CN104480096B - 交联聚合固载β-葡萄糖苷酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种交联聚合固载β‑葡萄糖苷酶的方法，以β‑葡萄糖苷酶为来源，经硫酸铵沉淀、戊二醛交联，与氨基功能化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂微球形成酶交联自聚体，增强了酶的生化性质，并用于水解纤维二糖，大大加快了纤维二糖的水解速率。本发明操作简单，制备耗时短，对酶的活性影响小，水解纤维二糖快。
Description
技术领域
本发明属于生物酶的固载技术领域，具体涉及一种以饱和硫酸铵为沉淀剂，戊二醛为交联剂，采用交联聚合的方法制备固载β-葡萄糖苷酶。
背景技术
酶作为一种天然的高分子催化剂，因具有极高的专一性、催化反应条件温和、催化反应速度快、无污染等诸多优点，使其在食品加工、医药等产业中有着极为广阔的应用前景。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。但在实际应用中，酶对环境敏感、反应后难以回收等缺点限制了酶制剂产品的开发和应用，在这种情况下，固定化酶技术应运而生。所谓固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。与游离酶相比，固定化酶具有的优点有：可以在较长时间内反复利用，反应过程可以严格控制，有助于提高酶的稳定性，酶易于与底物和产物分开，增加产物的收率，提高产物的质量，提高酶的使用效率，成本降低等。
目前关于固定化酶的方法主要有以下几种：(1)包埋法，该方法操作步骤简单，成本低，污染少，但是此法只适用于小分子底物和产物的酶催化反应，且固载酶易从包埋材料中漏出导致失活；(2)吸附法，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用，但酶与载体结合不牢，极易脱落；(3)共价键合法，此方法研究较为成熟，其优点是酶与载体间连接牢固，即使用高浓度底物或离子强度的溶液进行反应，也不会导致酶和载体的分离，因此具有良好的稳定性及重复使用性，缺点是反应步骤较为繁琐，反应条件较为苛刻，常常会引起酶蛋白结构发生改变，导致酶的活性中心受损。
现有的固载技术对于β-葡萄糖苷酶的固载量、耐酸碱性、热稳定性以及贮存稳定性等性能都有提升，但对纤维二糖的水解速率却提升不明显。Wei等通过将β-葡萄糖苷酶固载到功能化的二氧化钛表面上，提高了其耐酸碱性、热稳定性以及贮存稳定性，但对纤维二糖的水解速率较低，需要水解6小时才能达到90％的水解率(Immobilization ofβ-glucosidase on mercaptopropyl-functionalized mesoporous titanium dioxide，Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2013，97，303-310)。Verma等将β-葡萄糖苷酶固载到磁性纳米颗粒上，70℃下4小时内酶活性仍然保留67％，但其对纤维二糖的水解速率也较低，需要水解5小时才能达到90％左右的水解率(Immobilization of β-glucosidase on a magnetic nanoparticle improves thermostability:Applicationin cellobiose hydrolysis，Bioresource Technology，2013，135，2-6)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有固定化酶技术中关于酶失活所存在的不足，提供一种以硫酸铵为沉淀剂，戊二醛为交联剂，通过交联固载β-葡萄糖苷酶的方法，该方法操作简单、耗时短，固载效率高，酶活性损失小，且水解纤维二糖的速率高。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：将β-葡萄糖苷酶完全溶解于20mmol/LpH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入氨基功能化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂微球，混合均匀，加入沉淀剂，常温震荡20～40分钟，离心洗涤，所得沉淀加入20mmol/L pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，再加入质量分数为50％戊二醛水溶液，所得混合液中戊二醛的质量分数为0.2％～1％，室温震荡1～5小时，离心洗涤，得到固载β-葡萄糖苷酶。
