ES2233650T3 - Biomateriales formados por celulas preadipocito para reparacion de tejidos blandos. - Google Patents
Biomateriales formados por celulas preadipocito para reparacion de tejidos blandos.Info
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Abstract
Biomaterial para reconstrucción de tejidos blandos formado por (a) un material de soporte constituido por un bencil éster de ácido hialurónico; y (b) células de preadipocitos inseminadas sobre dicho material de soporte
Description
Biomateriales formados por células preadipocito
para reparación de tejidos blandos.
La presente invención está dirigida a un
biomaterial para la reconstrucción de tejidos blandos, construido
por un material de soporte formado por un bencil éster de ácido
hialurónico y células de preadipocito inseminadas sobre dicho
material de soporte, hace referencia además a un preparado
inyectable para el relleno de defectos y depresiones de tejidos
blandos formado por un derivado de ácido hialurónico parcialmente
soluble en el preparado , y hace referencia a la utilización de
dichos materiales de soporte y preparados inyectables.
La corrección de defectos de tejidos blandos es
un importante reto en la cirugía plástica y de reconstrucción. Los
tejidos adiposos como injerto libre han sido utilizados para la
reconstrucción de defectos de tejidos blandos durante más de 100
años. Sin embargo, ha existido una falta de material de implante
óptimo para sustitución de tejidos blandos. Se utilizan injertos de
tejidos adiposos libres, pero los resultados son pobres e
impredecibles. Los trasplantes son absorbidos ampliamente y
sustituidos por tejidos fibrosos y quistes de grasa. La técnica
recientemente recuparada de inyección de fragmentos de grasa
aspirados proporciona asimismo resultados poco satisfactorios, que
varían del 50% de retracción del injerto hasta una reabsorción
completa. Los malos resultados del autotrasplante de grasa libre se
cree que son debidos a la baja tolerancia de las células de grasa a
la isquemia y a la baja velocidad de revascularización.
Las células precursoras adiposas situadas en el
estroma de los tejidos adiposos pueden ser aisladas y cultivadas.
Estas células demuestran diferenciación in vitro y
desdiferenciación en condiciones distintas, y son una fuente posible
para la ingeniería de tejidos blandos a causa de la capacidad de
proliferación y de diferenciación. En un estudio preliminar, los
inventores han observado que los preadipocitos se revascularizan
rápidamente y reacumulan grasas después del trasplante. En un
estudio reciente los preadipocitos de rata diferenciados en PLGA
forman estructura ("scaffolds") después de injerto.
Recientemente, células de tallo de mesenquima
(MSC), obtenidas de tuétano de hueso de adultos, han sido utilizadas
para la producción de diferentes tipos de células de tejidos. Estas
células de tallo aisladas no son totipotentes, tal como las células
de tallos embriónicos, sino pluripotentes y capaces de
diferenciación en tejidos conectivos y sus derivados. El mesenquima
es una fuente no solamente de tejidos conectivos tales como
músculos, tendones y ligamentos, sino también de sangre, cartílagos,
huesos, células grasas y capas externas de los vasos sanguíneos.
Hasta el momento, las células MSC han sido diferenciadas
satisfactoriamente en células adiposas, células crondrocitas y
células osteocitas (Pittenger y otros (1999) Science
284:143-7).
Sin embargo existe todavía la necesidad de un
satisfactorio agente de llenado bioartificial de tejidos blandos
destinado a técnicas de tejidos, un agente de carga que idealmente
podría ser un vehículo de suministro para soportar preadipocitos
humanos en procesos de injerto. El material debe proporcionar una
estructura para soportar las células implantadas (células
preadiposas) y una estructura que permite que las células invadan y
se diferencien después del trasplante. La introducción de células
endoteliales, que son angiogénicas, aumentaría también el
comportamiento del material de relleno de tejidos blandos de tipo
bioartificial. Un número más elevado de adipocitos maduros se
encuentran en tejidos adiposos bien vascularizados, posiblemente
debido a la influencia que tienen las células endoteliales en los
preadipocitos y adipocitos diferenciadores. Como consecuencia, las
células endoteliales son particularmente útiles en la técnica de
tejidos adiposos que se basa en preadipocitos. La estabilidad
mecánica del soporte es también importante y el material/soporte
puede no ser reabsorbido de manera demasiado rápida después del
trasplante.
Estas necesidades son complementadas por la
presente invención, que da a conocer una matriz óptima para
preadipocitos humanos aislados y cultivados, células de tallo de
mesenquima y células endoteliales in vitro e in vivo.
La presente invención es también útil como material de relleno
bioartificial para tejidos blandos, particularmente como estructura
para preadipocitos, células de tallo de mesenquima y/o células
endetoliales con la capacidad de soportar adipogénesis in
vivo.
La figura 1 muestra preadipocitos humanos 24
horas después de inseminación en una esponja HYAFF 11 (HS+). Se
puede observar una buena adherencia de células viables a la
estructura ("scaffold"). Se observan vacuolas citoplásmicas y
éstas almacenan lípidos como signos morfológicos típicos de
diferenciación. (toluidina-azul, sc=
estructura).
La figura 2 muestra un aspecto macroscópico de
los injertos explantados HS después de 3 semanas en una rata
desnuda. Un tejido delgado de color amarillo se presentó sobre los
injertos de preadipocitos con nueva formación de vasos (derecha). La
esponja de control contralateral del mismo animal no mostró
prácticamente ningún cambio con respecto a la esponja y carencia de
vasos (izquierda).
La figura 3 muestra una vista microscópica de la
sección HS+ después de 3 semanas en el ratón desnudo. Las
agrupaciones diferenciadas de adipocitos son más numerosas en poros
abiertos incluso en el centro de la esponja. Se debe observar el
manchado rojo intenso de lípido que contiene adipocitos maduros y la
estructura básica. (grasa-rojo, sc= estructura).
La figura 4 muestra células humanas invadidas en
injertos de preadipocito/estructura HS+ en el grupo A (3 semanas
in vivo). Se debe observar una distribución satisfactoria y
homegénea de células humanas en la estructura ("scaffold").
(mah-mancha vim, sc= estructura).
La figura 5 muestra la distribución celular de
células cedente y hospedante en constructos de
preadipocito/estructura y controles.
La figura 6 muestra la ultraestructura de
preadipocitos en la matriz no estructurada ("nonwoven") después
de 3 semanas in vivo. Las células contienen múltiples gotitas
de lípidos citoplásmicos. Las fibras y preadipocitos están
íntimamente acoplados entre sí. Observar la fibra HYAFF®11 en la
esquina superior izquierda y la nueva ECM intermedia.
La figura 7 muestra adipocitos diferenciados en
una agrupación en esponja HYAFF®11 después de 8 semanas in
vivo. Las células contienen gotitas de lípidos únicas de grandes
tamaños (>50 \mum) y muestran aspecto típico de anillo con
sello. Se debe observar las nuevas fibras de colágeno intermedias en
las células.
La corrección de defectos en los tejidos blandos
por cirugía plástica o de reconstrucción se puede llevar a cabo por
implantación de células precursoras adiposas aisladas y expandidas
por cultivo, células MSC y/o células endoteliales. Las células
precursoras adiposas, cuando son implantadas, se diferencian en
adipocitos, que son células de tejidos conectivos animales
especializadas en la síntesis y almacenamiento de grasas. Si bien
las células MSC pueden requerir, en algunos casos, en primer lugar
una manipulación in vitro para iniciar la diferenciación,
estas células son también capaces de producir adipocitos. Sin
embargo, se requieren soportes o estructuras apropiadas en esta
técnica de tejidos blandos para permitir y favorecer la
diferenciación y proliferación de las células precursoras, células
MSC o células endoteliales.
En la presente invención, el biomaterial para
reconstrucción de tejidos blandos está compuesto por (a) un material
de soporte formado por un bencil éster de ácido hialurónico y (b)
células de preadipocitos inseminadas sobre dicho material de
soporte. El material de soporte puede adoptar forma de esponja o
material no estructurado ("no tejido"). Alternativamente, el
biomaterial es un preparado inyectable para el relleno de defectos y
depresiones de tejidos blandos formado por (a) un derivado de ácido
hialurónico totalmente soluble en agua o bien un derivado de ácido
hialurónico parcialmente soluble en agua, y (b) células de
preadipocitos suspendidas en el preparado. Los derivados son
especialmente un bencil éster o un derivado de amida. En particular,
los derivados de bencil éster con 85% o menos de esterificación y la
dodecilamida de HA son preferibles para preparados inyectables. El
preparado de dichos bencil ésteres se describe en el documento EP 0
216 453 B1 y la preparación de derivados de amida se describe en el
documento WO 00/01733.
El término "ácido hialurónico" (al que se
hace referencia también a continuación como "HA") se utiliza en
esta literatura para designar un polisacárido ácido con varios pesos
moleculares constituidos por residuos de ácido
D-glucorónico y
N-acetil-D-glucosamina,
que se presentan de manera natural en superficies celulares, en
substancias extracelulares básicas de tejidos conectivos de
vertebrados, en los fluidos sinoviales de uniones, en el humor
vítreo del ojo, en el tejido del cordón umbilical humano y en
crestas de pollos.
