CN112980807A - 一种基于dna与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于DNA与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法,属于固定化酶制备领域。本发明步骤:首先制备出金属有机骨架材料PCN‑222纳米粒子和单链DNA(ssDNA)功能化的葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP);其次配制好分散均匀的氧化石墨烯(GO)溶液;之后再将PCN‑222纳米粒子、GOX‑ssDNA复合物、HRP‑ssDNA复合物与GO溶液共同孵育;通过ssDNA的Janus粒子性质即核酸碱基与GO芳香域的π‑π堆积作用和磷酸骨架与PCN‑222上金属锆簇的配位作用将双酶固定在双载体上,构建固定多酶系统。本发明克服了传统固定化酶吸附效率不高和结合不牢固的问题,制备过程简单,级联效率高。
Description
技术领域
本发明属于固定化多酶系统制备技术领域,具体涉及通过单链DNA(ssDNA)的Janus粒子性质,利用其核酸碱基与氧化石墨烯(GO)的π-π堆积作用及磷酸骨架与PCN-222中金属锆簇的配位作用将酶固定的方法。
背景技术
酶是一种高选择性、低污染且反应条件温和的天然高效催化剂。在自然界,我们常可以在细胞代谢过程中观察到大量的酶级联反应。由于这种多酶级联系统可以通过消除反应中间体的繁琐分离和纯化直接降低生产成本,提高生产效率,因而被广泛用于食品加工、医药合成、生物能源、污染物降解等工业生产中。多酶复合物,酶的活性位点靠在一起,通过将中间体从一个活性位点转移到另一个活性位点促进底物沿着多酶复合物中的酶促途径转移,可以有效提高总反应效率。将多种酶添加到同一反应容器中,可以在体外进行多步酶促合成。但仅仅只是将级联酶放在一个溶液中,由于酶在溶液中自由分散,底物与之反应是随机的,且底物从一个反应位点到另一个反应位点存在扩散转移时间,级联反应效率不高。除此之外,酶以最直接的方式存在于溶液中,回收和再利用困难,使得生产成本高、操作稳定性差,大大限制了酶的工业应用。对酶进行固定化可以有效解决上述问题。将不同的酶通过共固定化连接到同一个载体上,一方面有效模拟了细胞系统中的多酶复合物,简化操作步骤,提高了原子利用率;另一方面载体的使用不仅可增强多酶在储存及极端反应条件下(高温、强酸、强碱等)的稳定性,而且有利于分离与回收。
传统固定化酶方法中,吸附法是最早出现的酶固定化方法,包括离子吸附法和物理吸附法,主要利用范德华力、氢键、疏水相互作用静电吸附和离子键等将酶固定在非水溶性载体上。由于吸附法工艺简便、条件温和、基本不改变酶的构象,因此对酶的催化活性影响小,而且载体廉价易得可再生,故常被用来进行酶的固定化。但该法中酶和载体之间结合不牢固,在极端条件下,酶易从载体脱落并污染产物。除此之外,包埋法不适用底物为大分子的酶;交联法和共价结合法由于反应剧烈而使酶活性损失较大等。因此,需要进一步研究固载量大、酶活性好和催化效率高的固定化酶体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于ssDNA的Janus粒子性质,利用其核酸碱基与氧化石墨烯(GO)的π-π堆积作用及磷酸骨架与PCN-222中金属锆簇的配位作用将酶固定在双载体上的方法,以克服传统吸附法酶易脱落及双酶级联反应效率不高的问题。本发明的人造多酶系统制备简单,条件温和,酶催化反应效率高,且具有良好的稳定性和重复使用性。本发明以葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)为模型来证明固定化酶体系的优良性能。
该方法首先制备出金属有机骨架材料PCN-222纳米粒子,其次合成GOX-ssDNA复合物及HRP-ssDNA复合物,再将上述三者与GO共同孵育,依靠ssDNA的Janus粒子性质将酶固定在双载体上。
为了达到上述目的,本发明按照以下技术方案实现:
一种基于DNA与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)称取八水氧氯化锆和内消旋-四(4-羧基苯基)卟吩于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中超声溶解,而后加入二氯乙酸搅拌均匀。将溶液转移至反应釜,在130℃下反应18h得到深紫色晶体和黄色母液。八水氧氯化锆、内消旋-四(4-羧基苯基)卟吩、DMF和二氯乙酸的质量比为76:13:30800:780。通过离心(11500rpm,20min)收集纳米晶体,然后与DMF进行三次溶剂交换,将得到的PCN-222纳米粒子用乙醇和buffer A交替清洗两次,离心(11500rpm,20min)移去废液,加入buffer A分散均匀,于4℃环境中待用。
