JP2018525360A

JP2018525360A - 創傷治癒、組織工学、及び再生医療のための組成物及び方法における使用のための大豆由来の生物活性ペプチド

Info

Publication number: JP2018525360A
Application number: JP2018503170A
Authority: JP
Inventors: レルケス，ピーター・アイ; ハレル，ヤエル・エイチ; マーシンキウィッツ，ツェザーリ; ラザロビチ，フィリップ; バハールー，ソゴル・モーイエド; ガーズテンハーバー，ジョナソン・エー
Original assignee: テンプルユニヴァーシティ − オブザコモンウェルスシステムオブハイアーエデュケーション
Priority date: 2015-07-22
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2018-09-06
Also published as: WO2017015488A1; US11077169B2; EP3325029A4; US20220211804A1; EP3325029B1; US20180207232A1; EP3325029A1; IL257057A

Abstract

創傷治癒及び組織再生の促進のための組成物及び方法を記載する。組成物及び方法では、水溶性大豆タンパク質単離物（ＷＳｓｏｙ）、大豆タンパク質単離物の画分５、画分９、及び／又は生物活性ペプチド成分を使用する。本発明はまた、精製されたＷＳｓｏｙが、水性環境中の特定の濃度範囲内に懸濁された場合にゲル状マトリックスを形成するとの予期せぬ発見に関する。ＷＳｓｏｙを含む本発明の組成物は、自然治癒を促進し、低リスクプロファイルを有する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／１９５，３８６号、２０１５年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／２３４，２６６号、２０１５年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／２５６，４８０号、及び２０１６年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／３３５，１９５号の優先権を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

発明の背景
非治癒性の皮膚創傷は、患者の罹患の有意な原因及び米国の医療システムでの財政負担となる。全層創傷は、皮膚の毛包及び汗腺に見られる重要な上皮再生要素（幹／前駆細胞）の一部の完全破壊により特徴付けられる（Driver, V.R., et al., 2010, J Am Podiatr Med Assoc 100, 335-341; Gordon, M.D., et al., 2010, J. Burn Care Rehabil 25, 388-410）。

クリニックで使用される製品は、即時のニーズ、例えば機械的障壁の提供、水分喪失の防止、創傷閉鎖が達成されるまでの細菌感染の予防などに主に対処している（Skorkowska-Telichowska, K., et al., 2013, J. Am Acad Dermatol 38, e117-126）。最近の研究では、創傷治癒プロセスを改善するための無細胞性及び細胞性の生物活性創傷マトリックスの開発に焦点が当てられており（Demidova-Rice, T.N. et al., 2012, Advances in Skin & Wound Care, 25, 304-314; Mayet, N., et al., 2014, Journal of Pharmaceutical Sciences 103, 2211-2230）、瘢痕形成の低減及び皮膚付属器の再生の促進に重点が置かれている（Sun, G., et al., 2011, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 20976-20981; Bonvallet, P.P., et al., 2014, Tissue engineering. Part A 20, 2434-2445）。無細胞性の生物活性創傷マトリックスにより、外因性細胞の非存在下で創傷治癒を増強することができ、このように、長い培養時間、短い有効期間、及び免疫原性といった、それらに関連する限定を伴う、より高価な細胞化創傷マトリックスを置き換えることができる。有意な進歩にもかかわらず、現在の市販製品は、創傷治癒プロセスに関与する細胞を直接的に調節する製品の「理想的」特性を満たさず、治療選択肢に重要な隔たりを残す（Pereira, R.F., et al., 2013, Nanomedicine (Lond) 8 603-621; Shevchenko, R.V., et al., 2010, J R Soc Interface 7, 229-258）。

現在、臨床的に使用されるいくつかの型の生物活性創傷マトリックスが存在する。しかし、いずれも皮膚組織の完全な再生を誘導することはできてきない。また、最も有望な細胞ベースの創傷マトリックスの一部は極めて高価であり、それらの取り扱いは、生存細胞の存在及び製品の短い有効期間により複雑になる。この課題は、無細胞性の創傷マトリックスを含む医薬製剤に変えることができる安価な天然生体材料を同定することであり、皮膚創傷治癒に関与する複雑な生物学的プロセスが増強され、長い有効期間で取り扱いやすくなり、このように、組織修復及び再生のための新規の機会が提供される。

再生工学的アプローチによる創傷治癒の促進は、伝統的に、皮膚細胞接着、成長、及び分化に導く細胞外マトリックス（ＥＣＭ）代替物として役立つ三次元足場の生成に頼っている。最近、他者及び本発明者らは、薬物送達及び創傷治癒のための、植物由来の「グリーン」で、再生可能で安価な天然生体材料である大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）の可能性を研究し始めた（Har-el, Y., et al., 2014, Wound Medicine 5, 9-15; Peles, Z., et al., 2013, J Tissue Eng Regen Med 7, 401-412; Santos, T.C., et al., 2013, Tissue Eng Part A 19, 860-869）。しかし、従来のＳＰＩは、強酸中又は侵襲的で高価な有機溶媒（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール）中でのみ可溶性であり、費用及び腐食性の溶媒残留物の可能性のために、その大規模な商業生産及び／又は生物医学的使用が妨げられている。さらに、現在まで、小型及び大型動物モデルにおいて、ＳＰＩが創傷治癒を増強する機構を試験している者はまだいない。増強された創傷治癒に関与するＳＰＩの細胞作用機構に関する詳細な機構情報の欠如は、最適な創傷マトリックスとしてのＳＰＩの開発に対する別の障壁である。

現在使用されている動物及びヒト由来の材料に関連する問題を伴わず、多数の患者に自然治癒を早めるとともに、総治療費を低減することができる製品に対する実質的な満たされない臨床的な必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たす。

発明の概要
一態様では、本発明は、大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）の生物活性ペプチド成分を含む、創傷治癒及び組織再生を誘導するための組成物を提供する。

一実施形態では、組成物は画分５を含む。一実施形態では、画分５は、溶出の直線勾配（４５分間にわたる０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を伴う、Ｃ１８を使用した逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用してＷＳｓｏｙ分離の間に溶出されるタンパク質画分を含み、画分５は約２５〜３５分間の保持時間を有する。一実施形態では、画分５は約１７．９mVのゼータ電位を有する。

一実施形態では、組成物は画分９を含む。一実施形態では、画分９は、溶出の直線勾配（４５分間にわたる０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を伴う、Ｃ１８を使用した逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用してＷＳｓｏｙ分離の間に溶出されるタンパク質画分を含み、画分９は約３５〜４０分間の保持時間を有する。一実施形態では、画分９は約３４．２mVのゼータ電位を有する。

一実施形態では、組成物は、粉末、ゲル、ローション、フィルム、溶液、スプレー、又は足場を含む。

一態様では、本発明は、水溶性大豆タンパク質単離物（ＷＳｓｏｙ）を含む、創傷治癒及び組織再生を誘導するための組成物を提供する。

一態様では、本発明は、ＷＳｓｏｙ及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む組成物を被験体の治療部位に投与することを含む、それを必要とする被験体において創傷治癒及び組織再生を促進する方法を提供する。

一態様では、本発明は、大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）の生物活性ペプチド成分を含む、創傷治癒及び組織再生を誘導するための足場を提供する。

一実施形態では、足場は画分５を含む。一実施形態では、画分５は、溶出の直線勾配（４５分間にわたる０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を伴う、Ｃ１８を使用した逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用してＷＳｓｏｙ分離の間に溶出されるタンパク質画分を含み、画分５は約２５〜３５分間の保持時間を有する。一実施形態では、画分５は約１７．９mVのゼータ電位を有する。

一実施形態では、足場は画分９を含む。一実施形態において、画分９は、溶出の直線勾配（４５分間にわたる０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を伴う、Ｃ１８を使用した逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用してＷＳｓｏｙ分離の間に溶出されるタンパク質画分を含み、画分９は約３５〜４０分間の保持時間を有する。一実施形態では、画分９は約３４．２mVのゼータ電位を有する。

一実施形態では、足場は、電気処理された繊維を含む。一実施形態では、電気処理された繊維はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む。一実施形態では、電気処理された繊維は合成ポリマーを含む。一実施形態では、合成材料ポリマーは、ポリ（エプシロン−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、コポリマーポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリアニリン、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される。

一実施形態では、電気処理された繊維は、α９β１インテグリンへのリガンドとして作用する画分９を含む。一実施形態では、足場は、可溶性形態の画分５をさらに含む。一実施形態において、画分５を、足場中に埋め込まれた薬物送達担体内にロードする。

一実施形態において、足場は、ＳＰＩの生物活性成分を含むヒドロゲルを含む。一実施形態では、ヒドロゲルは、ゲニピンを用いて架橋されたゼラチンを含む。

一態様では、本発明は、創傷治癒及び組織再生を誘導するための足場を提供し、足場はＷＳｓｏｙを含む。一実施形態では、足場は、ＷＳｓｏｙを含む電気処理された繊維を含む。一実施形態では、電気処理された繊維は合成ポリマーを含む。一実施形態では、合成材料ポリマーは、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、コポリマーポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリアニリン、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される。一実施形態では、足場は、ＷＳｓｏｙを含むヒドロゲルを含む。

一態様では、本発明は、ＷＳｓｏｙ及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む足場を被験体の治療部位に投与することを含む、それを必要とする被験体において創傷治癒及び組織再生を促進する方法を提供する。

一態様では、本発明は、精製された水溶性大豆タンパク質単離物（ＷＳｓｏｙ）を含む有効量の乾燥組成物を湿潤創傷に適用する工程を含む、湿潤創傷の治療方法を提供し、乾燥ＷＳｓｏｙは、湿潤創傷中の水分との接触時に、半液体マトリックスに自己組織化する。一実施形態では、適用する乾燥ＷＳｓｏｙの量は、創傷１cm²あたり１〜１００mgである。一実施形態では、乾燥ＷＳｓｏｙを５０〜５０００μmの厚さで適用する。

一態様では、本発明は、液体担体中の有効量のＷＳｓｏｙを創傷に適用する工程を含む創傷を治療する方法を提供し、ＷＳｓｏｙは液体担体中の半液体マトリックスに自己組織化する。一実施形態では、ＷＳｓｏｙは、液体担体１mLあたり１〜２００mgの濃度を有する。一実施形態では、液体担体中のＷＳｓｏｙの量は、創傷１cm²あたり０．１〜１mLである。一実施形態において、液体担体中の水溶性大豆タンパク質単離物を５０〜５０００μmの厚さで適用する。一実施形態では、適用方法は創傷上への直接電気処理による。

一態様では、本発明は、ＷＳｓｏｙ及び少なくとも１つの活性薬剤を含む、迅速な創傷治癒のための組成物を提供する。一実施形態では、組成物は乾燥ＷＳｓｏｙ粒子を含む。一実施形態では、粒子の直径は１〜１０００μmである。一実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤は、麻酔剤、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤、鎮痒剤、筋弛緩剤、鎮痛剤、解熱剤、ビタミン、抗菌剤、防腐剤、消毒剤、殺菌剤、外部寄生生物駆除剤、抗寄生虫剤、アルカロイド、塩、イオン、抗炎症剤、創傷治癒剤、植物抽出物、成長因子、ポリカーボネート、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分、皮膚軟化剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、精神安定剤、鎮咳剤、ナノ粒子、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。

一実施形態では、組成物は、ゼラチン、マトリゲル、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、キトサン、ポリウレタン、ポリシロキサン又はシリコーン、ポリエチレン、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレン−コ−酢酸ビニル、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリル酸、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリスチレン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される乾燥成分をさらに含む。

一態様では、本発明は、液体担体中にＷＳｓｏｙを含む迅速な創傷治癒のための組成物を提供する。一実施形態では、液体担体は医薬的に許容可能な担体である。一実施形態では、組成物は、液体担体１mLあたり１〜２００mgのＷＳｓｏｙを含む。一実施形態では、組成物は、麻酔剤、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤、鎮痒剤、筋弛緩剤、鎮痛剤、解熱剤、ビタミン、抗菌剤、防腐剤、消毒剤、殺菌剤、外部寄生生物駆除剤、抗寄生虫剤、アルカロイド、塩、イオン、抗炎症剤、創傷治癒剤、植物抽出物、成長因子、ポリカーボネート、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分、皮膚軟化剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、精神安定剤、鎮咳剤、ナノ粒子、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される薬剤をさらに含む。

一実施形態では、組成物は、ゼラチン、マトリゲル、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、キトサン、ポリウレタン、ポリシロキサン又はシリコーン、ポリエチレン、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレン−コ−酢酸ビニル、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリル酸、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリスチレン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される成分をさらに含む。一実施形態では、組成物を繊維、シート、又は布にエレクトロスピンする。

一態様では、本発明は、少なくとも１つの量のＷＳｓｏｙ組成物及び少なくとも１つの量の液体担体を含む、創傷を治療するためのキットを提供する。一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの量のＷＳｓｏｙ組成物及び少なくとも１つの量の液体担体を混合する方法をさらに含む。

一態様では、本発明は、生物活性成分画分（ＢＣＦ）５−５を含む、迅速な創傷治癒のための組成物を提供する。

一態様では、本発明は、ＢＣＦ９−４を含む、迅速な創傷治癒のための組成物を提供する。

一態様では、本発明は、βコングリシニンを含む、迅速な創傷治癒のための組成物を提供する。

一態様では、本発明は、ＬＤＶモチーフを有するβコングリシニンのフラグメントを含む、迅速な創傷治癒のための組成物を提供する。

一態様では、本発明は、ＬＤＶモチーフを有するペプチド又はそのフラグメントを含む、迅速な創傷治癒のための組成物を提供する。

本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばより良く理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、図面には現在好ましい実施形態を示している。しかし、本発明を、図面に示す実施形態の正確な配置及び手段に限定しないことを理解すべきである。
図１は、ＳＰＩ及びより低レベルのＷＳｓｏｙ粉末並びにそれらのそれぞれのエレクトロスピン繊維における植物エストロゲンの同定を実証する実験結果を示す。左：エレクトロスピン膜の巨視的視野、並びにＳＰＩ（上）及びＷＳｓｏｙ（下）の繊維のＳＥＭ。中央：陽性対照化合物、並びに植物エストロゲンの存在又は非存在を示すＳＰＩ及びＷＳｓｏｙエタノール抽出物で処理した、ＥＲＥレポーター遺伝子でトランスフェクトされたＴ４７Ｄ細胞におけるエストロゲン受容体依存性転写の測定（Hirsch, K. et al., 2007, Breast Cancer Res Treat, 104, 221-230）。右：エストロゲン受容体アンタゴニストであるフルベストラント（ＩＣＩ−１８２７８０）によるＨａＣａＴ上皮細胞におけるＳＰＩ誘導性創傷閉鎖の阻害。ＳＰＩ（１０μm）のエタノール抽出物の遊走前活性は、１０μmのアンタゴニストにより阻害された。ＥＲＥ活性を欠くＷＳｓｏｙのエタノール抽出物は創傷閉鎖において効果がなかった。図２は、ＷＳｓｏｙのＲＰ−ＨＰＬＣ分離を示すグラフである。ＷＳｓｏｙをＴＦＡに可溶化し、Ｃ１８ＶＹＤＡＣカラムに注入し、ＡＣＮの直線勾配（点線）を用いて分離した。数字は、生物学的アッセイにより収集及び特徴付けされた画分を示す。図３は、皮膚細胞スクラッチアッセイにおける遊走前活性が画分５で検出されたことを実証する実験結果を示す。１mmの掻創をＨＤＤＥＣ細胞、ＨＤＦＣ細胞、及びＨａＣａＴ細胞の単層で実施した。培養物を培地（０．１%ＦＢＳ）中の画分（５０μg/ml）と４８時間にわたりインキュベートした。創傷閉鎖の割合は定量的画像分析により決定した。図４は、画分５の再クロマトグラフィーを示すグラフである。「より平坦な」ＡＣＮ勾配（１２０分間にわたり３０〜８０%）を使用したことを除き、条件は図２と同じであった。収集された亜画分を５−１〜５−５と名付けた。網掛け領域は、ＨａＣａＴスクラッチアッセイにおけるタンパク質活性を示す（左の挿入図）。右の挿入図：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルはクーマシーブルーで染色した。図５は、ＨａＣａＴ細胞におけるＥＲＫリン酸化活性のＷＳｓｏｙ刺激を実証する実験結果を示す。細胞を５０μg/mlのＷＳｓｏｙで刺激した。細胞溶解物を電気泳動し、ペーパーに転写し、リン酸−ＥＲＫ、続いて汎−ＥＲＫ抗体でイムノブロットした。上：リン酸化バンド。下：ｐＥＲＫ／ＥＲＫ間のリン酸化率%。図６は、１回目のＲＰ−ＨＰＬＣ後に得られた固定化ＷＳｓｏｙ画分（５０μg/ml）に対する、α９インテグリンサブユニットでトランスフェクションした又はしていない細胞の接着を研究する実験の結果を実証するグラフである（図２を参照のこと）。接着は、記載されているように実施し、分析した（Brown et al., 2008, Neuro Oncol, 10: 968-980）。ＷＳｓｏｙ：固定化された水溶性大豆。血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１、α９β１インテグリンに対する天然リガンド）：陽性対照。フィブロネクチン（ＦＮ）：両方の細胞型についての陽性対照。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：陰性対照。エラーバーは、ＢＳＡへの結合と比較した場合での重複実験（＊）ｐ＜０．００１を表す。図７Ａ及び図７Ｂを含む図７は、１回目のＲＰ−ＨＰＬＣ後に得られた画分９の特徴付けのために実施した実験の結果を示す。図７Ａ。ＡＣＮの「より平坦な」勾配（１２０分間にわたる４０〜８０%）を使用することを除き、図２に記載するのと同じ条件下での画分９の再クロマトグラフィー。収集された亜画分は９−１〜９−５と名付けた。網掛け領域は、α９＋細胞接着を促進するタンパク質を示す。挿入図：クーマシーブルーで染色した還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。マークした領域：プロテオミクスにより分析したバンド。図７Ｂ：ＲＰ−ＨＰＬＣの第２工程後に得られた細胞接着アッセイにおける亜画分９の分析。実験は、図５に記載するようにα９＋細胞を用いて実施した。重複実験からのエラーバー。（＊）９−１への結合と比較したｐ＜０．０５。図８Ａ及び図８Ｂを含む図８は、画分９−４の存在下（図８Ａ）又は非存在下（図８Ｂ）におけるマトリゲル中でのＨＤＭＶＥＣ管形成を研究する実験の結果を示す。マトリゲルを画分９−４（３０μg／５０μL）と共重合させ、細胞（１５０μLの血清及び成長因子不含ＥＧＭ−２培地あたり１×１０^４個）を適用した。画像は、３７℃で２４時間のインキュベーション後に撮影した。図９は、ラットにおける創傷治癒遅延のリングモデルを使用した実験の結果を示す。左右のパネル：未処置で放置された創傷並びにテガダーム（対照）＆エレクトロスピンされた大豆サウンドマトリックスで覆い、次にテガダームで覆った創傷。上パネル：１８日目の「正常」ラットにおける創傷治癒−エレクトロスピンされた大豆足場での治癒の加速に注意すること（右上）。下パネル：ラットリングモデルにおける創傷治癒の遅延：テガダームで覆われた創傷は本質的に非治癒的であるが、大豆足場で処置された創傷は痂皮で覆われたように見えるが、下では再上皮化している。図１０Ａ〜図１０Ｄを含む図１０は、対照及びＷＳｓｏｙで処置された全層皮膚創傷のヘマトキシリン及びエオシン染色の結果を示す。図１０Ａ及び図１０Ｂ：創傷７日後。図１０Ｃ及び図１０Ｄ：創傷１４日後。詳細については、本文を参照のこと。Ｅ：再生上皮内層；Ａ：再生付属器；ＷＭ：創傷周辺；Ｓ：痂皮。ＧＴ：肉芽組織；白矢印：血管。スケールバーは２００μmを表す。図１１Ａ及び図１１Ｂを含む図１１は、ＷＳｓｏｙ足場（図１１Ａ）で処置された又は未処置で放置され、テガダームのみで覆われた全層皮膚創傷（図１１Ｂ）のパンサイトケラチン染色の結果を示す。詳細については、本文を参照のこと。スケールバーは２００μmを表す。図１２はβコングリシニンサブユニットα’鎖（部分）のアミノ酸配列を画分９に見られるペプチドの配列と比較したプロテオーム分析の結果を示す。フィブロネクチンの類似フラグメント（ＣＳ−１ペプチド）も含まれる。図１３は、画分５の亜画分でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を示す。生物活性成分画分（ＢＣＦ）５−５は生物学的に活性であったが、ＢＣＦ５−４は活性ではなかった。左の最初のラインは分子量マーカーを表す。サークルは、プロテオミクスについて分析されたバンドを示す。結果を図１６に示す。図１４は、細胞接着アッセイにおける画分９の亜画分での活性を分析する実験の結果を示す。細胞接着は、ａ９ＬＮ１８細胞株を使用して実施した。画分を９６ウェルプレートに固定化した。Ｆｒ９−４及びＦｒ９−５は、生物活性成分画分９−４並びに生物活性成分画分９−５、又はＢＣＦ９−４及びＢＣＦ９−５とさらに言及する。図１５は、画分９の亜画分でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を示す。ＢＣＦ９−４及びＢＣＦ９−５は生物学的に活性であったが、ＢＣＦ５−２は活性ではなかった。左の最初のラインは分子量マーカーを表す。サークルは、プロテオミクスについて分析されたバンドを示す。結果を図１７に示す。図１６は、図１３のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのＢＣＦ５−４及びＢＣＦ５−５タンパク質バンドのペプチド配列を列挙する表である。Ｍｏｘは、翻訳後修飾メチオニン、酸化アミノ酸（メチオニンスルホキシド）である。図１６は、図１３のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのＢＣＦ５−４及びＢＣＦ５−５タンパク質バンドのペプチド配列を列挙する表である。Ｍｏｘは、翻訳後修飾メチオニン、酸化アミノ酸（メチオニンスルホキシド）である。図１７は、図１５のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのＢＣＦ９−４及びＢＣＦ９−５タンパク質バンドのペプチド配列を列挙する表である。Ｍｏｘは、翻訳後修飾メチオニン、酸化アミノ酸（メチオニンスルホキシド）である。図１８Ａから図１８Ｈは、創傷閉鎖遅延のラットモデルにおける皮膚処置での一連の組織学的染色を示す。図１８Ａ及び図１８Ｂは無傷の真皮組織を示す。図１８Ｃ及び図１８Ｄは未処置の創傷を示す。図１８Ｅ及び図１８Ｆは、１４日後に湿潤ＷＳｓｏｙ組成物で処置した創傷を示す。図１８Ｇ及び１８Ｈは、１４日後に乾燥ＷＳｓｏｙ組成物で処置した創傷を示す。図１８Ａ、図１８Ｃ、図１８Ｅ、及び図１８Ｇは、サンプルの一般的な組織学を示すヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色である。図１８Ｂ、図１８Ｄ、図１８Ｆ、及び図１８Ｈは、サンプル中のコラーゲンの存在を示すピクロシリウスレッド染色である。全ての画像が１３０倍に拡大されている。図１９は、ラットモデルにおける皮膚処置の一連の組織学的染色である。左のカラムは、未処置の非創傷皮膚を示す。中央のカラムは、１４日後に湿潤ＷＳｓｏｙ組成物で処置した創傷を示す。右のカラムは、市販の皮膚代替物Oasis（登録商標）で処置した創傷を示す。上列はＨ＆Ｅで染色されている。下列はピクロシリウスレッドで染色されている。図２０は、処置の２１日後に大豆タンパク質単離物又はOasis（登録商標）で処置したラットモデルにおける全層皮膚切除創での血管新生を実証する実験の結果を示す。矢印は、主に小血管である対照創傷よりも大豆処置した創傷でより多く認められる新たな血管を指す。（ブロック矢印：大血管；直線矢印：小血管）。図２１は、処置の１４日後に大豆タンパク質単離物又はOasis（登録商標）で処置したラットモデルにおける全層皮膚切除創でのマクロファージ浸潤を実証する実験の結果を示す。棒グラフは、１週間及び４週間後に、未処置対照と比べて、大豆タンパク質単離株で処置したブタ創傷モデルにおいて存在するマクロファージの量を示す。図２２は、例示的なエレクトロスピンした大豆組成物が、未処置対照と比べて、大豆タンパク質単離物で処置したブタ創傷モデルにおいて創傷閉鎖を加速することを実証する実験の結果を示す。図２３は、シリンジに分注する準備ができている擬似液体マトリックスとしての例示的なＷＳｓｏｙ組成物を示し（左パネル）、マトリックスは針を通して分注され、迅速な重合を受ける（右パネル）。図２４Ａから図２４Ｄは、創傷／処置の１４日後にＷＳｓｏｙ製剤で処置した全層切除創における皮膚の表皮層のＨ＆Ｅ染色の結果を示す。図２４Ａ：ゲルとして適用したＷＳｓｏｙマトリックス；図２４Ｂ：粉末として適用したＷＳｓｏｙマトリックス；図２４Ｃ：ＷＳｓｏｙ電気処理足場；図２４Ｄ：未処置対照。スケールバーは各々２００ミクロンである。図２５Ａから図２５Ｄは、創傷／処置の１４日後にＷＳｓｏｙ製剤で処置した全層切除創における皮膚の表皮層のピクロシリウスレッド染色の結果を示す。各々の画像ペアは、偏光（左）及び明視野（右）画像を含む。図２５Ａ：ゲルとして適用したＷＳｓｏｙマトリックス。図２５Ｂ：粉末として適用したＷＳｓｏｙマトリックス；図２５Ｃ：ＷＳｓｏｙ電気処理足場；図２５Ｄ：未処置対照。スケールバーは各々２００ミクロンである。図２６は、健常な境界領域に対する創傷の「赤み」として計算されたピクロシリスレッド染色（図２５Ａから図２５Ｄ）におけるコラーゲンの定量化を示す。各々の領域で６回の測定を行い、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。計算は、図２５Ａから図２５Ｄの画像からの値だけを表す。図２７Ａから図２７Ｄは、創傷／処置の１４日後にＷＳｓｏｙ製剤で処置した全層切除創における皮膚の表皮層のケラチン染色の結果を示す。より成熟したケラチンはよりも濃く染色される。これらのサンプルは、ゲル及び粉末で処置した創傷が、対照よりも成熟したケラチンを有することを示す。各々の画像ペアは、創傷の（左）及び創傷辺縁の健常な皮膚（右）の中心領域を含む。図２７Ａ：ゲルとして適用したＷＳｓｏｙマトリックス；図２７Ｂ：粉末として適用したＷＳｓｏｙマトリックス；図２７Ｃ：ＷＳｓｏｙ電気処理足場；図２７Ｄ：未処置対照。スケールバーは各々２００ミクロンである。図２８は、健常な境界領域に対する創傷におけるパンサイトケラチン（ｐｃｋ）抗体染色（図２７Ａから図２７Ｄ）の定量化を示す。各々の領域で６回の測定を行い、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。計算は、図２７Ａから図２７Ｄの画像からの値だけを表す。