El ácido hialurónico juega un papel importante en
un organismo, en primer lugar como soporte mecánico de las células
de muchos tejidos, tales como la piel, tendones, músculos y
cartílagos y es, por lo tanto, el componente principal de la matriz
intracelular. Sin embargo, el ácido hialurónico lleva a cabo también
otras funciones en los procesos biológicos, tales como la
hidratación de tejidos, lubrificación, migración celular, función
celular y diferenciación. (Ver, por ejemplo, A. Balazs y otros,
Cosmetics & Toiletries, Nº 5/84, páginas 8-17).
El ácido hialurónico puede ser extraído de los tejidos naturales
anteriormente mencionados, tales como crestas de gallos, o también
de ciertas bacterias. En la actualidad, el ácido hialurónico puede
ser preparado también por métodos microbiológicos. El peso molecular
de ácido hialurónico completo obtenido por extracción se encuentra
en una zona de 8-13 millones. No obstante, la cadena
molecular del polisacárido se puede degradar de manera muy fácil
bajo influencia de diferentes factores físicos y químicos, tales
como influencias mecánicas o bajo la influencia de radiación,
hidrólisis, oxidación o agentes enzimáticos. Por esta razón,
frecuentemente en los procesos de purificación ordinarios o
extractos originales, se obtienen fracciones degradadas con un peso
molecular más bajo. (Ver Balazs y otros, antes citados). El ácido
hialurónico, sus fracciones moleculares y sales correspondientes han
sido utilizadas como medicamentos y su utilización se ha propuesto
también en cosméticos (ver, por ejemplo, el artículo antes
mencionado de Balazs y otros y la Patente francesa Nº. 2478468).
Como agente terapéutico, el ácido hialurónico y
sus sales han sido utilizados especialmente en terapia para
artropatías, tales como en medicina veterinaria para la curación de
artritis en caballos [Acta Vet. Scand. 167, 379 (1976)]. Como agente
terapéutico auxiliar y de substitución para tejidos naturales y
órganos naturales, se han utilizado el ácido hialurónico y sus
fracciones moleculares y sus sales en cirugía oftálmica (ver, por
ejemplo, Balazs y otros, Modem Problems in Ophthalmology, Vol. 10,
1970, p. 3 - E.B. Strieff, S. Karger eds., Basel; Viscosurgery and
the Use of
Sodium Hyaluronate During Intraocular Lens Implantation, documento presentado en el Congreso Internacional y
Primer Festival de Películas sobre Implantación Intraocular, Cannes, 1979; Patente U.S.A. Nº. 4.328.803 con un resumen de la literatura sobre las utilizaciones de HY en oftalmología y en la Patente U.S.A. Nº. 4.141.973). La publicación de Patente europea Nº. 0138572 describe una fracción molecular de ácido hialurónico que puede ser utilizada, por ejemplo, como sal sódica para inyecciones intraoculares e intraarticulares adecuadas para la substitución de fluidos internos del ojo y en terapias de artropatía.
Sodium Hyaluronate During Intraocular Lens Implantation, documento presentado en el Congreso Internacional y
Primer Festival de Películas sobre Implantación Intraocular, Cannes, 1979; Patente U.S.A. Nº. 4.328.803 con un resumen de la literatura sobre las utilizaciones de HY en oftalmología y en la Patente U.S.A. Nº. 4.141.973). La publicación de Patente europea Nº. 0138572 describe una fracción molecular de ácido hialurónico que puede ser utilizada, por ejemplo, como sal sódica para inyecciones intraoculares e intraarticulares adecuadas para la substitución de fluidos internos del ojo y en terapias de artropatía.
El ácido hialurónico puede también ser utilizado
como aditivo para una amplia variedad de materiales polímeros
utilizados para artículos médicos y quirúrgicos, tales como
poliuretanos, poliésteres, poliolefinas, poliamidas, polisiloxanos,
polímeros vinílicos y acrílicos y fibras de carbono con el efecto de
hacer estos materiales biocompatibles. En este caso la adición de HY
o una de sus sales se lleva a cabo, por ejemplo, cubriendo la
superficie de dichos materiales, por dispersión en el mismo o por
ambos procedimientos. Estos materiales se pueden utilizar para la
fabricación de diferentes artículos sanitarios y médicos, tales como
válvulas cardíacas, lentes intraoculares, pinzas vasculares,
marcapasos y similares (ver Patente U.S.A. Nº. 4.500.676).
Si bien el término "ácido hialurónico" es
utilizado habitualmente en sentido impropio, con el significado, tal
como se puede apreciar de lo anterior, una serie completa de
polisacáridos con alternaciones de residuos de ácido
D-glucurónico y
N-acetil-D-glucosamina
con diferentes pesos moleculares o incluso fracciones degradadas de
los mismos, y si bien la forma plural de "ácidos hialurónicos"
puede parecer más apropiada, la explicación siguiente continuará
utilizando la forma singular para hacer referencia al ácido
hialurónico en sus diferentes formas incluyendo fracciones
moleculares, y la abreviatura "HA" se utilizará también
frecuentemente para describir este término colectivo.
El documento EP 0 216 453 B1 describe ésteres
totales o parciales de ácido hialurónico con un alcohol de serie
alifática o aralifática o una sal de un éster parcial con una base
orgánica o inorgánica. Estos ésteres poseen interesantes
características bioplásticas y farmacéuticas y se pueden utilizar en
diferentes sectores incluyendo cosmética, cirugía y medicina. En el
caso del ácido hialurónico, en el que los nuevos productos poseen
cualitativamente las mismas propiedades
físico-químicas, farmacológicas y terapéuticas o
propiedades similares, son considerablemente más estables,
especialmente con referencia a la acción de las enzimas naturales
responsables para la degradación de la molécula de polisacárido en
el organismo, tal como especialmente hialuronidasa, y por lo tanto
conservan las características anteriormente mencionadas durante
períodos de tiempo muy prolongados.
El documento WO 00/01733 describe amidas de ácido
hialurónico y derivados del mismo obtenidas por reacción de grupos
carboxi o grupos amino que se originan de reacciones de
desacetilación con aminas y ácidos de las series alifática,
aromática, arilalifática, cicloalifática, heterocíclica, y sin
utilización de cadenas separadoras. Estos compuestos pueden ser o
bien solubles o insolubles en agua, de acuerdo con el ácido, la
amina, el porcentaje de enlace de amida o el derivado de ácido
hialurónico utilizado para preparar la amida. Estas amidas pueden
ser utilizadas en diferentes sectores de la cirugía, en la
prevención de adhesiones post-quirúrgicas y
cicatrices hipertróficas, cardiología, dermatología, oftalmología,
otorrinolaringología, odontología, ortopedia, ginecología, urología,
circulación y oxigenación de sangre por vía extracorpórea, cosmética
y angiología. Igual que los ésteres anteriormente descritos, estas
amidas de ácido hialurónico retienen la viscosidad de ácido
hialurónico libre, pero son más estables y persisten durante más
tiempo antes de su degradación.
El documento 99/24070 describe un biomaterial que
comprende un derivado de benciléster del ácido hialurónico en
asociación con células tales como células tallo o adipocitos. Este
biomaterial está destinado a su utilización en reconstrucción de
tejidos blandos.
El documento 97/18842 describe compuestos que
comprenden un derivado de bencil éster de ácido hialurónico en
asociación con células de tallo de mesenquima de tuétano de hueso a
utilizar en reconstrucción de tejidos blandos tales como
reconstrucción de la piel.
El documento WO 98/56897 describe compuestos
derivados de ácido hialurónico que comprenden células endoteliales
para trasplantes de piel.
En la presente invención, el éster de HA con
alcohol bencílico (el bencil éster) o una amida de HA se utiliza en
el soporte o estructura para células precursoras adiposas. El bencil
éster de HA utilizado en la invención es preferentemente un "éster
total" (es decir, un derivado en el que la totalidad de los
grupos carboxilos del HA están esterificados con bencil alcohol) o
un éster 5-99% (es decir, un derivado en el que de 5
a 99% de los grupos carboxilo están esterificados y los grupos
restantes salificados). Estos derivados proporcionan materiales de
soporte de estructura preferentes para el cultivo y crecimiento de
preadipocitos humanos, células MSC y/o células endoteliales. Estos
derivados pueden ser también suministrados con poblaciones
acompañantes de células (preadipocitos, células tallo de mesenquima
o células endoteliales) por inyección. En este caso, por ejemplo, se
mezcla un bencil éster o una amida de HA con una población de
preadipocitos y/o células MSC y/o células endoteliales y a
continuación se inyectan en un lugar de tejidos blandos que contiene
una depresión, defecto, arruga o deformidad. Los derivados de ácido
hialurónico, especialmente aquéllos en los que el 85% o menos de los
grupos carboxilo del HA están esterificados con bencil alcohol y la
dodecil amida de HA, son especialmente preferentes. Una combinación
especialmente preferente es la dodecil amida de HA y células de
preadipocitos.
