CN109943557A - 一种固定化壳聚糖酶及其载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种固定化壳聚糖酶及其载体的制备方法，载体制备方法包括以下步骤：先将纳米二氧化钛加入无水乙醇中分散均匀，再加入3‑氨基丙基三乙氧基硅烷作为氨基化试剂，冰乙酸作为催化剂，搅拌反应、离心，所得沉淀用无水乙醇反复洗涤除去残留试剂，最后真空干燥，制备得到氨基化修饰纳米二氧化钛；再加入戊二醛中反应、离心，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤除去未反应的戊二醛，最后真空干燥，制备得到固定化壳聚糖酶载体。将上述制备得到的固定化壳聚糖酶载体与壳聚糖酶加入到碳酸盐缓冲液中，避光搅拌反应、离心，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤，除去所述固定化壳聚糖酶载体表面吸附的游离酶，最后冷冻干燥，制备得到固定化壳聚糖酶。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种固定化壳聚糖酶及其载体的制备方法。
背景技术
壳聚糖酶是一类专一性降解壳聚糖的糖苷键水解酶。该酶反应条件温和，可以通过控制反应时间来控制水解产物，大规模生产特定分子量壳聚糖以及壳寡糖。因而在医药、食品、化工、化妆品、生物医学工程等诸多领域具有深远的应用潜力。但由于游离的壳聚糖酶的稳定性较差，而且不可回收也不能长期保存，所以极大的限制了壳聚糖酶在实际生产中的广泛应用。
随着酶固定化技术的兴起，实现了酶的更高效应用，易于底物和产物的回收、易于纯化，更在一定程度上改进了生物催化剂的性能。这一技术为壳聚糖酶的应用开拓了更为广阔的应用前景。酶的固定化材料是制备出高效生物催化剂的关键。载体材料的结构和性能对固定化酶的性能有着巨大的影响。与其他固定化酶载体材料制备相比，纳米二氧化钛粒径均匀，表面具有丰富的羟基作为官能团，不仅能够大大提高载体的亲水性以及分散在水体系中的稳定性，更重要的是羟基经过活化后，能为生物大分子提供附着位点。因此，纳米二氧化钛有望成为固定化酶的优良材料。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、对纳米二氧化钛进行氨基化修饰：
先将纳米二氧化钛加入无水乙醇中分散均匀，再加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为氨基化试剂，冰乙酸作为催化剂，搅拌反应、离心，所得沉淀用无水乙醇反复洗涤除去残留试剂，最后真空干燥，制备得到氨基化修饰纳米二氧化钛；
S2、对氨基化修饰纳米二氧化钛进行戊二醛活化：
将步骤S1制备得到的氨基化修饰纳米二氧化钛加入浓度为0.5-5%的戊二醛中反应、离心，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤除去未反应的戊二醛，最后真空干燥，制备得到固定化壳聚糖酶载体。
其中，所述纳米二氧化钛与所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量摩尔比为100:1-3g/mol。
优选地，所述纳米二氧化钛与所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量摩尔比为100:1.5g/mol，100:2g/mol，100:2.5g/mol。
其中，所述纳米二氧化钛与所述冰乙酸的质量体积比为100:0.5-3g/L。
优选地，所述纳米二氧化钛与所述冰乙酸的质量体积比为100:1g/L，100:1.5g/L，100:2g/L，100:2.5g/L。
其中，所述氨基化修饰纳米二氧化钛与所述戊二醛的质量体积比为100:5-35g/L。
优选地，所述氨基化修饰纳米二氧化钛与所述戊二醛的质量体积比为100:10g/L，100:15g/L，100:20g/L，100:25g/L，100:30g/L。
其中，所述步骤S1中，搅拌反应的温度为45-75℃，时间为12-36h。
其中，所述步骤S2中，反应的温度为室温，时间为1-5h。
本发明第二方面提供了一种固定化壳聚糖酶的制备方法，将本发明第一方面提供的方法制备得到的固定化壳聚糖酶载体与壳聚糖酶加入到碳酸盐缓冲液中，避光搅拌反应、离心，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤，除去所述固定化壳聚糖酶载体表面吸附的游离酶，最后冷冻干燥，制备得到固定化壳聚糖酶。
其中，所述固定化壳聚糖酶载体与所述壳聚糖酶的质量比为100:5-30。
优选地，所述固定化壳聚糖酶载体与所述壳聚糖酶的质量比为100:10，100:15，100:20，100:25。
其中，所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.02mol/L，pH=9-10，所述固定化壳聚糖酶载体与所述碳酸盐缓冲液的质量体积比为100:5-20g/L。
其中，所述避光搅拌反应的温度为15-25℃，时间为1-24h。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的固定化壳聚糖酶载体，来源稳定，成本低廉；本发明利用商品化的纳米二氧化钛材料，其具有均匀的球形结构和粒径、良好的分散性，且表面富含大量羟基作为官能团。
(2)本发明提供的固定化壳聚糖酶是通过化学键的作用共价键合将壳聚糖酶与纳米二氧化钛载体牢固结合，不会因为过高浓度的底物或盐类的存在等原因而使酶分子从载体上脱落，克服了酶连接不紧密，生物相容性差等缺点，提高了固定化酶在储存和使用中的稳定性。
具体实施方式
以下是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1