上述的氨基功能化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂微球与β-葡萄糖苷酶的量比为1:0.2～0.8，优选氨基功能化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂微球与β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.6，其中氨基功能化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂微球的粒径为2～5μm，根据文献Improved performance ofα-amylase immobilized on poly(glycidyl methacrylate-co-ethylenedimethacrylate)beads(J Int Biol Macromol 2014；65：492-499)中的方法制备而成。
上述的β-葡萄糖苷酶与戊二醛的质量比为1:0.0005～0.01，优选β-葡萄糖苷酶与戊二醛质量1:0.002～0.01。
上述的沉淀剂为异丙醇、丙酮、饱和硫酸铵水溶液中的任意一种，优选饱和硫酸铵水溶液。
上述方法中，优选所得混合液中戊二醛的质量分数为0.5％。
本发明采用酶交联技术，将β-葡萄糖苷酶与氨基功能化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂微球形成酶交联自聚体，操作简单，制备耗时短，对酶的活性影响小，增强了酶的生化性质，并用于水解纤维二糖，大大加快了纤维二糖的水解速率。
附图说明
图1是70℃下固载β-葡萄糖苷酶与可溶性β-葡萄糖苷酶的热稳定性对比图。
图2是固载β-葡萄糖苷酶与可溶性β-葡萄糖苷酶的贮存稳定性对比图。
图3是固载β-葡萄糖苷酶的重复利用率对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但是本发明的保护范围不仅限于下述的实施例。
实施例1
1、沉淀
将6mgβ-葡萄糖苷酶完全溶解于1mL 20mmol/L pH值为4.8的磷酸缓冲液中，然后加入10mg氨基功能化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂微球，常温震荡15分钟，再加入5mL饱和硫酸铵水溶液，常温震荡30分钟，将沉淀离心洗涤3次。
2、交联固载
将步骤1离心洗涤后的沉淀加入5mL 20mmol/L pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，再加入60μL质量分数为50％的戊二醛水溶液，常温震荡4小时后，离心洗涤3次，得到固载β-葡萄糖苷酶，测得β-葡萄糖苷酶的固载率为95％、相对活性为93％。
实施例2
本实施例中，β-葡萄糖苷酶的用量变为2mg，其他步骤与实施例1相同，得到固载β-葡萄糖苷酶，测得β-葡萄糖苷酶的固载率为90％、相对活性为91％。
实施例3
本实施例中，β-葡萄糖苷酶的用量变为4mg，其他步骤与实施例1相同，得到固载β-葡萄糖苷酶，测得β-葡萄糖苷酶的固载率为93％、相对活性为88％。
实施例4
本实施例中，β-葡萄糖苷酶的用量变为8mg，其他步骤与实施例1相同，得到固载β-葡萄糖苷酶，测得β-葡萄糖苷酶的固载率为98％、相对活性为78％。
实施例5
在实施例1中，所用的饱和硫酸铵水溶液用等体积的异丙醇替换，其他步骤与实施例1相同，得到固载β-葡萄糖苷酶，测得β-葡萄糖苷酶的固载率为75％、相对活性为90％。
实施例6
在实施例1的交联固载步骤2中，震荡时间缩短至3小时，其他步骤与实施例1相同，得到固载β-葡萄糖苷酶，测得β-葡萄糖苷酶的固载率为78％。
实施例7
在实施例1的交联固载步骤2中，震荡时间延长至5小时，其他步骤与实施例1相同，得到固载β-葡萄糖苷酶，测得β-葡萄糖苷酶的固载率为85％。
实施例8
在实施例1中的步骤1中，所用的饱和硫酸铵水溶液用等体积的丙酮替换，在实施例1的步骤2中，震荡时间延长至5小时，其他步骤与实施例1相同，得到固载β-葡萄糖苷酶，测得β-葡萄糖苷酶的固载率为92％、相对活性为60％。
实施例9
在实施例8中，所用的质量分数为0.5％的戊二醛水溶液用等体积质量分数为1％的戊二醛水溶液替换，其他步骤与实施例7相同，得到固载β-葡萄糖苷酶，测得β-葡萄糖苷酶的固载率为99％、相对活性为99％。
实施例10
在实施例8中，所用的质量分数为0.5％的戊二醛水溶液用等体积质量分数为0.2％的戊二醛水溶液替换，其他步骤与实施例7相同，得到固载β-葡萄糖苷酶，测得β-葡萄糖苷酶的固载率为85％、相对活性为85％。
为了证明本发明的有益效果，发明人对实施例1得到的固载β-葡萄糖苷酶的性能进行了测试，具体测试方法如下：
1、动力学参数的测定
将可溶性β-葡萄糖苷酶在pH值为5.0、温度为50℃，固载β-葡萄糖苷酶在pH值为5.5、温度为60℃，底物浓度均为0.5～50mmol/L下分别测量Km与Vmax。实验测得可溶性β-葡萄糖苷酶与固载β-葡萄糖苷酶的Km分别为11.97μmol/L和7.67μmol/L，Vmax分别为0.314μmol·mL-1·min-1和0.639μmol·mL-1·min-1，证明了固载β-葡萄糖苷酶具有比可溶性β-葡萄糖苷酶更高的催化活性。