Los bencil ésteres, tal como se ha indicado
anteriormente, pueden ser preparados de acuerdo con los
procedimientos en el documento EP 0 216 453 B1 (ver Ejemplos
1-4). Las amidas pueden ser preparadas de acuerdo
con los procedimientos descritos en el documento WO 00/01733 (ver
Ejemplos 5-24).
Los Ejemplos siguientes 1-24 son
ejemplos de preparación que indican la forma de sintetizar derivados
de ácido hialurónico utilizados en la invención.
12,4 gramos de sal de HY de tetrabutilamonio con
un peso molecular de 170.000 correspondiente a 20 m.Eq. de una
unidad monómera se solubilizan en 620 ml de dimetilsulfóxido a 25º,
4,5 g (25 m.Eq.) de bromuro de bencilo y 0,2 g de yoduro de
tetrabutilamonio, se añaden manteniendo la solución durante 12 horas
a 30ºC.
La mezcla resultante es vertida lentamente en
3.500 ml de acetato de etilo con agitación constante. Se forma un
precipitado que es filtrado y lavado cuatro veces con 500 ml de
acetato de etilo y finalmente es secado en vacío durante
veinticuatro horas a 30º.
Se obtienen 9 g del producto de bencil éster
deseado. La determinación cuantitativa de los grupos éster es
llevada a cabo de acuerdo con el método descrito en las páginas
169-172 de la obra de Siggia S. y Hanna J.G.
"Quantitative organic analysis via functional groups" 4ª
edición, John Wiley and Sons.
3 g de la sal potásica de HY con un peso
molecular de 162.000 son suspendidos en 200 ml de dimetilsulfóxido;
se añaden 120 mg de yoduro de tetrabutilamonio y 2,4 g de bromuro de
bencilo.
La suspensión se mantiene en agitación durante 48
horas a 30º. La mezcla resultante es vertida lentamente en 1.000 ml
de acetato de etilo con agitación constante. Se forma un precipitado
que es filtrado y lavado cuatro veces con 150 ml de acetato de etilo
y sometida finalmente a secado en vacío durante veinticuatro horas a
30º.
Se obtienen 3,1 g del bencil éster deseado. La
determinación cuantitativa de los grupos éster es llevada a cabo de
acuerdo con el método descrito en las páginas
169-172 de la obra de Siggia S. y Hanna J.G.
"Quantitative organic analysis via functional groups" 4ª
edición, John Wiley and Sons.
El material de soporte de la estructura está
formado por un material esponjoso constituido por el bencil éster de
HA, y se puede preparar de la manera siguiente.
1 g de bencil ésteres de ácido hialurónico con un
peso molecular de 170.000 en el que todos los grupos carboxílicos
son esterificados (obtenido, por ejemplo, tal como se ha descrito
anteriormente) se disuelven en 5 ml de dimetilsulfóxido. A cada
fracción de 10 ml de solución preparada se añade una mezcla de 31,5
g de cloruro sódico con un grado de granularidad que corresponde a
300 \mu, 1,28 g de carbonato sódico y 1 g de ácido cítrico se
añaden homogeneizando el conjunto en un mezclador.
La mezcla pastosa es estratificada de diferentes
modos, por ejemplo, mediante un dispositivo que consiste en dos
rodillos que giren en oposición entre sí a una distancia ajustable
entre ambos. Regulando esta distancia, se hace pasar la pasta entre
los rodillos junto con una tira de papel de silicona que actúa como
soporte para la capa de pasta formada de este modo. La capa es
cortada a las dimensiones deseadas de longitud y anchura, retirada
de la silicona, envuelta en papel de filtro y sacada con un
disolvente adecuado, tal como agua. Las esponjas obtenidas de este
modo son lavadas con un disolvente adecuado, tal como agua, y
opcionalmente son esterilizadas con rayos gamma.
Se puede preparar un soporte de estructura
formada por un material no estructurado ("no tejido") del
bencil éster de HA (conocido también como HYAFF®11), tal como se
describe en la Patente U.S.A. 5.520.916 de acuerdo con los
siguientes procedimientos.
Se prepara una solución de HYAFF®11 en
dimetilsulfóxido a una concentración de 135 mg/ml en un depósito y
se suministra mediante una bomba de dosificación de engranajes a un
cabezal de toberas para extrusión en húmedo compuesta de 3000
orificios, midiendo cada uno de ellos 65 micras.
La masa de hilos extrusionados pasa a un baño de
coagulación que contiene etanol absoluto. A continuación se desplaza
sobre rodillos de transporte a dos baños de lavado sucesivo que
contienen etanol absoluto. La proporción de estirado del primer
rodillo se dispone en un valor cero, mientras que la proporción de
estirado entre los otros rodillos se dispone en 1,05. Una vez que se
ha hecho pasar a través de los baños de lavado, el haz de hilos es
secado por soplado con aire caliente a 45-50 grados
C y es cortado con un cortador de rodillos formando fibras de 40
mm.
La masa de fibras obtenida de este modo es
conducida a una rampa que lleva a una máquina de carda/lapeado
transversal de la que sale en forma de elemento laminar, con un
grosor de 1 mm y con un peso de 40 mg/m^{2}. El elemento laminar
es pulverizado a continuación con una solución de HYAFF®11 en
dimetilsulfóxido a 80 mg/ml, colocado en un baño de coagulación de
etanol en una cámara de lavado, y finalmente en una cámara de
secado.
El grosor total del material es de 0,5 mm.
Un gramo de hialuronato sódico, con un peso
molecular medio de 600 Kda, es solubilizado en 50 ml de una solución
al 1% de sulfato de hidracina en monohidrato de hidracina. Se deja
reaccionar con agitación durante cinco días (120 horas) a 55ºC,
después de lo cual la reacción es interrumpida por añadidura de 100
ml de etanol. El precipitado formado de esta manera es filtrado a
través de un crisol Gooch, lavado con etanol y a continuación es
secado a temperatura ambiente a presión reducida. Cualquier
proporción de hidracida de ácido hialurónico que se pueda formar
probablemente durante la reacción con hidracinolisis es destruida
por reacción con HIO_{3} (ácido yódico). Dado que la reacción
puede ser muy vigorosa, es llevada a cabo con el enfriamiento del
contenedor de la reacción en agua helada. El producto de
hidracinólisis es solubilizado en 50 ml de una solución de acetato
sódico al 5% y se hace reaccionar con 25 ml de una solución al 0,5 M
de ácido yódico. La reacción continúa durante 30 minutos con
agitación, después de lo cual se añaden 5 ml de una solución al 57%
de HI para destruir cualquier cantidad de HIO_{3} no reaccionada.
El yodo que se ha formado es extraído de la solución acuosa con un
mínimo de tres partes alícuotas de 30 ml de etil éter (hasta
decoloración completa de la fase acuosa). La solución acuosa es
llevada a pH neutro por añadidura de una solución de NaOH 0,5 M
seguido de tratamiento con 100 ml de etanol. El precipitado obtenido
es filtrado con un crisol Gooch, es lavado con etanol y a
continuación secado a temperatura ambiente y a presión reducida. El
producto obtenido se caracteriza analíticamente para determinar el
porcentaje de grupos N-desacetilados y el peso
molecular medio.
Rendimiento de la reacción | 90% |
% de N-desacetilación | 26% |
peso molecular medio | 130 Kda |
Un gramo (2,5 mmol.) de sal sódica de ácido
hialurónico, parcialmente N-desacetilado, es
solubilizado en 60 ml de agua y la solución es percolada a través de
una columna llena con 25 ml de una resina sulfónica en forma de una
sal de tetrabutilamonio (TBA). La resina sulfónica en forma H^{+}
es activada con una solución al 40% peso/volumen de TBAOH. El eluido
que contiene sal TBA de ácido hialurónico
N-desacetilado es recogido y liofilizado.
Se solubilizan diez gramos (0,082 mol.) de ácido
benzoico en 800 ml de CH_{2}Cl_{2}, después de lo cual se
añaden
11,4 g (0,082 mol.) de p-NO_{2}-fenol y 16,9 g (0,082 mol.) de DCC (Diciclohexilcarbodiimida). La reacción continúa durante 2 horas, mientras que la solución es sometida a ebullición y reflujo. A continuación, la diciclohexilurea que se forma es filtrada y el producto filtrado es secado con un rotovapor a presión reducida. El producto obtenido de este modo es purificado mediante cristalización repetida en acetato de etilo. Los cristales son filtrados y colocados para su secado a temperatura ambiente a presión reducida. El derivado se caracteriza por análisis TLC (eluyente: CH_{2}Cl_{2}/acetato de etilo 90/10 y Rf=0,77) y por espectroscopia IR y UV.
