CN103602655A - 巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶及其制法与该固定化酶合成1，3-丙二醇的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶及其制法和利用固定化酶合成1，3-丙二醇的方法及专用设备。所述固定化酶包括多酶和固定该多酶的巯基改性二氧化钛纳米纤维载体。所述固定化酶的制法包括用静电纺丝制备二氧化钛纳米纤维；在该纤维中加巯烃基硅烷偶联剂溶液；再加戊二醛溶液和多酶即可。利用所述固定化酶合成1，3-丙二醇的方法是将固定化酶与惰性填料混合，通入底物反应液并控制反应液的pH、流速和反应温度，充分反应即可。本发明的优点是该固定化酶载体孔隙率高、比表面积大、巯基与酶亲合力强，提高酶的负载量、催化活性与稳定性；在合成1，3-丙二醇中酶使用效率高，反应充分，同时该专用设备设计合理且易于制造。

Description

巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶及其制法与该固定化酶合成1,3-丙二醇的应用
技术领域
本发明涉及一种纳米纤维固定化酶及其制备方法和该固定化酶的应用，尤其涉及巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶及其制备方法和利用该固定化酶合成1，3-丙二醇的方法及专用设备。 
背景技术
随着酶固定化技术的不断深入，固定用载体也随之推陈出新，不再局限于用传统的无机材料（高岭土、硅藻土、氧化铝、硅胶等）或者多糖类材料（壳聚糖类、纤维素类、葡聚糖类）为载体，而趋向于选择提高固定化酶性能的新型功能性材料为载体，比如纳米材料、磁性材料、离子液体、环境pH敏感载体等。 
纳米材料的种类很多，有纳米粒子、纳米介孔材料、纳米纤维和纳米管。其中电纺纤维由于具有较大的比表面积和较小的底物扩散阻力等优势，快速发展成为固定化酶的优异载体材料。电纺纳米纤维尺寸一般在80nm到1.50μm之间，与尺度较小的纳米颗粒固定化酶所催化的液相催化过程相比，纳米纤维固定化酶解决了液相反应过程扩散阻力较大、难于回收等不足，再加上纳米纤维的高比表面积带来的高酶负载，突出了它在固定化酶载体材料应用中的潜能。同时，静电纺丝技术作为简便可控合成二氧化钛纳米纤维的一种新型手段，通过调节静电纺丝技术参数和纺丝溶液组成成分，容易实现对纳米纤维的直径、组成、形貌等进行精细调控，获得长径比大、比表面积高、高孔隙率、分等级的纳米结构，如C、ZnO、SiO2、Fe2O3、TiO2、WO3、Al2O3等静二氧化钛纳米纤维，该纳米纤维可以更好地应用到酶分子固定和纳米酶反应器制备。 
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种负载量大、稳定性高的巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶； 
本发明的第二目的是提供上述巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶的制备方法； 
本发明的第三目的是利用上述巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶合成1，3-丙二醇的方法； 
本发明的第四目的是提供上述巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶合成1，3-丙二醇中的专用设备。 
技术方案：本发明所述的巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶，包括多酶和用于固定该多酶的巯基改性二氧化钛纳米纤维载体；所述巯基改性二氧化钛纳米纤维载体是将二氧化钛纳米纤维分散于乙醇中，在超声条件下加入巯烃基硅烷偶联剂溶液，搅拌，洗涤，所获得巯基改性的二氧化钛纳米纤维。 
其中，所述多酶为基因工程大肠杆菌多酶、克雷伯杆菌的多酶或者木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的混合溶液。 
本发明所述的巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶的制备方法，包括如下步骤： 
（1）用静电纺丝制备二氧化钛纳米纤维； 
（2）将二氧化钛纳米纤维分散于乙醇中，在超声条件下加入巯烃基硅烷偶联剂溶液，搅拌，洗涤，获得巯基改性的二氧化钛纳米纤维； 
（3）向巯基改性的二氧化钛纳米纤维中依次加入戊二醛溶液和多酶溶液，振荡，抽滤，得到巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶。 
其中，步骤（2）中，加入的巯烃基硅烷偶联剂溶液浓度为10～30g/L，二氧化钛纳米纤维与巯烃基硅烷偶联剂重量比为0.5～3.0：1，室温搅拌时间为20～30小时。 