詳細な説明
本発明は、水溶性大豆タンパク質単離物（本明細書では「ＷＳｓｏｙ」と言及する）及び／又は大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）の生物活性ペプチド成分を使用する組成物及び方法に関する。本発明は、部分的には、ＷＳｓｏｙが、組織工学適用における使用のための従来の大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）を上回る種々の利点を有するとの発見に基づく。例えば、ＷＳｓｏｙは、大豆タンパク質の処理のために過酷な有機溶媒の使用を要求しないため、有利であることが本明細書に記載されている。さらに、ＷＳｓｏｙ粉末は、エストロゲン類似体のサブセットである低レベルのイソフラボノイドを含み、これは従来のＳＰＩを使用する際に課題を提起しうる。

特定の実施形態では、組成物及び方法は、ＳＰＩの１つ又は複数の生物活性ペプチド成分を含む。例えば、ＳＰＩは、生物活性を付与する異なるタンパク質／ペプチド画分を含むことが本明細書に記載されている。例えば、ＷＳｓｏｙの種々の画分は、細胞遊走、細胞増殖、及び血管新生を促進することが実証されている。

本発明は、ＷＳｓｏｙ及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む組織工学及び創傷治癒組成物を提供する。例示的な組成物には、粉末、溶液、ヒドロゲル、フィルム、ローション、スプレー、薬物送達担体及び足場が単独又は他の材料との複合で含まれる。

定義
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似又は等価な任意の方法及び材料が本発明の実行又は試験において使用されうるが、好ましい方法及び材料を記載する。

本明細書中で使用する場合、以下の用語の各々は、このセクションにおいてそれに関連する意味を有する。

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、その冠詞の文法的目的の１つ又は複数（即ち、少なくとも１つ）を指すために使用する。例として、「ある要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。

測定可能な値（例えば量、持続時間など）を指すときに本明細書で使用する「約」は、特定の値からの±２０%、±１０%、±５%、±１%、又は±０．１%の変動を包含することを意味し、そのような変動が、開示する方法を実施するのに適当であるためである。

用語「生体分子」又は「生体有機分子」は、典型的には生物により作製された有機分子を指す。これは、例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂肪酸、ステロイド、核酸、ポリペプチド、ペプチド、ペプチドフラグメント、炭水化物、脂質、アミノ酸、フラボノイド、及びこれらの組み合わせ（例、糖タンパク質、リボ核タンパク質、リポタンパク質など）を含む分子を含む。

「細胞外マトリックス」は、細胞により合成された細胞外マトリックスにより提供される細胞成長を支持するために実質的に同じ条件を提供する１つ又は複数の物質を指す。細胞外マトリックスは基質上に提供してもよい。あるいは、細胞外マトリックスを含む成分を溶液中で提供してもよい。細胞外マトリックスの成分は、ラミニン、コラーゲン、及びフィブロネクチンを含みうる。

本明細書で使用する用語「細胞外マトリックス成分」は、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、及びエラスチンより選択されるメンバーを含むことができる。

用語「ブロースピニング」は、材料を標的基質に向けて流し込み、吹き付け、スパッタリング、又は滴下する方法を指す。材料は、加圧ガス流の１つ又は複数の供給源により標的基質の方向に空気力学的に導くことができる。

用語「電気集束」ブロースピニングとは、ポリマーの流れを発生させるのに必要な要素（例えばエレクトロスピンなど）ではなく、標的基質に向かう材料の流れの集束を改善するためだけに電界が提供されるブロースピニング方法を指す。用語「電気集束」は、本明細書に記載する特定の実施例に限定せず、標的上に材料を沈着させるために電界を使用する任意の手段を含む。

本明細書で使用する用語「電気処理」又は「電着」は、材料のエレクトロスピン、エレクトロスプレー、エレクトロエアロゾル、エレクトロブローイング、及びエレクトロスパッタリングの全ての方法、２つ又はそれ以上のそのような方法の組み合わせ、及び材料が流される、スプレーされる、電場を横切って標的に向かって滴下される任意の方法を含む。電気処理材料は、１つ又は複数の接地リザーバから、荷電基質の方向に、又は荷電リザーバから接地標的に向けて電気処理することができる。「エレクトロスピン」は、電気的に荷電した溶液又は溶融物を、オリフィスを通して流すことにより、溶液又は溶融物から繊維が形成されるプロセスを意味する。「エレクトロエアロゾル」は、荷電ポリマー溶液又は溶融物を、オリフィスを通して流すことにより溶液又は溶融物から液滴が形成されるプロセスを意味する。「エレクトロブローイング」は、ポリマー溶液を、電場を通してブロースピニングすることにより溶液から繊維が形成されるプロセスを意味する。用語「電気処理」は、本明細書に記載する特定の例に限定せず、標的上に材料を沈着させるために電界を使用する任意の手段を含む。

「エレクトロエアロゾル」は、荷電ポリマー溶液又は溶融物を、オリフィスを通して流すことにより溶液又は溶融物から液滴が形成されるプロセスを意味する。

「成長因子」は、細胞の成長を促進するのに効果的な物質を指す。成長因子は、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｔ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、血小板由来成長因子ＡＢ（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、アクチビンＡ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン、サイトカイン、ケモカイン、モルフォゲン、中和抗体、他のタンパク質、及び小分子を含むが、これらに限定しない。

「ヒドロゲル」は、液体のそれ自体の重量の少なくとも３倍、好ましくは少なくとも１０倍を吸収することが可能である水不溶性及び水膨潤性架橋ポリマーを指す。「ヒドロゲル」は、本明細書で使用するように「熱応答性ポリマー」を指すこともできる。

本明細書で使用するように、「足場」は、細胞の接着及び増殖のための適切な生体適合性表面を提供する生体適合性材料を含む構造を指す。足場は、機械的安定性及び支持をさらに提供しうる。足場は、増殖細胞の集団により想定される三次元形状又は形態に影響を及ぼす又は境界を定めるように、特定の形状又は形態でありうる。そのような形状又は形態は、フィルム（例、三次元よりも実質的に大きい二次元を伴う形態）、リボン、コード、シート、フラットディスク、シリンダ、球体、３次元アモルファス形状などを含むが、これらに限定しない。

用語「単離された」は、材料を産生するために使用される成分を実質的に又は本質的に含まない材料を指す。組成物についての純度の範囲の下限は約６０%、約７０%、又は約８０%であり、純度の範囲の上限は約７０%、約８０%、約９０%、又は約９０%を上回る。

本明細書で使用するように、「生体適合性」は、哺乳類に移植された場合、哺乳動物において有害応答を引き起こさない任意の物質を指す。生体適合性材料は、個体に導入された場合、その個体に有毒でも有害でもなく、哺乳動物における材料の免疫学的拒絶も誘導しない。

本明細書で使用するように、「移植片」は、典型的には、欠損を置き換えるか、矯正するか、そうでなければ克服するために、個体に移植される細胞、組織、又は器官を指す。移植片は足場をさらに含んでもよい。組織又は器官は、同じ個体に由来する細胞からなってもよい。この移植片は、本明細書において、以下の交換可能な用語により言及する：「自家移植片（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）」、「ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｔｒａｎｓｐｌａｎｔ」、「ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｉｍｐｌａｎｔ」、及び「ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｇｒａｆｔ」。同じ種の遺伝的に異なる個体由来の細胞を含む移植片は、本明細書において、以下の交換可能な用語により言及する：「同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）」、「ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃｔｒａｎｓｐｌａｎｔ」、「ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃｉｍｐｌａｎｔ」、及び「ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃｇｒａｆｔ」。個体から彼の一卵性双生児への移植片は、本明細書において「同系移植片（ｉｓｏｇｒａｆｔ）」、「ｓｙｎｇｅｎｅｉｃｔｒａｎｓｐｌａｎｔ」、「ｓｙｎｇｅｎｅｉｃｉｍｐｌａｎｔ」、又は「ｓｙｎｇｅｎｅｉｃｇｒａｆｔ」と言及する。「異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）」、「ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃｔｒａｎｓｐｌａｎｔ」、又は「ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃｉｍｐｌａｎｔ」は、異なる種の一個体から別の個体への移植片を指す。

本明細書で使用するように、用語「組織移植」及び「組織再構築」は両方とも、組織欠損（例えば肺欠損又は軟部組織欠損など）を処置又は軽減するために移植片を個体に移植することを指す。

「個体」、「患者」、又は「被験体」は、本明細書で使用する用語として、任意の動物種（鳥類、ヒト、及び他の霊長類を含むが、これらに限定しない）のメンバー、及び他の哺乳動物（商業的に関連する哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌなどを含む）を含む。好ましくは、被験体はヒトである。

本明細書で使用するように、用語「医薬的組成物」は、本発明の少なくとも１つの化合物と他の化学成分及び実体（例えば担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、及び／又は賦形剤など）の混合物を指す。医薬的組成物により、生物への化合物の投与が促される。化合物を投与する複数の技術が当技術分野に存在する（静脈内、経口、エアロゾル、非経口、眼科、肺、及び局所投与を含むが、これらに限定しない）。

「医薬的に許容可能な」は、薬理学的／毒物学的観点から患者に、及び組成、製剤、安定性、患者の受け入れ、及びバイオアベイラビリティーに関する物理的／化学的観点から製薬化学者に許容可能な特性及び／又は物質を指す。「医薬的に許容可能な担体」は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、それが投与される宿主に対して毒性のない担体を指す。

本明細書で使用するように、用語「医薬的に許容可能な担体」は、意図された機能を実施しうるように、患者内又は患者に本発明の範囲内で有用な化合物の運搬又は輸送に含まれる、医薬的に許容可能な材料、組成物、又は担体（例えば液体又は固体の充填剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、又はカプセル化材料など）を意味する。典型的には、そのような構築物は、１つの器官、又は身体の一部から、別の器官又は身体の部分に運搬又は輸送される。各々の担体は、製剤の他の成分（本発明の範囲内で有用な化合物を含む）と適合し、患者に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。医薬的に許容可能な担体として役立ちうる材料の一部の例は、以下を含む：糖類（例えば乳糖、グルコース、及びスクロースなど）；デンプン（例えばトウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなど）；セルロース及びその誘導体（例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなど）；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤（例えばカカオバター及び坐薬ワックスなど）；油（例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油など）；グリコール（例えばプロピレングリコールなど）；ポリオール（例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなど）；エステル（例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなど）；寒天；緩衝剤（例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなど）；界面活性剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張性生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；及び医薬製剤に用いる他の非毒性適合物質。本明細書で使用するように、「医薬的に許容可能な担体」はまた、本発明の範囲内で有用な化合物の活性と適合する任意の及び全てのコーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、及び吸収遅延剤などを含む。補充活性化合物も組成物中に組み入れてもよい。「医薬的に許容可能な担体」は、本発明の範囲内で有用な化合物の医薬的に許容可能な塩をさらに含みうる。本発明の実行において使用する医薬的組成物に含まれうる他の追加成分は、当技術分野で公知であり、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences（Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA）に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書で使用する「サンプル」又は「生物学的サンプル」は、被験体由来の生物学的材料（器官、組織、エキソソーム、血液、血漿、唾液、尿、及び他の体液を含むが、これらに限定しない）を意味する。サンプルは、被験体から得られた任意の材料源でありうる。

本明細書で使用するように、疾患、欠損、障害、又は状態を「軽減する」は、疾患、欠損、障害、又は状態の１つ又は複数の症状の重症度を低減させることを意味する。

本明細書で使用するように、「処置する」は、疾患、欠損、障害、又は有害状態などの症状が患者により経験される頻度を低減することを意味する。

本明細書で使用するように、「治療有効量」は、組成物が投与される個体に有益な効果を提供するのに十分な本発明の組成物の量である。

本明細書で使用するように、用語「成長培地」は、細胞の成長を促進する培地を指すことを意味する。成長培地は一般的に動物血清を含む。一部の例では、成長培地は動物血清を含まなくてもよい。

「分化培地」は、本明細書では、完全に分化していない幹細胞、胎児肺細胞、又は他のそのような前駆細胞が、培地中でインキュベートされた場合に分化細胞の特徴の一部又は全てを有する細胞に発生する、添加剤を含む又は添加剤を欠く細胞成長培地を指す。

「単離細胞」は、組織又は哺乳動物において単離細胞を自然に伴う他の成分及び／又は細胞から分離された細胞を指す。

本明細書中で使用するように、「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。このように、実質的に精製された細胞は、天然に生じる状態で通常会合している他の細胞型から精製された細胞を指す。

本明細書で使用するように、「組織工学」は、組織置換又は再構築における使用のための生体外で組織を生成するプロセスを指す。組織工学は、「再生医療」の一例であり、生物工学的材料及び技術と共に、細胞、遺伝子、又は他の生物学的構成要素の組み入れによる組織及び器官の修復又は置換へのアプローチを包含する。

本明細書中で使用するように、「内因性」は、生物、細胞、もしくは系からの、又はそれらの内部で産生される任意の物質を指す。

「外因性」は、生物、細胞、もしくは系中に導入される、又はそれらの外部に産生される任意の物質を指す。

本明細書で使用するように、「創傷治癒」は、任意の疾患、障害、症候群、異常、病状、もしくは皮膚及び／又は下層の結合組織の異常な状態により特徴付けられる全ての障害、例えば、機械的損傷により起こされる皮膚創傷、手術後の皮膚創傷、機械的外傷、腐食剤、又は火傷により起こされる皮膚擦過傷、白内障手術又は角膜移植後の角膜、感染又は薬物療法後の粘膜上皮創傷（例、呼吸器、胃腸、泌尿生殖器、乳房、口腔、眼組織、肝臓、及び腎臓）、糖尿病性創傷、移植後の皮膚創傷、及び血管形成術後の血管の再成長を含むことを意図する。

範囲：本開示を通じて、本発明の種々の態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式の記載は、便宜上のものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきではないことを理解する必要がある。したがって、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能な部分範囲並びに個々の数値を具体的に開示するものとみなすべきである。例えば、範囲の記載、例えば１〜６は、部分範囲、例えば１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜７など、並びにその範囲内の個々の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６などを具体的に開示するものとみなすべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用する。

説明
本発明は、組織工学及び創傷治癒の目的のために大豆由来タンパク質を使用する組成物及び方法を提供する。一態様では、本発明は、例えば、ヒドロゲル、エレクトロスピン足場などを含む足場を含み、この足場は大豆タンパク質単離物及び／又はその生物活性成分を含む。一態様では、本発明は、粉末、軟膏、ゲル、ペーストなどを含む局所組成物を含み、この組成物は大豆タンパク質単離物及び／又はその生物活性成分を含む。本発明は、大豆由来タンパク質単離物及び／又はその生物活性成分を含む生体材料を生成する手段を提供する。そのような生体材料は、組織工学、薬物送達、創薬、治療、及び他の研究目的における足場として使用することができる。

特定の実施形態では、本発明の大豆タンパク質単離物は、水溶性大豆タンパク質単離物（ＷＳｓｏｙ）及び／又はその生物活性成分を含む。本明細書に記載するように、ＷＳｓｏｙは、従来の大豆タンパク質単離物よりも特に安全性、経済性、及び実用性での利点を有する。

植物由来の生物活性化合物（栄養補助食品）全般、特に大豆／植物の創傷治癒特性の試験は初期段階にある。以前の試験では、従来の大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）に焦点を当てており、ＳＰＩの有益な効果の多くがＳＰＩに含まれる植物性エストロゲン／イソフラボノイドに端を発しうることが実証されている。エストロゲン類似体であるため、植物エストロゲン（例えばゲニステインなど）の使用により、それ自体の課題が提起される。

本明細書には、創傷治癒のための大豆タンパク質単離物（ＷＳｓｏｙ）の水溶性製剤を使用した組成物及び方法を記載している。ＷＳｓｏｙは、安価で再生可能な「グリーンな」原材料であり、イソフラボノイドを欠いている。ＷＳｓｏｙ由来の生物活性／再生治療法の開発により、材料がもはや植物性エストロゲンを含まないため、大豆ベースの創傷治癒技術のパラダイムが変化するであろう。イソフラボノイド／植物エストロゲンを欠く水溶性大豆タンパク質単離物の最近の可用性により、創傷治癒のモデルにおけるこの複合タンパク質混合物及び／又はその成分の治療的寄与を研究する機会が与えられる。

ＷＳｓｏｙは異なる大豆タンパク質及び／又はその分解産物中に存在する再生性の生物活性を持つことを本明細書に記載している。さらに、生物活性タンパク質ＷＳｓｏｙ成分が、異なる細胞シグナル伝達経路による皮膚細胞の複雑な皮膚創傷治癒挙動に影響を及ぼしうることを本明細書で実証している。本明細書中に提示される実験では、ＷＳｓｏｙ中の生物活性タンパク質成分の分離が実証され、個々のＷＳｓｏｙタンパク質画分が創傷治癒に関与するそれらの活性を発揮する異なる作用機構の一部が明らかになっている。

一実施形態では、本発明は、皮膚細胞の移動を強力に刺激する本明細書で画分５と言及するペプチド画分の使用に関する。本明細書で使用するように、画分５は、生物活性ペプチド画分又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を指しうる。画分５はＷＳｓｏｙに由来することを本明細書に記載しているが、画分５は任意のＳＰＩ製剤から誘導されうることが本明細書において熟慮される。本明細書に記載する実験では、画分５の生物活性成分画分（ＢＣＦ）をＢＣＦ５−５と言及してもよい。

特定の例では、画分５は、溶出の直線勾配（４５分間にわたる０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を使用し、Ｃ１８カラムを用いたＷＳｓｏｙの逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分離を使用して溶出することができるペプチド画分を含む。このタンパク質画分は、２３０nmでのＵＶ検出により同定される、約２５〜３５分の保持時間で溶出する。追加の分析では、このタンパク質画分のゼータ電位が１７．９±１．２ｍＶであることが示されている。

一実施形態では、本発明は、創傷治癒に含まれるインテグリンに強く選択的に結合する、本明細書において画分９と言及するペプチド画分の使用に関する。本明細書で使用するように、画分９は、生物活性ペプチド画分又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を指しうる。画分９がＷＳｓｏｙに由来することを本明細書に記載しているが、画分９は任意のＳＰＩ製剤に由来しうることを本明細書において熟慮する。本明細書に記載する実験では、画分９の生物活性成分画分をＢＣＦ９−４と言及してもよい。

特定の例において、画分９は、溶出の直線勾配（４５分間にわたる０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を使用し、Ｃ１８カラムを用いたＷＳｓｏｙの逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分離を使用して溶出することができるペプチド画分を含む。このタンパク質画分は、２３０nmでのＵＶ検出により同定される、約３５〜４０分の保持時間で溶出する。追加の分析では、このタンパク質画分のゼータ電位が３４．２±０．７mVであることが示されている。特定の実施形態において、画分９は、ベータ−コングリシニン（βＣＧ）のアルファプライム鎖又はそのフラグメントを含む。

特定の例において、生物活性ペプチド画分をさらに精製し、より小さなタンパク質画分又は亜画分を得てもよい。亜画分はβコングリシニンなどの最も高い生物活性を有するペプチドを含みうる。βコングリシニンは、インテグリン結合のために重要であり、哺乳動物組織への植物タンパク質の結合を可能にするＬＤＶモチーフを含む。一部の実施形態では、本発明は、ＬＤＶモチーフを含むペプチド又はそのフラグメントに関する。一実施形態では、本発明は、生物活性ペプチド亜画分の使用に関する。

このように、本発明はまた、本明細書に開示するペプチドと実質的な相同性を有する任意のペプチドを含むと解釈すべきである。好ましくは、「実質的に相同」であるペプチドは、本明細書に開示するペプチドのアミノ酸配列と約５０%相同、より好ましくは約７０%相同、さらにより好ましくは約８０%相同、より好ましくは約９０%相同、さらにより好ましくは約９５%相同、さらにより好ましくは約９９%相同である。

ペプチドは、あるいは、組換え手段により、又はより長いポリペプチドからの切断により作製してもよい。ペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定により確認してもよい。

本発明に従ったペプチドの変異体は（ｉ）アミノ酸残基の１つ又は複数が保存された又は保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されており、そのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされるものであっても、そうでなくてもよい変異体、（ｉｉ）１つ又は複数の修飾アミノ酸残基、例えば、置換基の付着により修飾された残基が存在する変異体、（ｉｉｉ）ペプチドが本発明のペプチドの選択的スプライスバリアントである変異体、（ｉｖ）ペプチドのフラグメント、及び／又は（ｖ）ペプチドが別のペプチド、例えばリーダー配列もしくは分泌配列など、又は精製（例えば、Ｈｉｓタグ）もしくは検出（例えば、Ｓｖ５エピトープタグ）のために用いられる配列と融合している変異体である。フラグメントは、本来の配列のタンパク質分解的切断（マルチサイトタンパク分解を含む）を介して生成されたペプチドを含む。変異体を翻訳後に又は化学的に修飾してもよい。そのような変異体は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあるとみなされる。

当技術分野で公知であるように、２つのペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換物を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定する。変異体は、本来の配列とは異なる、好ましくは本来の配列とは目的のセグメントあたり残基の４０%未満が異なる、より好ましくは本来の配列とは目的のセグメントあたり残基の２５%未満が異なる、より好ましくは目的のセグメントあたり残基の１０%未満が異なる、最も好ましくは本来のタンパク質配列とは目的のセグメントあたりわずか数残基が異なり、同時に本来の配列の機能性を保持するために本来の配列と十分に相同であるペプチド配列を含むと定義する。本発明は、本来のアミノ酸配列と少なくとも６０%、６５%、７０%、７２%、７４%、７６%、７８%、８０%、９０%、又は９５% 類似している又は同一であるアミノ酸配列を含む。２つのペプチド間の同一性の程度は、コンピュータアルゴリズム及び当業者に公知である方法を使用して決定する。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)）を使用して決定する。

このように、ＷＳｓｏｙ及びＳＰＩの生物活性ペプチド成分は、異なる製剤（例えば粉末、溶液、フィルム、スプレー、ローション、軟膏、ヒドロゲル、及び繊維創傷マトリックスなど）を単独で、又は他の薬物（抗生物質、抗炎症薬、鎮痛薬など）と組み合わせることにより、創傷治癒薬物のための新規治療法／薬物に開発することができる。

構成
本発明は、ＷＳｓｏｙ及びＳＰＩの生物活性ペプチド成分を使用して創傷治癒を促進することができるとの発見に基づく。このように、本発明は、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む創傷治癒及び組織工学適用のための組成物を提供する。種々の実施形態において、組成物がＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む、粉末、溶液、ゲル、ペースト、ローション、ヒドロゲル、マイクロスフェア、又はエレクトロスピン足場を含む。

本明細書で使用するように、用語「大豆材料」は、大豆に由来する材料として定義する。用語「大豆」は、グリシンｍａｘ、グリシンｓｏｊａ、又はグリシンｍａｘと性的に交差適合性のある任意の種を指す。

本明細書で使用する用語「大豆タンパク質単離物」は、大豆タンパク質産業に対して従来の意味で使用する。例えば、大豆タンパク質単離物は、水分を含まない少なくとも９０%の大豆タンパク質のタンパク質含量を有する大豆材料である。「単離大豆タンパク質」は、当技術分野で使用するように、本明細書中で使用し、当技術分野で使用される「大豆タンパク質単離物」と同じ意味を有する。大豆タンパク質単離物は、子葉から大豆の外皮及び胚芽を除去し、子葉を剥離又は粉砕し、フレーク状にした又は粉砕した子葉から油を除去し、子葉の大豆タンパク質及び炭水化物を子葉繊維及び脂質から分離し、その後、炭水化物から大豆タンパク質を分離することにより大豆から形成させる。特定の実施形態では、結果として得られた材料をエタノールで洗浄し、特定の割合のイソフラボノイドを除去する。