11,4 g (0,082 mol.) de p-NO_{2}-fenol y 16,9 g (0,082 mol.) de DCC (Diciclohexilcarbodiimida). La reacción continúa durante 2 horas, mientras que la solución es sometida a ebullición y reflujo. A continuación, la diciclohexilurea que se forma es filtrada y el producto filtrado es secado con un rotovapor a presión reducida. El producto obtenido de este modo es purificado mediante cristalización repetida en acetato de etilo. Los cristales son filtrados y colocados para su secado a temperatura ambiente a presión reducida. El derivado se caracteriza por análisis TLC (eluyente: CH_{2}Cl_{2}/acetato de etilo 90/10 y Rf=0,77) y por espectroscopia IR y UV.
Rendimiento de la reacción | 92% |
Doce gramos (0,082 mol.) de ácido cinámico se
solubilizan en 800 ml de CH_{2}Cl_{2}, después de lo cual se
añaden 11,4 g (0,082 mol.) de
p-NO_{2}-fenol y 16,9 g (0,082
mol.) de DCC (Diciclohexilcarbodiimida). La reacción prosigue
durante 2 horas, mientras la solución es sometida a ebullición y
reflujo. A continuación, la diciclohexilurea que se forma es
filtrada y el producto filtrado es secado con un rotovapor a presión
reducida. El producto obtenido de este modo es purificado por
cristalización repetida en acetato de etilo. Los cristales son
filtrados y colocados para su secado a temperatura ambiente a
presión reducida. El derivado se caracteriza por análisis TLC
(eluyente: CH_{2}Cl_{2}/acetato de etilo 90/10 y Rf=0,77) y
espectroscopia IR y UV.
Rendimiento de la reacción | 89% |
Se solubilizan dieciséis gramos (0,082 mol.) de
ácido dodecanoico en 1 litro de CH_{2}Cl_{2}, después de lo cual
se añaden 11,4 g (0,082 mol.) de
p-NO_{2}-fenol y 16,9 g (0,082
mol.) de DCC (Diciclohexilcarbodiimida). La reacción continúa
durante 2 horas, mientras la solución es sometida a ebullición y
reflujo. A continuación, la diciclohexilurea que se forma es
filtrada y el producto filtrado es secado con un rotovapor a presión
reducida. El producto obtenido de este modo es purificado por
cristalización repetida en acetato de etilo. Los cristales son
filtrados y colocados para su secado a temperatura ambiente a
presión reducida. El derivado se caracteriza por análisis TLC
(eluyente: CH_{2}Cl_{2}/acetato de etilo 90/10 y Rf= 0,77) y por
espectroscopia IR y UV.
Rendimiento de la reacción | 93% |
Se solubilizan 23,3 gramos de ácido esteárico en
un litro de CH_{2}Cl_{2}, después de lo cual se añaden 11,4 g
(0,082 mol.) de p-NO_{2}-fenol y
16,9 g (0,082 mol.) de DCC (Diciclohexilcarbodiimida). La reacción
continúa durante 2 horas mientras la solución es sometida a
ebullición y reflujo. A continuación, la diciclohexilurea que se
forma es filtrada y el producto filtrado es secado con un rotovapor
a presión reducida. El producto obtenido de este modo es purificado
por cristalización repetida en acetato de etilo. Los cristales son
filtrados y colocados para su secado a temperatura ambiente a
presión reducida. El derivado se caracteriza por análisis TLC
(eluyente: CH_{2}Cl_{2}/acetato de etilo 90/10 y Rf=0,77) y con
espectroscopia IR y UV.
Rendimiento de la reacción | 87% |
14,7 gramos de ácido acetilsalicílico son
solubilizados en 1 litro de CH_{2}Cl_{2}, después de lo cual se
añaden 11,4 g (0,082 mol.) de
p-NO_{2}-fenol y 16,9 g (0,082
mol.) de DCC (Diciclohexilcarbodiimida). La reacción continúa
durante 2 horas, mientras la solución es sometida a ebullición y
reflujo. A continuación, la diciclohexilurea que se forma es
filtrada y el producto filtrado es secado con un rotovapor a presión
reducida. El producto obtenido de este modo es purificado por
cristalización repetida en acetato de etilo. Los cristales son
filtrados y colocados a secar a temperatura ambiente a presión
reducida. El derivado se caracteriza por análisis TLC (eluyente:
CH_{2}Cl_{2}/acetato de etilo 90/10 y Rf=0,77) y por
espectroscopia IR y UV.
Rendimiento de la reacción | 80% |
Un gramo (1,6 mmol.) de DHA/TBA (26% de
desacetilación) es solubilizado en 50 ml de DMSO, después de lo cual
se añaden 5 ml de una solución al 10% de
p-NO_{2}-feniléster de ácido
benzoico (preparado según el Ejemplo 7) en DMSO. La reacción
prosigue durante 24 horas con agitación a temperatura ambiente,
después de lo cual se bloquea por adición de 2,5 ml de una solución
saturada de NaCl. Se deja reaccionar durante 30 minutos y a
continuación se añaden lentamente 100 ml de etanol. El precipitado
obtenido de este modo es filtrado a través de un Gooch, lavado con
etanol y etil éter y finalmente es secado a temperatura ambiente a
presión reducida. El derivado es analizado por TLC (después de
hidrólisis de la amida), análisis colorimétrico del porcentaje de
grupos NH_{2} libres y espectroscopia IR y UV.
Rendimiento de la reacción | 85% |
% libre de NH_{2} | 11% |
% de N-acilación | 15% |
Un gramo (1,6 mmol.) de DHA/TBA (26% de
desacetilación) es solubilizado en 50 ml de DMSO, después de lo cual
se añaden 5 ml de una solución al 10% de
p-NO_{2}-feniléster de ácido
cinámico (preparado según el Ejemplo 8) en DMSO. La reacción
prosigue durante 24 horas, con agitación a temperatura ambiente,
después de lo cual es bloqueada añadiendo 2,5 ml de una solución
saturada de NaCl. Se deja reaccionar durante 30 minutos y a
continuación se añaden lentamente 100 ml de etanol. El precipitado
obtenido de este modo es filtrado a través de un Gooch, lavado con
etanol/agua 9:1, éter etílico y finalmente es secado a temperatura
ambiente a presión reducida. El derivado es analizado por TLC
(después de hidrólisis de la amida), análisis colorimétrico del
porcentaje de grupos libres de NH_{2} y espectroscopia IR y
UV.
Rendimiento de la reacción | 85% |
% libre de NH_{2} | 11% |
% de N-acilación | 15% |
Un gramo (1,6 mmol.) de DHA/TBA (26% de
desacetilación) es solubilizado en 50 ml de NMP, después de lo cual
se añaden 5 ml de una solución al 10% del
p-NO_{2}-feniléster de ácido
dodecanoico (preparado de acuerdo con el Ejemplo 9) en NMP. La
reacción continúa durante 24 horas, con agitación a temperatura
ambiente, después de lo cual es bloqueada por adición de 2,5 ml de
una solución saturada de NaCl. Ésta se deja reaccionar durante 30
minutos y a continuación se añaden lentamente 100 ml de etanol. El
precipitado obtenido de este modo es filtrado a través de un Gooch,
lavado con etanol y éter etílico y secado finalmente a temperatura
ambiente y a presión reducida. El derivado es analizado por TLC
(después de hidrólisis de la amida), análisis colorimétrico del
porcentaje de grupos NH_{2} libres y espectroscopia IR y UV.
Rendimiento de la reacción | 88% |
% libre de NH_{2} | 10% |
% de N-acilación | 16% |
Un gramo (1,6 mmol.) de DHA/TBA (26% de
desacetilación) se solubiliza en 50 ml de NMP, después de lo cual se
añaden 5 ml de una solución al 10% de
p-NO_{2}-feniléster de ácido
esteárico (preparado según el Ejemplo 10) en NMP. La reacción
continúa durante 24 horas, bajo agitación a temperatura ambiente,
después de lo cual es bloqueada por adición de 2,5 ml de una
solución saturada de NaCl. Se deja reaccionar durante 30 minutos y a
continuación se añaden lentamente 100 ml de etanol. El precipitado
obtenido de este modo es filtrado a través de un Gooch, lavado con
etanol y éter etílico y finalmente es secado a temperatura ambiente
y presión reducida. El derivado es analizado por TLC (después de
hidrólisis de la amida), análisis colorimétrico del porcentaje de
grupos NH_{2} libres y espectroscopia IR y UV.
Rendimiento de la reacción | 85% |
% libre de NH_{2} | 12% |
% de N-acilación | 14% |
Un gramo (1,6 mmol.) de DHA/TBA (26% de
desacetilación) es solubilizado en 50 ml de NMP, después de lo cual
se añaden 5 ml de una solución al 10% del
p-NO_{2}-feniléster de ácido
acetil salicílico (preparado según el Ejemplo 11) en NMP. La
reacción continúa durante 24 horas, con agitación a temperatura
ambiente, después de lo cual se bloquea por adición de 2,5 ml de una
solución saturada de NaCl. Se deja reaccionar durante 30 minutos y a
continuación se añaden lentamente 100 ml de etanol. El precipitado
obtenido de este modo es filtrado a través de un Gooch, lavado con
etanol y etil éter y finalmente secado a temperatura ambiente y a
presión reducida. El derivado es analizado por TLC (después de
hidrólisis de la amida), análisis colorimétrico del porcentaje de
grupos NH_{2} libres y espectroscopia IR y UV.