步骤（3）中，加入的戊二醛浓度为2～10g/L，多酶溶液浓度为10～50mg/mL，巯基改性二氧化钛纳米纤维与多酶和戊二醛重量比为2～10：1：0.2～1.0，振荡时间为2～5小时，且得到的巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶于2～5℃贮存在密封袋中。 
步骤（1）中，用静电纺丝制备二氧化钛纳米纤维具体为在10-18kV的静电压下，将电纺溶液以0.2～0.6ml·h-1流速纺丝，烧结、去除高分子模板，即得二氧化钛纳米纤维；其中，所述烧结温度为500～650℃，烧结时间为3～6小时，所述电纺溶液由用量比为10～12mL：3～5mL：3～5mL：500～550mg的乙二醇、钛酸异丙酯、草酸和聚乙酸乙烯酯组成。 
本发明所述的利用巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶合成1，3-丙二醇中的方法，向巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶中通入底物反应液并控制反应液的pH、流速和反应温度，充分反应即可得到1，3-丙二醇。 
其中，可以先将巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶与惰性填料混合，再向其中通底物反应液；所述惰性填料为活性炭、石英砂、空心玻璃珠、硅胶粒或氧化铝瓷球；控制所述底物反应液pH为8～9，流速为0.2～0.6mL·min-1，反应温度为25℃～42℃。 
反应机理：TiO2二氧化钛纳米纤维作为载体，其孔隙率高、比表面积大、可以减少 酶分子在纤维上的扩散阻力；在纤维表面组装巯基，获得裸露在纤维表面的功能团，由于巯基带电，通过静电作用和共价作用，巯基与酶分子亲合力好，吸附大量酶分子并将其牢牢固定在纤维上。正是由于纳米纤维的高比表面积带来的高酶负载量和巯基改性增强的高稳定性相结合的固定化体系，将底物甘油转化生成1，3-丙二醇。 
本发明所述的巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶合成1，3-丙二醇中的专用设备，包括纳米多酶反应器，该反应器包括上下端开口的壳体，壳体两端口内侧各设过滤网，壳体内壁上设有保温层；其中，所述纳米多酶反应器是用作巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶催化底物反应液生成1，3-丙二醇的反应器。 
其中，该专用设备还包括底物反应装置和检测装置，其中，底物反应装置通过进液管与反应器下端连通，并在进液管上安装微量化学泵和阀门；反应器上下端与检测装置进出口相互连通，形成循环管路，从检测装置下端出口的管路上延伸一道支路，该支路与管路的交叉处安装三通阀，并在支路上设产物收集装置，同时，该三通阀与检测装置之间安装流量控制阀。 
工作原理：预先在纳米多酶反应器中装入巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶和惰性填料，开启微量化学泵，底物反应液从反应器下端进入，充分反应后产物从反应器上端出料，进入检测装置，调整流量控制阀和三通阀，检测合格的产物沿支路进入产物收集装置，不合格的产物重新进入反应器反应。 
有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点为：1、本发明提供的巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶，以TiO2纳米纤维作为载体，通过在其表面组装巯基获得裸露在TiO2纳米纤维表面的巯基功能团；采用巯基改性的TiO2电纺纳米纤维作为固定化酶的载体，其一能够利用纳米纤维高孔隙率、大比表面积的特性，其二巯基通过静电作用、共价作用与酶分子结合，与酶亲合力高、使酶分子固定，因此能够有效改善固定化酶传质阻力大、酶分子易脱落等缺点，显著提高固定化酶的负载量、催化活性与稳定性。2、在纳米多酶反应器中巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶催化合成1，3-丙二醇，该反应器能够充分发挥纳米纤维孔隙高率的特点，减小底物扩散阻力，酶在载体上的负载量大、附着力强，酶的使用效率提高，成本降低，为催化反应提供了有利条件，便于反应的充分进行，从而实现重要生物基化学品1,3-丙二醇的高效、连续生产；同时，该专用设备结构紧凑、设计合理且易于制造，不仅可以有效控制反应条件，检测反应状况，还能通过循环使反应充分进行。 
附图说明
图1为利用本发明巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶合成1，3-丙二醇中的专用设备的结构示意图。 
具体实施方式
一、本发明所述的巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶，包括多酶和用于固定该多酶的巯基改性二氧化钛纳米纤维载体；其中，该载体是将二氧化钛纳米纤维分散于乙醇中，在超声条件下加入巯烃基硅烷偶联剂溶液，搅拌，洗涤，所获得巯基改性的二氧化钛纳米纤维；该多酶为基因工程大肠杆菌多酶、克雷伯杆菌的多酶或者木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的混合溶液等属于本领域常用的蛋白酶。 