(2)进一步,称取葡萄糖氧化酶(GOX)加入buffer A涡旋至完全溶解;称取4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(suflo-SMCC)用buffer A超声溶解,并加入到上述GOX溶液中;suflo-SMCC和GOx的质量比为1:2;将混合液放置于摇床中,在37℃下孵育2h;反应结束后,混合物用10K超滤管过滤洗涤6次(10min/次,8100xg),除去未反应的suflo-SMCC。将ssDNA采用buffer A涡旋至完全溶解;称取三(2-羧乙基)膦(TCEP)加入buffer A超声溶解,并加入到上述ssDNA溶液中;ssDNA和TCEP的质量比为33:104;将混合液放置于摇床中,在37℃下孵育2h;反应结束后,混合物用3K超滤管过滤洗涤6次(20min/次,8100xg),除去未参加反应的TCEP。将过滤好的GOX溶液和ssDNA溶液混合,于摇床孵育12h(29℃,400rpm);反应结束后,用10K超滤管过滤洗涤6次(10min/次,8100xg),除去未反应的ssDNA,得到的GOX-ssDNA复合物保存于4℃环境中待用。
(3)进一步,HRP-ssDNA复合物的制备方法与GOX-ssDNA复合物相同,除了将GOX换成HRP。
(4)进一步,称取GO于buffer A中超声分散均匀。
(5)进一步,取步骤(1)中制备的PCN-222储备液、步骤(2)、(3)中制备的酶-单链DNA复合物(GOX-ssDNA:HRP-ssDNA =1:1)和步骤(4)中配制的GO溶液,在摇床中孵育3h(29℃,400rpm);PCN-222、GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物和GO的质量比为200:17:17:180;反应结束后,将反应液离心(11500rpm,25min),移去上清液;用buffer A将产物洗涤2次(3mL/次),离心(11500rpm,20min)得到固定化双酶(PCN-222@GO@GOx@HRP),将其浸泡在buffer A中,保存在4℃下备用。
进一步,步骤(1)中所述的buffer A为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液,10mM,pH7.4,0.1M NaCl。
进一步,步骤(2)中所述的ssDNA的序列为5′-SH-CTCCAGGCGCGCTCTCTCACCCGT-3′;
进一步,制备的固定多酶系统中酶-DNA复合物(GOX-ssDNA,HRP-ssDNA)分布在薄片状的GO和棒状的PCN-222之间;
进一步,制备的PCN-222纳米粒子直径为100nm;
进一步,所述的固定多酶系统较好的保持了酶的催化活性,并且其催化效率高于传统酶固定化方法;
进一步,所述的固定多酶系统中的天然酶为GOX和HRP,此固定方法不仅可以扩展到其他酶及双载体构成的酶级联系统,还可以扩展到其他载体中,具有广泛的应用范围。
本发明的优点在于:
(1)ssDNA是一种物理化学高度稳定的生物分子,不仅具有良好的机械刚性、生物相容性和可编程性,而且在酶的固定化过程中能保持酶的生物特异性和构型不变。
(2)固定化方法简单温和高效。酶通过双功能试剂与巯基修饰的ssDNA复合后,利用ssDNA的Janus性质,即磷酸骨架与PCN-222中金属锆簇的配位作用及核酸碱基与GO不饱和芳香域的π-π堆积作用进行双酶固定。固定过程中不涉及酶的化学改性,充分保持酶活性和稳定性。
(3)显著提高了酶级联反应效率。本实验所使用的载体均具有高比表面积,可提高酶固载量,为酶级联反应提供更多的活性位点;GO的使用有利于提高电子传输速率进而促进级联反应电子转移,提高酶催化效率。
(4)有效改善了传统吸附法中酶易脱落的问题。PCN-222的使用增加了配位作用使酶与载体间的结合更牢固,有利于重复使用。
(5)本发明以GOX和HRP为模型酶,可广泛应用于不同类型的单酶或多酶固定,是一种通用型制备策略。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明,但并不构成对本发明的限制。
实施例1:金属有机骨架——PCN-222纳米粒子的合成。
向八水氧氯化锆(0.47mmol)和内消旋-四(4-羧基苯基)卟吩(32.8μmol)中加入DMF(0.84mol)超声溶解,而后加入二氯乙酸(12.0mmol)并用玻璃棒搅拌均匀。将溶液转移至反应釜,在130℃下反应18h得到深紫色晶体和黄色母液;八水氧氯化锆、内消旋-四(4-羧基苯基)卟吩、DMF和二氯乙酸的质量比为76:13:30800:780;通过离心(11500rpm,20min)收集纳米晶体,然后与DMF进行三次溶剂交换,将得到的PCN-222纳米粒子用乙醇和buffer A交替清洗两次,离心(11500rpm,20min)移去废液,加入buffer A分散均匀,于4℃环境中待用。
实施例2:酶-ssDNA复合物(GOX-ssDNA、HRP-ssDNA)的制备。