\newpage
Rendimiento de la reacción | 90% |
% libre de NH_{2} | 10% |
% de N-acilación | 16% |
Dos gramos (3,2 mmol.) de sal de tetrabutilamonio
de ácido hialurónico (HA/TBA) se solubilizan en 100 ml de DMSO. Esta
solución es suplementada con 3 ml de resina ácido húmeda en DMSO y
784 mg (4,8 mmol.) de 1,1-carbonildiimidazol. Se
deja reaccionar con agitación durante 12 horas, después de lo cual
se filtra a través de un crisol Gooch para eliminar la resina y el
producto filtrado es suplementado con 1 ml (9,6 mmol) de
bencilamina. Se deja reaccionar durante 48 horas y a continuación se
añaden 5 ml de una solución saturada de NaCl y se deja en agitación
durante 30 minutos. Se suplementa con 200 ml de acetona y el
precipitado obtenido de esta manera es filtrado y secado a presión
reducida. El derivado seco es analizado por TLC, IR y HPLC.
% de amidación | 25% |
Dos gramos (3,2 mmol.) de sal de tetrabutilamonio
del ácido hialurónico (HA/TBA) se solubilizan en 100 ml de DMSO. La
solución se ajusta a pH 3 con HCl 1 M y a continuación con 784 mg
(4,8 mmol) de 1,1-carbonildiimidazol. Se deja
reaccionar con agitación durante 12 horas, después de lo cual se
filtra a través de un crisol Gooch para eliminar la resina y el
producto filtrado es suplementado con 1 ml (9,6 mmol) de
bencilamina. Se deja reaccionar durante 48 horas y a continuación se
añaden 5 ml de solución saturada de NaCl y se deja en agitación
durante 30 minutos. Se suplementa con 200 ml de acetona y el
precipitado obtenido de este modo es filtrado y secado a presión
reducida. El derivado seco es analizado por TLC, IR y HPLC.
% de amidación | 15% |
Se solubilizan dos gramos (3,2 mmol.) de ácido
hialurónico en forma ácida en 100 ml de DMF. A esta solución se
añaden 854 mg (5,2 mmol.) de 1,1-carbonildiimidazol.
Se deja reaccionar con agitación durante 6 horas, después de lo cual
se añaden 1,13 ml (10,4 mmol) de bencilamina. La reacción prosigue
durante 48 horas y a continuación es bloqueada por añadidura de 200
ml de acetona. El precipitado obtenido es filtrado y secado a
presión reducida. El derivado seco se caracteriza por TLC, IR y
HPLC.
% de amidación | 60% |
Dos gramos (3,2 mmol.) de ácido hialurónico en
forma ácida son solubilizados en 100 ml de DMF. A esta solución se
añaden 2 ml de piridina, 3,68 g (0,025 mmol.) de
p-NO_{2}-fenol y cloruro de
piridina hasta alcanzar pH 7/8. Finalmente, se añaden 5,3 (0,026
mol.)de DCC y 2,8 (0,026 mol.) de benzilamina. Se deja reaccionar
con agitación durante 16 horas, después de lo cual se bloquea con
añadidura de 200 ml de acetona. El precipitado obtenido es filtrado
y secado a presión reducida. El derivado seco se caracteriza por
TLC, IR y HPLC.
% de amidación | 5% |
Dos gramos (3,2 mmol.) de HA/TBA son
solubilizados en 100 ml de DMSO. La solución es insuflada con HCl
gaseoso hasta que la mezcla de reacción alcanza un pH comprendido
entre 4,5 y 5. A continuación, se añaden 518 mg (3,2 mmol.) de
carbonildiimidazol. Se deja reaccionar con agitación durante una
hora, después de lo cual se añaden 0,700 ml (6,4 mmol.) de
bencilamina. La reacción prosigue durante 16-18
horas. Después de este tiempo, se añaden 5 ml de una solución
saturada de NaCl. Se precipita añadiendo 200 ml de acetona y el
precipitado obtenido de este modo es filtrado y secado a presión
reducida. El derivado seco es analizado por TLC, IR y HPLC.
\newpage
% de amidación | 50% |
Se solubilizan dos gramos (3,2 mmol.) de HA/TBA
en 100 ml de DMSO. La solución es insuflada con HCl gaseoso hasta
que la mezcla de reacción alcanza un pH entre 4,5 y 5. A
continuación, se añaden 207 mg (1,28 mmol.) de carbonildiimidazol.
Se deja reaccionar con agitación durante una hora, después de lo
cual se añaden 0,417 ml (3,2 mmol.) de octilamina. La reacción
prosigue durante 16-18 horas. Después de este
período de tiempo, se añaden 5 ml de una solución saturada de NaCl.
Se precipita por añadidura de 200 ml de acetona y el precipitado
obtenido de este modo es filtrado y secado a presión reducida. El
derivado seco se analiza por TLC, IR y HPLC.
% de amidación | 25% |
Dos gramos (3,2 mmol.) de HA/TBA son
solubilizados en 100 ml de DMSO. La solución es insuflada con HCl
gaseoso hasta que la mezcla de reacción alcanza un pH comprendido
entre 4,5 y 5. A continuación se añaden 104 mg (0,64 mmol.) de
carbonildiimidazol. Se deja reaccionar bajo agitación durante una
hora, después de lo cual se añaden 600 mg (3,2 mmol.) de
dodecilamina. La reacción prosigue durante 16-18
horas. Después de este período de tiempo, se añaden 5 ml de una
solución saturada de NaCl. Se precipita por añadidura de 200 ml de
acetona y el precipitado obtenido de este modo es filtrado y secado
a presión reducida. El derivado seco es analizado por TLC, IR y
HPLC.
% de amidación | 15% |
Dos gramos (3,2 mmol.) de HA/TBA son
solubilizados en 100 ml de DMSO. La solución es insuflada con HCl
gaseoso hasta que la mezcla de reacción alcanza un pH comprendido
entre 4,5 y 5. A continuación se añaden 52 mg (0,32 mmol.) de
carbonildiimidazol. Se deja reaccionar a temperatura ambiente con
agitación durante una hora, después de lo cual se añaden 780 mg (3,2
mmol.) de hexadecilamina. La reacción prosigue durante
16-18 horas. Después de este período de tiempo, se
añaden 5 ml de una solución saturada de NaCl. Se precipita por
añadidura de 200 ml de acetona y el precipitado obtenido de este
modo es filtrado y secado a presión reducida. El derivado seco es
analizado por TLC, IR y HPLC.
% de amidación | 5% |
En este estudio se aislaron preadipocitos humanos
y se cultivaron. Se inseminaron 10^{6} preadipocitos en diferentes
estructuras ("scaffolds") y se implantaron en 42 ratones para
comprobar los nuevos materiales. Se utilizaron esponjas y materiales
no tejidos basados en ácido hialurónico modificado por
esterificación (HYAFF®11)y esponjas de colágeno. Estructuras
sin células sirvieron como controles negativos en el mismo animal.
Después de 3 y 8 semanas se explantaron los injertos. Se evaluaron
el aspecto macroscópico, peso, grosor, características
microscópicas, inmunohistoquímica y TEM (estructura básica,
celularidad, profundidad de penetración de las células inseminadas,
vascularización) en cuanto a diferencias en las interacciones de
estructura-célula.
Resultados: In vitro los
preadipocitos se diferenciaron más rápidamente cuando estaban
acoplados a HYAFF®11 estructuras ("scaffolds").
Macroscópicamente todos los constructos de preadipocitos tenían
aspecto amarillento y presentaban numerosos vasos, apareciendo los
controles de color blanco y avasculares. Microscópicamente los
constructos HYAFF®11 mostraron densidades de células superiores que
los constructos de colágeno. Los poros de las esponjas contenían más
adipocitos diferenciados que los no tejidos, mientras que los
preadipocitos no diferenciados fueron más numerosos en el no tejido.
La penetración de células precursoras adiposas era más profunda y
más homogénea en estructuras HYAFF®11. Todos los injertos de
preadipocitos tenían mejor vascularización que los controles; la
formación de los vasos era más pronunciada alrededor de los
adipocitos maduros. La microscopia electrónica demostró adipocitos
bien diferenciados y grandes cantidades de ECM alrededor de los
preadipocitos en esponjas de HYAFF®11.
Conclusión: Los preadipocitos humanos
cultivados in vitro se diferencian en tejidos similares a los
adiposos. Este prometedor método se utilizará para futura
reconstrucción de defectos en tejidos blandos. Las esponjas de
HYAFF®11 soportaron la expansión y diferenciación de las células
precursoras adiposas. Este portador es superior al no tejido con
respecto a la diferenciación de adipocitos y superior a la esponja
de colágeno con respecto a la celularidad.