一実施形態では、大豆ベースの組成物は、大豆タンパク質及び大豆子葉繊維を含む繊維状材料を含む。繊維状材料は、一般的に、脱脂大豆タンパク質材料及び大豆子葉繊維を含む。繊維状材料は、大豆タンパク質材料及び大豆子葉繊維を押し出すことにより産生する。繊維状材料は６%〜８０%の含水量を有する。繊維材料の産生において用いる水分条件は、低水分繊維材料（６%〜３５%）及び高水分繊維材料（５０%〜８０%）である。追加成分は、大豆タンパク質材料及び大豆子葉繊維を用いて押し出してもよい（例えば小麦グルテン、デンプン、及びクニッツタンパク質阻害剤など）。

大豆タンパク質単離物は低分子量分布を有する高加水分解大豆タンパク質単離物ではないはずである。なぜなら、高加水分解大豆タンパク質単離物は、プロセスにおいてタンパク質繊維を適切に形成するためのタンパク質鎖長を欠くためである。高加水分解大豆タンパク質単離物は、しかし、組み合わせた大豆タンパク質分離物の高加水分解大豆タンパク質単離物の含量が、組み合わされた大豆タンパク質単離物の４０重量%未満であれば、他の大豆タンパク質単離物と組み合わせて使用することができる。

利用された大豆タンパク質単離物は、単離物中のタンパク質が電気処理時に繊維を形成するのに十分な保水能力を有する必要がある。大豆タンパク質単離物の保水能力は、水和時にタンパク質が受ける膨潤量の測定値である。タンパク質の膨潤は、タンパク質が分子間接触を形成して繊維形成が起こることを可能にするのに十分である必要がある。本発明の方法において使用する大豆タンパク質単離物は、好ましくは、ｐＨ７．０で大豆タンパク質単離物（そのまま）のグラムあたり少なくとも４．０グラムの保水能力を有し、より好ましくはｐＨ７．０で大豆タンパク質単離物（そのまま）のグラムあたり少なくとも５．０グラムの保水能力を有する。保水能力は遠心分離法により決定する。

本発明において有用な大豆タンパク質単離物１グラムあたり少なくとも水４．０グラムの保水能力を有する非高度加水分解大豆タンパク質単離物が市販されている。

繊維状材料において有用な大豆タンパク質単離物を、大豆タンパク質製造産業における従来のプロセスに従って大豆から産生してもよい。そのようなプロセスの例として、大豆全体を、従来のプロセスに従って、最初に離解し、割砕し、脱皮し、脱胚し、脱脂し、大豆フレーク、大豆粉、粗びき大豆、又は大豆ミールを形成する。大豆を磁気分離器に通過させて鉄、鋼、及び他の磁気感受性物体を除去し、続いて徐々に細かくなるメッシュスクリーン上で大豆を撹拌し、土壌残留物、鞘、茎、雑草種子、小さすぎる豆、他のゴミを除去することにより大豆を離解してもよい。離解大豆は、大豆を割砕ロールに通過させることにより割砕してもよい。割砕ロールは、大豆がロールを通過する際に殻を弛緩させ、大豆材料をいくつかの片に割砕するスパイラルカットの波形シリンダである。割砕大豆は、次に、吸引により脱皮することができる。脱皮大豆は、十分に小さいメッシュサイズのスクリーン上で脱皮大豆を撹拌し、小さなサイズの胚を除去し、豆のより大きな子葉を保持することにより、脱胚される。子葉を、次に、剥離ロールに通過させることにより子葉をフレーク状にする。フレーク状子葉は、フレークから油を機械的に排出することにより、又はフレークをヘキサンもしくは他の適切な親油性／疎水性溶媒と接触させることにより、フレークから油を抽出することにより脱脂する。脱脂フレークは、所望の場合、粉砕して大豆粉、粗びき大豆、又は大豆ミールを形成してもよい。

脱脂された大豆フレーク、大豆粉、粗びき大豆、又は大豆ミールは、次に、アルカリ性水溶液、典型的には７．５〜１１．０のｐＨを有する希釈水酸化ナトリウム水溶液で抽出され、アルカリ性水溶液中で可溶性タンパク質を不溶物から抽出する。不溶物は、主に不溶性炭水化物で構成される大豆子葉繊維である。可溶性タンパク質を含む水性アルカリ性抽出物を、その後、不溶物から分離し、抽出物を次に酸で処理し、抽出物のｐＨを大豆タンパク質の等電点付近に、好ましくはｐＨ４．０〜５．０に、最も好ましくはｐＨ４．４〜４．６に低下させる。大豆タンパク質は、その等電点又はその近辺の水溶液中でのタンパク質の溶解性の欠如のため、酸性化抽出物から沈殿する。沈殿したタンパク質凝固物を次に、残りの抽出物から分離する。分離されたタンパク質を水で洗浄し、残留可溶性炭水化物及び灰分をタンパク質材料から除去してもよい。分離されたタンパク質を次に、従来の乾燥手段（例えば噴霧乾燥又はトンネル乾燥など）を使用して乾燥させ、大豆タンパク質単離物を形成する。

特定の実施形態では、大豆タンパク質単離物は、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコールなどで洗浄してもよく、これによりイソフラボノイド（例えばゲニステインなど）が除去されるが、生物活性画分Ｐｒｏｋｉｎｅｔ及び画分９は除去されない。

大豆タンパク質濃縮物を大豆タンパク質単離物と混ぜて、大豆タンパク質単離物の一部を大豆タンパク質の供給源として代替してもよい。大豆タンパク質単離物は、一般的に、大豆タンパク質濃縮物よりも高い保水能力を有し、より良好な繊維を形成する。従って、大豆タンパク質単離物に代替される大豆タンパク質濃縮物の量は、押出物中で有意な繊維形成を可能にする量に限定すべきである。好ましくは、大豆タンパク質濃縮物を大豆タンパク質単離物の一部について代替した場合、大豆タンパク質濃縮物は多くとも大豆タンパク質単離物の４０重量%まで、より好ましくは大豆タンパク質単離物の３０重量%まで代替される。

繊維状材料において有用な大豆タンパク質濃縮物が市販されている。本発明において有用な大豆タンパク質濃縮物はまた、大豆タンパク質製造産業における従来のプロセスに従って大豆から産生してもよい。例えば、上に記載するようにして産生された脱脂大豆フレーク、大豆粉、粗びき大豆、又は大豆ミールは、大豆タンパク質及び大豆繊維から可溶性炭水化物を除去するために水性エタノール（好ましくは６０%〜８０%水性エタノール）で洗浄してもよい。大豆タンパク質及び大豆繊維含有材料をその後に乾燥させ、大豆タンパク質濃縮物を産生する。あるいは、脱脂大豆フレーク、大豆粉、粗びき大豆、又は大豆ミールは、大豆タンパク質及び大豆繊維から可溶性炭水化物を除去するために、４．３〜４．８のｐＨを有する水性酸性洗浄液で洗浄してもよい。大豆タンパク質及び大豆繊維含有材料をその後に乾燥させて、大豆タンパク質濃縮物を産生する。

繊維状材料に利用される大豆子葉繊維は、大豆タンパク質材料と大豆子葉繊維との混合物が同時に押出された場合、水と効果的に結合する必要がある。水を結合することにより、大豆子葉繊維は、押出物が冷却ダイを通じて押出され、それによりタンパク質繊維の形成が促進されるため、押出物を横切り粘性勾配が誘導される。本発明のプロセスの目的のために水と効果的に結合するためには、大豆子葉繊維は、大豆子葉繊維１グラムあたり少なくとも水５．５０グラムの保水能力を有する必要があり、好ましくは、大豆子葉繊維は大豆子葉繊維１グラムあたり少なくとも６．０グラムの保水能力を有する。また、大豆子葉繊維は、大豆子葉繊維１グラムあたり最大８．０グラムの保水能力を有することが好ましい。

大豆子葉繊維は複雑な炭水化物であり、市販されている。本発明のプロセスにおいて有用な大豆子葉繊維は、大豆加工産業における従来のプロセスに従って産生してもよい。例えば、上に記載するようにして産生された脱脂大豆フレーク、大豆粉、粗びき大豆、又は大豆ミールは、大豆タンパク質単離物の産生に関して上に記載したようにアルカリ性水溶液で抽出して不溶性大豆子葉繊維をアルカリ水溶性大豆タンパク質及び炭水化物から分離してもよい。分離された大豆子葉繊維を次に、好ましくは噴霧乾燥により乾燥させて、大豆子葉繊維産物を産生する。大豆子葉繊維は、一般的に、水分を除き、１重量%〜８重量%、好ましくは１．５重量%〜７．５重量%、最も好ましくは２重量%〜５重量%で繊維材料中に存在する。

本明細書に記載するように、本発明は、水溶性大豆タンパク質単離物（ＷＳｓｏｙ）、及びその成分又は画分を含む。特定の実施形態では、水溶性ＳＰＩ溶液を、存在しうる任意の不溶物から分離する。本明細書の他の箇所に記載するように、特定の例では、ＷＳｓｏｙは、従来の大豆タンパク質単離物中に存在するイソフラボノイド／植物エストロゲンのレベル低下を特徴とする。

特定の実施形態では、ＷＳｓｏｙを生物活性成分に画分する。例えば、当技術分野で公知の方法（１Ｄ又は２Ｄ電気泳動、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、二相性イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除クロマトグラフィーを含むが、これらに限定しない）を使用してＷＳｓｏｙを画分してもよい。本明細書の他の箇所に記載するように、特定の実施形態では、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用してＷＳｓｏｙを画分する。例えば、ＷＳｓｏｙは、溶出の直線勾配（０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を用いてＣ１８を使用して分離することができ、１１のタンパク質画分が得られる（図２）。例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣ分画により、有意な創傷治癒特性を呈する少なくとも２つのタンパク質画分（画分５及び画分９と表示する）が得られる。特定の実施形態では、生物活性画分は、画分を再クロマトグラフィーすることによりさらに分画することができる。例えば、画分５は、ＡＣＮの「より平坦な」勾配（１２０分間にわたる３０〜８０%）を使用したＲＰ−ＨＰＬＣＣ１８カラムでの再クロマトグラフィーによりさらに分画することができる。さらに、画分９は、アセトニトリルの「より平坦な」勾配（１２０分間にわたる４０〜８０%）を使用したＲＰ−ＨＰＬＣで再クロマトグラフィーすることによりさらに分画することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載する創傷治癒組成物中への包含のために生物活性画分を精製してもよい。

特定の実施形態では、組成物は、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む粉末を含む。例えば、特定の実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分は、当技術分野で公知の任意の方法（例、米国特許第４，００１，９４４号を参照のこと）を使用して凍結乾燥又は凍結乾燥させてもよい。例えば、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分は、１００%エタノール及びドライアイス中で急速に凍結させ、次に乾燥するまで滅菌凍結乾燥機内で、−２０℃で凍結乾燥させてもよい。

特定の実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を製粉し、刻み、又は微粉に粉砕する。得られる粉末の形成は、当技術分野で公知の任意の方法により行ってもよい。例えば、一実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分は極低温衝撃粉砕機内に配置する。例示的な極低温衝撃粉砕機は、サンプルの粉砕の間に冷却段階及び粉砕段階のサイクルを可能にするSamplePrep 6870 Freezer/Mill（登録商標）である。

一実施形態では、本発明の組成物は、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む溶液を含む。例えば、特定の実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を適切な緩衝液と混合し、溶液に到達させる。特定の実施形態では、溶液のｐＨを調整する。例えば、溶液を約７〜７．５の範囲のｐＨに調節してもよい。

一部の実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を適切な等張緩衝液又は細胞培養培地と混合してもよい。適切な緩衝液として、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ハンクス平衡塩類溶液などが含まれるが、これらに限定されない。適切な細胞培養培地には、ＲＰＭＩ１６４０、フィッシャー培地、イスコフ培地、マッコイ培地、ダルベッコ培地などが含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、組成物は、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含むクリーム、液体、ゲル、スプレー、軟膏などを含む。例えば、特定の実施形態において、組成物は、粉末化又は可溶性ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含むクリーム、液体、ゲル、スプレー、軟膏などを含む。

一実施形態では、組成物は、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む薬物送達担体を含む。例えば、薬物送達担体は、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分と埋め込んでもよい。特定の実施形態では、担体は、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を担体からの制御放出、連続放出、又は遅延放出のために製剤化する。例示的な薬物送達担体には、マイクロスフェア、微小粒子、ナノ粒子、ポリマーゾーム、脂質ナノ粒子、ミセルなどが含まれるが、これらに限定しない。

特定の実施形態では、薬物送達担体は、１つ又は複数のバイオポリマー又は合成ポリマーを含むマイクロスフェアを含む。例えば、一実施形態では、マイクロスフェアはＰＬＧＡを含む。一実施形態では、マイクロスフェアはアルギン酸塩を含む。しかし、本発明は、高分子マイクロスフェアの特定の製剤に限定しない。むしろ、本発明は、溶液中の又はナノ粒子内に埋め込まれたＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分をロードする又は埋め込むことが可能である、当技術分野で公知の任意の適切なマイクロスフェアを包含する。

医薬的組成物
本発明はまた、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む医薬的組成物を提供する。本明細書の他の箇所に記載しているように、本発明は、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分が創傷治癒及び組織再生を増強するとの知見に基づく。製剤は、従来の賦形剤、即ち、創傷又は処置部位への投与のために適切な医薬的に許容可能な有機又は無機の担体物質との混合物中で用いてもよい。医薬的組成物は、滅菌し、所望の場合、補助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝に影響を与える塩、着色剤、及び／又は芳香物質などと混合してもよい。それらはまた、所望の場合、他の活性薬剤、例えば抗炎症剤、抗生物質、又は鎮痛剤と組み合わせてもよい。

本明細書で使用するように、「追加成分」には以下の１つ又は複数を含むが、これらに限定しない：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；顆粒化剤及び崩壊剤；結合剤；潤滑剤；着色剤；防腐剤；生理学的に分解可能な組成物（例えばゼラチンなど）；水性担体及び溶媒；油性担体及び溶媒；懸濁剤；分散剤又は湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生剤；抗真菌剤；安定剤；及び医薬的に許容可能なポリマー又は疎水性材料。本発明の医薬的組成物中に含まれてもよい他の「追加成分」は、当技術分野において公知であり、例えば、Genaro, ed.（1985, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA）に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。

一実施形態では、組成物は、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分の１つ又は複数の成分の分解を阻害する抗酸化剤及びキレート剤を含む。一部の化合物についての好ましい酸化防止剤は、組成物の総重量の約０．０１重量%〜０．３重量%の好ましい範囲中のＢＨＴ、ＢＨＡ、アルファ−トコフェロール、及びアスコルビン酸、より好ましくは０．０３重量%〜０．１重量%の範囲中のＢＨＴである。好ましくは、キレート剤は、組成物の総重量の０．０１重量%〜０．５重量%の量で存在する。特に好ましいキレート剤は、組成物の総重量の約０．０１重量%〜０．２０重量%、より好ましくは０．０２重量%〜０．１０重量%の範囲中のエデト酸塩（例、エデト酸二ナトリウム）及びクエン酸を含む。キレート剤は、製剤の有効期間に有害でありうる、組成物中の金属イオンをキレート化するのに有用である。ＢＨＴ及びエデト酸二ナトリウムは、一部の化合物についてそれぞれ特に好ましい酸化防止剤及びキレート剤であるが、他の適切な等価の酸化防止剤及びキレート剤を、従って、当業者に公知のように代替してもよい。

液体懸濁液は、水性又は油性担体中のＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分の懸濁を達成するための従来の方法を使用して調製してもよい。水性担体は、例えば、水及び等張性生理食塩水を含む。液体懸濁液は、１つ又は複数の追加成分（懸濁化剤、分散剤又は湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、着香剤、着色剤及び甘味剤を含むが、これらに限定しない）をさらに含みうる。公知の懸濁化剤は、ソルビトールシロップ、硬化食用油脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴム、及びセルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）を含むが、これらに限定しない。公知の分散剤又は湿潤剤は、天然リン脂質（例えばレシチンなど）、アルキレンオキシドと脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸及びヘキシトールから由来する部分エステルとの、又は脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合産物（例、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を含むが、これらに限定しない。公知の乳化剤は、レシチン及びアカシアゴムを含むが、これらに限定しない。公知の保存剤は、メチル、エチル、又はｎ−プロピル−パラ−ヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸、及びソルビン酸を含むが、これらに限定しない。

本発明の医薬的組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載する成分の各々を含んでもよく、懸濁剤は必ずしも溶媒中での活性成分の溶解を助長しないことが理解される。水性溶媒は、例えば、水及び等張性生理食塩水を含む。

本発明の医薬的組成物は、水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンの形態で調製、包装、又は販売してもよい。油性相は、植物油（例えばオリーブ油又はラッカセイ油など）、鉱油（例えば流動パラフィンなど）、又はこれらの組み合わせでありうる。そのような組成物は、１つ又は複数の乳化剤、例えば天然ガム（例えばアカシアゴム又はトラガカントゴムなど）、天然リン脂質（例えば大豆又はレシチンリン脂質など）、脂肪酸及びヘキシトール無水物との組み合わせから由来するエステル又は部分エステル（例えばソルビタンモノオレエートなど）、及びそのような部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなど）をさらに含んでもよい。

材料を化学組成物で含浸又は被覆する方法は、当技術分野において公知であり、化学組成物を表面上に沈着又は結合させる方法、材料の合成の間に化学組成物を材料の構造中に組み入れる方法（即ち、生理学的に分解可能な材料を用いる、など）、及びその後の乾燥の有無を問わず、及び水性又は油性の溶液又は懸濁液を吸収材料中に吸収させる方法を含むが、これらに限定しない。

特定の例では、本発明の組成物の１つの利点は、それが不規則で深い創傷を充填する能力を有することである。このように、一実施形態では、医薬的組成物は、創傷又は組織再生を必要とする部位に局所適用しうる。

局所投与のための適切な製剤は、液体又は半液体製剤、例えばリニメント剤、ローション、水中油又は油中水型エマルジョン（例えばヒドロゲル、クリーム、軟膏又はペーストなど）、及び溶液又は懸濁液が含まれるが、これらに限定されない。局所的に投与可能な製剤は、例えば、約１%〜約１０%（w/w）の活性成分を含むことができるが、活性成分の濃度は、賦形剤の存在において溶媒中の活性成分の溶解限界と同じくらい高くてもよい。局所投与のための製剤は、本明細書に記載する追加成分の１つ又は複数をさらに含んでもよい。

浸透増強剤を使用してもよい。これらの材料により、皮膚を横切る薬物の浸透速度が増加する。当技術分野における典型的な増強剤は、エタノール、グリセロールモノラウレート、ＰＧＭＬ（ポリエチレングリコールモノラウレート）、ジメチルスルホキシドなどが含まれる。他の増強剤には、オレイン酸、オレイルアルコール、エトキシジグリコール、ラウロカプラム、アルカンカルボン酸、ジメチルスルホキシド、極性脂質、又はＮ−メチル−２−ピロリドンを含む。

本発明の組成物の一部の局所送達のための１つの許容可能な担体は、リポソームを含みうる。リポソームの組成及びその使用は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第６，３２３，２１９号を参照のこと）。

代替の実施形態では、局所投与のための適切な製剤は、場合により、他の成分（例えばアジュバント、酸化防止剤、キレート剤、界面活性剤、発泡剤、湿潤剤、乳化剤、粘性付与剤、緩衝剤、防腐剤など）と組み合わせてもよい。別の実施形態では、透過又は浸透増強剤が組成物中に含まれ、浸透増強剤を欠く組成物に対して角質層中への及びそれを通じた経皮浸透を改善する際に効果的である。種々の透過増強剤（オレイン酸、オレイルアルコール、エトキシジグリコール、ラウロカプラム、アルカンカルボン酸、ジメチルスルホキシド、極性脂質、又はＮ−メチル−２−ピロリドンを含む）及びそれらの製剤は当業者に公知である。別の態様では、組成物は、角質層の構造における障害を増加させるように機能するハイドロトロープ剤をさらに含み、このように、角質層を横切り輸送を増加させることが可能になる。種々のヒドロトロープ剤（例えばイソプロピルアルコール、プロピレングリコール、又はキシレンスルホン酸ナトリウムなど）が当業者に公知である。

局所投与のための適切な製剤は、所望の変化に影響を及ぼすのに効果的な量で適用すべきである。本明細書中で使用するように、「効果的な量」は、変化が望ましい皮膚表面の領域を覆うのに十分な量を意味するものとする。活性化合物は、組成物の約０．０００１重量%〜約５０重量%の量で存在する必要がある。より好ましくは、それは組成物の約０．０００５%〜約１５%の量で存在する必要がある；最も好ましくは、それは組成物の約０．００１%〜約５%の量で存在する必要がある。そのような化合物は、合成的に又は天然に由来しうる。

別の実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む医薬的組成物は、包帯又はドレッシング材に適用してもよく、次に被験体の創傷又は治療部位に適用する。例えば、一実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む液体溶液又は液体懸濁液中にドレッシング材を浸漬する。別の実施形態において、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む軟膏を、ドレッシング材又は包帯の表面に適用する。

別の実施形態では、医薬的組成物は、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含むエアロゾル化又は噴霧化された溶液又は懸濁液を含む。そのようなエアロゾル化又はエアロゾル化された製剤は、分散時に、好ましくは約０．１〜約２００ナノメートルの範囲の平均粒子又は液滴サイズを有し、本明細書に記載する追加成分の１つ又は複数をさらに含んでもよい。本明細書に記載する製剤の例は網羅的ではなく、本発明が、これら及び、本明細書に記載していないが、当業者に公知である他の製剤の追加修飾を含むことが理解される。

足場
本発明は、工学的適用のために有用な生体材料の生成のためのＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分の使用を提供する。本明細書に記載するように、ＷＳｓｏｙ及びその生物活性成分は、細胞移動、細胞増殖、及び血管新生を支持する足場の産生において使用することができ、このように、創傷治癒を含む様々な組織工学的適用において使用することができる。

例えば、一実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を足場内に組み入れる。一実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を足場の表面に適用する。本発明の足場は、当技術分野において公知の任意の型の足場でありうる。そのような足場の非限定的な例には、ヒドロゲル、エレクトロスピン足場、泡、メッシュ、シート、パッチ、及びスポンジが含まれる。

ヒドロゲル
一実施形態では、本発明は、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含むヒドロゲルを提供する。ヒドロゲルは、一般的に多量の液体を吸収することができ、平衡状態では、典型的には６０〜９０%の液体及び１０〜３０%のポリマーだけで構成される。好ましい実施形態では、ヒドロゲルの含水量は約７０〜８０%である。ヒドロゲルは、架橋ポリマーネットワークでの固有の生体適合性のため、特に有用である（Hill-West, et al.,1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5967-5971）。ヒドロゲルの生体適合性は、親水性及び多量の生物学的液体を浸す能力に起因しうる（Brannon-Peppas. Preparation and Characterization of Cross-linked Hydrophilic Networks in Absorbent Polymer Technology, Brannon-Peppas and Harland, Eds. 1990, Elsevier: Amsterdam, pp 45-66; Peppas and Mikos. Preparation Methods and Structure of Hydrogels in Hydrogels in Medicine and Pharmacy, Peppas, Ed. 1986, CRC Press: Boca Raton, Fla., pp 1-27）。ヒドロゲルは、親水性バイオポリマー又は合成ポリマーを架橋することにより調製してもよい。親水性バイオポリマーの物理的又は化学的架橋から形成されたヒドロゲルの例は、ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸塩、コラーゲン、デキストラン、ペクチン、カラゲナン、ポリリジン、ゼラチン、又はアガロースを含むが、これらに限定しない（W. E. Hennink and C. F. van Nostrum, 2002, Adv. Drug Del. Rev. 54, 13-36 and A. S. Hoffman, 2002, Adv. Drug Del. Rev. 43, 3-12を参照のこと）。これらの材料は、直鎖状又は分枝状の多糖類又はポリペプチドで作製される高分子量主鎖からなる。化学的又は物理的架橋性合成ポリマーの基づくヒドロゲルの例は、（メタ）アクリレート−オリゴラクチド−ＰＥＯ−オリゴラクチド−（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＯ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＯ）、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯコポリマー（Pluronics）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（Ｎビニルピロリドン）、ＰＬ（Ｇ）Ａ−ＰＥＯ−ＰＬ（Ｇ）Ａコポリマー、ポリ（エチレンイミン）などを含むが、これらに限定しない（A. S Hoffman, 2002, Adv. Drug Del. Rev, 43, 3-12を参照）。

一実施形態では、ヒドロゲルは少なくとも１つのバイオポリマーを含む。他の実施形態では、ヒドロゲル足場は、少なくとも２つのバイオポリマーをさらに含む。さらに他の実施形態では、ヒドロゲル足場は、少なくとも１つのバイオポリマー及び少なくとも１つの合成ポリマーを含む。

