 나머지 두 양막 군과 비교하였을 때, 히드로겔 중 분말 군의 상피형성 속도 사이에는 최소한의 차이가 관찰되었다. 양막 분말 및 양막 + 히드로겔 치료는 전 용량의 분말을 상처 위에 적용시키는 것을 포함하였지만, 양막 분말을 히드로겔로 희석시키는 것은 생체활성 인자의 상처 층으로의 방출을 약간 지연시킬 수 있고, 잠재적으로는 또한 상처 치유 동안 중요한 시점에서 양막 분말의 효과를 희석시킬 수도 있다.
피부 질:
조직학적 관찰 결과, 양막 분말 군은 모두, 유사한 표피 층, 두께 및 망상 돌출의 존재로 이루어진, 건강한 피부와 유사한 상처 조성, 및 더 작은 섬유와 서로 얽혀있는 큰 조직화된 진피 섬유를 포함하는 진피 조성을 가지는 것으로 나타났다. 상처 ECM의 질은 상처 치유에서 장기간의 성공을 거두는 데 있어서 매우 중요하다. ECM 조성은 상처 치유 특성 전반에 걸쳐 중요한 영향을 미친다. 조직학적 염색을 통해 초기 관찰 결과를 확인하였는데, 모든 양막 분말 처리군은 더 소량의 미성숙한 콜라겐과 서로 얽혀있는 두꺼운 성숙한 콜라겐 섬유 및 성숙한 피부와 일관된 국재화 및 염색 강도를 보이는 엘라스틴 섬유에 대한 염색으로 이루어진, 진피 ECM 조성을 가지는 것으로 나타났다. 진피 콜라겐 조성과 관련하여, 시리우스 레드 염색 결과, 모든 양막 분말 처리군은 진피 내의 미성숙한 및 성숙한 콜라겐 섬유를 유사한 비 및 조성으로 가지는 것으로 나타났다. 비처리군 및 히드로겔 처리된 상처는 미성숙한 표피를 보이거나, 표피가 존재하지 않았고, 조밀한 미성숙한 및 비조직화된 콜라겐 섬유의 진피 조성, 및 세포 과형성을 나타내었다.
압축 시험
대개 압축 시험에서의 차이는 통계학적으로 유의적이지는 않았다. 그러나, 전반적인 경향에 준하여, 분말이 조합되지 않은 것과의 비교로 분말 압축 강도 데이터, 및 절개된 조직 샘플의 조직학적 검사에 기초해 보면, 본 데이터는 치료에 양막 분말을 포함하는 것이 압축 강도를 감소시킨다는 것을 제안한다. 압축 강도는 조직 압축 생체역학의 비탄성 성분을 나타내며, 압축 강도 증가란, 재생된 피부가 변형될 수 있고, 이어서, 탄력적으로 리바운드될 수 있는 능력이 감소되었다는 것을 의미한다. 그러므로, 상기 데이터는 치유 과정에서의 이 지점에서 분말 처리군은 더 낮은 강성을 띠고, 탄성은 더 높다는 것을 제안한다. 추가로, 양막 분말과 함께 또는 그의 부재하에서의 히드로겔의 모든 조합을 통해서는 비처리군보다 더 높은 영률을 얻을 수 있다. 이는 상기 치료가 실제로 재생 피부의 탄력성을 증가시킨다는 것을 제안할 수 있다. 그러므로, 손상 후 28일째 측정된 상기 조직은 재생 과정에 있어서 충분하다고 하기에는 너무 빠른 시점의 것일 수도 있다. 연구는 더욱 장기간 동안에 진행되어야 하며, 그럴 경우, 기계적 특성의 차이는 통계학상 유의적일 수 있다고 본다.
결론적으로, 양막 분말, 양막 분말 + 히드로겔 (적층된 것) 및 양막 히드로겔 중 분말 (혼합된 것)은 동등하게 전층 상처에 투여하기가 용이하였고, 주로 새로운 상피형성에 의해 구동되어, 가장 빠른 속도로 상처를 봉합하였으며, 건강한 피부와 유사한 조성으로 성숙한 표피 및 진피를 형성하였다. 이러한 관찰 결과는 본원에 기술된 다른 생체내 연구와도 일치하며, 임상적 상처 치유 적용을 위한 상기 생성물 전달에 관한 다중의 옵션을 제공한다.