本发明第一方面提供了一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、对纳米二氧化钛进行氨基化修饰：
先取100mg纳米二氧化钛加入20mL无水乙醇中搅拌1h使其分散均匀，再加入2mmol 3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为氨基化试剂，并加入1mL冰乙酸作为催化剂，在60℃温度下搅拌反应24h，再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用无水乙醇反复洗涤除去残留试剂，最后真空干燥，制备得到氨基化修饰纳米二氧化钛；
S2、对氨基化修饰纳米二氧化钛进行戊二醛活化：
取100mg步骤S1制备得到的氨基化修饰纳米二氧化钛加入20mL浓度为2.5%的戊二醛中，在室温下反应3h、再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤除去未反应的戊二醛，最后真空干燥，制备得到固定化壳聚糖酶载体。
本发明第二方面还提供了一种固定化壳聚糖酶的制备方法，取100mg上述方法制备得到的固定化壳聚糖酶载体与10mg壳聚糖酶加入到10mL浓度为0.01mol/L，pH值为9.5的碳酸盐缓冲液中，在25℃温度下避光搅拌反应2h、再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤，除去固定化壳聚糖酶表面吸附的游离酶，最后冷冻干燥，制备得到固定化壳聚糖酶。
经测试，实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶中酶的固载量为28.56mg/g，固定化壳聚糖酶的酶活性达到1248U/g，酶活性回收率为72.83%。
实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶水溶液的储存稳定性验证
取适量实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶与游离壳聚糖酶，分别保存在浓度为0.01mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，放置4℃冰箱中，每隔一周取样检测其酶活。
结果表明，在相同的储存条件下，固定化壳聚糖酶酶活力下降速度远远低于游离酶，在第四个星期，固定化壳聚糖酶保留酶活为78％，而游离壳聚糖酶保留酶活为35％。
实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶在使用中的稳定性验证
取适量实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶，加入45℃水浴保温的1％壳聚糖溶液中2小时，完成第一次反应，再控制转速6000r/min，离心15min，收集固定化壳聚糖酶，投入第二次反应；以此类推，一共完成十次反应，每完成一次反应取样检测其酶活。
结果表明，固定化壳聚糖酶在实际使用中比较稳定，在完成十次反应后保留酶活为82％，与游离壳聚糖酶相比，本实施例制备得到的固定化壳聚糖酶更加适合于特定分子量壳聚糖以及壳寡糖的大规模生产。
为了验证不同质量摩尔比的纳米二氧化钛与3-氨基丙基三乙氧基硅烷制备得到的固定化壳聚糖酶载体，对固定化壳聚糖酶酶的固载量、酶活、酶活性回收率及在水溶液中的储存稳定性和使用中稳定性影响，以实施例1为参考，控制其他试验、测试及验证参数和条件不变，通过调整纳米二氧化钛与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量摩尔比，设置第一组对比试验，如表1-3。
表1 不同配比对制备得到的固定化壳聚糖酶酶的固载量、酶活和酶活性回收率的影响
从表1-3中对比试验1-7可以看出，当纳米二氧化钛与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量摩尔比在100:1-3之间，采用制备得到的固定化壳聚糖酶载体制备得到的固定化壳聚糖酶酶的固载量、酶活、酶活性回收率及在水溶液中的储存稳定性和使用中的稳定性都较好，因此纳米二氧化钛与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量摩尔比优选在100:1-3之间。
为了验证不同质量比的固定化壳聚糖酶载体与壳聚糖酶制备得到的固定化壳聚糖酶酶的固载量、酶活、酶活性回收率及在水溶液中的储存稳定性和使用中稳定性影响，以实施例1为参考，控制其他试验、测试及验证参数和条件不变，通过调整固定化壳聚糖酶载体与壳聚糖酶的质量比，设置第二组对比试验，如表4-6。
表5 不同配比对制备得到的固定化壳聚糖酶在水溶液中的储存稳定性的影响
| 对比试验 | 固定化壳聚糖酶载体与壳聚糖酶的质量比 | 固定化壳聚糖酶在水溶液中保留的酶活力 |
| 对比试验1 | 100:0.5 | 43% |
| 对比试验2 | 100:1 | 48% |
| 对比试验3 | 100:5 | 72% |
| 对比试验4 | 100:10 | 78% |
| 对比试验5 | 100:20 | 81% |
| 对比试验6 | 100:30 | 76% |
| 对比试验7 | 100:40 | 63% |
| 对比试验8 | 100:50 | 59% |
表6 不同配比对制备得到的固定化壳聚糖酶在使用中稳定性的影响
| 对比试验 | 固定化壳聚糖酶载体与壳聚糖酶的质量比 | 固定化壳聚糖酶在使用中保留的酶活力 |
| 对比试验1 | 100:0.5 | 46% |
| 对比试验2 | 100:1 | 53% |
| 对比试验3 | 100:5 | 76% |