二、本发明所述巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶的制备方法，包括以下步骤： 
实施例1 
（1）采用静电纺丝方法制备TiO2纳米纤维：电纺溶液由3mL钛酸异丙酯、3mL草酸、0.5g聚乙酸乙烯酯（PVAc）、10mL乙二醇组成，在10kV的静电压下，采用注射泵精确控制电纺溶液以0.2ml·h-1流速纺丝，纺丝静置24小时，在500℃烧结3小时，去除高分子模板，即得TiO2纳米纤维； 
（2）将10mgTiO2纳米纤维分散于18mL乙醇中，在超声条件下加入2mL的浓度为10g/L巯烃基硅烷偶联剂溶液（以任何溶剂配制得到的该溶液均可以使用），使得二氧化钛纳米纤维与巯烃基硅烷偶联剂重量比为0.5：1，室温搅拌20小时，过滤、水洗，即得巯基改性的TiO2纳米纤维； 
（3）向巯基改性的20mg TiO2纳米纤维中加入10mL Tris-HCl缓冲溶液，在超声条件下，先后加入1mL浓度为2g/L的戊二醛水溶液和1mL浓度为10mg/mL的多酶水溶液，摇床振荡2小时，减压抽滤，真空干燥，即得巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶。 
所述多酶溶液为等量的木瓜蛋白酶与胰蛋白酶共溶于Tris-HCl缓冲液。 
经检测，酶负载率为58%，负载量290mg·g-1。 
酶蛋白质含量测定采用Bradford法测定，以牛血清蛋白为标准蛋白。分光光度计检测负载前后溶液中的蛋白含量C0，Ct，计算出固定在载体巯基改性TiO2纳米纤维上的酶蛋白量，得到酶蛋白的负载率和负载量mg·g-1。 
Figure BDA0000399041840000041
式中m是载体巯基改性TiO2纳米纤维的质量(g)。 
对比例：方法步骤同本实施例，但是TiO2纳米纤维未通过巯基改性，得到的固定化酶酶负载率和负载量分别是52%和260mg·g-1。 
实施例2 
（1）采用静电纺丝方法制备TiO2纳米纤维：电纺溶液由5mL钛酸异丙酯、5mL草酸、0.55g聚乙酸乙烯酯（PVAc）、12mL乙二醇组成，在18kV的静电压下，采用注射泵精确控制电纺溶液以0.6ml·h-1流速纺丝，纺丝静置24小时，在650℃烧结6小时，去除高分子模板，即得TiO2纳米纤维； 
（2）将180mg TiO2纳米纤维分散于18mL乙醇中，在超声条件下加入2mL的30g/L巯烃基硅烷偶联剂溶液，使得二氧化钛纳米纤维与巯烃基硅烷偶联剂重量比为3：1，室温搅拌30小时，过滤、水洗，即得巯基改性的TiO2纳米纤维； 
（3）向巯基改性的500mg TiO2纳米纤维中加入6mL Tris-HCl缓冲溶液，在超声条件下，先后加入5mL浓度为10g/L的戊二醛水溶液和1mL浓度为50mg/mL的多酶水溶液，摇床振荡2小时，减压抽滤，真空干燥，即得巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶。 
所述多酶溶液来自基因工程大肠杆菌多酶液，其制作方法为基因工程大肠杆菌经过增殖培养，4000r/min离心，收集菌体，悬浮于生理盐水中，超声波细胞破碎，8000r/min离心，上清液透析盐析，溶于Tris-HCl缓冲溶液，得到基因工程大肠杆菌多酶液。 
经检测，酶负载率为85%，负载量85mg·g-1，检测方法同实施例1。 
对比例：方法步骤同本实施例，但是TiO2纳米纤维未通过巯基改性，得到的固定化酶酶负载率和负载量分别是75%和75mg·g-1。 
实施例3 
（1）采用静电纺丝方法制备TiO2纳米纤维：电纺溶液由4mL钛酸异丙酯、4mL草酸、0.52g聚乙酸乙烯酯（PVAc）、11mL乙二醇组成，在15kV的静电压下，采用注射泵精确控制电纺溶液以0.4ml·h-1流速纺丝，纺丝在580℃烧结5小时，去除高分子模板，即得TiO2纳米纤维； 
（2）将100mgTiO2纳米纤维分散于18mL乙醇中，在超声条件下加入2mL浓度为30g/L巯烃基硅烷偶联剂溶液，室温搅拌24小时，过滤、水洗，即得巯基改性的TiO2纳米纤维； 
（3）向巯基改性的200mg TiO2纳米纤维中加入10mL Tris-HCl缓冲溶液，在超声条件下，先后加入1mL浓度为8g/L的戊二醛水溶液和1mL浓度为25mg/mL的多酶水溶液，摇床振荡2小时，减压抽滤，真空干燥，即得巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶。 
所述多酶溶液为来自克雷伯杆菌的多酶液。其制作方法为克雷白杆菌经过增殖培养，4000r/min离心，收集菌体，悬浮于生理盐水中，超声波细胞破碎，8000r/min离心，上清液透析盐析，溶于Tris-HCl缓冲溶液，得到克雷伯杆菌多酶液。 
经检测，酶负载率为92%，负载量115mg·g-1，检测方法同实施例1。 
对比例：方法步骤同本实施例，但是TiO2纳米纤维未通过巯基改性，得到的固定化酶的负载率和负载量分别是82%和102mg·g-1。 