본원에서 값 및 범위를 제공하는 경우에는 언제나, 이 값 및 범위에 포함된 모든 값과 범위는 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의미된다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 상기 범위 내에 포함되어 있는 모든 값 뿐만 아니라, 상기 값의 범위의 상한 또는 하한 또한 본 출원에 의해 고려된다.
당업자는 단지 통상의 실험을 사용하여, 본원에 기술된 구체적인 방법, 실시양태, 특허청구범위, 및 실시예에 대한 다수의 등가물을 이해하게 되거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물은 본 발명의 범주 내에 포함되고, 본원에 첨부된 특허청구범위에 의해 포괄되는 것으로 간주되었다. 당업계에서 인정되는 대안을 사용하고, 단지 통상의 실험을 사용하면서 진행되는, 예를 들어, 반응시간, 반응 크기/부피, 및 실험 시약, 예컨대, 용매, 촉매, 압력, 대기 조건, 예컨대, 질소 대기, 및 환원제/산화제를 포함하나, 이에 제한되지 않는 반응 조건에 대한 변형은 본 출원의 범주 내에 포함된다는 것을 이해하여야 한다.
본원에서 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원, 및 공개 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 본 발명이 구체적인 실시양태를 참조로 하여 개시되었지만, 본 발명의 다른 실시양태 및 변형은 본 발명의 실제 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 당업자에 의해 고안될 수 있다는 것이 자명하다. 첨부된 특허청구범위는 상기의 모든 실시양태 및 등가 변형을 포함하는 것으로 해석되는 것으로 의도된다.

Claims (53)

  1. 양막 분말 및 스캐폴드를 포함하는, 상처 치유 및 조직 재생을 유도하기 위한 조성물로서, 여기서
    양막 분말이 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 상기 양막으로부터 방출된 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 30 ㎍/g 내지 1,000 ㎍/g 범위의 트롬보스폰딘-1 (TSP-1), 및 0.1 ㎍/g 내지 50 ㎍/g 범위의 펜트락신 3 (PTX-3)을 포함하고,
    스캐폴드의 전구체 물질이 히알루론산 및 젤라틴을 포함하고,
    폴리에틸렌 글리콜 기반 가교제 (polyethylene glycol based cross-linker)가 말레이미드-티올 가교-결합을 통해 상기 전구체 물질을 가교-결합시키는데 사용되는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 양막으로부터 방출된 전체 단백질이 50 mg/g 내지 250 mg/g 범위로 존재하는, 조성물.
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  4. 제1항에 있어서, 엘라스틴이 5 mg/g 내지 60 mg/g 범위로 존재하는, 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 콜라겐이 10 mg/g 내지 600 mg/g 범위로 존재하는, 조성물.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 글리코사미노글리칸이 0.5 mg/g 내지 2 mg/g 범위로 존재하는, 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 트롬보스폰딘-1 (TSP-1)이 50 ㎍/g 내지 400 ㎍/g 범위로 존재하는, 조성물.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 펜트락신 3 (PTX-3)이 1 ㎍/g 내지 20 ㎍/g 범위로 존재하는, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 1.5 ng/g 미만인 양으로 종양 괴사 인자-자극 유전자 6 (TSG-6)을 추가로 포함하는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, TSG-6이 1.0 ng/g 미만으로 존재하는, 조성물.
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  40. 양막 분말 및 스캐폴드를 포함하는, 상처 치유 및 조직 재생을 유도하기 위한 조성물로서, 상기 양막 분말이 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 상기 양막으로부터 방출된 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 30 ㎍/g 내지 1,000 ㎍/g 범위의 트롬보스폰딘-1 (TSP-1), 0.1 ㎍/g 내지 50 ㎍/g 범위의 펜트락신 3 (PTX-3), 및 1.5 ng/g 미만의 종양 괴사 인자-자극 유전자 6 (TSG-6)을 포함하고,
    상기 스캐폴드의 전구체 물질이 히알루론산 및 젤라틴을 포함하고,
    폴리에틸렌 글리콜 기반 가교제가 말레이미드-티올 가교-결합을 통해 상기 전구체 물질을 가교-결합시키는데 사용되는, 조성물.
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  46. 비-인간 대상체의 치료 부위에 제1항, 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제14항, 및 제40항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 비-인간 대상체에서 상처 치유 및 조직 재생을 유도하는 방법.