将GOX溶液(10mg mL-1,500μL)和suflo-SMCC溶液(5mg mL-1,500μL)混合,于摇床中孵育2h(37℃,400rpm);suflo-SMCC和GOx的质量比为1:2;反应结束后,混合物用10K超滤管过滤洗涤6次(10min/次,8100xg),除去未反应的suflo-SMCC。将1OD ssDNA(24base)离心(6min,12000rpm)后,加入buffer A涡旋至完全溶解;将ssDNA(0.11mg mL-1,300μL)和TCEP(0.87mg mL-1,120μL)混合,于摇床中孵育2h(37℃,400rpm);ssDNA和TCEP的质量比为33:104;反应结束后,混合物用3K超滤管过滤洗涤6次(20min/次,8100xg),除去未参加反应的TCEP。将过滤好的GOX溶液和ssDNA溶液混合,于摇床孵育12h(29℃,400rpm)。反应结束后,用10K超滤管过滤洗涤6次(10min/次,8100xg),除去未反应的ssDNA,将得到的GOX-ssDNA复合物保存于4℃环境中待用。HRP-ssDNA复合物的制备方法与GOX-ssDNA复合物相同,除了将GOX换成HRP。
实施例3:基于DNA与氧化石墨烯和PCN-222间相互作用构建固定多酶系统。
(1)PCN-222的合成和GOX-ssDNA、HRP-ssDNA的制备:同实施例1和实施例2。
(2)将实施例1中制备的PCN-222和实施例2中制备的GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物与GO溶液混合,置于摇床中孵育3h(29℃,400rpm);PCN-222、GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物和GO的质量比为200:17:17:180;反应结束后,将反应液离心(11500rpm,25min),移去上清液。用buffer A将产物洗涤2次(3mL/次),离心(11500rpm,20min)得到固定化的双酶(PCN-222@GO@GOx@HRP),将其均匀分散在buffer A中,保存在4℃下备用。
实施例4:固定多酶系统的条件优化及动力学考察
(1)ssDNA的碱基比例及长度,PCN-222和GO的用量,PCN-222、GO和酶-ssDNA复合物的加入顺序及孵育时间均对人造多酶系统的活性和稳定性有影响,因此本发明对制备固定多酶系统的反应条件进行了考察。
(2)将PCN-222(0.16mg mL-1)或GO(0.5mg mL-1)储备液(20μL)分别和FAM标记的不同DNA(50nM,980μL)溶液于摇床(29℃,400rpm)中孵育15min或30min。离心(14000rpm,6min)得到含有未结合ssDNA的上清液,在激发波长485nm、发射波长525nm下检测并比较处理前后荧光强度的变化。实验中所使用的FAM标记的DNA碱基序列:(a)不同碱基优化:A24、T24、C24、DNA1;(b)不同长度:12、24、36、48bases;(c)不同比例:DNA1(C:G:T:A=1:2:1:2)与DNA2(C:G:T:A=5:2:2:1)。分析结果表明,ssDNA碱基比例为C:G:T:A=5:2:2:1,碱基长度为24时,达到酶的最大固载量。
(3)将PCN-222(2mg)与制备的酶-ssDNA复合物(质量比GOX-ssDNA:HRP-ssDNA=1:1,总酶量0.34mg)混合,使最终反应体积为3mL,于摇床(29℃,400rpm)中孵育3h。反应结束后离心(12000rpm,20min),将所得产物用buffer A清洗两次(3mL/次)。而后加入3mL系列浓度梯度的GO(0,0.075,0.15,0.30,0.60,1.20mg mL-1)溶液,于摇床(29℃,400rpm)中孵育3h。反应结束后离心(12000rpm,20min),将所得产物用buffer A清洗两次(3mL/次)。向反应产物加入3mL buffer A并分散均匀。为了检测酶活性,取10μL固定化酶溶液,加入1mL 10mM葡萄糖(GLU)和0.25mM 2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)的底物混合溶液,于摇床(37℃,400rpm)中孵育10min。反应结束后离心(10000rpm,5min),用紫外可见分光光度计(UV-vis)检测反应液在415nm下的吸光度。PCN-222用量的考察与上述操作步骤基本相同。在最佳GO用量下,采用一系列浓度梯度的PCN-222溶液用于酶的固定化。分析结果显示,当GO用量为1.8mg,PCN-222用量为2mg时达到最佳的酶催化效率。随着GO用量的增加,酶的催化效率逐渐提高。在最佳GO用量下,随着PCN-222用量逐渐增加,酶的催化效率先快速增加然后趋于平缓,表明酶的固载量从不饱和逐渐接近饱和。