ヒドロゲルは、天然生存細胞外マトリックスに密接に似ている（Ratner and Hoffman. Synthetic Hydrogels for Biomedical Applications in Hydrogels for Medical and Related Applications, Andrade, Ed. 1976, American Chemical Society: Washington, D.C., pp 1-36）。ヒドロゲルは、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、又はＰＧＡポリマーを組み入れることによりインビボで分解可能にしてもよい。さらに、ヒドロゲルは、表面修飾のために、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、又は、例えばＲＧＤで修飾しもよく、これらにより細胞接着及び増殖が促進されうる（Heungsoo Shin, 2003, Biomaterials 24:4353-4364; Hwang et al., 2006 Tissue Eng. 12:2695-706）。実際に、分子量、ブロック構造、分解可能な結合、及び架橋様式を変化させることで、インスタントヒドロゲルの強度、弾性、及び分解特性に影響を及ぼしうる（Nguyen and West, 2002, Biomaterials 23(22):4307-14; Ifkovits and Burkick, 2007, Tissue Eng. 13(10):2369-85）。

ヒドロゲルはまた、種々のタンパク質（例、コラーゲン）又は化合物（例えば治療用薬剤など）を共有結合的に付着するための官能基で修飾してもよい。マトリックスに結合してもよい治療用薬剤は、鎮痛剤、麻酔剤、抗真菌剤、抗生物質、抗炎症剤、駆虫剤、解毒剤、制吐剤、抗ヒスタミン剤、抗高血圧剤、抗マラリア剤、抗菌剤、解熱剤、防腐剤、抗関節炎剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、着色又は蛍光造影剤、コルチコイド（例えばステロイドなど）、診断補助剤、酵素、ホルモンミネラル、副交感神経興奮剤、カリウム補助剤、放射線増感剤、鎮静剤、スルホンアミド、交感神経興奮剤、精神安定剤、血管収縮剤、血管拡張剤、ビタミン、キサンチン誘導体などを含むが、これらに限定しない。治療用薬剤はまた、他の小有機分子、天然で単離された実体もしくはその類縁体、有機金属剤、キレート化金属もしくは金属塩、ペプチドベースの薬物、又はペプチドもしくは非ペプチド受容体標的もしくは結合剤でありうる。マトリックスへの治療的薬剤の結合は、プロテアーゼ感受性リンカー又は他の生分解性結合を介しうることが熟慮される。ヒドロゲルマトリックス中に組み入れてもよい分子は、ビタミン及び他の栄養補助剤；糖タンパク質（例、コラーゲン）；フィブロネクチン；ペプチド及びタンパク質；炭水化物（単一及び／又は複合体の両方）；プロテオグリカン；抗原；オリゴヌクレオチド（センス及び／又はアンチセンスＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）；抗体（例えば、感染性物質、腫瘍、薬物、又はホルモン）；及び遺伝子治療試薬を含むが、これらに限定しない。

特定の実施形態では、１つ又は複数の多官能性架橋剤は、バイオポリマー又は合成ポリマーを共有結合する反応性部分として利用されうる。そのような二官能性架橋剤には、グルタルアルデヒド、ゲニピン、エポキシド（例、ビス−オキシラン）、酸化デキストラン、ｐアジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、ｐアジドフェニルグリオキサール一水和物、ビス−［β（４アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、ジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート］、ジスクシンイミジルスベレート、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、及び当業者に公知の二官能性架橋剤を含みうる。ヒドロゲルの機械的特性は、架橋時間及び架橋剤の量により大きく影響されることが当業者には理解されるはずである。

架橋剤を利用する別の実施形態では、ポリアクリル化材料（例えばエトキシル化（２０）トリメチルプロパントリアクリレートなど）を非特異的光活性化架橋剤として使用してもよい。例示的な反応混合物の成分は、３９℃で保持された熱可逆性ヒドロゲル、ポリアクリレートモノマー（例えばエトキシル化（２０）トリメチルプロパントリアクリレートなど）、光開始剤（例えばエオシンＹなど）、触媒剤（例えば１−ビニル−２−ピロリジノンなど）、及びトリエタノールアミンを含みうる。この反応性混合物を長波長光（＞４９８nm）に連続的に暴露することで、架橋ヒドロゲルネットワークが生成される。

一実施形態では、ヒドロゲルは、ヒドロゲル重合を開始させるＵＶ感受性硬化剤を含む。例えば、一実施形態では、ヒドロゲルは、光開始剤４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル−（２−ヒドロキシ−２−プロピル）ケトンを含む。一実施形態では、重合は、ＵＶ光の適用時に４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル−（２−ヒドロキシ−２−プロピル）ケトンにより誘導される。ＵＶ感受性硬化剤の他の例には、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニルプロパン−２−オン、４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル（２−ヒドロキシ−２−フェニル−２−ヒドロキシ−２−プロピル）ケトン、２，２−ジメトキシ−２−フェニル−アセトフェノン１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オン、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、トリメチルベンゾイルジフェニルホスフィンオキシド、及びそれらの混合物を含む。

本発明の安定化された架橋ヒドロゲルマトリックスは、１つ又は複数の増強剤の添加を通じてさらに安定化され、増強されうる。「増強剤」又は「安定化剤」により、さらなる安定性又は機能的利点を提供することによりヒドロゲルマトリックスを増強する、高分子量成分に加えてヒドロゲルマトリックスに加えられる任意の化合物を意図する。高分子量成分と混合され、ヒドロゲルマトリックス内に分散される適切な増強剤には、上で考察した熱可逆性マトリックスに関連して先に記載した添加剤の多くが含まれる。増強剤は、架橋されたヒドロゲルマトリックス中に組み入れられると、さらなる安定性又は機能的利点を提供することによりヒドロゲルマトリックスを増強する任意の化合物、特に極性化合物を含みうる。

安定化された架橋ヒドロゲルマトリックスと使用するための好ましい増強剤には、極性アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体、未変性コラーゲン、及び二価カチオンキレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はその塩など）が含まれる。極性アミノ酸では、チロシン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含むことを意図する。好ましい極性アミノ酸は、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、及びＬ−アルギニンである。各々の特定の好ましい増強剤の適切な濃度は、熱可逆性ヒドロゲルマトリックスに関連する上記のものと同じである。極性アミノ酸、ＥＤＴＡ、及びそれらの混合物は好ましい増強剤である。増強剤は、高分子量成分の架橋前又はその間にマトリックス組成物に加えてもよい。

一実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分がヒドロゲルに組み入れられる。例えば、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を、ゲルのゲル化又は重合前にヒドロゲル溶液に加えてもよい。ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分は、所望の効果を産生するのに望ましい任意の量でヒドロゲル溶液に加えてもよい。一実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分対ヒドロゲル溶液の比率は、約１０：１〜１：１０の範囲である。別の実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分対ヒドロゲル溶液の比率は、約５：１〜１：５の範囲である。別の実施形態では、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分対ヒドロゲル溶液の比率は１：１である。このようにして、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分の成分がヒドロゲル内に散在するようになる。別の実施形態では、重合したヒドロゲルを有効量のＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分で被覆する。一部の実施形態では、ヒドロゲルは、ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分がヒドロゲルの中及びその全体に拡散することを可能にする。

エレクトロスピン足場
本発明は、天然産物（例えば大豆など）からエレクトロスピンされた繊維並びにナノファイバー生体適合性バイオマトリックスを提供する。一部の例では、天然産物をバイオポリマー及び／又は合成ポリマー、例えばポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）などと混ぜて、組織工学足場を産生する。特定の実施形態では、特定のブレンドにより、架橋することなく足場内での細胞の浸透及び増殖を促す、機械的及び物理的特性の独特の混合物が提供される。

本発明の足場は、種々の方法で産生することができる。例示的な実施形態では、足場は、エレクトロスピンにより産生することができる。エレクトロスピンは、静電界と導電性流体との間の相互作用を利用する導電性流体の噴霧プロセスである。導電性流体（例、半希釈ポリマー溶液又はポリマー溶融物）に外部静電界を適用する場合、懸濁した円錐状の小滴が形成され、それによって小滴の表面張力が電場と平衡状態になる。静電場が液体の表面張力に打ち勝つだけ十分に強い場合、静電噴霧が起こる。液滴は次に不安定になり、微小な噴射が液滴の表面から排出される。接地標的に達すると、材料は、比較的細い、即ち、小さな直径の繊維を含む相互接続された蜘蛛の巣状物として収集することができる。これらの小径繊維から結果として得られるフィルム（又は膜）は、非常に大きな表面積対体積比及び小さな孔径を有する。エレクトロスピン装置の詳細な記載を、Zong, et al., 2002 Polymer 43: 4403-4412; Rosen et al., 1990 Ann Plast Surg 25: 375-87; Kim, K., Biomaterials 2003, 24: 4977-85; Zong, X., 2005 Biomaterials 26: 5330-8に提供する。エレクトロスピン後、押出及び成形を利用してポリマーをさらに形作ることができる。整列した繊維状ポリマー足場中に繊維構成を調節するために、パターン化電極、ワイヤードラムコレクター、又は後処理方法（例えば一軸延伸など）の使用が成功している。Zong, X., 2005 Biomaterials 26: 5330-8; Katta, P., 2004 Nano Lett 4: 2215-2218; Li, D., 2005 Nano Lett 5: 913-6。

ＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含むタンパク質溶液は、いくつかの方法のうちの１つで産生することができる。１つの方法は、大豆タンパク質単離物、又はＷＳｓｏｙの生物活性成分を適当な溶媒中に溶解することを含む。このプロセスは、シリンジアセンブリにおいて達成することができ、又はその後、シリンジアセンブリ中にロードすることができる。別の方法は、市販のポリマー溶液又は市販のポリマーを購入し、それらを溶解してポリマー溶液を作製することを含む。例えば、ポリ（エチレンオキサイド）（ＰＥＯ）はSigma（Sigma、ミズーリ州セントルイス）から購入することができ、ポリ−Ｌ−ラクチド（ＰＬＬＡ）はＤｕＰｏｎｔ（デラウェア州ウィルミントン）、ポリ−コ−グリコリド）はＥｔｈｉｃｏｎ（ニュージャージー州ソマービル）から購入することができる。本発明のさらなるポリマー足場成分（例えば細胞及び生体分子など）も供給業者から市販されている。

特定の実施形態では、大豆タンパク質単離物又はＷＳｓｏｙの生物活性成分を最初に溶媒中に溶解する。例えば、一実施形態では、溶媒は水又は他の適切な緩衝液である。特定の実施形態では、溶媒は、過酷な有機溶剤、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、塩化メチレン、ジオキサン、エタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、クロロホルム、１，１，１，２−テトラフルオロエタン３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＰ）、又は氷酢酸などを欠いている。

タンパク質溶液は、場合により、過剰電荷効果を作り、エレクトロスピンプロセスを促す塩を含むことができる。適切な塩の例は、ＮａＣｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＩＯ_３、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４、ＭｇＣｌ_２、ＮａＨＣＯ_３、ＣａＣｌ_２又はこれらの塩の混合物を含む。

導電性流体を形成するタンパク質溶液は、好ましくは約１〜約８０重量%、より好ましくは約８〜約６０重量%の範囲のタンパク質濃度を有する。

エレクトロスピンプロセスにおいて作製される電場は、好ましくは約５〜約１００キロボルト（kV）、より好ましくは約１０〜約５０kVの範囲である。スピナレット（又は電極）に対する導電性流体の供給速度は、好ましくは約０．１〜約１０００マイクロリットル／分、より好ましくは約１〜約２５０マイクロリットル／分の範囲である。

単一又は複数のスピナレットを、調整可能なプラットフォーム上に置き、プラットフォームと接地コレクタ基板との間の距離を変化させる。距離は、ポリマーと接地コレクタ基板との接触前に溶媒が本質的に完全に蒸発することを可能にする任意の距離でありうる。例示的な実施形態では、この距離は１cmから２５cmまで変動することができる。接地コレクタ基板とプラットフォームとの間の距離を増加させることで、より薄い繊維が一般的に産生される。

回転マンドレルが要求されるエレクトロスピンの場合、マンドレルは、しばしばドリルチャックを通じてモータに機械的に取り付ける。例示的な実施形態では、モータは約１回転／分（rpm）〜約５００rpmの速度でマンドレルを回転させる。例示的な実施形態では、モータの回転速度は、約２００rpm〜約５００rpmの間である。別の例示的な実施形態では、モータの回転速度は、約１rpm〜約１００rpmの間である。

エレクトロスピンプロセス及び装置の追加の実施形態又は改変を本明細書に記載する。

本発明はまた、天然材料の組み合わせ、合成材料の組み合わせ、及び天然及び合成材料の組み合わせを含む。組み合わせの例として、異なる型のコラーゲンのブレンド（例えばＩ型とＩＩ型、Ｉ型とＩＩＩ型、ＩＩ型とＩＩＩ型など）；１つ又は複数の型のコラーゲンとフィブリノゲン、トロンビン、エラスチン、ＰＧＡ、ＰＬＡ、及びポリジオキサノンとのブレンド；フィブリノゲンと１つ又は複数の型のコラーゲン、トロンビン、エラスチン、ＰＧＡ、ＰＬＡ及びポリジオキサノンとのブレンドを含むが、これらに限定しない。

本発明の電気処理された材料は、天然材料、合成材料、又はそれらの組み合わせの電気処理から得ることができる。例は、アミノ酸、ペプチド、変性ペプチド（例えば変性コラーゲンからのゼラチンなど）、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、及びプロテオグリカンを含むが、これらに限定されない。

電気処理される一部の好ましい材料は、天然に生じる細胞外マトリックス材料及び天然細胞外マトリックス材料（コラーゲン、フィブリン、フィブリノゲン、トロンビン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、及びケラタン硫酸、並びにプロテオグリカンを含むが、これらに限定しない）のブレンドである。電気処理のための特に好ましい材料は、コラーゲン、フィブリン、フィブリノゲン、トロンビン、フィブロネクチン、及びそれらの組み合わせを含む。使用する一部のコラーゲンは、コラーゲン型Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、及びＸＩＸを含むが、これらに限定しない。一部の好ましいコラーゲンは、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型を含む。これらのタンパク質は、任意の形態（天然形態及び変性形態を含むが、これらに限定しない）でありうる。電気処理のための他の好ましい材料は、炭水化物、例えば多糖類（例、セルロース及びその誘導体）、キチン、キトサン、アルギン酸、及びアルギン酸塩（例えばアルギン酸カルシウム及びアルギン酸ナトリウムなど）などである。これらの材料は、植物産物、ヒト、又は他の生物もしくは細胞から単離してもよく、あるいは合成的に製造してもよい。電気処理のための特に好ましい一部の天然材料は、コラーゲン、フィブリノゲン、トロンビン、フィブリン、フィブロネクチン、及びそれらの組み合わせである。また、組織の粗抽出物、細胞外マトリックス材料、非天然組織の抽出物、又は細胞外マトリックス材料（即ち、癌性組織の抽出物）が単独又は組み合わせて含まれる。生物学的材料（細胞、組織、器官、及び腫瘍を含むが、これらに限定しない）の抽出物も電気処理してもよい。

コラーゲン及びフィブリノゲンの各々をエレクトロスピンし、繊維長さに沿って反復するバンドパターンを有する繊維を産生することができる。これらのパターンは、例えば透過型電子顕微鏡で観察可能であり、自然プロセスにより産生されたパターンに典型的である。一部の実施形態では、エレクトロスピンされたコラーゲン繊維中で観察されるバンドパターンは、インビボで細胞により産生されるものと同じである。一部の実施形態では、エレクトロスピンされたフィブリノゲンにおけるバンディングパターンは、インビボで形成された正常な凝塊において見出されるフィブリノゲンのバンディングパターンと同じである。任意の特定の理論に拘束されることを望まないが、天然コラーゲン繊維に沿って明らかであるバンディングは、コラーゲン中のタンパク質鎖のらせんパターンに起因し、インビボでのフィブリノゲン中のバンディングは、積み重ねられた構成における個々のフィブリン分子積層構成である。これらの実施形態の一部では、組成物は、フィブリン凝塊に特徴的なネットワークではなく、繊維ウェブで構成される。さらに、一部の実施形態では、電気処理されたフィブリノゲンは、天然フィブリノゲンとは異なり、水に溶解しない。

本発明は、任意の材料の電気処理から生じる全ての天然又は天然合成ハイブリッド組成物を含む。電気処理の前、間、又は後に組成又は構造が変化する材料は、本発明の範囲内である。

これらの電気処理された材料は、本発明の組成物を形成する際に他の材料及び／又は物質と組み合わせてもよいことを理解すべきである。一部の実施形態における電気処理された材料は、同じ効果を達成するために、非常に塩基性又は酸性のｐＨで（例えば、特定のｐＨを有する溶液からの電気処理により）調製する。別の例として、細胞を含む電気処理されたマトリックスは、電気処理された生物学的に適合するポリマー及び成長因子と組み合わせて、電気処理されたマトリックス中の細胞の成長及び分裂を刺激してもよい。

足場中での使用のために電気処理された合成材料は、人工合成、加工、単離、又は製造の任意の方法を通じて調製された任意の材料を含む。合成材料は、好ましくは、インビボ又はインビトロでの投与のために生物学的に適合する。そのようなポリマーは以下を含むが、これらに限定しない：ポリ（ウレタン）、ポリ（シロキサン）又はシリコーン、ポリ（エチレン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ナイロン、ポリアミド、ポリ無水物、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）（ＥＶＯＨ）、ポリカプロラクトン、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、ポリビニルヒドロキシド、ポリ（エチレンオキサイド）（ＰＥＯ）、及びポリオルトエステル、又は生物学的に適合するように開発されうる他の同様の合成ポリマーを含むが、これらに限定しない。一部の好ましい合成材料は、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＡ及びＰＧＡのコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ＥＶＯＨ、ＰＶＡ、及びＰＥＯを含む。カチオン性部分を有するポリマーも一部の実施形態では好ましい。そのようなポリマーの例は、ポリ（アリルアミン）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（リシン）、及びポリ（アルギニン）を含むが、これらに限定しない。ポリマーは、任意の分子構造（直鎖、分岐、グラフト、ブロック、スター、コーム及びデンドリマー構造を含むが、これらに限定しない）を有してもよい。マトリックスは、エレクトロスピンされた繊維、エレクトロエアロゾル、エレクトロスプレーされた、もしくはエレクトロスパッタリングされた液滴、電気処理された粉末もしくは粒子、又はこれらの組み合わせで形成することができる。

異なる天然及び合成物質、又はそれらの組み合わせを選択することにより、足場の多くの特徴を操作する。電気処理された材料及び物質で構成されるマトリックスの特性を調整してもよい。また、電気処理のための材料の選択は、移植されたマトリックスの永続性に影響を及ぼしうる。例えば、フィブリノゲン又はフィブリンを電気処理することにより作製された多くのマトリックスは、より迅速に分解しうるが、コラーゲンで作製された多くのマトリックスはより耐久性があり、電気処理材料により作製された多くのマトリックスはさらにより耐久性がある。このように、例えば、耐久性合成ポリマー（例、ＰＬＡ、ＰＧＡ）宙への組み入れにより、一部の実施形態において、フィブリノゲンの溶液から電気処理されたマトリックスの耐久性及び構造強度が増加する。電気処理天然材料（例えばＷＳｓｏｙなど）により作製されたマトリックスの使用によっても、移植マトリックスへの拒絶又は免疫学的応答が最小限になる。したがって、電気処理及び物質送達における使用のための材料の選択は、所望の用途により影響される。

一実施形態にでは、電気処理されたＷＳｓｏｙ、画分５、画分９、及び／又はＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む皮膚パッチは、治癒促進剤、鎮痛剤、及び／又は麻酔剤や抗拒絶物質と組み合わせ、皮膚に適用し、その後に皮膚中に溶解しうる。マトリックスがマトリックスから放出される物質を含む実施形態では、電気処理された合成成分（例えば生体適合性物質など）を組み入れることにより、電気処理された組成物からの物質の放出を調節することができる。例えば、層状構造又は積層構造を使用して物質の放出プロファイルを制御することができる。非層状構造も使用することができ、この場合、放出は、構築物の各々の成分の相対的な安定性により制御される。例えば、交互の電気処理された材料からなる層状構造を、異なる材料を順に標的上で電気処理することにより調製する。外側層は、例えば、内側層よりも速く又は遅く溶解するように調整する。複数の薬剤を、この方法により、場合により異なる放出速度で送達することができる。層は、経時的な単一薬剤の複雑な多動態放出プロファイルを提供するように調整することができる。上記の組み合わせを使用することにより、放出される複数の物質の放出が提供され、各々がそれ自体のプロファイルを伴う。複雑なプロファイルが可能である。

天然成分（例えば生体適合性物質など）を使用して、電気処理された材料又は電気処理された組成物からの物質の放出を調節することができる。例えば、制御された様式で放出される薬物もしくは一連の薬物又は他の物質もしくは物質は、一連の層中に電気処理することができる。層状構築物を移植することができ、連続層が溶解又は分解する際、各々の連続層が侵食されるにつれて薬物（又は薬物）が順番に放出される。一部の実施形態では、非層状構造を使用し、放出は、構築物の各々の成分の相対的安定性により制御される。

一部の実施形態では、電気処理された材料自体が治療効果を提供しうる。例えば、本明細書に記載するように、画分９は、α９β１インテグリンについてのリガンドとして作用することにより、それらの固定化状態でのそれらの活性を付与する生物活性成分を含む。従って、電気処理されたＷＳｓｏｙ及び／又はＳＰＩの画分９は、治療効果を提供する。

治療効果を有する材料の非限定的な例は、電気処理されたフィブリノゲン、トロンビン、フィブリン、又はそれらの組み合わせである。例えば、トロンビンはフィブリノゲンをフィブリンに変換する。フィブリンは出血の抑止（止血）を助ける。フィブリンは、治癒の初期段階に位置付けられる暫定マトリックスの成分であり、また、隣接領域における脈管構造の成長を促進しうる。多くの点で、フィブリンは自然治癒促進剤である。一部の実施形態では、電気処理されたフィブリノゲンはまた、治癒を補助する。患者の創傷と接触して置かれた場合、このような電気処理された材料はフィブリンと同じ治癒特性を提供する。

特定の実施形態では、足場は、可溶性生物活性ＷＳｓｏｙ成分をさらに含む。例えば、画分５はその可溶性形態でその生物活性を付与することを本明細書に記載している。このように、足場は、エレクトロスピン足場内にＷＳｓｏｙ及び／又は画分５を含んでもよい。例えば、足場は、可溶性ＷＳｓｏｙ及び／又は画分５を放出するヒドロゲル層を含みうる。一実施形態では、エレクトロスピン足場は、可溶性ＷＳｓｏｙ及び／又は画分５を含む埋め込まれたマイクロスフェアを含む。

マトリックス又は足場の形成方法
生体適合性足場は、例えば、溶媒キャスティング、圧縮成形、フィラメント延伸、噛合、浸出、製織、発泡、エレクトロスピン、及びコーティングなどの方法を使用して成形してもよい。溶媒キャスティングでは、適当な溶媒中の１つ又は複数のタンパク質の溶液が分岐パターンレリーフ構造としてキャスティングされる。溶媒の蒸発後、薄膜が得られる。圧縮成形では、ポリマーを１平方インチあたり３０，０００ポンドまでの圧力で適当なパターンにプレスする。フィラメントの引き抜きは、溶融ポリマーからの引き抜きを含み、噛合は、繊維をフェルト様材料に圧縮することによりメッシュを形成することを含む。浸出において、２つの材料を含有する溶液を人工器官の最終形態に近い形状に広げる。次に、溶剤を使用して成分の１つを溶解させ、孔を形成させる（Ｍｉｋｏｓの米国特許第５，５１４，３７８号を参照のこと）。

足場は、任意の数の全体的な系、幾何学的形状、又は空間制限を満たすために任意の数の望ましい配置に成形してもよい。例えば、マトリックス又は足場は、処置される組織の全体又は部分の寸法及び形状に適合するように成形してもよい。足場は、異なるサイズの患者の器官又は創傷に適合するように、異なるサイズ及び形状に成形してもよい。マトリックス又は足場はまた、患者の特別なニーズに順応するように他の様式で成形してもよい。

一実施形態では、足場に細胞の１つ又は複数の集団を播種して人工器官構築物を形成する。人工器官構築物は自己由来であることができ、細胞集団は被験体自身の組織由来、又は同種異系であり、細胞集団は患者と同じ種内の別の被験体から由来する。人工器官構築物は異種でもあることができ、異なる細胞集団が被験体とは異なる哺乳動物種から由来する。例えば、細胞は、哺乳動物（例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、及びヒツジなど）の器官から由来してもよい。

細胞は、多くの供給源（例えば、生きている被験体からの生検及び死体からの全器官の回収を含む）から単離することができる。単離された細胞は、好ましくは、レシピエントであることが意図される被験体からの生検により得られた自己細胞である。例えば、腕、前腕、もしくは下肢からの骨格筋、又は少量のリドカインを皮下注射した局所麻酔薬で処置した部位の平滑筋の生検を培養中で増殖させる。生検は、急速で簡単な操作を行う迅速な処置針である生検針を使用して得ることができる。