三、利用本发明巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶制备1,3-丙二醇并考察在不同条件下1,3-丙二醇的产率。 
如图1，利用巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶制备1,3-丙二醇的专用设备包括纳米多酶反应器1、底物反应装置2、检测装置3和产物收集装置9，其中，该反应器包括壳体11，壳体11两端口内侧各设过滤网12，壳体11内壁上设有保温层13，并预先在纳米多酶反应器1中装入巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶和惰性填料硅胶粒，其中，固定化酶为克雷伯杆菌的多酶，固定化酶与惰性填料硅胶粒的体积比为1：2，另外，惰性填料还可以是活性炭，石英砂，空心玻璃珠或氧化铝瓷球。在底物反应装置2内装有底物反应液，开启微量化学泵4，底物反应液按一定流速通过进液管6从反应器下端进入反应器中，开启反应器的保温系统，控制温度，充分反应的产物从反应器上端出料，沿出料管7进入检测装置3，取样检测判断产物是否合格，然后调节流量控制阀5控制流速，开启三通阀8，调节液体流向，如果产物合格，则产物沿支路进入产物收集装置9，如果产物不合格，则沿出料管7重新进入反应器中反应。 
其中，底物反应液为含甘油200mM、NAD+2mM、VB1215μM、(NH4)2SO430mM、(NH4)2Fe(SO4)21μM、Mg2+1.7mM、柠檬酸1.1mM的pH8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液。该缓冲液被专利号为2010102223716的发明专利所公开。 
多酶催化甘油合成1,3-丙二醇的反应条件为底物反应液pH为8.0～9.0，流速为0.2～0.6mL·min-1，反应温度为25℃～42℃。 
1.底物反应液流速对1,3-丙二醇产出的影响 
控制纳米多酶反应器1的温度在37℃；底物反应液pH为8.5；调节底物反应液流速，考察底物反应液流速对1,3-丙二醇产出的影响，结果见表1，其中，1,3-丙二醇浓度利用气相色谱法测定。 
表1底物反应液流速对1,3-丙二醇产出的影响 
Figure BDA0000399041840000071
其中，1,3-丙二醇含量测定方法采用气相色谱分析。 
由表1可知，以0.3mL·min-1的流速启动反应，反应开始15分钟时，取样分析1,3-丙二醇含量已达到19.31g·L-1，连续反应12小时内，产物溶液中1,3-丙二醇含量维持在一个较高的产出水平。但24小时后，产物溶液中1,3-丙二醇含量下降到在60%～70%左右。以0.2mL·min-1的流速启动反应，因为流速慢，底物反应液流经固定化酶床层分布不均匀，1,3-丙二醇产出波动较大、不稳定。 
2.底物反应液pH对1,3-丙二醇产出的影响 
控制纳米多酶反应器温度为37℃；底物反应液0.3mL·min-1；分别用pH8.0、8.5和9.0的Tris-HCl缓冲液调节底物反应液pH，考察底物反应液pH对1,3-丙二醇产出的影响。12h取样分析，结果见表2。 
表2底物反应液pH对1,3-丙二醇产出的影响 
底物反应液pH 1,3-丙二醇含量g·L-1
8.0 14.57
8.5 18.93
9.0 11.66
由表2可知，底物反应液pH为8.5时，1,3-丙二醇产出较高，说明介质酸碱度影响酶分子与TiO2纳米纤维间的相互作用，pH对多酶的催化活性影响较大。 
3.反应温度对1,3-丙二醇产出的影响 
底物反应液pH为8.5；底物反应液0.3mL·min-1；控制反应器温度分别为25℃、37℃、42℃时，考察反应温度对1,3-丙二醇产出的影响。12h取样分析，结果见表3。 
表3温度对1,3-丙二醇产出的影响 
反应温度℃ 1,3-丙二醇含量g·L-1
25 1.18
37 19.27
42 18.32
由表3可知，经巯基改性TiO2纳米纤维固定的克雷白杆菌多酶液，在37℃至42℃温度范围内，固定酶的热稳定性好，利于纳米酶反应器的连续稳定生产。 
4.巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶稳定性考察 
底物反应液pH为8.5；底物反应液0.3mL·min-1；纳米多酶反应器1的温度37℃；考察4℃储存的巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶的催化活性。12h取样分析，结果见表4。 
表4巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶的稳定性考察 
储存时间 1,3-丙二醇含量g·L-1
24小时 18.56
10天 16.91
30天 13.94
以上连续化生产1，3-丙二醇结果表明，以巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶制备的固定化酶，反应活性高，连续反应12小时，产物溶液中1,3-丙二醇含量维持在一个较高的产出水平。储藏稳定性好，4℃储藏30天后，还保留有75%左右的酶活。 