(4)采用(3)中的合成方法,在最佳条件下,即PCN-222、GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物和GO的质量比为200:17:17:180,改变PCN-222、GO和酶-ssDNA复合物(GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物)的加入顺序。将得到的固定化酶体系均匀分散在6mLbuffer A中;取10μL固定化酶溶液,加入1mL 10mM GLU和0.25mM ABTS的底物混合溶液,于摇床(37℃,400rpm)中孵育10min。反应结束后离心(10000rpm,5min),用UV-vis检测反应液在415nm下的吸光度。结果表明,当三者一同加入时酶活性最高。
(5)将制备的PCN-222溶液(2mg mL-1,1mL)、酶-单链DNA复合物溶液(GOX-ssDNA:HRP-ssDNA=1:1,0.68mg mL-1,500μL)和GO溶液(1.2mg mL-1,1.5mL)一同加入并混合,于摇床(29℃,400rpm)中孵育不同时间(0.5,1.0,1.5,2,3,4h);PCN-222、GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物和GO的质量比为200:17:17:180;反应结束后离心(11500rpm,20min),将所得固定化酶用buffer A清洗两次(3mL/次)并均匀分散在6mL buffer A中;取10μL固定化酶,加入1mL 10mM GLU和0.25mM ABTS的底物混合溶液,于摇床(37℃,400rpm)中反应10min。反应结束后离心(10000rpm,5min),用UV-vis检测反应液在415nm下的吸光度。
(6)在最佳固定化条件下对人造多酶系统进行动力学考察。根据米氏方程(Michaelis-Menten equation)分别考察人造多酶系统和自由酶(GOX&HRP)的动力学参数。以人造多酶系统中GOX为模型酶衡量对比封装酶和自由酶的动力学参数。人造多酶系统的米氏常数(Km)及最大反应速率(Vmax)分别为1.17mM和2.258×10-8M s-1,游离酶的(Km)和最大反应速率(Vmax)分别为1.49mM和1.012×10-8M s-1,表明与自由酶相比,该固定多酶系统具有较好的底物亲和性和较大的反应速率。
实施例5:固定多酶系统重复使用性测试
(1)固定多酶系统的制备:同实施例3。
(2)重复使用性考察:将得到的固定多酶系统均匀分散在6mL buffer A中;取固定化酶储备液(0.02mg,400μL)于5mL离心管中,离心(11500rpm,5min)移去上清液;加入1mL10mM GLU和0.25mM ABTS的底物混合溶液,于摇床(37℃,400rpm)中反应10min。反应结束后离心(10000rpm,5min)。
(3)用UV-vis测量产物上清液在415nm处的吸光度,(2)中的人造多酶系统用buffer A充分洗涤,去除其表面粘有的底物溶液,加入1mL 10mM GLU和0.25mM ABTS的底物混合溶液,摇床反应10min(37℃,400rpm),用UV-vis测量产物在415nm处的吸光度。反复批次催化1mL 10mM GLU和0.25mM ABTS的底物混合溶液,考察人造多酶系统的重复使用性。
(4)经考察,本发明制备的人造多酶系统拥有很好的重复使用性。重复使用12次后仍可保持原酶活性的77%;与传统的单载体多酶体系相比,本发明制备的人造多酶系统重复使用性优势明显。
实施例6:固定多酶系统用于葡萄糖检测
(1)固定多酶系统的制备:同实施例3。
(2)将得到的固定多酶系统均匀分散在6mL buffer A中,取一定量的固定化酶,分别加入50,75,100,200,300,400,500,750μM GLU、2.5mM ABTS和buffer A,将混合液置于摇床(37℃,400rpm)中反应10min。固定化酶溶液、不同浓度的GLU溶液、ABTS溶液和buffer A的体积比为1:80:10:9,总体积为1mL。反应结束后离心(10000rpm,5min),上清液分别用UV-vis测量415nm处的吸光度。
(3)将得到的吸光度与相应浓度的葡萄糖做线性拟合,表明葡萄糖浓度在50-750μM范围内时,固定多酶体系与葡萄糖浓度具有较好的线性关系(R2=0.999)。进一步对葡萄糖浓度进行分析,表明固定多酶体系对葡萄糖的检出限为5.26μM。实验结果表明,固定多酶体系具有较好的葡萄糖浓度响应性能,可将其应用于葡萄糖浓度的检测。
(4)取固定化酶与2.5mM ABTS、buffer A及不同底物溶液混合,置于于摇床(37℃,400rpm)中反应10min。固定化酶溶液、ABTS溶液、buffer A和不同底物溶液的体积比为1:10:9:80,总体积为1mL。反应结束后离心(10000rpm,5min),用UV-vis检测上清液在415nm下的吸光度。