細胞を、当業者に公知の技術を使用して単離してもよい。例えば、組織もしくは器官を機械的に分解し、及び／又は隣接細胞間の結合を弱める消化酵素及び／又はキレート剤で処理して、認識できる細胞破壊なしに個々の細胞の懸濁液中に組織を分散させることができる。酵素的解離は、組織を刻み、多数の消化酵素のいずれかを用いて、刻んだ組織を単独で又は組み合わせて処理することにより達成することができる。これらは、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、及び／又はヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ及びディスパーゼを含むが、これらに限定しない。機械的破壊はまた、多くの方法（器官の表面の剥離、グラインダー、ブレンダー、ふるい、ホモジナイザー、圧力セル、又はソニケーターの使用を含むが、これらに限定しない）により達成することができる。

好ましい細胞型は、尿路上皮細胞、間葉細胞、特に平滑筋細胞又は骨格筋細胞、筋細胞（筋幹細胞）、繊維芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維筋芽細胞、及び外胚葉細胞（管細胞及び皮膚細胞を含む）、肝細胞、島細胞、腸内に存在する細胞、及び他の実質細胞、骨芽細胞、及び骨又は軟骨を形成する他の細胞を含むが、これらに限定しない。一部の場合では、神経細胞を含むことも望ましいであろう。他の場合には、幹細胞を含むことが望ましいであろう。

一旦組織が個々の細胞の懸濁液に還元されれば、懸濁液を、細胞成分を得ることができる亜集団に分画することができる。これは、細胞分離のための標準的な技術（特定の細胞型のクローニング及び選択、不必要な細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）、混合集団中での細胞分画凝集性に基づく分離、凍結融解手順、混合集団中での細胞の分画付着特性、濾過、従来及びゾーン遠心分離、遠心水簸（逆流遠心分離）、単位重力分離、向流分配、電気泳動、及び蛍光活性化細胞選別を含むが、これらに限定しない）を使用して達成してもよい。

細胞画分は、例えば、ドナーが、疾患（例えば癌など）又は所望の組織に対する他の腫瘍の転移を有する場合には望ましいであろう。細胞集団を選別し、正常な非癌細胞から悪性細胞又は他の腫瘍細胞を分離してもよい。正常な非癌性細胞を、１つ又は複数の選別技術から単離し、次に器官再構築のために使用してもよい。

単離された細胞は、生体適合性足場をコーティングするために利用可能な細胞の数を増加させるためにインビトロで培養することができる。同種異系細胞、より好ましくは自己細胞の使用が、組織拒絶を防止するために好ましい。しかし、人工器官の移植後に被験体に免疫学的応答が生じた場合、被験体を免疫抑制剤（例えばシクロスポリン又はＦＫ５０６など）で処置し、拒絶反応の可能性を低減してもよい。特定の実施形態では、キメラ細胞、又はトランスジェニック動物からの細胞を、生体適合性足場上にコーティングすることができる。

単離細胞を、遺伝材料でコーティングする前にトランスフェクトしてもよい。有用な遺伝材料は、例えば、宿主における免疫応答を低減又は排除することが可能な遺伝子配列でありうる。例えば、細胞表面抗原（例えばクラスＩ及びクラスＩＩ組織適合抗原など）の発現を抑制してもよい。これにより、移植細胞の宿主による拒絶の可能性が低減することが可能になりうる。また、トランスフェクションを遺伝子送達のために使用することもできる。

単離細胞は、正常であるか、又は遺伝的に改変し、追加又は正常な機能を提供することができる。レトロウイルスベクター、ポリエチレングリコール、又は当業者に公知の他の方法を用いて細胞を遺伝子操作するための方法を使用することができる。これらには、細胞中で核酸分子を輸送及び発現する発現ベクターの使用が含まれる（Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)を参照のこと）。

ベクターＤＮＡを、従来の形質転換又はトランスフェクション技術を介して原核生物又は細胞に導入する。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための適切な方法が、Sambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (2001)）及び他の実験室用教科書に記載されている。

マトリックス又は足場への細胞の播種は、標準的な方法に従って実施することができる。例えば、組織修復における使用のためのポリマー基質上への細胞の播種が報告されている（例、Atala, A. et al., J. Urol. 148(2 Pt 2): 658-62 (1992);Atala, A., et al. J. Urol. 150 (2 Pt 2): 608-12 (1993)を参照のこと）。培養中で成長させた細胞をトリプシン処理して細胞を分離することができ、分離した細胞をマトリックス上に播種することができる。あるいは、細胞培養から得られた細胞を、細胞層として培養プレートから持ち上げることができ、細胞層は、細胞を事前に分離することなく、足場上に直接播種することができる。

好ましい実施形態では、１００万〜７００億５，０００万個の範囲の細胞を培地中に懸濁し、足場の表面の各１平方センチメートルに適用する。好ましくは、１００万〜５，０００万個の細胞、より好ましくは１００万〜１，０００万個の細胞を培地中に懸濁し、足場の表面の各１平方センチメートルに適用する。マトリックス又は足場を、細胞が付着するまでの期間にわたり、標準的な培養条件（例えば３７℃、５%ＣＯ_２など）下でインキュベートする。しかし、足場上に播種された細胞の密度は変動しうることが理解されるであろう。例えば、より高い細胞密度により、播種細胞によるより大きな組織再生が促進されるが、より低い密度により、宿主から移植片に浸潤する細胞による組織の比較的大きな再生が可能になりうる。他の播種技術をマトリックス又は足場及び細胞に依存して使用してもよい。例えば、細胞を、真空濾過によりマトリックス又は足場に適用してもよい。細胞型の選択、及び足場上への細胞の播種は、本明細書の教示に照らして当業者にはルーチンであろう。

一実施形態では、足場に１つの細胞集団を播種して人工器官構築物を形成する。別の実施形態では、マトリックス又は足場は、２つの異なる細胞集団を用いて２つの側に播種される。これは、最初にマトリックス又は足場の片側に播種し、次に他の側に播種することにより実施してもよい。例えば、足場は、１つの側を上に配置して播種してもよい。次に、マトリックス又は足場を、第２の側が上になるように再配置してもよい。第２の側には、次に、第２の細胞集団を播種してもよい。あるいは、マトリックス又は足場の両側を同時に播種してもよい。例えば、２つの細胞チャンバーを足場の両側（即ち、サンドイッチ）に配置してもよい。２つのチャンバーを異なる細胞集団で満たし、マトリックス又は足場の両側を同時に播種してもよい。サンドイッチされた足場を回転させるか、又は頻繁にひっくり返して、両方の細胞集団について等しい付着機会を可能にしてもよい。同時播種が、マトリックス又は足場の細孔が１つの側から他の側への細胞通過のために十分に大きい場合には好ましいであろう。足場の両側に同時に播種することにより、細胞が反対側に移動する可能性を低減することができる。

別の実施形態では、２つの別々の足場に異なる細胞集団を播種してもよい。播種後、２つのマトリックスを一緒に付着させて、２つの異なる細胞集団を伴う単一のマトリックス又は足場を両側に形成してもよい。足場同士の付着は、標準的な手順（例えばフィブリン糊、液体コポリマー、縫合糸など）を使用して実施してもよい。

本発明の足場上での細胞増殖を促すために、足場は、１つ又は複数の細胞接着促進剤でコーティングしてもよい。これらの薬剤は、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンを含むが、これらに限定しない。足場はまた、足場上で培養された細胞を含み、標的組織代替物を形成しうる。本発明の足場を使用して形成されうる標的組織は、動脈血管でありうるが、ここでは、一連のマイクロファイバーが、動脈血管の中間層においてエラスチンの配置を模倣するように配置される。あるいは、他の細胞を本発明の足場上で培養してもよい。これらの細胞は、足場上で培養されて血管代替物を形成する細胞、足場上で培養されて上皮組織を形成する上皮細胞、足場上で培養され筋肉組織を形成する筋細胞、足場上で培養されて内皮組織を形成する内皮細胞、足場上で培養されて骨格筋組織を形成する骨格筋細胞、足場上で培養されて心筋組織を形成する心筋細胞、足場上で培養されて軟骨を形成するコラーゲン繊維、足場上で培養されて弁組織を形成する間質弁細胞、及びそれらの混合物を含むが、これらに限定しない。

治療適用
増大すべき器官又は組織への足場の移植は、本明細書に記載する方法に従って、又は当技術分野で認められている方法に従って実施することができる。マトリックス又は足場は、移植材料を標的器官に縫合することにより、被験体の器官又は組織に移植することができる。全器官置換のための新生器官構築物の移植は、本明細書に記載する方法に従って、又は当技術分野で認められている外科的方法に従って実施することができる。足場は、生物製剤、薬物を活性化する酵素、プロテアーゼ阻害剤などの送達にも有用である。

一実施形態では、本発明は、天然の皮膚繊維芽細胞及びケラチノサイトの誘導による創傷治癒が、足場を定植し、適当なマトリックス成分を分泌するように方向づけるためのプラットフォームとしての天然タンパク質ベースの足場の使用を含む。一部の例では、足場は所望の細胞を含むこともできる。例えば、足場は、血管新生成長因子及びサイトカインを発現し、創傷治癒関連サイトカインを分泌し、コラーゲンを分泌し、及びインビボで創傷治癒を促進する能力を有する細胞を含むことができる。

記載する本発明の足場は、臨床的及び個人的な創傷ケア並びに軟部組織再生のために有用でありうる。本発明の一態様では、足場は、外皮創傷用のための創傷ドレッシング材又は移植片として使用する。臨床現場では、足場は、外傷、火傷、潰瘍、擦過傷、裂傷、手術、又は他の損傷から生じる創傷を処置するために使用することができる。外科医は、これらの移植片を使用して、創傷領域を被覆して保護し、喪失又は損傷した皮膚組織を一時的に置換し、損傷領域に新しい組織生成及び創傷治癒に導くことができる。臨床状況では、足場は、縫合糸、接着剤、又は包帯を使用して創傷領域に固定してもよい。足場は、創傷の大きさに合わせて切断されてもよく、又は創傷辺縁と重なってもよい。

本発明の別の態様では、足場は、足場包帯を作製するためにシートを接着性裏地と組み合わせることにより、個人／在宅ケア用に調整してもよい。接着部分により、創傷部位上の足場を適所に保持することができ、繊維が分解する又は組織と融合する場合に除去することができる。足場シートは、液体又はゲル接着剤を用いて固定してもよい。

本発明の別の態様では、足場シートは、流体を吸収し大きな創傷を保護するためのガーゼとして使用することができる。この足場ガーゼは、創傷部位に巻き付けるか、テープで固定することができる。

本発明の別の態様では、足場シートは、内部軟部組織創傷（例えば羊水嚢中の創傷、胃腸管又は粘膜中の潰瘍、歯肉の損傷又は後退、内部の外科的切開又は生検など）を処置するために使用することができる。足場移植片は、適所に縫合又は接着して損傷組織部位を充填又は被覆することができる。

足場は、創傷治癒のために有用な多数の特徴を有する。第一に、ナノファイバーを含む、本明細書に記載するポリマー足場は、ナノ多孔性及び通気性の両方である。それらは微生物及び感染性粒子が通過するのを予防することができるが、自然な創傷治癒において重要な空気流及び水分浸透を可能にする。

第二に、本発明の繊維は生分解性であり、一時的な創傷被覆、それに続く新組織での最終的な内殖を可能にする。足場創傷ドレッシング材用の材料の選択は、機械的強度及び分解速度／組織再生を含む自然の組織特徴に適合するように決定することができる。

第三に、足場は、分解の際に放出されうる種々の因子を用いて埋め込んでもよく、結合させてもよい。これらの因子は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、及びメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）を含むが、これらに限定しない。これらは創傷治癒において有益であることが示されている。追加の創傷治癒因子（例えば抗生物質、殺菌剤、殺菌剤、銀含有剤、鎮痛剤、及び一酸化窒素放出化合物など）も足場創傷ドレッシング材又は移植片中に組み入れることができる。

第四に、創傷治癒のための足場移植片は、より速い組織再生及びより自然な組織構造のために、細胞と播種することができる。これらの細胞は、繊維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞、間葉幹細胞、及び／又は胚性幹細胞を含むが、これらに限定しない。

第五に、ナノ繊維足場のナノスケール構築は、多くの一般的な軟部組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構築を密接に模倣している。例えば、ナノスケールの繊維は、皮膚及び他の組織中に見いだされるコラーゲン原繊維と構造的に類似している。この構築は、細胞が創傷中に移動するための組織化された足場を提供することにより瘢痕形成を防止しうる。本発明のこの態様では、足場の整列は、細胞を瘢痕組織の形成のように無作為に整列させるのではなく、整列させて組織化した状態に保つことが好ましい。整列した足場は、より速い組織内成長及び創傷被覆を可能にするために、創傷の所定の軸に関して配向されうる。

足場のアライメントはまた、天然組織ＥＣＭの構築に密接に適合させるために使用してもよい。これは、一方向の繊維アライメント、直交方向の十字アライメント、又はより複雑な繊維構築を含む。本発明のこの例では、足場は、各層において特定の繊維配向を伴う複数の繊維層を含む。同様に、各々の個々の足場層はまた、先に列挙したような特定の因子又は細胞型を含んでもよい。これにより、天然組織の構築及び組成に密接に適合することができるポリマー足場の作製が可能になる。例えば、単純な足場創傷ドレッシング材又は移植片は、整列した繊維の単一層を含みうる。他方で、より複雑な足場皮膚移植片は、底部シート中に繊維芽細胞及び上部シート中にケラチノサイト、並びに底部シート中にｂＦＧＦ及び上部シート中に抗菌剤を伴う十字パターンで積層された複数の整列した繊維シートを含みうる。他のそのような組み合わせが、患者の特定の必要性に応じて可能である。

別の実施形態では、足場は治療用薬剤を含むことができる。治療用薬剤は、抗腫瘍剤（化学療法剤、抗細胞増殖剤、又はそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定しない）でありうる。

本発明は、組織再生適用も包含する。組織再生治療アプローチの目的は、初期創傷力学及び最終的な新生組織産生の両方を最適化する形式で、高密度の修復能力のある細胞（又は局所環境による影響を受けると能力を獲得する細胞）を欠損部位に送達することである。

本発明の組成物は、それを必要とする個体に多種多様な方法で投与することができる。好ましい投与様式は、静脈内、血管内、筋肉内、皮下、大脳内、腹腔内、軟部組織注入、外科的配置、関節鏡的配置、及び経皮挿入（例、直接注入、カニューレ挿入、又はカテーテル法）を含む。最も好ましい方法は、本発明の組成物の組織欠損部位又は部位への局所投与をもたらす。任意の投与は、本発明の組成物の単一適用又は複数適用でありうる。投与は、処置される個体の単一部位又は複数部位にしてもよい。複数の投与は、本質的に同時に、時間を分けて生じてもよい。

自己組織化組成物
本発明はまた、ＷＳｓｏｙを含む自己組織化組成物を提供する。精製されたＷＳｓｏｙは、特定の条件下で予想外に自己組織化してマトリックスになりうる。自己組織化は、高次構造（例えば繊維、フィルム、シート、バンドル、及び格子など）を形成するための個々の水溶性大豆タンパク質間での自発的な会合及び結合を指す。乾燥形態のＷＳｓｏｙは自発的な会合を示さない。乾燥ＷＳｓｏｙ粒子が特定の濃度範囲内の水性環境中に懸濁されると、分子間接触は、ＷＳｓｏｙが高次構造に自己組織化してマトリックスを形成することを可能にするのに十分である。種々の実施形態では、異なる湿潤ＷＳｓｏｙ組成物は、わずかに粘性の液体、流動性ゲル（図２３）、ゲル化遅延を伴う流動性ペースト、及び自発的に硬質ゲルを形成する特徴を示しうる。

一部の実施形態では、本発明は乾燥ＷＳｓｏｙ組成物を含む。乾燥ＷＳｓｏｙ組成物は、処置が湿った創傷部位（例えば新鮮な創傷など）のためである場合に有用である。乾燥ＷＳｓｏｙ組成物は、典型的には、粒状又は粉末形態のＷＳｓｏｙを含む。例えば、乾燥ＷＳｓｏｙ粒子は、直径１〜１０００μmの間でありうる。一部の実施形態では、乾燥ＷＳｓｏｙ粒子は均一なサイズを有し、他の実施形態では、乾燥ＷＳｓｏｙ粒子は種々のサイズを有する。当業者には理解されうるように、本明細書に記載する粒径範囲は絶対範囲ではない。例えば、約２００〜５００ミクロンのサイズ範囲を伴う、本発明の乾燥ＷＳｓｏｙ粒子混合物は、約２００〜５００ミクロンの範囲よりも小さい又は大きい粒子の一部を含むことができる。一部の実施形態では、粒度範囲は、粒子サイズ分布（ＰＳＤ）を表し、混合物の粒子のパーセンテージは列挙した範囲内にある。例えば、約２００〜５００ミクロンの乾燥ＷＳｓｏｙ粒子サイズ範囲は、約２００〜５００ミクロンの範囲中の粒子の少なくとも５０%、しかし、より好ましくは、より高いパーセンテージ（例えば６０%、７０%、８０%、９０%、９５%、９７%、９８%、又はさらには９９%などであるが、これらに限定しない）を有する乾燥ＷＳｓｏｙ粒子の混合物を表すことができる。

乾燥組成物の粒子は、球状であってもよいし、所望の任意の他の形状であってもよいことを理解すべきである。一実施形態では、粒子は、表面が不均一又は「ディンプル」であってもよい。そのような実施形態では、不均一な表面により、粒子に付着して均一なコーティングを産生する追加成分の能力を増加させてもよい。一部の実施形態では、そのような形状を有する粒子は、被験体の創傷により容易に付着し、付着したままでありうるが、それにより、創傷治癒マトリックス中に自己組織化する乾燥組成物の能力が改善される。

特定の実施形態において、乾燥ＷＳｓｏｙ組成物は、乾燥ＷＳｓｏｙだけを含む。他の実施形態では、乾燥ＷＳｓｏｙ組成物は、追加の乾燥要素を含む。例えば、乾燥組成物は、賦形剤（例えば増量剤など）をさらに含んでもよい。増量剤は、室温で一般に固体である任意の適切な水溶性及び生体適合性材料（例えばステアリン酸、デンプン、及びタルクなど）を含みうる。

他の実施形態では、乾燥ＷＳｓｏｙ組成物は、医薬的及び治療用成分、例えば麻酔剤、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤、鎮痒剤、筋弛緩剤、鎮痛剤、解熱剤、ビタミン剤、抗菌剤、防腐剤、消毒剤、殺菌剤、外部寄生虫駆除剤、抗寄生虫、アルカロイド、塩、イオン、抗炎症剤、創傷治癒剤、植物抽出物、成長因子、ポリカーボネート、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分（例えばＥＣＭタンパク質など）、皮膚軟化剤、抗菌剤又は抗ウイルス剤、精神安定剤、鎮咳剤、ナノ粒子（例えば銀イオンなど）などをさらに含みうる。

他の実施形態では、乾燥ＷＳｓｏｙ組成物は、追加のポリマーをさらに含むことができる。ポリマーの非限定的な例は、ポリウレタン、ポリシロキサン又はシリコーン、ポリエチレン、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレン−コ−ビニル酢酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリル酸、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリスチレン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカーボネートなどを含む。

一部の実施形態では、本発明は湿潤ＷＳｓｏｙ組成物を含む。湿潤ＷＳｓｏｙ組成物は、典型的には、液体担体中に懸濁したＷＳｓｏｙを含むのに対し、ＷＳｓｏｙはゲル状マトリックスに自己組織化する。適切な液体担体は、生体適合性の非反応性水溶液（例えば本明細書の他の箇所に記載する医薬的に許容可能な担体など）を含む。種々の実施形態では、液体担体は、上に記載する可溶性治療成分及び添加剤をさらに含みうる。

湿潤ＷＳｓｏｙ組成物は、ゲル状マトリックスを提供するために、液体担体中に特定の濃度範囲内でＷＳｓｏｙを含む。例えば、液体担体中のＷＳｓｏｙの濃度は１〜２００mg/mLの間でありうる。一部の実施形態では、ＷＳｓｏｙの濃度は１〜２０重量%の間で表すことができる。

一部の実施形態では、液体担体は細胞をさらに含んでもよい。非限定的な例は、幹細胞、前駆細胞、コミットした幹細胞、及び分化細胞を含む。「幹細胞」の例は、多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞、誘導多能性細胞、又は新生仔もしくは成体多能性幹細胞など、例えば骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、歯髄幹細胞、濾胞幹細胞、胎盤幹細胞、及び臍帯幹細胞を含むが、これらに限定しない。他の細胞は表皮細胞及び間質細胞を含む。他の実施形態では、液体担体は、細胞成長及び創傷治癒を促進する薬剤（例えば成長因子、塩、イオン、ビタミン、抗体、核酸、タンパク質、電解質、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、ホルモン、サイトカインなど）を含む。一部の実施形態では、液体担体は、本明細書の他の箇所に記載するゲル又はマトリックス形成材料をさらに含みうる。

一部の実施形態では、乾燥ＷＳｓｏｙ組成物を液体担体と提供してもよい。例えば、乾燥ＷＳｓｏｙ組成物及び液体担体を別々に提供してもよく、適用直前に組み合わせた場合に、湿潤ＷＳｓｏｙ組成物を調製してもよい。乾燥ＷＳｓｏｙ組成物及び液体担体を別々に提供することで、有効期間及び製造の容易さが改善されうる。使用者が湿潤ＷＳｓｏｙ組成物を調製することを可能にすることで、湿潤組成物中のＷＳｓｏｙの最終濃度、又は液体担体を使用するか否かさえをも決定する際に柔軟性がさらに提供される。

本発明のＷＳｓｏｙは、上記の湿潤及び乾燥組成物に限定しないことを理解すべきである。種々の実施形態では、本発明のＷＳｓｏｙ成分は、エアロゾル、クリーム、軟膏、パッチ、包装中などでの包含のために適切である。他の実施形態では、本発明の組成物は、（上に定義する）電気処理における使用のために適切である。ＷＳｓｏｙを含む組成物は、シート、繊維、布地、足場などを形成するために電気処理することができ、それらは創傷床を刺激せず、非常に柔軟性があり、生分解性であるため除去する必要がなく、創傷床の不要な壊死を避ける。電気処理された組成物は、環境に優しく、操作者又は創傷床のいずれでも作製の間にも毒性溶媒を要求しない。

使用方法
ＷＳｓｏｙ組成物及び治癒を必要とする創傷部位へのその適用。

提供するＷＳｓｏｙ組成物の量は、処置する創傷のサイズに基づいて決定してもよい。例えば、１〜１００mgの乾燥ＷＳｓｏｙ組成物又は０．１〜１ｍＬの湿潤ＷＳｓｏｙ組成物を、１cm²の創傷ごとに提供してもよい。他の実施形態では、提供するＷＳｓｏｙ組成物の量は、処置する創傷のサイズ及び深さに基づいて決定してもよい。創傷は、部分厚創傷又は全層創傷として記載してもよい。当業者であれば、部分厚創傷が真皮又は表皮の損傷を含む創傷を指し、全層創傷が皮下層又はそれより深い損傷を含む創傷を指すことを理解するであろう。創傷を処置するために提供するＷＳｓｏｙ組成物の量は、創傷型に依存して調整してもよい。例えば、同じ表面積を有するが、異なる深さを有する２つの創傷については、より多くのＷＳｓｏｙ組成物を、より深い創傷を処置するために使用してもよい。一部の実施形態では、提供するＷＳｓｏｙ組成物の量は、所望の適用の厚さ、例えば５０〜５０００μmの厚さに基づいて決定してもよい。他の実施形態では、ＷＳｓｏｙ組成物の正確な量は必要とされないであろう。例えば、任意の量のＷＳｓｏｙ組成物を創傷に適用し、創傷全体に被覆を提供するのに十分なＷＳｓｏｙ組成が存在するようにしてもよい。過剰なＷＳｓｏｙ組成は、任意の他の便利な手段により簡単に落ちたり、除去されたりしうる。

創傷部位へのＷＳｓｏｙ組成物の適用は、提供するＷＳｓｏｙ組成物の型によって異なる。例えば、乾燥ＷＳｓｏｙ組成物は、組成物を創傷部位に散布すること、組成物を創傷部位に振りかけること、又は組成物を創傷部位に注入ことにより適用してもよい。湿潤ＷＳｓｏｙ組成物は、噴霧、注射、局所適用、又は注入により適用してもよい。一部の実施形態では、湿潤ＷＳｓｏｙ組成物は、携帯型エレクトロスピン装置により適用してもよい。

本明細書に開示するＷＳｓｏｙ組成物は、他の皮膚処置のために適用可能であることを理解すべきである。例えば、ＷＳｓｏｙ組成物は、局所的病気、擦過傷（表在性創傷）、予防的ケア、消毒の処置、並びに薄いコーティングを要求する皮膚の単純な２Ｄ又は複雑な３Ｄ領域の任意の他の処置に適している。

創傷を処置するためのキット
本発明は、本発明の方法内で有用な成分を含むキット、及び、例えば本明細書の他の箇所に記載するＷＳｓｏｙ組成物を使用する方法を記載する教材に関する。キットは、本発明の方法を実施するのに有用な成分及び材料を含みうる。例えば、キットは１つ又は複数の容器を含むことができ、各々は予め測定された調剤可能な量の乾燥ＷＳｓｏｙ組成物又は液体担体を保持する。一部の実施形態では、キットは少なくとも２つのシリンジを含むことができ、少なくとも１つのシリンジが乾燥ＷＳｓｏｙ組成物で部分的に満たされ、少なくとも１つのシリンジが液体担体で部分的に満たされているか、又は液体担体を受け入れることができる。ＷＳｓｏｙ組成物は、シリンジの分注端部を一緒に連結することにより、使用のために準備してもよく、操作者は１つのシリンジを繰り返し押して他方を充填し、乾燥ＷＳｓｏｙを液体担体と混合してもよい。