| 对比试验4 | 100:10 | 82% |
| 对比试验5 | 100:20 | 83% |
| 对比试验6 | 100:30 | 79% |
| 对比试验7 | 100:40 | 62% |
| 对比试验8 | 100:50 | 57% |
从表4-6中对比试验1-8可以看出，当固定化壳聚糖酶载体与壳聚糖酶的质量比在100:5-30之间，制备得到的固定化壳聚糖酶酶的固载量、酶活、酶活性回收率及在水溶液中的储存稳定性和使用中的稳定性都较好，因此固定化壳聚糖酶载体与壳聚糖酶的质量比优选在100:5-30之间。
实施例2
本发明第一方面提供了一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、对纳米二氧化钛进行氨基化修饰：
先取100mg纳米二氧化钛加入20mL无水乙醇中搅拌1h使其分散均匀，再加入1mmol 3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为氨基化试剂，并加入1.5mL冰乙酸作为催化剂，在50℃温度下搅拌反应15h，再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用无水乙醇反复洗涤除去残留试剂，最后真空干燥，制备得到氨基化修饰纳米二氧化钛；
S2、对氨基化修饰纳米二氧化钛进行戊二醛活化：
取100mg步骤S1制备得到的氨基化修饰纳米二氧化钛加入20mL浓度为1%的戊二醛中，在室温下反应2h、再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤除去未反应的戊二醛，最后真空干燥，制备得到固定化壳聚糖酶载体。
本发明第二方面还提供了一种固定化壳聚糖酶的制备方法，取100mg上述方法制备得到的固定化壳聚糖酶载体与5mg壳聚糖酶加入到10mL浓度为0.02mol/L，pH值为9的碳酸盐缓冲液中，在15℃温度下避光搅拌反应5h、再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤，除去固定化壳聚糖酶表面吸附的游离酶，最后冷冻干燥，制备得到固定化壳聚糖酶。
经测试，实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶中酶的固载量为27.68mg/g，固定化壳聚糖酶的酶活性达到1198U/g，酶活性回收率为71.43%。
实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶水溶液的储存稳定性验证
取适量实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶与游离壳聚糖酶，分别保存在浓度为0.01mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，放置4℃冰箱中，每隔一周取样检测其酶活。
结果表明，在相同的储存条件下，固定化壳聚糖酶酶活力下降速度远远低于游离酶，在第四个星期，固定化壳聚糖酶保留酶活为79％，而游离壳聚糖酶保留酶活为35％。
实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶在使用中的稳定性验证
取适量实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶，加入45℃水浴保温的1％壳聚糖溶液中2小时，完成第一次反应，再控制转速6000r/min，离心15min，收集固定化壳聚糖酶，投入第二次反应；以此类推，一共完成十次反应，每完成一次反应取样检测其酶活。
结果表明，固定化壳聚糖酶在实际使用中比较稳定，在完成十次反应后保留酶活为79％，与游离壳聚糖酶相比，本实施例制备得到的固定化壳聚糖酶更加适合于特定分子量壳聚糖以及壳寡糖的大规模生产。
实施例3
本发明第一方面提供了一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、对纳米二氧化钛进行氨基化修饰：
先取100mg纳米二氧化钛加入20mL无水乙醇中搅拌1h使其分散均匀，再加入2.5mmol3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为氨基化试剂，并加入0.5mL冰乙酸作为催化剂，在55℃温度下搅拌反应20h，再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用无水乙醇反复洗涤除去残留试剂，最后真空干燥，制备得到氨基化修饰纳米二氧化钛；
S2、对氨基化修饰纳米二氧化钛进行戊二醛活化：
取100mg步骤S1制备得到的氨基化修饰纳米二氧化钛加入20mL浓度为3%的戊二醛中，在室温下反应2.5h、再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤除去未反应的戊二醛，最后真空干燥，制备得到固定化壳聚糖酶载体。
本发明第二方面还提供了一种固定化壳聚糖酶的制备方法，取100mg上述方法制备得到的固定化壳聚糖酶载体与20mg壳聚糖酶加入到10mL浓度为0.02mol/L，pH值为10的碳酸盐缓冲液中，在20℃温度下避光搅拌反应10h、再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤，除去固定化壳聚糖酶表面吸附的游离酶，最后冷冻干燥，制备得到固定化壳聚糖酶。
经测试，实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶中酶的固载量为27.34mg/g，固定化壳聚糖酶的酶活性达到1256U/g，酶活性回收率为74.25%。