2、热稳定性测定
将可溶性β-葡萄糖苷酶与固载β-葡萄糖苷酶在70℃、pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中静置10小时，间隔测量酶活性。由图1可知，可溶性β-葡萄糖苷酶在1小时之内失去全部活性，固载β-葡萄糖苷酶3小时和5小时后仍然保留了70％和50％的活性。
3、贮存稳定性测定
将可溶性β-葡萄糖苷酶与固载β-葡萄糖苷酶在4℃、pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中贮存60天，间隔测量酶活性。由图2可知，放置9天后，可溶性β-葡萄糖苷酶失去了70％的活性，固载β-葡萄糖苷酶保持95％的活性；放置45天后，可溶性β-葡萄糖苷酶无活性，固载β-葡萄糖苷酶的活性仍然保持在95％左右。
4、重复利用率测定
将固载β-葡萄糖苷酶在60℃、pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中与4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷反应5分钟，离心后取上清液测量酶活性。之后离心分离固载β-葡萄糖苷酶，再加入新的4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷与之反应。此过程重复9次。由图3可以看出，固载β-葡萄糖苷酶在9次连续反应之后保持了90％的活性，保持了较高的催化活性。
为了进一步证明本发明的有益效果，发明人采用实施例1～10得到的固载β-葡萄糖苷酶进行纤维二糖的水解，具体试验方法如下：
将可溶性β-葡萄糖苷酶(以下简称可溶性酶)和固载β-葡萄糖苷酶分别与纤维二糖在60℃下反应5小时，控制β-葡萄糖苷酶与纤维二糖的质量比为1:10，间隔30分钟测量纤维二糖的水解率，测试结果见表1。
表1纤维二糖水解试验结果
由表1可见，实施例1～10得到的固载β-葡萄糖苷酶在30分钟内使纤维二糖的水解率达到了65％以上，60分钟内基本使纤维90％以上达到水解，90分钟内使纤维二糖达到完全水解。而可溶性β-葡萄糖苷酶在前3小时内，纤维二糖的水解速度较慢，4小时才使纤维二糖全部水解。说明采用本发明方法固载后的β-葡萄糖苷酶对水解纤维二糖具有更好的高效性和实用性。
Claims (5)
1.一种交联聚合固载β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：将β-葡萄糖苷酶完全溶解于20mmol/L pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，加入氨基功能化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂微球，混合均匀，加入沉淀剂，常温震荡20～40分钟，离心洗涤，所得沉淀加入20mmol/L pH值为4.8的醋酸钠缓冲液中，再加入质量分数为50％戊二醛水溶液，所得混合液中戊二醛的质量分数为0.2％～1％，室温震荡1～5小时，离心洗涤，得到固载β-葡萄糖苷酶；
上述的氨基功能化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂微球的粒径为2～5μm，氨基功能化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂微球与β-葡萄糖苷酶的量比为1:0.2～0.8，β-葡萄糖苷酶与戊二醛的质量比为1:0.0005～0.01；其中沉淀剂为异丙醇、丙酮、饱和硫酸铵水溶液中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的交联聚合固载β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：所述的氨基功能化的聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂微球与β-葡萄糖苷酶的质量比为1:0.6。
3.根据权利要求1所述的交联聚合固载β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：所述的β-葡萄糖苷酶与戊二醛质量1:0.002～0.01。
4.根据权利要求1所述的交联聚合固载β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：所得混合液中戊二醛的质量分数为0.5％。
5.根据权利要求1所述的交联聚合固载β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：所述的沉淀剂为饱和硫酸铵水溶液。
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