  47. i. 히드로겔 전구체 물질을 함유하는 제1 구획; 및
    ii. 치료학적 유효량의 양막 분말을 포함하는 조성물 및 말레이미드-티올 가교-결합된 하이드로겔을 형성하기 위한 가교제를 포함하는 조성물을 함유하는 제2 구획을 포함하는, 대상체에서 상처 치유 및 조직 재생을 유도하기 위한 키트 팩으로서, 여기서
    양막 분말이 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 상기 양막으로부터 방출된 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 30 ㎍/g 내지 1,000 ㎍/g 범위의 트롬보스폰딘-1 (TSP-1), 및 0.1 ㎍/g 내지 50 ㎍/g 범위의 펜트락신 3 (PTX-3)을 포함하는, 키트 팩.
  48. i. 양막 분말을 포함하는 조성물 및 히드로겔 전구체 물질을 함유하는 제1 구획; 및
    ii. 말레이미드-티올 가교-결합된 하이드로겔을 형성하기 위한 가교제를 포함하는 치료학적 유효량의 조성물을 함유하는 제2 구획을 포함하는, 대상체에서 상처 치유 및 조직 재생을 유도하기 위한 키트 팩으로서, 여기서
    양막 분말이 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 상기 양막으로부터 방출된 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 30 ㎍/g 내지 1,000 ㎍/g 범위의 트롬보스폰딘-1 (TSP-1), 및 0.1 ㎍/g 내지 50 ㎍/g 범위의 펜트락신 3 (PTX-3)을 포함하는, 키트 팩.
  49. 치료학적 유효량의 양막 분말, 수용성 물질에 의해 코팅된 히드로겔 전구체 물질, 및 가교제를 포함하는 대상체에서 상처 치유 및 조직 재생을 유도하기 위한 키트 팩으로서, 여기서
    양막 분말, 수용성 물질에 의해 코팅된 히드로겔 전구체 물질, 및 가교제가 건조되고(desiccated),
    양막 분말이 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 상기 양막으로부터 방출된 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 30 ㎍/g 내지 1,000 ㎍/g 범위의 트롬보스폰딘-1 (TSP-1), 및 0.1 ㎍/g 내지 50 ㎍/g 범위의 펜트락신 3 (PTX-3)을 포함하고,
    가교제가 히드로겔 전구체 물질 사이에 말레이미드-티올 가교-결합의 형성을 보조하는 것인, 키트 팩.
  50. 치료학적 유효량의 양막 분말, 히드로겔 전구체 물질, 및 수용성 물질에 의해 코팅된 가교제를 포함하는 대상체에서 상처 치유 및 조직 재생을 유도하기 위한 키트 팩으로서, 여기서
    양막 분말, 히드로겔 전구체 물질, 및 수용성 물질에 의해 코팅된 가교제가 건조되고,
    양막 분말이 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 상기 양막으로부터 방출된 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 30 ㎍/g 내지 1,000 ㎍/g 범위의 트롬보스폰딘-1 (TSP-1), 및 0.1 ㎍/g 내지 50 ㎍/g 범위의 펜트락신 3 (PTX-3)을 포함하고,
    가교제가 히드로겔 전구체 물질 사이에 말레이미드-티올 가교-결합의 형성을 보조하는 것인, 키트 팩.
  51. 제49항 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 물질이 젤라틴인, 키트 팩.
  52. 치료학적 유효량의 양막 분말, 히드로겔 전구체 물질, 및 가교제를 포함하는 대상체에서 상처 치유 및 조직 재생을 유도하기 위한 키트 팩으로서, 여기서
    히드로겔 전구체 물질 및 가교제가 pH<7인 용액으로부터 건조되고,
    양막 분말이 30 mg/g 내지 500 mg/g 범위의 상기 양막으로부터 방출된 전체 단백질, 4 mg/g 내지 100 mg/g 범위의 엘라스틴, 10 mg/g 내지 800 mg/g 범위의 콜라겐, 0.1 mg/g 내지 5 mg/g 범위의 글리코사미노글리칸, 30 ㎍/g 내지 1,000 ㎍/g 범위의 트롬보스폰딘-1 (TSP-1), 및 0.1 ㎍/g 내지 50 ㎍/g 범위의 펜트락신 3 (PTX-3)을 포함하고,
    가교제가 히드로겔 전구체 물질 사이에 말레이미드-티올 가교-결합의 형성을 보조하는 것인, 키트 팩.
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