实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶水溶液的储存稳定性验证
取适量实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶与游离壳聚糖酶，分别保存在浓度为0.01mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，放置4℃冰箱中，每隔一周取样检测其酶活。
结果表明，在相同的储存条件下，固定化壳聚糖酶酶活力下降速度远远低于游离酶，在第四个星期，固定化壳聚糖酶保留酶活为81％，而游离壳聚糖酶保留酶活为35％。
实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶在使用中的稳定性验证
取适量实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶，加入45℃水浴保温的1％壳聚糖溶液中2小时，完成第一次反应，再控制转速6000r/min，离心15min，收集固定化壳聚糖酶，投入第二次反应；以此类推，一共完成十次反应，每完成一次反应取样检测其酶活。
结果表明，固定化壳聚糖酶在实际使用中比较稳定，在完成十次反应后保留酶活为79％，与游离壳聚糖酶相比，本实施例制备得到的固定化壳聚糖酶更加适合于特定分子量壳聚糖以及壳寡糖的大规模生产。
实施例4
本发明第一方面提供了一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、对纳米二氧化钛进行氨基化修饰：
先取100mg纳米二氧化钛加入20mL无水乙醇中搅拌1h使其分散均匀，再加入1.5mmol3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为氨基化试剂，并加入3mL冰乙酸作为催化剂，在65℃温度下搅拌反应25h，再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用无水乙醇反复洗涤除去残留试剂，最后真空干燥，制备得到氨基化修饰纳米二氧化钛；
S2、对氨基化修饰纳米二氧化钛进行戊二醛活化：
取100mg步骤S1制备得到的氨基化修饰纳米二氧化钛加入20mL浓度为4%的戊二醛中，在室温下反应3.5h、再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤除去未反应的戊二醛，最后真空干燥，制备得到固定化壳聚糖酶载体。
本发明第二方面还提供了一种固定化壳聚糖酶的制备方法，取100mg上述方法制备得到的固定化壳聚糖酶载体与25mg壳聚糖酶加入到10mL浓度为0.01mol/L，pH值为9的碳酸盐缓冲液中，在25℃温度下避光搅拌反应15h、再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤，除去固定化壳聚糖酶表面吸附的游离酶，最后冷冻干燥，制备得到固定化壳聚糖酶。
经测试，实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶中酶的固载量为26.38mg/g，固定化壳聚糖酶的酶活性达到1324U/g，酶活性回收率为74.25%。
实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶水溶液的储存稳定性验证
取适量实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶与游离壳聚糖酶，分别保存在浓度为0.01mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，放置4℃冰箱中，每隔一周取样检测其酶活。
结果表明，在相同的储存条件下，固定化壳聚糖酶酶活力下降速度远远低于游离酶，在第四个星期，固定化壳聚糖酶保留酶活为79％，而游离壳聚糖酶保留酶活为35％。
实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶在使用中的稳定性验证
取适量实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶，加入45℃水浴保温的1％壳聚糖溶液中2小时，完成第一次反应，再控制转速6000r/min，离心15min，收集固定化壳聚糖酶，投入第二次反应；以此类推，一共完成十次反应，每完成一次反应取样检测其酶活。
结果表明，固定化壳聚糖酶在实际使用中比较稳定，在完成十次反应后保留酶活为81％，与游离壳聚糖酶相比，本实施例制备得到的固定化壳聚糖酶更加适合于特定分子量壳聚糖以及壳寡糖的大规模生产。
实施例5
本发明第一方面提供了一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、对纳米二氧化钛进行氨基化修饰：
先取100mg纳米二氧化钛加入20mL无水乙醇中搅拌1h使其分散均匀，再加入3mmol 3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为氨基化试剂，并加入2mL冰乙酸作为催化剂，在70℃温度下搅拌反应30h，再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用无水乙醇反复洗涤除去残留试剂，最后真空干燥，制备得到氨基化修饰纳米二氧化钛；
S2、对氨基化修饰纳米二氧化钛进行戊二醛活化：
取100mg步骤S1制备得到的氨基化修饰纳米二氧化钛加入20mL浓度为5%的戊二醛中，在室温下反应4h、再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤除去未反应的戊二醛，最后真空干燥，制备得到固定化壳聚糖酶载体。