Se produjeron estructuras de esponjas de colágeno
por un método de solidificación direccional descrito por Heschal y
otros, Posibles aplicaciones de técnicas de solidificación
direccional en criobiología. En P. Kittel (Ed.) Advances of
Cryogenic Engineering. Vol. 41, Nueva York: Plenum Press, 1996.
Se congeló y se liofilizó a continuación colágeno bovino tipo I
(1,8% en peso) en suspensión (Dr. Otto Suwelack GmbH, Alemania), ver
WO 99/27315. Los poros restantes corresponden a la estructura
cristalina de hielo anterior con un tamaño promedio de poros de 50
\mum, tal como se describe por Schoof y otros, EinfluB des
Einfriervorganges auf die Porenstruktur gefriergetrockneter
Kollagenschwämme. Ki-Luft und Källetechnik 34, 1998.
Kollagenschwämme. Ki-Luft und Källetechnik 34, 1998.
Se prepararon esponjas de HYAFF®11 (derivado
lineal de ácido hialurónico modificado por esterificación completa
de la función carboxílica del ácido glucurónico con grupos bencilo)
tal como se ha descrito anteriormente y por Rastrelli y otros,
Hyaluronic acid esters, a new class of semisynthetic biopolymers:
chemical and physico-chemical properties. Clin.
Implant. Mater. 9: 199, 1990. La estructura HS tiene poros de
interconexión abiertos obtenidos por una tecnología con proceso de
inversión de fase acoplada con un proceso de gas a baja presión. Los
tamaños de poros varían entre 50 y 340 \mum.
El HV se compone de fibras no tejidas (espesor 20
\mum) de hialuronan bencil éster con un peso específico de 100
g/m^{2} que se preparó también tal como se ha descrito
anteriormente.
Para los experimentos todos los materiales
esterilizados fueron cortados en muestras (0,75 cm x 0,75 cm x 0,5
cm).
Se aislaron preadipocitos procedentes de tejidos
adiposos subcutáneos humanos recién cortados
(0,4-0,7 gramos) de adultos jóvenes (edad:
18-29 años) en el Departamento de Cirugía Plástica
de Cirugía de Manos - Centro de Quemados que llevó a cabo las
operaciones electivas (por ejemplo, reducción de mamaplastia). Los
tejidos fibrosos fueron retirados, los tejidos adiposos fueron
triturados en trozos y sometidos a digestión por colagenasa 0,1 U
ml^{-1}/dispasa 0,8 U ml^{-1} (Boehringer Mannheim, Alemania) en
un baño de agua a 37ºC durante 60 minutos con agitación permanente.
La digestión fue interrumpida por adición de medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM) conteniendo 15% FCS (Biochrom,
Berlin, Alemania) e incubado en tampón de lisis de eritrocitos (154
mmol l^{-1} NH_{4}Cl, 10 mmol l^{-1} KHCO_{3}, 1 mmol
l^{-1} EDTA, 10 minutos). La suspensión de células fue
centrifugada (200xg a 17ºC durante 10 minutos) y las células fueron
inseminadas sobre platillos de cultivo de tejidos (63,6 cm^{2},
Greiner, Solingen, Alemania) con DMEM 15 FCS (con añadidura de 100 U
ml^{-1} penicilina, 100 \mug ml^{-1} Streptomicina) con una
densidad de inseminación de 3x10^{4} células/cm^{2}. Las células
fueron sometidas a cultivo a 37ºC a 10% CO_{2}, el medio fue
cambiado en el día 2 y suplementado con EGF (factor de crecimiento
epidérmico, 10 ng ml^{-1}, Sigma). Se tripsinizaron preadipocitos
del segundo paso en la confluencia, se resuspendieron y contaron en
un hemocitómetro. Se sembró una suspensión de 100 \mul conteniendo
1 x 10^{6} \pm 5 x 10^{4} células (acumulaciones de
preadipocitos) sobre la superficie superior al verter suavemente
sobre el FCS humedecido (el humedecimiento de FCS de las estructuras
duró 24 horas a 37ºC antes de la inseminación de las células) y se
dejó en el incubador durante 24 horas para permitir el acoplamiento
de las células.
Ratones atímicos desnudos (8 semanas, NMRI nu/nu)
fueron operados en condiciones asépticas y con inhalación de
anestesia (Enflurane®). Se transplantaron 42 constructos fabricados
de preadipocito/estructura (+) y 42 controles negativos (-)
(estructura sin células, empapado con DMEM durante 24 horas). Cada
uno de los animales recibió un constructo de preadipocito/estructura
subcutáneamente para dejar el área escapular y su control
correspondiente en el lado contralateral mediante incisiones
separadas. La parte baja de los constructos fue colocada sobre los
haces musculares. Todos los experimentos con animales se llevaron a
cabo de acuerdo con la ley alemana de Protección de Animales.
Después de 3 semanas (grupo A, 21 animales llevando 7CS+ y 7CS-, 7
HS+ y 7 HS-, 7 HV+ y 7 HV-) y 8 semanas (grupo B, 21 animales 7CS+ y
7 CS-, 7 HS+ y 7 HS-, 7 HV+ y 7 HV-) los ratones fueron sacrificados
por sobredosis de anestésico gaseoso. Las muestras fueron retiradas
para análisis macroscópico (color, vasos, crecimientos internos) y
microscópico. El peso de cada una de las esponjas fue evaluado antes
del transplante y después de la explantación.
Una parte de las muestras cortadas verticalmente
fue fijada en solución de formaldehido con tampón al 4% y embebido
posteriormente en parafina, siendo criofijada la otra mitad. Ambas
fueron seccionadas verticalmente. Se obtuvieron imágenes
ultraestructurales a partir de muestras in vitro (3 muestras)
e in vivo (6 muestras). Se prepararon cortes de tejido de 6 \mum
(muestras de parafina) y se tiñeron con
hematoxilin-eosina y Giemsa. Los fragmentos
criofijados fueron teñidos con aceite rojo para identificación de
vacuolas de lípidos. Se tiñeron las secciones de parafina de las
matrices inseminadas y de los controles no inseminados mediante
anticuerpos monoclonales específicos para vimentina humana (mahv,
clon V9, Código Nr. M 0725 Lote 057, DAKO, Dinamarca) con dilución
de 1:10. Tres examinadores, que no sabían a qué grupo pertenecían
las secciones, evaluaron independientemente las secciones
histológicas. Cuando se observaron diferencias entre ambas
evaluaciones, se calculó el valor medio.
Se evaluó la celularidad no específica
(donante y hospedante) contando todos los núcleos de células
manchadas con Giemsa en 5 campos microscópicos definidos de las
secciones transversales con 200 aumentos.
Se evaluó la celularidad específica
(donante = humano) al contar todas las células positivas de
vimentina humana en 5 campos microscópicos definidos con 200
aumentos.
Se midió la profundidad de penetración de
las células donantes en tres campos microscópicos definidos con 200
aumentos utilizando un micrómetro intraocular (Zeiss).
Se evaluó la vascularización de los injertos en
las secciones transversales. En caso de no existir vasos se indicó
"-", los vasos en una o varias regiones superficiales se
designaron "+", los vasos en la zona central "++" y una
distribución homogénea de vasos en el injerto recibió la designación
"+++".
La ultraestructura de los injertos fue
evaluada después del proceso de posfijación y se observó con un
microscopio electrónico Philips EM 400.
Se expresaron los datos de peso y grosor de los
injertos, la celularidad global de los injertos y la profundidad de
penetración de los preadipocitos humanos inseminados en forma de
valor medio y desviación \pm estándar. La significación de
diferencias entre diferentes períodos de implantación y entre los
constructos de preadipocitos/estructura y los controles negativos se
evaluó por prueba de rango de Wilcoxon. Las diferencias a p <
0,05 se consideraron significativas.
Las células se adhirieron a las estructuras 24
horas después de inseminación (figura 1). La penetración de las
células in vitro se observó solamente en las áreas superficiales de
la estructura. Inmediatamente después del transplante, los
precursores adiposos HS+ y HV+ mostraron algunas vacuolas
citoplásmicas y forma redonda y signos de diferenciación (figura 1)
en histología y en ultraestructura. Esto no se observó en muestras
CS+.
Todos las muestras fueron identificadas
fácilmente. La forma global de las muestras CS+ y HS+ casi no cambió
después de 3 y 8 semanas. Las muestras CS- y HS- mostraron bordes
redondos y tenían un aspecto más pequeño que las CS+ y HS+. Las HV+
mostraron gran variación entre las muestras, las esctructuras HV-
mostraron la deformación y retracción mayores. Todos los constructos
de preadipocito/estructura fueron cubiertos por capas muy adherentes
de tejido amarillo macroscópicamente y nuevos vasos en la parte
superior (figura 2). Los injertos de control tenían un aspecto
blanco y casi avascular (figura 2).
Pesos CS+ y CS-: después de 24 horas in
vitro no hubo diferencia en peso entre las estructuras de
colágeno que llevaban preadipocitos CS+ y los que no tenían células
CS-. Después de tres semanas in vivo había una pérdida
significativa de peso para CS+ y CS-. CS+ presentaba un peso
significativamente superior a CS-. La reducción de peso entre 3 y 8
semanas fue inferior que la reducción de peso entre la implantación
y la semana 3.