(5)进一步,(4)中所用的不同底物溶液依次是:GLU(10mM);KCl(0.1M+10mM GLU);果糖(200mM);半乳糖(200mM);麦芽糖(200mM);蔗糖(200mM);抗坏血酸(200mM)和尿素(200mM)。实验表明,尽管干扰物质的浓度比葡萄糖浓度高20倍,但是基本上没有吸收值,然而制备的多酶系统催化葡萄糖具有较高的吸光度。进而表明,制备的固定多酶体系对葡萄糖具有较好的选择性。
Claims (9)
1.一种基于DNA与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)称取八水氧氯化锆和内消旋-四(4-羧基苯基)卟吩于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中超声溶解,而后加入二氯乙酸搅拌均匀;将溶液转移至反应釜,在130℃下反应18h;反应结束后通过离心收集纳米晶体;其中八水氧氯化锆、内消旋-四(4-羧基苯基)卟吩、DMF和二氯乙酸的加入质量比为76:13:30800:780;
(2)将(1)中得到的纳米晶体与DMF进行三次溶剂交换,并用乙醇和buffer A交替清洗两次,离心后加入buffer A分散均匀,得到PCN-222储备液保存于4℃环境中待用;
(3)(a)称取葡萄糖氧化酶(GOX)加入buffer A涡旋至完全溶解;称取4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(suflo-SMCC)用buffer A超声溶解,并加入到上述GOX溶液中;将混合液放置于摇床中,在37℃下孵育2h;反应结束后,混合物用10K超滤管过滤洗涤除去未反应的suflo-SMCC;步骤(3)中suflo-SMCC和GOx的质量比为1:2;
(b)将单链DNA(ssDNA)采用buffer A涡旋至完全溶解;称取三(2-羧乙基)膦(TCEP)加入buffer A超声溶解;将上述两者溶液混合放置于摇床中,在37℃下孵育2h;反应结束后,混合物用3K超滤管过滤洗涤除去未参加反应的TCEP;
(c)将步骤(a)和(b)中过滤好的GOX溶液和ssDNA溶液混合放置于摇床中,在29℃下孵育12h;反应结束后,用10K超滤管过滤洗涤除去未反应的ssDNA,得到的GOX-ssDNA复合物保存于4℃环境中待用;辣根过氧化物酶(HRP)-ssDNA复合物的合成方法同GOX-ssDNA复合物,除了将GOX换成HRP;
(4)称取氧化石墨烯(GO)于buffer A中超声分散均匀,保存于4℃环境中待用;
(5)将PCN-222、GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物、GO溶液混合放置于摇床中,在29℃下孵育3h,用buffer A润洗,得到基于Janus DNA的固定多酶系统。
2.按照权利要求1所述的一种基于DNA与氧化石墨烯和PCN-222间相互作用构建固定多酶系统的方法,其特征在于,步骤(2)所述的buffer A为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液,10mM,pH 7.4,0.1M NaCl。
3.按照权利要求1所述的一种基于DNA与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法,其特征在于,步骤(3)中suflo-SMCC和酶即GOx或HRP的质量比为1:2。
4.按照权利要求1所述的一种基于DNA与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法,其特征在于,步骤(3)中ssDNA的序列为5′-SH-CTCCAGGCGCGCTCTCTCACCCGT-3′。
5.按照权利要求1所述的一种基于DNA与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法,其特征在于,步骤(3)中ssDNA和TCEP的质量比为33:104。
6.按照权利要求1所述的一种基于DNA与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法,其特征在于,步骤(5)中GOX-ssDNA复合物、HRP-ssDNA复合物、PCN-222和GO的加入质量比为17:17:200:180。
7.按照权利要求1所述的一种基于DNA与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法,其特征在于,制备的酶-DNA复合物分布在薄片状GO和棒状PCN-222之间。
8.按照权利要求1所述的一种基于DNA与氧化石墨烯和金属有机骨架材料间相互作用构建固定多酶系统的方法,其特征在于,制备的PCN-222纳米粒子直径为100nm。
9.按照权利要求1-8任一项所述方法制备的固定多酶系统。
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