本发明第二方面还提供了一种固定化壳聚糖酶的制备方法，取100mg上述方法制备得到的固定化壳聚糖酶载体与30mg壳聚糖酶加入到10mL浓度为0.01mol/L，pH值为10的碳酸盐缓冲液中，在15℃温度下避光搅拌反应20h、再控制转速6000r/min，离心15min，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤，除去固定化壳聚糖酶表面吸附的游离酶，最后冷冻干燥，制备得到固定化壳聚糖酶。
经测试，实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶中酶的固载量为27.79mg/g，固定化壳聚糖酶的酶活性达到1356U/g，酶活性回收率为73.94%。
实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶水溶液的储存稳定性验证
取适量实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶与游离壳聚糖酶，分别保存在浓度为0.01mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，放置4℃冰箱中，每隔一周取样检测其酶活。
结果表明，在相同的储存条件下，固定化壳聚糖酶酶活力下降速度远远低于游离酶，在第四个星期，固定化壳聚糖酶保留酶活为76％，而游离壳聚糖酶保留酶活为35％。
实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶在使用中的稳定性验证
取适量实施例1制备得到的固定化壳聚糖酶，加入45℃水浴保温的1％壳聚糖溶液中2小时，完成第一次反应，再控制转速6000r/min，离心15min，收集固定化壳聚糖酶，投入第二次反应；以此类推，一共完成十次反应，每完成一次反应取样检测其酶活。
结果表明，固定化壳聚糖酶在实际使用中比较稳定，在完成十次反应后保留酶活为83％，与游离壳聚糖酶相比，本实施例制备得到的固定化壳聚糖酶更加适合于特定分子量壳聚糖以及壳寡糖的大规模生产。
需要说明的是，本发明采用的纳米二氧化钛的粒径为250-300纳米，从江沪钛白公司购买。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都是属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、对纳米二氧化钛进行氨基化修饰：
先将纳米二氧化钛加入无水乙醇中分散均匀，再加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为氨基化试剂，冰乙酸作为催化剂，搅拌反应、离心，所得沉淀用无水乙醇反复洗涤除去残留试剂，最后真空干燥，制备得到氨基化修饰纳米二氧化钛；
S2、对氨基化修饰纳米二氧化钛进行戊二醛活化：
将步骤S1制备得到的氨基化修饰纳米二氧化钛加入浓度为0.5-5%的戊二醛中反应、离心，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤除去未反应的戊二醛，最后真空干燥，制备得到固定化壳聚糖酶载体。
2.根据权利要求1所述的一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，其特征在于：所述纳米二氧化钛与所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量摩尔比为100:1-3g/mol。
3.根据权利要求1所述的一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，其特征在于：所述纳米二氧化钛与所述冰乙酸的质量体积比为100:0.5-3g/L。
4.根据权利要求1所述的一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，其特征在于：所述氨基化修饰纳米二氧化钛与所述戊二醛的质量体积比为100:5-35g/L。
5.根据权利要求1-4中任意一项权利要求所述的一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，搅拌反应的温度为45-75℃，时间为12-36h。
6.根据权利要求1-4中任意一项权利要求所述的一种固定化壳聚糖酶载体的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，反应的温度为室温，时间为1-5h。
7.一种固定化壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：将权利要求1-6中任意一项权利要求制备得到的固定化壳聚糖酶载体与壳聚糖酶加入到碳酸盐缓冲液中，避光搅拌反应、离心，所得沉淀用蒸馏水反复洗涤，除去所述固定化壳聚糖酶载体表面吸附的游离酶，最后冷冻干燥，制备得到固定化壳聚糖酶。
8.根据权利要求7所述的一种固定化壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述固定化壳聚糖酶载体与所述壳聚糖酶的质量比为100:5-30。
9.根据权利要求7所述的一种固定化壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.02mol/L，pH=9-10，所述固定化壳聚糖酶载体与所述碳酸盐缓冲液的质量体积比为100:5-20g/L。
10.根据权利要求7所述的一种固定化壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述避光搅拌反应的温度为15-25℃，时间为1-24h。
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