特定の実施形態では、キットは教材を含む。教材は、本明細書に記載するキットの機能を伝達するために使用することができる出版物、記録、図、又は他の任意の表現媒体を含みうる。本発明のキットの教材は、例えば、所望の手順のために必要でありうる１つ又は複数の器具を含むパッケージに添付されうる。あるいは、教材はパッケージとは別に出荷されてもよく、通信ネットワーク（例えばインターネットなど）を介して電子的にアクセス可能であってもよい。

実験例
本発明を、以下の実施例を参照してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、例示だけを目的として提供し、他に定めない限り、限定することを意図するものではない。このように、本発明は、以下の実施例に限定するものと決して解釈すべきではなく、むしろ、本明細書で提供する教示の結果として明らかになる任意の及び全てのバリエーションを包含すると解釈すべきである。

さらなる記載がない限り、当業者が、前述の記載及び以下の例示的な実施例を使用し、本発明を作製及び利用し、請求する方法を実行することができると考えられる。以下の実施例は、従って、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘し、本開示の残りの部分を限定するものとして決して解釈すべきではない。

実施例１：
そのような「スマートな」創傷マトリックスの探索において、本発明者らは以前に、げっ歯類及びブタにおける再上皮化及び付属器の再生の増強に対する、植物エストロゲンを含む共通の精製された大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）からエレクトロスピンされた無細胞足場の有益な効果を記載した（Har-el, Y., et al., 2014, Wound Medicine 5, 9-15; Har-el, Y. et al. 2014, Biomedical Engineering Society Annual Meeting）。本明細書に提示する実験は、イソフラボノイドを欠く水溶性大豆タンパク質単離物（ＷＳｓｏｙ）からエレクトロスピンされた創傷マトリックスが、全層皮膚創傷のげっ歯類モデルにおける治癒を増強することを実証する。

皮膚創傷治癒は、造血細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、及び内皮細胞による協調的応答を要求する、複雑で多段階の生物学的プロセスである（Demidova-Rice T.N., et al., 2012, Advances in skin & wound care 25, 304-314）。創傷治癒の初期段階には、再上皮化（ケラチノサイトの側方移動、それに続く真皮繊維芽細胞の内向き移動）及び血管新生（真皮内皮細胞の移動及び毛細管形成）が含まれる（Tarnawski, A., 2000, Drug news & perspectives 13, 158-168; Johnson, K.E., et al. 2014, Adv Wound Care (New Rochelle) pp 647-661）。創傷治癒の再上皮化段階の間、ケラチノサイト、繊維芽細胞、及び内皮細胞の創傷への移動は、細胞移動を増強するために、細胞外マトリックスからの迅速な結合及び解離を要求する。これらの細胞型は、ＥＣＭタンパク質への移動及び付着を媒介する異なるインテグリンを発現する。例えば、正常表皮においては、α３β１及びα６β４インテグリンがケラチノサイトを基底膜ラミニンに結合するのに対し（Carter, W.G., et al. 1990, J Cell Biol 111, 3141-3154）、α２β１、α５β１、及びα９β１インテグリンは、創傷閉鎖の間のケラチノサイトとコラーゲン、フィブロネクチン、及びテネイシンとの相互作用の重大なメディエーターである（Kim, J.P., et al., 1992, J Cell Physiol 151, 443-450; Mercurio, A.M., 2000, Am J Pathol, pp 3-6; Singh, P., et al., 2009, J Invest Dermatol 129, 217-228）。細胞性フィブロネクチン及びα９β１の空間的発現パターンは異なるが、真皮−表皮接合部において相関的に重複する（Singh, P., et al., 2004, J Invest Dermatol 123, 1176-1181）。これらの観察所見は、創傷後のケラチノサイト機能におけるα９β１についての重要な役割を示唆する。さらに、インテグリンα９β１の非存在は、細胞増殖における欠損をもたらし、不良な再上皮化を起こす（Singh, P., 2004, J Invest Dermatol 123, 1176-1181）。本データは、ＷＳｓｏｙ由来足場が再上皮化を増強する機構の１つが、α９β１インテグリンリガンドとして作用しうるＷＳｓｏｙ中の生物活性タンパク性成分を介していることを示唆する。

治療適用での使用のための天然食品の栄養機能はかなりの注目を集めている。大豆生物活性ペプチド（Singh, B.P. et al., 2014, Peptides 54, 171-179）は、栄養補助食品として摂取した場合、閉経後の女性の症状の緩和、骨粗鬆症のリスクの低減、心臓血管疾患の予防、及び抗癌効果などの多数の健康増進特性を示すと報告されている（Chen, K.I., 2012, Appl Microbiol Biotechnol 96, 9-22）。具体的には、イソフラボノイド（非ステロイド性、植物エストロゲン性、抗酸化性化合物、約１〜５μg/g乾燥大豆単離物）は、上記の健康増強特性の多くを占める。大豆の高栄養成分及び多くの生物活性成分の存在のために、栄養補助食品及び幼児用調合乳から畜産製品まで、多数の大豆タンパク質製品が商品化されている（Chen, K.I., 2012, Appl Microbiol Biotechnol 96, 9-22; Agostoni, C., et al., 2006, J Pediatr Gastroenterol Nutr, pp 352-361）。いくつかの生化学的及び細胞試験では、抗酸化性抗炎症特性及び抗癌活性を持つルナシン（Lule, V.K., et al. 2015, J. Food Sci.）、抗発癌特性を示すＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ及びグリセロリン（Anta, L., et al., 2010, J Chromatogr A pp 7138-7143; Shin, S.H., 2013, Exp Mol Med, p e17）、並びに血管新生を遮断するＫｕｎｉｔｚトリプシン阻害剤（Shakiba, Y., et al., 2007, Fitoterapia pp 587-589）などの大豆タンパク質由来タンパク質／ペプチドの有益な全身効果が実証されている。他の生物活性大豆タンパク質構成成分は、抗高血圧特性を伴うアンギオテンシン１変換酵素阻害ペプチド（Mallikarjun Gouda, et al., 2006, J. Agric Food Chem 54, 4568-4573）、抗肥満効果を伴う脂肪生成抑制ペプチド（Kim, H.J., et al., 2007, Peptides, pp 2098-2103）、及び神経保護効果を伴う抗酸化ペプチド（Liu, P., et al., 2014, Rejuvenation Res 17, 209-211）を含む。大豆アグルチニン（レクチン）は、内皮細胞及び上皮細胞において単層形成を調節し、創傷治癒を促進する（Gordon, S.R. 2011, J Tissue Viability, pp 20-29）。最近では、タンパク質／ペプチド並びにイソフラボノイド及び他の生物活性化合物を含む強酸中又は侵襲的な有機溶媒中で可溶性である大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）調製物の生物学的効果が試験されている。ＳＰＩは、ペースト（Shevchenko, R., et al., 2014, Burns and Trauma 2, 187-195）、ヒドロゲル（Chien, K.B. et al., 2014, J Biomater Appl 28, 1085-1096; Shevchenko, R., et al., 2014, Burns and Trauma 2, 187-195）、フィルム（Peles, Z. et al., 2013, J Tissue Eng Regen Med 7, 401-412）、及びエレクトロスピンされた繊維膜足場（Har-el Y., et al., 2014, Wound medicine 5, 9-15; Lin, L., et al., 2013, Journal of tissue engineering and regenerative medicine 7, 994-1008）の形態で、皮膚創傷治癒のために考慮されてきた（Har-el, Y., et al., 2014, Wound Medicine 5, 9-15; Peles, Z., et al., 2013, J Tissue Eng Regen Med 7, 401-412; Santos, T.C., et al., 2013, Tissue Eng Part A 19, 860-869; Lin, L., et al., 2013, Journal of Tissue Engineering and regenerative medicine 7, 994-1008; Peles, Z., et al., 2012, Acta Biomater 8, 209-217; Ramji, K., et al., 2014, J Biomater Appl 29, 411-422; Santos, T.C., et al., 2010, Tissue Eng Part A 16, 2883-2890; Chien, K.B., et al., 2013, Acta Biomater 9, 8983-8990; Chien, K.B. et al., 2014, J Biomater Appl 28, 1085-1096; Shevchenko, R., et al., 2014, Burns and Trauma 2, 187-195）。これらの製剤は、繊維症の徴候又は大豆由来物質に対するアレルギー応答なく、マウスにおける皮下移植時に、２週間以内に安全で完全に分解されたと特徴付けられている（Chien, K.B., 2013, Acta Biomater 9, 8983-8990; Chien, K.B., et al., 2014, J Biomater Appl 28 1085-1096）。創傷治癒遅延のラットリングモデルでは、ＳＰＩ足場が迅速な再上皮形成及び創傷閉鎖を促進することが実証されているが、ブタでの試験では再上皮化及び付属器の再生が示されており、いずれでも明白な免疫毒性は実証されなかった（Har-el, Y., et al., 2014, Wound Medicine 5, 9-15; Har-el, Y., et al., 2014, Biomedical Engineering Society Annual Meeting）。これに関連して、ＳＰＩの構成成分の１つである大豆イソフラボノイドゲニステインは、複数の独立した機構を通じて創傷治癒を増強することが示されている（Park, E., et al., 2011, Biochem Biophys Res Commun 410, 514-519; Emmerson, E., et al., 2010, Mol Cell Endocrinol, pp 184-193）。さらに、アンチメイテッド４は免疫調節大豆−ペプチドフラグメントであり、抗脱毛効果（脱毛を防止する）を示す（Tsuruki, T., et al., 2005, Peptides, 26, 707-711）。まとめると、これらの結果は、従来の大豆調製物中に見出されるタンパク質、オリゴペプチド、及び／又は植物エストロゲンが、創傷治癒を増強するための「緑色」の治療プラットフォームとして有望であることを示す。本実験は、植物エストロゲンを欠く調製物であるＷＳｓｏｙからの単離タンパク質成分が、個々に又は組み合わせて、多様な動物モデルにおける創傷治癒及び、具体的には、再上皮化を増強するか否かを検証するために行った。データは、異なる作用機構を伴う少なくとも２つの異なるタンパク質画分がＷＳｓｏｙに存在することを実証する：１つ（操作上は画分５と呼ばれる）は、１つ又は複数の移動促進、増殖促進、及び血管新生促進タンパク質（画分９）を含み、これは可溶性形態の皮膚細胞に影響し、他（分画９）は、α９β１発現細胞のリガンドとして働く固相（例えば足場に固定された）中での移動、増殖、及び血管新生を促進する。

実施例２：再上皮化及び血管新生の増強は、イソフラボノイドの非存在下での可溶性タンパク質により誘導される移動促進効果に部分的に基づく。

恐らく創傷治癒を含む、一般に使用されるＳＰＩの多くの生物学的活性が、イソフラボノイド（例えばゲニステインなど）、即ち、エストロゲン受容体（ＥＲ）に結合し、弱いエストロゲン活性を示す植物エストロゲンのサブクラスの存在に起因しうる（McCarver, G., et al., 2011, Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol 92, 421-468; Thornton, M.J., 2013, Dermatoendocrinol pp 264-270）。従って、他の大豆由来の生体材料と同様に、水溶性ＳＰＩ（ＷＳｓｏｙ，ＡＤＭ（イリノイ州ディケーター）によりClarisoy（商標）として販売されている）調製物が植物エストロゲンを含むか否かを最初に研究した（Hirsch, K., 2007, Breast Cancer Res Treat 104, 221-230）。この目的のために、エレクトロスピンしたＳＰＩ及びＷＳｓｏｙ足場をエタノール抽出し、それらの植物エストロゲン活性を、感受性バイオアッセイを使用してゲニステイン及びエストラジオールＥ２と比較することにより評価した（McCarver, G., et al., 2011, Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol 92, 421-468）。

図１は、エレクトロスピンされた大豆繊維膜（０．５mg ＳＰＩ）の抽出物が、ゲニステイン及びエストラジオールと同様のエストロゲン応答エレメント依存活性を誘導することを示し、ＳＰＩ製剤中の植物エストロゲンの存在を示している。対照的に、このデータは、ＷＳｓｏｙ粉末及びエレクトロスピンされたＷＳｓｏｙマトリックスが植物エストロゲンの量を低減させたことも示している。さらに、ＨａＣａＴ細胞におけるＳＰＩ誘導性の創傷閉鎖は、非選択的エストロゲンアンタゴニストであるフルベストラントにより有意に阻害され、これはＷＳｓｏｙ誘導性の創傷閉鎖に影響しなかった。さらに、図９〜図１１に実証するように、エレクトロスピンされたＷＳｓｏｙマトリックスは、フィトエストロゲンの非存在において創傷治癒、具体的には再上皮形成及び血管新生を増強する。

これらの結果を考慮して、逆相及びイオン交換液体クロマトグラフィーにより生物活性ＷＳｓｏｙタンパク質を単離するさらなる研究が行われる。抽出タンパク質はプロテオミクスにより同定され、それらの効果は、創傷治癒に関与する培養皮膚細胞（即ち、ケラチノサイト、内皮細胞、及び繊維芽細胞）で特徴付けられる。ＷＳｓｏｙの創傷治癒活性が異なる生物活性タンパク質／ペプチドに起因しうることを考慮すると、ＷＳｓｏｙをいくつかの生物活性画分に最初に（第１工程）調製分離するために、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用した（図２）。溶出の直線勾配（４５分間にわたる０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を用いたＣ１８カラムを使用して実施したこの分離により、１１のタンパク質画分が得られた。創傷皮膚における細胞移動は再上皮形成プロセスの重要部分であるため（Li, J., et al. 2007, Clin Dermatol 25, 9-18）、ゼータ電位が＋８〜＋３４mVの画分３〜１１を、培養皮膚細胞、即ち、ヒト皮膚ケラチノサイト（ＨａＣａＴ／初代ケラチノサイト）、繊維芽細胞（ＨＤＦＣ）、及び微小血管内皮細胞（ＨＤＭＶＥＣ）の移動を刺激する能力について、インビトロでの創傷治癒アッセイ（スクラッチアッセイ）においてテストした（Lecht, S., et al., 2015, Biochim Biophys Acta 1850, 1169-1179）。画分５は、全ＷＳｓｏｙ抽出物と同様に、スクラッチアッセイにおいて全てのこれらの細胞の移動を強く刺激した（図３）。これらの知見は、ＷＳｓｏｙ中でのタンパク質の存在を示し、これによって皮膚細胞の遊走促進活性が誘導される。

移動性タンパク質をさらに精製するために、画分５を、「より平坦な」ＡＣＮ勾配（１２０分間にわたる３０〜８０%）を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣＣ１８カラムで再クロマトグラフィーにかけた。分離により、５−１〜５−５と名付けられた５つの新たな亜画分が得られた（図４）。ケラチノサイト遊走の最大刺激が画分５−５で見られた（図４、左挿入図）。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、画分５−５がいくつかのタンパク質バンドを依然として含むことが明らかになった（図４、右挿入図）。

生物活性成分画分５−５（ＢＣＦ５−５）からの移動促進性の生物活性成分を同定及び精製し、それらを均一に精製するために追加の精製を実施する。

実験は、イオン交換クロマトグラフィーにより画分５−５を精製及び特徴付けるために実施される。画分５−５成分は、MonoQ HR 5/5及びMonoS HR 5/5カラムを用いたＦＰＬＣを使用したイオン交換クロマトグラフィーにより均一に精製され、大豆タンパク質の単離のために成功裏に適用される方法である（Amigo-Benavent, M., et al., 2010, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, pp 2453-2456）。

種々の培養皮膚細胞の移動／増殖に対する画分５−５の精製成分のインビトロでの効果を研究する。２４ウェルプレートにおける確立された創傷スクラッチアッセイにより、精製タンパク質の移動促進活性を評価する（Lecht, S., et al., 2015, Biochim Biophys Acta 1850, 1169-1179）。簡単に説明すると、完全にコンフルエントな細胞層を一晩血清飢餓状態にし、次に傷をつけて単層内に人工創傷を生成させる。細胞を、培養培地中の２%ＦＢＳ（ＨＭＶＤＥＣ）、５%ＦＢＳ（ＨａＣａＴ又は初代ケラチノサイト）、及び１０%ＦＢＳ（ＨＤＦＣ）（陽性対照）により、又は１〜１００μg/mlの精製ＢＣＦ５−５の存非在下（陰性対照）もしくは存在下で０．１%ＦＢＳを伴う培地により刺激し、用量応答を生成する。プレートを３７℃、５%ＣＯ_２雰囲気下で２４時間インキュベートする。記載されているように（Lecht, S., et al., 2015, Biochim Biophys Acta 1850, 1169-1179）、「創傷閉鎖」の範囲を視覚化して計算する。インビトロでの増殖活性は、ＢＣＦ５−５を用いた刺激後での皮膚細胞中へのＢｒｄＵの取り込み（Ventresca, E.M., et al., 2015, Cell Signal 27, 1225-1236）を測定することによりテストする。ＢｒｄＵアッセイの結果を、細胞カウント及びＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイにより確認する。測定は２４時間、４８時間、及び７２時間に実施する。

さらに、血管新生に対する画分５−５の精製成分の効果をインビトロで（マトリゲルアッセイ）及びウシ漿尿膜（ＣＡＭ）においてインビボで研究する。インビトロでの血管新生促進活性を、成長因子が低減したマトリゲルを使用した管形成アッセイにより分析する（Walsh, E.M., et al., 2012, Neuro Oncol, pp 890-901）。ＨＤＭＶＥＣをマトリゲル上で培養し、可溶性ＢＣＦ５−５で処理する。インビボでの血管新生促進活性を、記載されているように（Walsh, E.M., et al., 2012, Neuro Oncol, pp 890-901）、胚性胎児ＣＡＭアッセイを使用して分析する。胚をＢＣＦ５−５で処理し、記載されているように（Lazarovici, P., et al., 2006, Endothelium 13, 51-59）血管新生指標の分析を実施する。ＢＣＦ５−５の用量は、インビトロ用量応答結果により決定する。追加の陰性対照として、非活性画分５−４の効果を研究する。

画分５−５の生物活性成分の一次配列は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより同定される。ＮＩＨＰＤＢタンパク質データバンク及び大豆タンパク質データベース（Tavakolan, M., et al., 2014 Bioinformation pp 599-601）に注釈付けられた既知の高及び低存在量タンパク質とのアミノ酸配列アラインメントを、ＢＬＡＳＴｐツールを使用して実施する。

さらに、画分５−５成分の生物活性成分により誘導される細胞受容体及び細胞シグナル伝達経路を培養皮膚細胞において同定する。

PhosphoScanを使用することにより、活性化タンパク質プロファイリングを試験する。大豆タンパク質が、異なる細胞型においてＥＲＫ−ｍＴＯＲ−Ｓ６キナーゼ（Lee, J., et al., 2012, J Nutr Biochem 23, 1341-1351）、ＪＡＫ２及びＡＭＰＫ（Jang, E.H., et al., 2008, Int J. Obes (Lond) 32, 1161-1170）のリン酸化を誘導するという報告、並びにＷＳｓｏｙにより誘導されたＥＲＫ１，２リン酸化の本明細書に提示する知見（図５）に基づき、皮膚細胞リン酸化に対する精製ＢＣＦ５−５の効果が研究されている。異なる細胞型を５０μg/mlのＢＣＦ５−５（細胞移動を増強する濃度）で処理する。トリプシン消化により得られたペプチドを、記載されているように（Gu, T.L., et al., 2011, PLoS One 6, e15640）、ＨＰＬＣ（Seppak C18カラム）により精製する。モノクローナル抗ホスホチロシン抗体（ｐＹ１００）を用いた免疫沈降によりリン酸化タンパク質を単離し、逆相マイクロチップ上で濃縮し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ）により分析する（Gu, T.L., et al., 2012, PLoS One 6, e15640）。細胞移動／増殖及び／又は血管新生を刺激する推定上の膜受容体を単離し特徴付けるために、高度に光反応性のアジド基と結合した精製ＢＣＦ５−５を最初に調製し、ビオチン化が続く（Kurose, T., et al., 1994, J Biol Chem 269, 29190-29197）。受容体を同定するために、プローブを皮膚細胞に光架橋し、光親和性標識リガンド−受容体複合体を生成する。この産物をエンドペプチダーゼで消化し、結果として得られた架橋ペプチドフラグメントをストレプトアビジン−アフィニティ−クロマトグラフィーにより分離し、ＬＣ−ＬＴＱイオントラップ質量分析法（Luque-Garcia, J.L., 2010, Proteomics 10, 940-952）を使用して分析する。

本明細書において提示する試験は、画分５−５における１つ又は複数の移動促進タンパク質の精製及び一次配列同定、並びにインビトロでの皮膚細胞の移動を誘導するその／それらの有効量の特徴付けをもたらす。大豆タンパク質データベースに従い、大豆調製物は、総タンパク質の８０%を占める２つの主要な貯蔵タンパク質であるβコングリシニン（βＣＧ）及びグリシニン並びに１００を上回る低存在タンパク質を含む（Tavakolan, M., et al., 2014, Bioinformation, pp 599-601）。ＢＣＦ５−５中の移動促進タンパク質は、豊富な（全タンパク質、サブユニット、又は誘導ペプチドフラグメント）、又はプロテオーム質量スペクトルデータ、それに続くバイオインフォマティクスベースのデータマイニングを利用して同定することができる微量タンパク／ペプチドのいずれかである。

イオン交換クロマトグラフィーの２つの工程がプロテオームシーケンシングのための適切な均質の生物活性タンパク質を提供しない場合、精製のための他のクロマトグラフィーの代替物、例えばDEAE-Toyopearl陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Zhang, G.Y., 2002, Phytochemistry, pp 675-681）及びSephadex G-100を使用したサイズ排除クロマトグラフィー（Bhushan, R., et al., 2007, Biomed Chromatogr 21, 1245-1251）などを使用することができ、これらのいずれも大豆タンパク質（例えばグリシニン及びコングリシニンなど）の精製に成功裏に使用されている（Amigo-Benacent, M., et al., 2010, J. Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci pp 2453-2456）。単離タンパク質が糖タンパク質である場合、大豆の移動促進タンパク質の脱グリコシル化を、製造者の指示に従って酵素的Ｎ脱グリコシル化キット（GlycoProfile II，Sigma）を使用し、記載されているように（Fu, C., et al., 2007, J Agric Food Chem 55 4014-4020）実施し、脱グリコシル化の効率をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のタンパク質の移動度のシフトにより確認する。脱グリコシル化タンパク質は、生物学的効果へのグリコシル化の寄与を評価するために、移動促進活性についてテストする。活性化合物がオリゴペプチド（＜３０アミノ酸）である場合、検証は固相合成により実施する。ウズラにおけるインビボＣＡＭ血管新生アッセイの代替物として、ラットにおける角膜マイクロポケットアッセイでＢＣＦ５−５の血管新生促進活性を測定する（Momic, T, et al., 2014, J Pharmocol Exp Ther 350, 506-519）。上記のようにリンタンパク質を同定する代わりに、網羅的キノミクスアプローチが使用される。生物活性大豆タンパク質で処理した皮膚細胞の抽出物を市販のヒトリン酸化ペプチドマイクロアレイにより分析する（Kindrachuk, J., et al., 2012, Mol Cell Proteomics 11, M111.015701）。シグナル伝達経路は、バイオインフォマティクスアプローチ（Lecht, S., et al., 2014, Stem Cells Dev 23, 1923-1936）を使用し、サンプル中の活性化キナーゼに基づいて分析する。上記のとおりに移動促進タンパク質受容体を特徴付けることが困難な場合、インサイチュ化学架橋（Pertl-Obermeyer, H., et al., 2014, J Proteomics 10817-29）及び免疫親和性精製（Kim, K. M., et al., 2012, Methods, pp 161-165）と共役した質量分析が、ＢＣＦ５−５の細胞受容体を同定するために使用される。このために、ウサギポリクローナル抗体又はマウスモノクローナル抗体が、精製ＢＣＦ５−５に対して生成される。

実施例３：再上皮化及び血管新生の増強は、α９β１インテグリンのリガンドである異なるＷＳｓｏｙタンパク質及びそれらの誘導体により媒介される。

記載された試験では、ＲＰ−ＨＰＬＣ分離（図２参照）により得られた１１のＷＳｓｏｙ画分を固定化し、α９インテグリンサブユニット（α９＋）でトランスフェクトした細胞を使用し、α９β１インテグリンを発現した細胞又は発現しなかった細胞の接着を促進する能力をテストした（Ventresca, E.M., et al., 2015, Cell Signal 27, 1225-1236; Brown, M.C., et al., 2008, Neuro Oncol 10, 968-980）。これらの画分のスクリーニングにより、固定化された画分９、１０、及び１１へのα９＋細胞の接着が明らかになった（図６）。α９β１インテグリンを発現していない野生型細胞（α９−）では接着が観察されなかった。重要なことに、これらの接着実験は、インテグリン（活性化モノクローナル抗体又は高濃度のマンガン陽イオン）のための刺激因子の非存在下で実施した。最も効率的な接着が画分９で観察され、この画分をさらなる研究のために選択した。