Pesos HS+ y HS-: después de 24 horas in
vitro el peso de constructos de preadipocito/estructura HS+ fue
superior que los controles HS-. Después de 3 semanas en el ratón
desnudo se produjo un incremento de peso en HS+ mientas que hubo una
reducción de peso en el control HS-. La diferencia era
significativa. Después de 8 semanas HS+ tenía todavía un peso
significativamente superior al de los controles.
Pesos HV+ y HV-: la matriz no tejida con
preadipocitos mostró pesos superiores que los controles en todo
momento. Se apreció después de 8 semanas in vivo una ligera
ganancia de peso con una notable variación en
HV+.
HV+.
Comparando las tres estructuras (CS, HS y HV)
entre sí, la estructura HV mostró el peso más bajo de las
estructuras diseminadas y la variación más grande entre las
muestras. Los injertos con preadipocitos tenían peso más elevado en
todos los injertos en todo momento, siendo ello significativo para
HS+ y HV+. Solamente se observó una ganancia significativa de peso
en preadipocitos que llevaban HS+ que correspondían a los tejidos
parecidos a adiposos que se desarrollaron en esta estructura.
Cada una de las muestras explantadas fue rodeada
por una cápsula fibrosa delgada, que separaba la estructura con los
nuevos tejidos formados parecidos a adiposos con respecto a los
tejidos hospedantes circundantes. El examen microscópico de los
constructos de preadipocitos/estructura demostraron tejidos adiposos
viables situados sobre las superficies de las estructuras bajo la
cápsula. Se encontraron adipocitos maduros en las áreas por debajo
de la superficie. No se observaron adipocitos diferenciados en la
región central de las esponjas. Muchos vasos presentaron en esta
nueva forma tejidos adiposos. En los injertos de control no se
encontraron en absoluto adipocitos. Los poros parecían haberse
colapsado en HV (fibras hinchadas y poros estrechos) y en CS (áreas
de infraestructura y poros obstruidos). Solamente en HS se mantenía
bien la estructura porosa. En estas áreas HS+ el tejido adiposo
estaba compuesto por agrupaciones de adipocitos (figura 3).
La celularidad no específica (donante y
hospedante) en muestras de colágeno era superior en los injertos CS+
que en los injertos CS- después de 3 y 8 semanas mientras que hubo
una reducción en la celularidad no específica en CS+ y CS- (Tabla
2).
En las muestras HYAFF 11 había una celularidad no
específica más elevada en los injertos de control (HS- y HV-) que en
las muestras que llevaban preadipocitos(HS+ y HV+). Ente la
semana 3 y la semana 8 hubo una reducción ligera de la celularidad
no específica en HS+, HV+ y HV- (Tabla 2).
El manchado para vimentina humana indicó que las
células en las muestras CS+, HS+ y HV+ eran fuertemente positivas
demostrando origen humano (Figura 4). No hubo manchado positivo en
las muestras CS-, HS- y HV-. Esta celularidad específica (donante)
mostró interesantes resultados en las tres estructuras distintas
(Tabla 2). En HS+ no hubo diferencia entre la semana 3 y la semana
8; la celularidad no específica era superior que la celularidad
específica. En CS+ hubo una reducción ligera entre la semana 3 y la
semana 8. En HV+ hubieron diferencias significativas entre la semana
3 y la semana 8. La celularidad específica más elevada de todas las
estructuras se observó en HV+ en la semana 3 (115 células/campo)
pero 8 semanas después de la implantación el número de células
humanas se redujo en HV+ al número más bajo de todas las estructuras
(26 células/campo).
La profundidad de penetración de las células
precursoras adiposas humanas después de 3 semanas in vivo era
diferente para cada uno de los materiales (Tabla 3, figura 5). La
mejor penetración se encontró en HS+. Después de 3 semanas la mayor
parte de muestras HS+ presentaba penetración completa de las
células, después de 8 semanas en todas las HS+ la penetración era
completa. La profundidad de penetración era ¾ del grosor de la
estructura en HV+ después de tres semanas y completa en HV+ después
de 8 semanas. En CS+ había una penetración parcial después de tres
semanas con profundidad creciente, pero todavía parcial después de 8
semanas.
Solamente se encontraron adipocitos maduros en
algunas áreas. El número más elevado de adipocitos maduros
penetraron 1800 \mum en HS+ (figura 3), el número mínimo de
adipocitos maduros penetró solamente 280 \mum en HV+ (Tabla 3,
Figura 5). No se encontraron adipocitos en ninguno de los injertos
de control.
Hubo una formación de nuevos vasos notablemente
mejor en los constructos de preadipocito/estructura (+ Media) en
comparación con los controles negativos (- Media) para todos los
materiales (Tabla 4). En los poros de interconexión abiertos de HS
la neovascularización era mejor (++). En ninguno de los injertos
explantados la distribución era homogénea y rica en vasos (+++).
La microscopia electrónica detalló células
precursoras adiposas humanas y su interacción con las estructuras.
Después de 3 semanas in vivo se encontraron numerosas gotitas
de lípido citoplásmico en todos los preadipocitos. En HV+ se
encontraron principalmente preadipocitos tipo bastón con múltiples
pequeñas gotitas de lípidos (figura 6) indicando que no había
diferenciación completa. Se presentaron precursores parecidos a
fibroblastos no diferenciados profundamente dentro de la parte no
estructurada (nonwoven) (HV+) en poros estrechos íntimamente
asociados al material portador. En HV- se encontraron muchas más
células después de 3 semanas que en los constructos de
preadipocito/estructura básica. Se presentaron muchos histiocitos y
células gigantes en el control negativo de injertos HV-. En HS+ se
encontraron principalmente células de forma redonda con gotitas de
lípido únicas grandes con aspecto de anillo de sello típico de
adipocito (figura 7). Se presentaron numerosos capilares situados
cerca de los preadipocitos y adipocitos. Se encontraron nuevos
fibrilos de colágeno en proximidad íntima a la estructura. Los
adipocitos se encontraron fijados íntimamente a la estructura y se
encontraron haces de nuevos fibrilos de colágeno intermedios (figura
7). Después de 8 semanas la morfología in vivo de los
adipocitos fue similar a las muestras de 3 semanas. Las estructuras
mostraron una forma más irregular y poros obstruidos por residuos
colapsados de la estructura base. Hubieron algunas células gigantes
y nuevas células ECM formadas compuestas principalmente por fibras
de colágeno.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \begin {minipage}[t]{140mm}*Después de 3 semanas in vivo se presentó una pérdida de peso significativa (p<0,05) para ambos, CS+ y CS-. CS+ tenía un peso significativamente más elevado **(p<0,05) en comparación con CS-.\end{minipage} \cr \begin {minipage}[t]{140mm}***Después de 3 semanas en el ratón hubo un incremento en peso en HS+ mientras que no hubo reducción significativa de peso en los controles HS- (p<0,05) en comparación con el peso in vitro .\end{minipage} \cr \begin {minipage}[t]{140mm}****En ambos períodos de tiempo (después de 3 y 8 semanas) HS+ tiene un peso significativamente más elevado que los controles HS- (p<0,05).\end{minipage} \cr \begin {minipage}[t]{140mm}*****Después de ser tres semanas tanto HV+ como HV- tenían un peso significativamente más bajo que en el momento de la implantación.\end{minipage} \cr}
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Los tejidos adiposos conseguidos por técnica de
tejidos tenían el potencial de corregir los defectos de tejidos
blandos congénitos, idiopáticos o traumáticos en todas las zonas del
cuerpo sin crear un efecto cedente principal. El estudio presente
demuestra la posibilidad de conseguir técnicamente un tejido
parecido al adiposo por transplante de preadipocitos cultivados
seguido de diferenciación después de implantación.
En estudios in vivo de 3 y 8 semanas, el
hialuronan bencil éster (HYAFF®11) en esponja demostró un mejor
efecto de estructura que la esponja de colágeno y el hialuronan
bencil éster (HYAFF®11) no tejido con respecto al peso constante,
distribución homogénea de células precursoras cedentes
supervivientes y finalmente la cantidad más elevada de tejido
adiposo diferenciado. La esponja de hialuronan bencil éster no
solamente mostró un peso constante, sino también el peso más elevado
de todas las estructuras investigadas. El peso constante y las
dimensiones del material de relleno de tejidos blandos son los
criterios más importantes para utilización clínica.
La celularidad específica inicial (después de 3
semanas in vivo) en hialuronan bencil éster no tejido (HV+)
fue el doble que el del colágeno (CS+) y esponjas de hialuronan
(HS+). La celularidad específica final por campo (después de 8
semanas in vivo) en esponjas (CS+, HS+) fue el doble que en
(HV+) no tejido. La celularidad específica indica las células
precursoras de mesenquima humano inseminadas. Es probable que el
colapso de las no tejidas (fibras hinchadas y poros más estrechos)
disminuyera el espacio disponible para la diferenciación de los
preadipocitos. Las áreas infracturadas y los poros obstruidos de la
estructura de colágeno después de 8 semanas, no mostraron adipocitos
diferenciados (CS+). En esponjas de hialuronan bencil éster (HS+) la
estructura porosa se encontraba todavía presente después de 8
semanas y en estas áreas los tejidos adiposos estaban compuestos por
agrupaciones de adipocitos.