Claims (10)

1.一种巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶，其特征在于：包括多酶和用于固定该多酶的巯基改性二氧化钛纳米纤维载体；所述巯基改性二氧化钛纳米纤维载体是将二氧化钛纳米纤维分散于乙醇中，在超声条件下加入巯烃基硅烷偶联剂溶液，搅拌，洗涤，所获得巯基改性的二氧化钛纳米纤维。 
2.根据权利要求1所述巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶，其特征在于：所述多酶为基因工程大肠杆菌多酶、克雷伯杆菌多酶或者木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的混合溶液。 
3.一种制备权利要求1所述巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶的方法，其特征在于包括如下步骤： 
（1）用静电纺丝制备二氧化钛纳米纤维； 
（2）将二氧化钛纳米纤维分散于乙醇中，在超声条件下加入巯烃基硅烷偶联剂溶液，搅拌，洗涤，获得巯基改性的二氧化钛纳米纤维； 
（3）向巯基改性的二氧化钛纳米纤维中依次加入戊二醛溶液和多酶溶液，振荡，抽滤，得到巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶。 
4.根据权利要求3所述制备巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶的方法，其特征在于：步骤（2）中，加入的巯烃基硅烷偶联剂溶液浓度为10～30g/L，二氧化钛纳米纤维与巯烃基硅烷偶联剂重量比为0.5～3.0：1，室温搅拌时间为20～30小时。 
5.根据权利要求3所述制备巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶的方法，其特征在于：步骤（3）中，加入的戊二醛溶液浓度为2～10g/L，多酶溶液浓度为10～50mg/mL，巯基改性二氧化钛纳米纤维与多酶和戊二醛重量比为2～10：1：0.2～1.0，振荡时间为2～5小时。 
6.根据权利要求3所述制备巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶的方法，其特征在于：步骤（1）的具体制备方法为在10-18kV的静电压下，将电纺溶液以0.2～0.6ml·h-1流速纺丝，烧结、去除高分子模板，即得二氧化钛纳米纤维；其中，所述烧结温度为500～650℃，烧结时间为3～6小时，所述电纺溶液由用量比为10～12mL：3～5mL：3～5mL：500～550mg的乙二醇、钛酸异丙酯、草酸和聚乙酸乙烯酯组成。 
7.一种利用权利要求1所述巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶合成1，3-丙二醇中的方法，其特征在于：向巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶中通入底物反应液并控制反应液的pH、流速和反应温度，充分反应即可得到1，3-丙二醇。 
8.根据权利要求7所述的利用巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶合成1，3-丙二醇中的方法，其特征在于：先将巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶与惰性填料混合，再向其中通底物反应液；所述惰性填料为活性炭、石英砂、空心玻璃珠、硅胶粒或氧化铝瓷球中；控制所述底物反应液pH为8～9，流速为0.2～0.6mL·min-1，反应温度为25℃～42℃。 
9.一种利用巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶合成1，3-丙二醇中的专用设备，其特征在于：包括纳米多酶反应器（1），该反应器包括上下端开口的壳体（11），壳体（11）两端口内侧各设过滤网（12），壳体（11）内壁上设有保温层（13）；其中，所述纳米多酶反应器（1）是用作巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶催化底物反应液生成1，3-丙二醇的反应器。 
10.根据权利要求9所述利用巯基改性二氧化钛纳米纤维固定化酶合成1，3-丙二醇中的专用设备，其特征在于：还包括底物反应装置（2）和检测装置（3），其中，底物反应装置（2）通过进液管（6）与反应器下端连通，并在进液管上安装微量化学泵（4）和阀门；反应器上下端与检测装置（3）进出口相互连通，形成循环管路，从检测装置（3）下端出口的管路上延伸一道支路，该支路与管路的交叉处安装三通阀（8），并在支路上设产物收集装置（9），同时，该三通阀（8）与检测装置（3）之间安装流量控制阀（5）。 
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