α９β１インテグリンのリガンドである画分９中の活性タンパク質を同定するために、この画分を、アセトニトリルの「より平坦な」勾配（１２０分間にわたる４０〜８０%）を使用したＲＰ−ＨＰＬＣで再クロマトグラフィーにかけ、５つの亜画分が得られた（図７Ａ）。テストした最低濃度（０．５μg/ml）での接着促進活性は、主に画分９−４において認められた（図７Ｂ）。亜画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、非還元条件下で高度の異種性が示された（図７Ｂ、挿入図）。活性画分９−４及び非活性画分９−２における特定のバンドの存在を比較することで、α９β１インテグリン結合の可能性のある候補、最も顕著には、５５kDaの見掛け分子量を伴うタンパク質が明らかになった。このバンドを切り出し、トリプシン生成ペプチドを配列決定することによる質量分析（プロテオミクス）により分析した。このバンド（５５kDa）中の全ての同定されたペプチド配列はβコングリシニン（βＣＧ）のアルファプライム鎖のフラグメントの配列に予想通りに対応する。

さらに、画分９−４中のタンパク質とα９β１インテグリン発現細胞との相互作用の選択性を、ＶＬＯ５を用いた競合実験においてテストした。ＶＬＯ５はα９β１インテグリンに強力に結合するヘビ毒ＭＬＤ−ディスインテグリンであり（Bazan-Socha, S., et al., 2004, Biochemistry 43, 1639-1647）、ＶＬＯ５は固定化ＶＣＡＭ−１と同様の効力（ＩＣ５０＝３．２nM）で固定化された画分９−４へのα９＋細胞の付着を阻害し（ＩＣ５０＝５．６nM）、これらのリガンドの両方へのα９β１結合の同等の親和性を示した。重要なことに、可溶性画分９−４（１００μg/mlまで）の添加は、ＶＣＡＭ−１、ＶＬＯ５、及びＮＧＦを含む他の固定化α９β１インテグリンリガンドへのα９＋細胞接着を阻害しなかった。このように、画分９−４中のタンパク質は、大部分のＥＣＭタンパク質に特徴的である固相においてのみα９β１インテグリンに結合すると結論づけられる。この観察により、ラットにおける治療的な創傷治癒を増強するエレクトロスピンＷＳｓｏｙマトリックスの観察された有効性が説明されうる（図１０）。

インビトロでの血管新生に対する画分９−４の効果を評価するために、マトリゲル管形成アッセイを記載のとおりに使用した（Walsh, E.M., et al., 2012, Neuro Oncol, pp 890-901）。画分９−４のタンパク質が固定化形態でのみ活性であったという事実を考慮すると、画分９−４は成長因子低減マトリゲルと共重合した。予想通り、ＨＤＭＶＥＣは成長因子枯渇マトリゲル上で管状構造を形成しなかったが、しかし、頑強な毛細血管様ネットワーク形成が、重合前にマトリゲルに画分９−４タンパク質を加えた場合に観察された（図８）。

実験は、イオン交換クロマトグラフィーにより画分９−４を精製及び特徴付けるために実施される。α９β１インテグリン結合タンパク質の精製のために、画分９−４は、異なる精製戦略、例えばｐＨ分画沈殿（Lakemond, C.M., et al., 2000, J. Agric Food Chem 48, 1985-1990）及び本明細書の他の箇所に記載されているイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。α９＋細胞への画分の接着促進活性をテストすることにより、各工程をモニターする。

実験はまた、種々の培養皮膚細胞の移動／増殖に対する精製画分９−４成分のインビトロ効果を研究するために実施される。さらに、インビトロでの血管新生（マトリゲルアッセイ）及びインビボでのウズラＣＡＭにおける精製画分９−４成分の効果も検証する。培養皮膚細胞を使用し、精製タンパク質の細胞応答を試験する。具体的には、移動、増殖、及び血管形成アッセイを、画分９−４からの固定化タンパク質を使用し、本明細書の他の箇所に記載されているように実施する。生物活性成分画分９−４（ＢＣＦ９−４）とα９β１インテグリンとの相互作用の特異性は、このインテグリンの特異的阻害剤であるＶＬＯ５を使用して確認する（Walsh, E.M., et al., 2012, Neuro Oncol, pp 890-901）。

実験はまた、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより画分９−４中の生物活性タンパク質の一次配列を同定するために行う。公知の高及び低存在量タンパク質とのアミノ酸配列アライメントは、本明細書の他の箇所で考察されるように実施する。

実験はまた、画分９−４の生物活性成分がα９β１インテグリンを活性化する細胞シグナル伝達を同定するために実施する。細胞シグナル伝達実験は、ＢＣＦ９−４への細胞の付着後に活性化される細胞質シグナル伝達分子を同定するために実施する。最初に、実験を、チロシンキナーゼに焦点を当てて実施し、それらの同族基質のリン酸化を、抗チロシン抗体を用いたウエスタンブロットを使用し、ＢＣＦ９−４上の皮膚細胞の拡散／付着後に記載のように比較する（Jiang, H., et al., 1997, J Cell Biochem 66, 229-244）。さらに、チロシンリン酸化のための基質を、プロテオームアプローチにより同定する。ウエスタンブロットによる細胞溶解物の分離は、２−Ｄゲルを使用して処理する。強度増加を示すタンパク質スポットをゲルから切り出し、プロテオーム分析のために送る。試験される他の重要な経路は、ＭＡＰキナーゼ、ＡＫＴ、及びＦＡＫを含み、これらはα９β１インテグリン媒介性細胞遊走／増殖に含まれる。最近、これらの経路がα９β１インテグリンにより活性化されることが記載された（Ventresca, E.M., et al., 2015, Cell Signal 27, 1225-1236）。

本研究では、画分９−４の精製が、固定化された形態のα９β１インテグリンと相互作用する活性化合物を産生し、提案された皮膚細胞系における移動／増殖を刺激することが実証される。さらに、実験では、ＢＣＦ９−４のインビボでの血管新生促進効果が、異なる濃度で成長因子低減マトリゲルと共重合させた場合に確認される。ＭＬＤディスインテグリンＶＬＯ５によるＢＣＦ９−４とα９β１インテグリンとの相互作用の阻害によって、マトリゲルにおける細胞移動及び増殖並びに管形成が遮断される。さらに、ＢＣＦ９−４は、リガンドと大部分のインテグリンとの相互作用に続いて活性化されるＥＲＫ又は焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）などのキナーゼの活性化をもたらす。これらの又は他のキナーゼが実際に活性化される場合、確立された生化学的アッセイを、ＢＣＦ９−４依存性移動／増殖及び血管新生におけるそれらの関与を確認するために特異的阻害剤を使用して実施する。

ＢＣＦ９−４と不活性画分９−２との比較分析（図７）を２−Ｄ電気泳動により実施し、潜在的な活性タンパク質を表しうるユニークなスポットを同定する。これらのスポット中のタンパク質をプロテオミクスにより同定する。この評価からの主要タンパク質を、細胞接着アッセイにおいてα９β１インテグリンへの結合についてスクリーニングする。上記のようにリンタンパク質を同定するための代替物において、網羅的キノミクスアプローチを本明細書の他の箇所に記載されているように使用する。

実施例４：ラット及びブタモデルにおける全層皮膚創傷でのＷＳｓｏｙ再上皮化及び血管新生の生物活性成分の効果。

以前の試験では、イソフラボノイドを含み、全層皮膚創傷のラット及びブタモデルにおいて、再上皮化及び血管新生の増強が実証されたＨＦＰ可溶性形態のＳＰＩが使用された（Har-el, Y., et al., 2014, Wound Medicine, 5, 9-15; Har-el Y., et al., 2014, Biomedical Engineering Society Annual Meeting; Lin, L., 2011, PhD thesis, Drexel University, Biomedical Engineering p 207）。具体的には、ラットの試験では、遅延治癒のモデル（Galiano, R.D., et al., 2004, Wound Repair Regen 12,485-492）を適応させ（図９）、創傷辺縁周辺の皮膚をシリコーンリングで固定することにより収縮による創傷閉鎖を避ける。従来のＳＰＩの代わりに水溶性大豆タンパク質に焦点を当てているのが、現在記載されている試験におけるこの「ラットリングモデル」である。図１０に見られるように、創傷（ｐｗ）後７日目、ＷＳｓｏｙで覆われた創傷は完全な上皮被覆を示し（図１０Ａ）、テガダームで覆われた対照創傷は表皮を欠き、創傷中心の真皮は本質的に任意の組織を欠く肉芽組織である（図１０Ｂ）。１４日目までに、対照（テガダームで覆われた創傷）は、特定レベルの上皮化を示し、表皮は肉芽組織で充満している（図１０Ｄ）。これとは対照的に、ＷＳｓｏｙ足場で覆われた創傷において以前に公表された結果と一致して、真皮の組織化はより顕著であり、付属器の再生の開始を示す（図１０Ｃ）。免疫組織化学的試験（図１１）では、ＷＳｓｏｙ処置創傷におけるより成熟した上皮（パンサイトケラチンを伴う表皮の強固な染色）が明らかになっているのに対し、対照創傷はほとんど又は全く染色を示さなかった。重要なことは、これまでに試験された全てのＷＳｓｏｙ処置動物（ｎ＝４）において、１４日目までに虫垂の再発生が観察されたが、範囲は、それらの一部ではより頑強であり、創傷の中心にさえ見られた。

特定の生物活性タンパク質画分の精製後、ラット創傷治癒遅延の以前に確立されたモデル（Galiano, R.D., et al., 2004, Wound Repair Regen 12, 485-492）を使用して、これらの画分の各々の有効性をインビボでの創傷治癒についてテストする。さらに、この知見をブタ試験においてさらに検証する（下記参照のこと）。

具体的には、ＢＣＦ５−５は、創傷の部位でこれらのタンパク質を可溶性形態で急速に提供する送達担体／製剤中で調製する。可能性のある製剤は、生物活性を有さないヒドロゲル（例えばジェニピンと架橋されたゼラチンなど）と混合された（Saglam A., et al., 2013, J Mol Neurosci 49, 334-346）又はエレクトロスピンされた足場に組み入れられたマイクロスフェアにカプセル化された（Zabrodin, I.,, 2009, MS thesis, Drexel University, Biomedical Engineering p 104）粉末として画分を調製することを含む。対照的に、ＢＣＦ９−４は、固定化形態、例えば、エレクトロスピンされた足場として、又はエレクトロスピンされた足場として生物学的に不活性なポリマーと混合して調製する。これらの送達系は、創傷治癒遅延のラットモデルにおいて最初にテストして最適化し（Har-el Y. et al., 2014, Biomedical Engineering Society Annual Meeting; Galiano, R.D., et al., 2004, Wound Repair Regen 12,485-492）、次に創傷治癒のブタモデルにおいて検証する（Har-el Y., et al., 2014, Wound Medicine 5, 9-15）。

インビボでの創傷の処置のための可溶性ＢＣＦ５−５を送達するための系を調製するため、及び創傷治癒遅延のラットモデルにおいて最適な送達系を決定するための実験を実施する。インビボでの創傷の処置のために固定化されたＢＣＦ９−４を送達するための系を調製するため、及び創傷治癒遅延のラットモデルにおいて最適な送達系を決定するための実験も実施する。さらに、ＢＣＦ５−５及びＢＣＦ９−４の両方の最適な送達系を、創傷治癒のブタモデルにおいて検証する。

ラット試験は、ＢＣＦ５−５及びＢＣＦ９−４が経時的に皮膚の再上皮化をどれくらいうまく増強するかを決定するための経時試験である。早期及び後期の時間点を研究し、これらの画分がどのように陽性及び陰性対照と比較して再上皮化及び血管新生を組織学的に増強するかを分析する。創傷治癒遅延のラットリングモデルは、公開された方法（Galiano, R.D., et al., 2014, Wound Repair Regen 12,485-492; Har-el Y. et al., 2014, Biomedical Engineering Society Annual Meeting）に基づく。実験は所定の時間点で終了する（下記参照のこと）。安楽死後、記載されるように（Har-el Y., et al., 2015, Wound Medicine 5, 9-15）、創傷／治癒皮膚及び周囲の健常組織を採取し、ルーチンの組織学及び凍結切片のために処理する。薄いパラフィン包埋切片（５μm）を、ヘマトキシリン＆エオシン、マッソントリクローム及びピクロシリウスレッド（ＥＣＭ回収、特にコラーゲン）で染色する。切片で免疫組織化学（ＩＨＣ）を行い、炎症／免疫応答、血管新生及び再上皮化の範囲を決定する。これらの全ての染色技術は、公開されたプロトコールを使用してうまく実施される（Mondrinos, M.J., et al. 2006, Tissue Eng 12, 717-728; Mondrinos, M.J., et al., 2007, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 293 L639-650; Mondrinos, M.J., et al., 2008 Tissue Eng Part A 14, 361-368）。さらに、組織切片もまた、炎症及び組織修復の前兆として、それぞれＭ１及びＭ２ａマクロファージの２つの確立されたマーカーであるｉＮＯＳ及びＣＤ２０６を使用してマクロファージについて染色する（Novak, M.L., et al., 2013, J Leukoc Biol 93, 875-881）。内皮細胞を抗ＣＤ３１抗体で染色し、パンサイトケラチン及びサイトケラチン１５抗体を使用して上皮細胞を染色する。この染色により、皮膚が血管再生及び上皮化によりそれ自体を修復する範囲、及び各処置群においてこの修復がどのくらい急速に進行するかが明らかになる。全ての場合において、一次抗体と同じ種からのアイソタイプを一致させた免疫前抗体を陰性対照として使用する。マルチプレックス染色では、記載されているように、異なるフルオロフォアで標識された二次抗体を使用する（Mondrinos, M.J., et al., 2006, Tissue Eng 12, 717-728; Mondrinos, M.J., et al., 2007, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 293 L639-650; Mondrinos, M.J., et al., 2008, Tissue Eng Part A 14, 361-368）。

テストしたＢＣＦ５−５の送達系は、３つの選択肢からなる。Ａ．創傷上に散布したＣＢＦ５−５粉末の送達。Ｂ．ＢＣＦ５−５と混合したゼラチンなどの非生物活性天然ポリマーで作製されたヒドロゲル。ゼラチンヒドロゲルは、ゲニピンと架橋した場合に３７℃で安定である（Seglam, A., et al., 2013, J Mol Neurosci 49, 334-346）。この方法により、剛性が天然の皮膚に近いハイドロゲルを達成するために使用されるゲニピンの濃度の変更が可能になる。Ｃ．以前に記載された技術（Zabrodin, I., 2009, MS thesis, Drexel University, Biomedical Engineering, p 104）を使用したマイクロカプセル及び組み込まれたエレクトロスピン足場中のＢＢＣＦ５−５。足場は、生体適合性であるが、ＰＬＧＡ／ゼラチン／エラスチン（ＰＧＥ）の混合物などの既知の生物活性を有さないポリマーから作製する（Han, J. et al., 2011, Biomacromolecules 12, 399-408）。マイクロスフェアは、ＢＣＦ５−５のより良い放出をもたらす方法に依存し、ＰＬＧＡ（Zabrodin, I., 2009, MS thesis, Drexel University, Biomedical Engineering, p 104; Har-el Y, 2005, PhD thesis, Johns Hopkins University, Chemical and Biomolecular Engineering p 199）から、又はアルギン酸塩（Zabrodin, I., 2009, MS thesis, Drexel University, Biomedical Engineering, p 104）から作製する。インビボ試験の開始前に、ロード効率のテスト及びインビトロ放出試験の試験を記載されているように実施し（Zabrodin, I., 2009, MS thesis, Drexel University, Biomedical Engineering, p 104; Har-el Y., et al., 2005, PhD thesis, Johns Hopkins University, Chemical and Biomolecular Engineering p 199）、マイクロスフェア製剤の各々からのＢＣＦ５−５の放出の範囲を決定する。ＷＳｓｏｙの最初の２つの精製工程（画分５−５及び９−４に到達する）により、タンパク質が少なくとも５０倍濃縮されたと推定される。さらなる精製により、活性タンパク質を合計約１００倍濃縮することができる。従って、等価用量のＢＣＦ５−５及びＢＣＦ９−４を送達するためには、１００μgの用量、又は本来のＷＳｓｏｙの１%がラットにおいて必要である。各々の系について、ＷＳｓｏｙは陽性対照として作用し、未処置創傷は陰性対照としての役割を果たす。

粉末として送達された可溶性ＢＣＦ５−５の創傷治癒能力の比較（４０匹のラット）：以下に記載する４つの処置のうちの２つを無作為に各ラットに施す（２つの同じ処置を受けるラットはいない）。処置は以下である：Ａ．メチルセルロース（１０mg）と混合したＢＣＦ５−５粉末（１００μg）（Bonadio, W.A., et al., 1992, Ann Emerg Med 21, 1435-1438）。Ｂ．全ＷＳｓｏｙ粉末（１０mg、陽性対照）。Ｃ．メチルセルロース単独（１０mg）。Ｄ．未処置。時間点あたり合計１０匹のラット（２０の創傷）。検証する時間点：３、７、１４、及び２８日。

ヒドロゲルとして送達された可溶性ＢＣＦ５−５の創傷治癒能力の比較（２５匹のラット）：以下に記載する２つの処置を各々のラットに施す。処置は以下である：Ａ．ＢＣＦ５−５／架橋ゼラチンヒドロゲル（１００μgのＢＣＦ５−５）。Ｂ．未処置。時間点あたり合計５匹のラット（１０の創傷）。検証する時間点：３、７、１４、及び２８日。

マイクロスフェアから送達された可溶性ＢＣＦ５−５の創傷治癒能力の比較（２８匹のラット）：以下に記載する３つの処置のうちの２つを、各ラットに無作為に施す（２つの同じ処置を受けるラットはいない）。処置は以下である：Ａ．ＰＧＥエレクトロスピン足場に組み入れられたマイクロスフェア中のＡ．ＢＣＦ５−５。Ｂ．ＰＧＥエレクトロスピン足場（陰性対照）に組み入れられたブランクマイクロスフェア。Ｃ．未処置。時間点あたり合計７匹のラット（１４の創傷、Ａ及びＢの５つの創傷、及び対照の４つ）。検証する時間点：３、７、１４、及び２８日。

ＢＣＦ９−４は、エレクトロスピン足場マトリックスとして固定化形態で調製する。エレクトロスピンＷＳｓｏｙは陽性対照として作用し、画分４（現在までのいずれの試験においても生物活性を示していない）は陰性対照としての役割を果たす。使用されるＢＣＦ９−４の濃度は、細胞試験における用量応答に基づいて計算する。実験を行い、上に記載するのと同じプロトコールに従って分析する。

エレクトロスピン足場としての固定化ＢＣＦ９−４の送達における創傷治癒能力の比較（２８匹のラット）：以下に記載する３つの処置のうちの２つを無作為に各々のラットに施す（２つの同じ処置を受けるラットはいない）。処置は以下である：Ａ．エレクトロスピン足場としてのＢＣＦ９−４。Ｂ．エレクトロスピン足場としての全ＷＳｓｏｙ。Ｃ．未処置。時間点あたり合計７匹のラット（１４の創傷、Ａ及びＢの５つの創傷、及び対照の４つ）。検証する時間点：３、７、１４、及び２８日。

１つの処置においてＢＣＦ５−５とＢＣＦ９−４とを組み合わせることでの可能性のある相加的又は相乗的効果の決定（６０匹のラット）：６つの処置のうち２つを無作為に各ラットに施す（２つの同じ処置を受けるラットはいない）。処置は以下である：Ａ．（相乗効果のための）エレクトロスピンＢＣＦ９−４足場に組み入れられたＢＣＦ５−５マイクロスフェア。Ｂ．ＢＣＦ９−４の最適製剤（ＢＣＦ９−４の陽性対照）。Ｃ．ＢＣＦ５−５の最適製剤（ＢＣＦ５−５の陽性対照）。Ｄ．ＰＢＣエレクトロスピン足場中に組み入れられたマイクロスフェア中のＢＣＦ５−５。Ｅ．エレクトロスピン足場としての全ＷＳｓｏｙ（全体的な陽性対照）。Ｆ．未処置。これらの処置の各々からの５つの創傷があるように、時間点あたり合計１５匹のラット（３０の創傷）。検証する時間点：３、７、１４、及び２８日。

ブタ試験を、以前に記載されたのと同様に行う（Har-el Y., et al., 2014, Wound Medicine 5, 9-15）。安楽死後、切除組織の半分を４℃で一晩、ホルマリン中で固定し、次に組織学的分析のために処理し、残りの半分を凍結切片として処理用にＯＣＴ中で凍結する。組織学的分析用のサンプルを創傷の中心から切断する。除去された領域は、創傷の幅に及び、健常な周囲組織の２〜３mmを含む。組織学的分析のために収集された各々の組織から少なくとも２つの切片（〜２cm×３mm）を除去する。全ての組織学的Ｈ＆Ｅ及びトリクロム染色を、ラットモデルについて記載されるように実施する。凍結サンプルに対する免疫組織学的分析は、ラット試験において記載された同じ抗原に対するブタ特異的一次抗体を使用して行う。

大型動物ブタモデル（２０頭のブタ）においてラット試験＃３．１−３．５で同定された最適な処置を比較する：この試験では、ブタに５つの異なる処置を与える（各々の動物について追加の異なる処置を伴う、各々の処置の動物あたり３つの創傷）。Ａ．ＢＣＦ５−５のための最適な送達系；Ｂ．ＢＣＦ９−４のための最適な送達系；Ｃ．全ＷＳｓｏｙエレクトロスピン足場；Ｄ．ＢＣＦ５−５及びＢＣＦ９−４送達系の組み合わせ；Ｅ．未処置。全ての群が、本明細書において記載するのと同じ創傷処置を有する。群１（ｎ＝ブタ５頭）：処置の２８日後に屠殺する。各々の処置についての創傷治癒の範囲を分析する。群２（ｎ＝ブタ５頭）：処置の３日後に屠殺する。群３（ｎ＝ブタ５頭）：処置の７日後に屠殺する。群４（ｎ＝ブタ５頭）：処置の１４日後に屠殺する。

本明細書に提示する実験では、ＢＣＦ５−５及びＢＣＦ９−４の単独又は組み合わせの包含により、非処置対照と比較し、増強された再上皮形成により見られるような、これらの大型動物モデルにおける皮膚創傷治癒が増強されるか否かが検証される。ゼラチン／ＢＣＦ５−５ヒドロゲルの代替物は、大豆で試験されたＰＥＧヒドロゲル系中にＢＣＦ５−５を組み入れることであろうが、ＰＥＧは生物学的活性を有さないことが示されている（Snyders, R., et al., 2007, J Biomed Mater Res A 83, 88-97）。ＢＣＦ９−４がそれ自体でエレクトロスピンできない場合、それをＰＧＥとエレクトロスピンし、相乗効果の試験において最適な同時スピン足場を使用することができる。さらなる実験には、ラットにＶＬＯ５で投与してＢＣＦ９−４の活性を阻害するなどの阻害試験を含むことができる。

過剰なバックグラウンド蛍光に伴う問題に遭遇した場合、適当なベクターＡＢＣキットを使用し、比色染色技術（ＨＲＰ、ＡＰなど）を用いることができる。

実施例５：ＷＳｓｏｙにおける生物活性タンパク質

画分の各々（画分５（Ｆ５）及び画分９（Ｆ９））をさらに精製し、より小さなタンパク質画分を得ている。これらのうち、Ｆ５及びＦ９中の生物活性を同定した同じアッセイを使用し、生物活性亜画分を同定した（図１４は、Ｆ９亜画分の生物活性を示す）。これらの生物活性亜画分及び非活性亜画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介したプロテオーム分析に供した。

Ｆ９のプロテオーム分析（図１７）はβコングリシニンとの類似性を示唆する。具体的には、活性画分の最も高い同一性が（３つの鎖のうちの）βコングリシニンアルファ’（プライム）鎖で認められた（Maruyama, N., et al., 1998, Eur J Biochem 258, 854-862）。図１２は、赤色であるプロテオミクス由来ペプチドとのβコングリシニンアルファ’の配列の重複領域を示す。最も重要な因子はβコングリシニンアルファ’の配列中にＬＤＶモチーフがあることである（黄色で強調表示、図１２）。これは、フィブロネクチンのＣＳ−１フラグメントに存在する、最良に特徴付けられた生物学的に活性なモチーフの１つである（Komoriya, A., et al., 1991, J Biol Chem 266, 15075-15079; Yokosaki, Y., et al., 1998, J Biol Chem 273, 11423-11428; Keinan, O., et al., 2014, J Cell Sci 127, 4740-4749）。それはα４β１インテグリンの結合部位として特徴付けた。α４β１及びα９β１インテグリンは非常に類似しており、いくつかのリガンドを共有する。ＣＳ−１配列を図１２に緑色で含め、ＬＤＶを示す。