Todos los explantes con preadipocitos humanos
acoplados tenían aspecto vascular, en comparación con las
estructuras de control sin células. Los controles tenían aspecto
blanco y casi avascular. Este resultado es atribuible probablemente
a la matriz extracelular producidad por los precursores adiposos
cultivados que es un inductor potente de neovascularización. Los
vasos dentro de las muestras confirmaron la morfología general. La
neovascularización era mucha más pronunciada en constructos de
preadipocito/estructura (+).
La celularidad no específica en estructuras
hialuronan bencil éster sin células precursoras adiposas (HS-, HV-)
era más elevada que en HS+ y HV+. Se observaron histiocitos y
células gigantes multinucleadas en mayor número en los controles
negativos indicando que la reacción de los tejidos (cuerpos
extraños) era mucho más intensa. Estas observaciones son
contradictorias con respecto a la celularidad no específica en
estructuras de colágeno. Estos resultados no pueden ser explicados
por nuestros conocimientos actuales. Se pueden atribuir a la
secreción de preadipocitos de factor inhibitorio cuando se han
cultivado y transplantado sobre material de hialuronan bencil éster.
Esta observación debe ser examinada en otros experimentos.
La profundidad de penetración de las células en
una matriz es un buen parámetro para el análisis de interacción de
estructura/células en la preparación técnica de tejidos, es decir,
ingeniería de tejidos. En el presente estudio se encontraban
presentes todavía células humanas después de 8 semanas en los
ratones desnudos en todos los tipos de estructuras. Había una
penetración creciente de las células a lo largo de este período de
tiempo en las esponjas. Estos portadores biodegradables esponjosos
de ácido hialurónico soportaron la expansión y diferenciación de las
células precursoras. Una distribución más homogénea de las células
inseminadas condujo a un número menos concentrado en los campos
examinados relacionados con una mejor penetración en el injerto.
Los preadipocitos humanos penetraron en la
estructura in vivo hasta una profundidad de penetración media de
2227 \pm 706 \mum en HS+, se encontraron adipocitos maduros
hasta una profundidad media de 520 \mum (máximo 1800 \mum). Los
inventores llegan a la conclusión de que los preadipocitos necesitan
bastante espacio poroso para diferenciarse con respecto a los
adipocitos maduros. El material óptimo y la arquitectura de la
estructura utilizados en la ingeniería de tejidos adiposos tienen
que ser definidos. La estructura ideal de acuerdo con los presentes
resultados contiene grandes poros (>120 \mum) interconectados y
tiene características de hinchado reducidas. La esponja de HYAFF®11
demostró ser superior a la no tejida HYAFF®11 y la esponja de
colágeno en los presentes experimentos.
Una nueva estrategia para investigación clínica
aplicada debería ser la reconstrucción in vitro de tejidos y
órganos completos obtenida por proliferación guiada in vitro
de células autólogas del mismo paciente. La forma tridimensional de
una estructura ("scaffold") que soporta células de mesenquima
es importante para el depósito de matriz extracelular. La calidad de
la matriz es importante para la regulación de actividades celulares
y para la calidad de la matriz extracelular para conseguir
características similares del sustituto, tal como el tejido nativo.
Por lo tanto, es importante investigar la influencia de diferentes
matrices en el comportamiento in vitro e in vivo de
las células inseminadas. Se han investigado muchos materiales en el
sector de la ingeniería de tejidos a lo largo de la última década.
Las estructuras basadas en colágeno, como uno de los primeros
soportes biodegradables, y las estructuras basadas en hialuronan,
como material nuevo en la ingeniería de tejidos, han sido examinadas
en el presente estudio. La matriz de colágeno porosa puede soportar
crecimientos celulares y nuevas síntesis de matriz. Las estructuras
de colágeno proporcionan una buena matriz para los fibroblastos que
se diferencian de modo completo y muestran morfología y metabolismo
normal in vivo. El ácido hialurónico se encuentra presente en
la matriz extracelular de muchos tejidos y abundante en tejidos de
mesenquima en el feto y se cree que los biomateriales basados en HA
son buenos soportes para desarrollo de células progenitoras y
facilitarán la preparación de tejidos. Durante la diferenciación de
adipocitos las células precursoras adquieren características de
adipocitos y ocurren cambios drásticos en la morfología celular. La
conexión física entre la matriz extracelular y la matriz nuclear,
por un lado, y la calidad de la matriz extracelular, por otro lado,
influyen principalmente en la diferenciación de adipocitos. Las
células ECM de los tejidos conectivos sueltos de los tejidos
adiposos nativos interconectan los adipocitos e inducen la
agrupación de células de grasa in vivo. Se llega, por lo
tanto, a la conclusión de que el hialuronan que se encuentra
presente en todos los tejidos conectivos, influye positivamente la
conversión adiposa in vivo. Dado que se encontraron solamente
agrupaciones de adipocitos maduros en esponjas HYAFF®11 y no en
HYAFF®11 no tejidas, se llega a la conclusión de que la calidad de
la estructura es tan importante como su arquitectura. En el estudio
presente las estructuras esponjosas de hialuronan bencil éster
dieron los mejores resultados entre los materiales investigados.
Claims (18)
1. Biomaterial para reconstrucción de tejidos
blandos formado por
- (a)
- un material de soporte constituido por un bencil éster de ácido hialurónico; y
- (b)
- células de preadipocitos inseminadas sobre dicho material de soporte
2. Biomaterial, según la reivindicación 1, que
comprende además, como mínimo, un miembro del grupo que consiste en
células tallo de mesenquima y células endetoliales.
3. Biomaterial, según la reivindicación 1 ó 2, en
el que dicho bencil éster de ácido hialurónico es un 100% éster,
mientras que la totalidad de los grupos carbóxilos de dicho ácido
hialurónico están esterificados con un residuo de bencil
alcohol.
4. Biomaterial, según la reivindicación 1 ó 2, en
el que dicho bencil éster de ácido hialurónico es un éster 5 a 99%,
de manera que de 5 a 99% de los grupos carbóxilo de dicho ácido
hialurónico están esterificados con un residuo de bencil alcohol y
los grupos restantes están salificados.
5. Biomaterial, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho material de soporte es una
estructura ("scaffold") que adopta la forma de un material
esponjoso o no tejido.
6. Biomaterial, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que, como mínimo, un elemento de
dicho grupo de células de preadipocitos, células tallo de mesenquima
y células endoteliales son células humanas.
7. Biomaterial, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, para tratar daños en los tejidos
blandos.
8. Biomaterial, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, para tratamientos de reconstrucción de daños
en tejidos blandos.
9. Preparado inyectable para el relleno de
defectos y depresiones de tejidos blandos formado por:
- (a)
- un derivado de ácido hialurónico totalmente soluble en agua o un derivado de ácido hialurónico parcialmente soluble en agua y
- (b)
- células de preadipocitos suspendidas en el preparado.
10. Preparado inyectable, según la reivindicación
9, que comprende además, como mínimo, un miembro del grupo que
consiste en células tallo de mesenquima y células endetoliales.
11. Preparado inyectable, según la reivindicación
9 ó 10, en el que la totalidad de derivado de ácido hialurónico
totalmente soluble en agua es una amida de ácido hialurónico.
12. Preparado inyectable, según la reivindicación
9 ó 10, en el que la totalidad de derivado de ácido hialurónico
totalmente soluble en agua es dodecil amida de ácido
hialurónico.
13. Preparado inyectable, según la reivindicación
9 ó 10, en el que el derivado de ácido hialurónico parcialmente
soluble en agua es 5 a 99% éster, de manera que 5 a 99% de los
grupos carbóxilo de dicho ácido hialurónico están esterificados con
un residuo de alcochol bencílico y el resto de grupos están
salificados.
14. Preparado inyectable, según la reivindicación
9 ó 10, en el que el derivado de ácido hialurónico parcialmente
soluble en agua es un 85% éster, en el que el 85% de los grupos
carbóxilo del ácido hialurónico están esterificados con residuo de
bencil alcohol y los grupos restantes están salificados.
15. Preparado inyectable, según la reivindicación
9 ó 10, en el que, como mínimo, un miembro de dicho grupo de células
de preadipocitos, células tallo de mesenquima y células endoteliales
son células humanas.
16. Preparado, según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 15, para relleno de defectos y depresiones de
tejidos blandos.
17. Preparado, según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 16, para el relleno de defectos, depresiones,
arrugas y deformidades de los tejidos blandos de un paciente que lo
requiera.
18. Biomaterial, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, o preparado inyectable, según cualquiera de
las reivindicaciones 9 a 15, para su utilización en tratamiento
reconstructivo de daños en los tejidos blandos.
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