ＬＤＶ（ＥＩＬＤＶＰＳＴ）配列（配列番号１）を含むＣＳ−１を購入し、細胞接着アッセイにおいてテストした。α９インテグリンサブユニット（α９ＬＮ１８）をトランスフェクトしたＬＮ１８細胞をこのアッセイで使用した。固定化Ｆ９画分及び組換えＶＣＡＭ−１をα９β１インテグリンのためのリガンドとして使用した。ＥＩＬＤＶＰＳＴペプチド（配列番号１）は、５００μm前後の濃度で両方のリガンドへのこれらの細胞の接着を完全に阻害した。これはβコングリシニンアルファ’中に存在するＬＤＶモチーフがα９β１インテグリンについての結合部位であるという最初の証明である。大豆タンパク質中でのこのモチーフの存在は、生物学的に活性であるとして公開されたことはない。次の工程にはβコングリシニンアルファ’（ＲＤＬＤＶＦＬＳ）（配列番号２）由来のＣＳ−１ペプチドに類似するペプチドの合成が含まれ、このインテグリンを発現する細胞を用いた細胞接着アッセイ、並びに精製α９β１インテグリンを使用したＥＬＩＳＡにおいてα９β１インテグリンとＦ９及びＶＣＡＭ−１との結合の阻害剤としてテストする。この戦略により、大豆βコングリシニンアルファ’中に存在するＬＤＶモチーフがα９β１インテグリンについての結合部位であることが確認される。

画分５のプロテオーム分析は、活性な生物活性成分画分ＢＣＦ５−５が活性タンパク質についての可能性のある候補を示しうることを示唆する（図１６）。不活性である生物活性成分画分ＢＣＦ５−４からの結果は、類似のペプチド配列を有することに起因する、考察からのバンドＣの排除を支持する（図１６）。残りのバンドのうち、さらなる試験のための潜在的な活性を伴う１０のペプチドが同定された。

実施例５：ＷＳｓｏｙマトリックスは、皮膚創傷の治癒を増強する。
ＷＳｓｏｙは、湿潤組成物として、及びインサイチュでの自己組織化のために湿式創傷表面上に散布して創傷ドレッシング材マトリックスを形成する乾燥組成物としてテストした。組織の組織学的染色（図１８Ａ、図１８Ｃ、図１８Ｅ、及び図１８ＧはＨ＆Ｅである；図１８Ｂ、図１８Ｄ、図１８Ｆ、及び図１８Ｈはピクロシリウスレッド、コラーゲン染色である）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）におけるコラーゲンの再組織化と同時に頑強で複雑な再上皮化及び付属器（毛包、汗腺）の再生を示し、未処置の創傷は未熟な上皮層のみの形成及びごくわずかなコラーゲン沈着を示す。

実施例６：インビトロ及びインビボでのＷＳｓｏｙの生体適合性、毒性、安全性、及び忍容性
細胞毒性は、以前に記載されたように、種々の濃度のＷＳｓｏｙの存在において培養ヒト皮膚細胞（内皮細胞、繊維芽細胞、及びケラチノサイト）の接着、増殖、及び移動を測定することによりインビトロで評価する（Du L et al., Wound Repair and Regeneration, 2012, 20:904-910; Lin L et al., Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2013, 7:994-1008; Ribeiro MP et al., Wound Repair and Regeneration, 2009, 17:817-824; Vandenbulcke K et al., The International Journal of Lower Extremity Wounds, 2006, 5:109-114）。簡単に説明すると、繊維芽細胞、内皮細胞、及びケラチノサイトを、それぞれの細胞培養培地中で、インビボでテストする用量に対応して、及びそれを超えてＷＳｓｏｙの濃度を増加させながら（０、０．１−２００mg/mL）再懸濁する。最初の細胞接着は、ＷＳｓｏｙの非存在下又は存在下で３０分間に付着する細胞の割合を評価することにより測定し（Lecht S et al., Biochimica et Biophysica Acta, 2015, 1850:1169-1179）、細胞増殖は、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ（Lin L et al., Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2013, 7:994-1008）を使用し、７日間にわたり連続的に測定し、細胞移動は、確立されたインビトロ創傷治癒アッセイ（Ventresca EM et al., Cellular Signaling, 2015, 27:1225-1236）を使用して評価する。

インビボでの安全性及び忍容性の試験のために、増加用量のＷＳｓｏｙを、「正常な」雄性無毛性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、創傷治癒遅延モデル（直径１cmのスプリント全層創傷）に適用する（Carlson MA et al., Matrix Biology, 2004, 23:243-250）。予備試験の大部分は、１０mgの大豆タンパク質／創傷を用いて行った。各々の創傷に適用した大豆の最大量は２５mg/創傷を超えなかった。

この実験では、３つの別々の目的を検証する：乾燥ＷＳｓｏｙ組成物として、湿潤ＷＳｓｏｙ組成物として送達されるＷＳｓｏｙの増加用量の安全性及び忍容性、湿潤ＷＳｓｏｙ組成物の場合では、マトリックスの厚さが一定用量に及ぼす効果。全ての場合において、動物は、手術後４週間まで経過観察し、挙動及び体重を隔日でモニターする。血液サンプル及び尿サンプルを毎週採取し、ＦＤＡガイドラインに従って、血液細胞数及び全身／肝臓毒性並びに尿排泄／クリアランス（高感度大豆特異的ＨＰＬＣ技術を使用する）を評価する（Lee MH et al., Tissue Engineering Part B, Reviews, 2010, 16:41-54）。試験終了時（４週間後）に動物を屠殺する。病変部位及び周囲の「健常」組織を、従来の組織病理学的方法により炎症性／免疫細胞の継続的な存在の徴候について評価する。内臓（例、肺、肝臓、腎臓、脳）を肉眼的病変（塞栓）について視覚的に検査し、ルーチンのＨ＆Ｅ組織学により評価する。

ＷＳｓｏｙ濃度の増加をテストするために、中性ＰＢＳ（約２．５〜５０mg ＷＳｓｏｙに相当）中の１．２５〜２５%ＷＳｓｏｙを含む０．２mLの湿潤ＷＳｓｏｙ組成物を適用し、予備データに従い、２５０μmの薄く均一な創傷マトリックスを形成する。２．５、５、１０、２５、及び５０mgのＷＳｓｏｙ／創傷の安全性を合計５サンプル（２５匹の動物）についてテストする。同量の乾燥ＷＳｓｏｙ粉末を湿った創傷に無菌的に適用（散布及びエアロゾル化）し、種々の濃度のマトリックスの自己組織化を可能にする（２５匹）。別の一連の創傷は、ＦＤＡ５１０（ｋ）承認のコラーゲン−グリコサミノグリカン（Integra（商標））創傷ドレッシング材の試験設計テストと同様に（１５匹の動物）（Heit YI et al., Plastic and Reconstructive Surgery, 2013, 132:767e-776e）、種々の厚さ（１、２．５、５mm、それぞれエレクトロスピン足場の厚さ、半分の厚さ、及び全層創傷の厚さに相当する）の湿潤ＷＳｓｏｙ組成物（１５%ＷＳｓｏｙ製）を用いて被覆する。

真皮創傷治癒についての小動物モデルの中で（Birch M et al., Methods in Molecular Medicine, 2005, 117:223-235）、げっ歯類におけるスプリント全層切除創は（Carlson MA et al., Matrix Biology, 2004, 23:243-250; Galiano RD et al., Wound Repair Regen, 2004, 12:485-492）、収縮よりもむしろ上皮形成による遅延創傷治癒についてのモデルとして十分に確立されている（Har-el Y et al., Biomedical Engineering Society Annual Meeting, San Antonio, TX, 2014）。各々のラットは、直径１cmの２つの全層切除創を背側に受ける。１つの創傷を湿潤ＷＳｓｏｙ組成物で処置する；反対側はIntegra（商標）マトリックスで処置するか、又は未処置のままにする。全ての創傷及び周囲の皮膚をテガダームで覆い、感染を最小限にする。

安全性及び毒性実験は、４週間後に終了するエンドポイント実験であるが、他の試験は、経時的に湿潤ＷＳｓｏｙ増強された再上皮化付属器の再生をより詳細に試験するための経時的試験である。早期及び後期の時間点を検証し、これらの処置が炎症応答、再上皮化、及び血管新生をいかに調節するかを組織学的に分析する。安楽死後、創傷／治癒皮膚及び周囲の健常組織を採取し、ルーチンの組織学及び凍結切片のために処理する（Har-el Y et al., Wound Medicine, 2014, 5:9-15）。薄いパラフィン包埋切片（５μm）を、ヘマトキシリン＆エオシン、マッソントリクローム及びピクロシリウスレッド（ＥＣＭ回収、特にコラーゲン）で染色する。免疫組織化学（ＩＨＣ）を切片で実施し、炎症／免疫応答、血管新生、及び再上皮化の範囲を決定する（Mondrinos MJ et al., Tissue Engineering, 2006, 12:717-728; Mondrinos MJ et al., American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology, 2007, 293:L639-650; Mondrinos MJ et al., Tissue Engineering Part A, 2008, 14:361-368）。インビトロでの細胞傷害性は予測されない；ＷＳｓｏｙをインビボで創傷マトリックスとして局所的に適用する場合、明白な毒性又は有害な免疫反応は予測されない（Har-el Y et al., Wound Medicine, 2014, 5:9-15; Lin L et al., Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2013, 7:994-1008）。

実施例７：血清中でのＷＳｓｏｙ安定性の測定
この試験の目的は、血清／創傷滲出液に曝露された場合でのＷＳｓｏｙの安定性を確立することである。その根拠は、種々の厚さのＷＳｓｏｙマトリックスのタンパク質分解速度を評価し、ＷＳｓｏｙの潜在的な（迅速な）分解が処置期間中に周期的な再適用を要求するか否かを決定することである。インビトロでのＷＳｓｏｙの血清安定性テストは、任意のＰＯＣ試験での重要な構成要素であり、インビボでの糖尿病性創傷における環境を現実的に模倣する実験環境において行う。この試験では、多形核白血球（ＰＭＮｓ、１０^６個細胞/mL、正常なＰＭＮ数に近似する）の存在下又は非存在下で正常及び糖尿病ラットからの５０%血清を含む培地中での種々の厚さ（０．２５〜１mm）のＷＳｓｏｙマトリックスの分解／安定性を４週間まで測定する。ＰＭＮは、確立されたプロトコール（Yuli I et al., European Journal of Biochemistry/FEBS, 1991, 201:421-430）に従って調製し、炎症性サイトカイン（例、ＩＬ−１）により活性化させる。この系は、タンパク質分解酵素を放出し、ＷＳｓｏｙを攻撃しうる、最も初期に侵入した白血球の一部を模倣する。逆位相／蛍光細胞培養顕微鏡（ＥＶＯＳ）における自動化ｘ−ｙステージを使用してＷＳｓｏｙマトリックスのサイズの低減（収縮）を測定することにより、最初に分解を定量化する。その後、選択された場合（最大及び最小効果）、上清中の大豆分解産物を、キャピラリーＣ１８ＨＰＬＣ分離及び特異的イムノアッセイ（Brandon DL et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50:6635-6642）を使用して分析する。注入可能なＷＳｓｏｙマトリックスは生分解性であると予測され、最も厚いＷＳｓｏｙマトリックスでさえ４週間以内に分解する（Har-el Y et al., Wound Medicine, 2014, 5:9-15; Lin L et al., Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2013, 7:994-1008）。予備試験からの凍結切片の組織像は、手術後１４日目のＷＳｓｏｙマトリックスの残存物のみを示す。

実施例８：最適に効果的なＳＷＭ製剤の決定
この試験の目的は、「正常な」ラットの全層切除創における再上皮形成及び付属器の再生を最適に増強するＷＳｓｏｙの製剤／実施形態を同定することである。以前の試験から得られたエンドポイントの結果に基づき、ＷＳｓｏｙの最適に許容可能な有効濃度の効果を、「正常な」ラットモデルにおける創傷治癒遅延の動態に関して時間依存的に評価する。第１の製剤により、以前の試験において確立された最適濃度／厚さの湿潤ＷＳｓｏｙ組成物が送達される。第２の製剤により、制御された量の乾燥ＷＳｓｏｙを湿った創傷上に散布／エアロゾル化することにより同量の乾燥ＷＳｓｏｙ粉末が送達される。市販の創傷マトリックス（例えばIntegra（商標）など）は陽性対照として作用する。

同様のIntegra（商標）製品のプロトコールに従って（Heit YI et al., Plastic and Reconstructive Surgery, 2013, 132:767e-776e）、湿潤ＷＳｓｏｙ組成物の単一の有効用量を、ゲル状注射用マトリックスの半分の厚さの層（５０mg/mLとして調製）に相当する０．５mL（２５mg ＷＳｓｏｙ）として適用する。各々の動物は直径１cmの２つの創傷を背部側に受ける。１つの創傷を湿潤ＷＳｓｏｙで処置し、反対側をIntegra（商標）マトリックスで処置するか、又は未処置のままにし、テガダームでのみ覆う。創傷治癒を３日、７日、１４日、２１日、及び２８日目に評価する。合計２５匹の動物について、１つの時間点あたり５匹の動物を使用する。

同じ根拠に従って、２５mgの乾燥ＷＳｓｏｙ粉末を、各々の「正常な」ラットの１つの予め湿らせた創傷に散布／エアロゾル化する。反対側は、ＩｎｔｅｇｒａＴＭマトリックスで処置するか、又は未処置のままにし、テガダームでのみ処置する。創傷治癒を３日、７日、１４日、２１日、及び２８日目に評価する。合計２５匹の動物について、１つの時間点あたり５匹の動物を使用する。合計で５５匹（起こりうる死亡及び病気を説明するために過剰な１０%を含む）の動物を使用する。

この試験では、以前の試験で得られたエンドポイントデータを検証し、拡大し、ＷＳｓｏｙにより誘導されたとして、動態の加速及び創傷治癒の質の増強についての洞察を提供することが期待される。ＷＳｓｏｙは、同等の市販のIntegra（商標）製品よりも良くない場合、等価であるとも予想される。

実施例９：動物モデルにおける糖尿病性創傷治癒を増強するためのＷＳｓｏｙ
糖尿病性足潰瘍（ＤＦＵ）、静脈脚潰瘍（ＶＬＵ）、及び他の糖尿病性合併症は、大半の症例で肥満でもある遅発２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者で最も頻繁に遭遇する。このように、遺伝的に糖尿病性のＺｕｃｋｅｒ糖尿病性脂肪（ＺＤＦ）ラットを使用し、多くの局面において、ヒトＴ２Ｄの進行を模倣する。具体的には、ＺＤＦラットにおける創傷は、他の糖尿病ラットモデル（例、ストレプトゾトシン誘導性Ｔ２Ｄモデル又は同系の「正常対照」）よりもかなり遅く治癒する（Michaels JT et al., Wound Repair and Regeneration, 2007, 15:665-670）。ＺＤＦラットは、従って、創傷閉鎖を加速し、治癒／再生プロセスを増強するという点で、任意の治療計画の有益な効果を小動物モデルにおいて最初に実証するのに理想的である。ブタは、ヒト疾患のための（Sullivan TP et al., Wound Repair and Regeneration, 2001, 9:66-76）、特に皮膚創傷治癒のための（Seaton M et al., ILAR Journal, 2015, 56:127-138）優れた一般的モデルとして認識されており、Ｔ２Ｄのための適切な遺伝的ブタモデルはない。代わりに、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病ブタモデルは、非糖尿病対照ブタと比較して創傷治癒遅延を呈することが示されている（Velander P et al., Wound Repair and Regeneration, 2008, 16:288-293）。

ＺＤＦラットでの実験は、ＷＳｓｏｙの最も有効な実施形態を使用して以前に記載されたように行う。実施例２からの最適に許容可能な／有効な用量を用いた、実施例４からの同じ処置群を使用する。対照動物は、糖尿病ではない（同系）ＺＤＦ痩せラットである。ラットでの試験と同様に、ＷＳｓｏｙについての１用量／送達方法をブタ試験に使用する。ヨークシャーブタ（約６０kg）を使用し、糖尿病は、記載されたように誘導し、グルコースレベルの上昇を測定することにより検証する（Velander P et al., Wound Repair and Regeneration, 2008, 16:288-293）。一度、動物が糖尿病になったら、１６の全層創傷（３cm×３cm×１cm）を各側４列中２列で背側切除する（Har-el Y et al., Wound Medicine, 2014, 5:9-15）。ＷＳｓｏｙは、ブタ（９cm²）対ラット（１．７cm²）において有意に大きなサイズの創傷に外挿する最適に選ばれた用量／適用方法で創傷に適用する。対照創傷には創傷ドレッシング材が適用ない。各々の創傷は密封テガダームドレッシング材で個々に固定し、全領域に包帯する。各々のブタに適用することができる多数の創傷のために、各々のブタにおいて複数の時間点の創傷を作製することが可能であり、各々のブタがそれ自体の対照であることを可能にする。創傷を３つの異なる時間点で作製し、ブタを屠殺し、組織を同日に収集する（Har-el Y et al., Wound Medicine, 2014, 5:9-15）。組織採取の４週間前、２週間前、及び３日目に手術を実施し、時間点を確実にする。組織を採取し、実施例２に記載するように分析する。４頭のブタを使用する；ＳＴＺ誘導性糖尿病を伴う２頭及び２頭の健常対照ブタ。ＷＳｓｏｙを用いたブタの創傷の処置により皮膚創傷の治癒が増強されることが期待される。糖尿病動物における創傷治癒が有意に遅延することを考慮すると、治癒プロセスがある程度加速することも期待される。

本明細書において引用する各々の特許、特許出願、及び刊行物の開示は、それらの全体が参照により本明細書中に組み入れられる。本発明は、特定の実施形態を参照して開示されているが、本発明の他の実施形態及びバリエーションが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者により考案されうることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態及び等価のバリエーションの全てを含むと解釈されることが意図される。

Claims

組成物が、大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）の生物活性ペプチド成分を含む、創傷治癒及び組織再生を誘導するための組成物。
組成物が、画分５を含む、請求項１記載の組成物。
画分５が、溶出の直線勾配（４５分間にわたる０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を伴う、Ｃ１８を使用した逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用してＷＳｓｏｙ分離の間に溶出されるタンパク質画分を含み、画分５が、約２５〜３５分間の保持時間を有する、請求項１記載の組成物。
画分５が、約１７．９mVのゼータ電位を有する、請求項２記載の組成物。
組成物が、画分９を含む、請求項１記載の組成物。
画分９が、溶出の直線勾配（４５分間にわたる０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を伴う、Ｃ１８を使用した逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用してＷＳｓｏｙ分離の間に溶出されるタンパク質画分を含み、画分９が、約３５〜４０分間の保持時間を有する、請求項５記載の組成物。
画分９が、約３４．２mVのゼータ電位を有する、請求項５記載の組成物。
組成物が、粉末、ゲル、ローション、フィルム、溶液、スプレー、及び足場からなる群の少なくとも１つを含む、請求項１記載の組成物。
組成物が、水溶性大豆タンパク質単離物（ＷＳｓｏｙ）を含む、創傷治癒及び組織再生を誘導するための組成物。
請求項１〜９のいずれか一項記載の組成物を被験体の処置部位に投与することを含む、それを必要とする被験体において創傷治癒及び組織再生を促進するための方法。
足場が、大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）の生物活性ペプチド成分を含む、創傷治癒及び組織再生を誘導するための足場。
足場が、画分５を含む、請求項１１記載の足場。
画分５が、溶出の直線勾配（４５分間にわたる０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を伴う、Ｃ１８を使用した逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用してＷＳｓｏｙ分離の間に溶出されるタンパク質画分を含み、画分５が約２５〜３５分間の保持時間を有する、請求項１２記載の足場。
画分５が、約１７．９mVのゼータ電位を有する、請求項１２記載の足場。
足場が、画分９を含む、請求項１１記載の足場。
画分９が、溶出の直線勾配（４５分間にわたる０〜８０%アセトニトリル（ＡＣＮ））を伴う、Ｃ１８を使用した逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用してＷＳｓｏｙ分離の間に溶出されるタンパク質画分を含み、画分９が約３５〜４０分間の保持時間を有する、請求項１５記載の足場。
画分９が、約３４．２mVのゼータ電位を有する、請求項１５記載の足場。
足場が、電気処理された繊維を含む、請求項１１記載の足場。
電気処理された繊維が、ＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含む、請求項１８記載の足場。
電気処理された繊維が、合成ポリマーを含む、請求項１８記載の足場。
合成材料ポリマーが、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、コポリマーポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリアニリン、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２０記載の足場。
電気処理された繊維が、α９β１インテグリンのリガンドとして作用する画分９を含む、請求項１９記載の足場。
足場が、可溶性形態の画分５をさらに含む、請求項１８記載の足場。
画分５を、足場に埋め込まれた薬物送達担体内にロードする、請求項２３記載の足場。
足場が、ＳＰＩの生物活性ペプチド成分を含むヒドロゲルを含む、請求項１１記載の足場。
ヒドロゲルが、ゲニピンで架橋されたゼラチンを含む、請求項２５記載の足場。
足場が、水溶性大豆タンパク質単離物（ＷＳｓｏｙ）を含む、創傷治癒及び組織再生を誘導するための足場。
足場が、ＷＳｓｏｙを含む電気処理された繊維を含む、請求項２７記載の足場。
電気処理された繊維が、合成ポリマーを含む、請求項２７記載の足場。
合成材料ポリマーが、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、コポリマーポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリアニリン、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２９記載の足場。
足場が、ＷＳｓｏｙを含むヒドロゲルを含む、請求項２７記載の足場。
請求項１１〜３１のいずれか一項記載の足場を被験体の処置部位に投与することを含む、それを必要とする被験体において創傷治癒及び組織再生を促進する方法。
精製された水溶性大豆タンパク質単離物（ＷＳｓｏｙ）を含む有効量の乾燥組成物を湿潤創傷に適用する工程を含み、乾燥ＷＳｓｏｙが、湿潤創傷中の水分との接触時に自己組織化して半液体マトリックスとなる、湿潤創傷を処置する方法。
適用された乾燥ＷＳｓｏｙの量が創傷１cm²あたり１〜２００mgである、請求項３３記載の方法。
乾燥ＷＳｓｏｙを５０〜５０００μmの厚さで適用する、請求項３３記載の方法。
液体担体中の有効量のＷＳｓｏｙを創傷に適用する工程を含み、ＷＳｓｏｙが、液体担体中の半液体マトリックスに自己組織化する、創傷を処置する方法。
ＷＳｓｏｙが、１mLの液体担体あたり１〜２００mgの間の濃度を有する、請求項３６記載の方法。
液体担体中のＷＳｓｏｙの量が、創傷１cm²あたり０．１〜１mLである、請求項３６記載の方法。
液体担体中の水溶性大豆タンパク質単離物を５０〜５０００μmの厚さで適用する、請求項３６記載の方法。
適用方法が、創傷上への直接電気処理によるものである、請求項３６記載の方法。
ＷＳｓｏｙ及び少なくとも１つの活性薬剤を含む、迅速な創傷治癒のための組成物。
乾燥ＷＳｓｏｙ粒子を含む、請求項４１記載の組成物。
粒子が、直径１〜１０００μmである、請求項４２記載の組成物。
少なくとも１つの活性薬剤が、麻酔剤、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤、鎮痒剤、筋弛緩剤、鎮痛剤、解熱剤、ビタミン、抗菌剤、防腐剤、消毒剤、殺菌剤、外部寄生生物駆除剤、抗寄生虫剤、アルカロイド、塩、イオン、抗炎症剤、創傷治癒剤、植物抽出物、成長因子、ポリカーボネート、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分、皮膚軟化剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、精神安定剤、鎮咳剤、ナノ粒子、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４１記載の組成物。
ゼラチン、マトリゲル、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、キトサン、ポリウレタン、ポリシロキサン又はシリコーン、ポリエチレン、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレン−コ−酢酸ビニル、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリル酸、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリスチレン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される乾燥成分をさらに含む、請求項４１記載の組成物。
液体担体中にＷＳｓｏｙを含む、迅速な創傷治癒のための組成物。
液体担体が、医薬的に許容可能な担体である、請求項４６記載の組成物。
組成物が、１mLの液体担体あたり１〜２００mgのＷＳｓｏｙを含む、請求項４６記載の組成物。
麻酔剤、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤、鎮痒剤、筋弛緩剤、鎮痛剤、解熱剤、ビタミン、抗菌剤、防腐剤、消毒剤、殺菌剤、外部寄生生物駆除剤、抗寄生虫剤、アルカロイド、塩、イオン、抗炎症剤、創傷治癒剤、植物抽出物、成長因子、ポリカーボネート、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分、皮膚軟化剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、精神安定剤、鎮咳剤、ナノ粒子、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される薬剤をさらに含む、請求項４６記載の組成物。
ゼラチン、マトリゲル、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、キトサン、ポリウレタン、ポリシロキサン又はシリコーン、ポリエチレン、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレン−コ−酢酸ビニル、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリル酸、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリスチレン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される成分をさらに含む、請求項４６記載の組成物。
組成物を繊維、シート、又は布地に紡績する、請求項４６記載の組成物。
少なくとも１つの量の乾燥ＷＳｓｏｙ組成物及び少なくとも１つの量の液体担体を含む、創傷を処置するためのキット。
生物活性成分画分（ＢＣＦ）５−５を含む、迅速な創傷治癒のための組成物。
ＢＣＦ９−４を含む、迅速な創傷治癒のための組成物。
βコングリシニンを含む、迅速な創傷治癒のための組成物。
ＬＤＶモチーフを有するβコングリシニンのフラグメントを含む、迅速な創傷治癒のための組成物。
ＬＤＶモチーフを有するペプチド又はそのフラグメントを含む、迅速な創傷治癒のための組成物。