CN114433236A - 一种基于氯化血红素插层于金属有机骨架材料构建模拟酶的方法 - Google Patents

一种基于氯化血红素插层于金属有机骨架材料构建模拟酶的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于氯化血红素插层于金属有机骨架材料构建模拟酶的方法属于模拟酶构建技术领域，该方法首先合成由二维网络结构堆积形成的三维十字花状类沸石咪唑酯骨架化合物(ZIF‑L)，将其在水溶液中与血红素分子共同孵育，凭借疏水作用力驱动血红素分子吸附在ZIF‑L上，并进一步与层间的2‑甲基咪唑分子相互作用，使二维单元相互分离，得到血红素分子插层于ZIF‑L层间的ZIF‑L‑Hemin复合材料。该模拟酶的制作方法简单，所选取的载体对血红素分子活性有明显的激活作用，并且与天然辣根过氧化物酶有相似的催化机理。在温和条件下具有高催化活性、良好的稳定性和重复使用性，且易于从反应体系中分离。

Description

一种基于氯化血红素插层于金属有机骨架材料构建模拟酶的 方法
技术领域
本发明属于模拟酶构建技术领域，具体涉及一种基于血红素插层于金属有机骨架材料的模拟酶制备方法。
背景技术
酶是一种具有高特异性和高效率的天然催化剂。在生命体系中，几乎所有的生物催化反应都需要酶的参与。其中，过氧化物酶以血红素为活性中心，能在温和条件下利用双氧水(H2O2)对芳香族化合物进行氧化，被广泛应用于生物传感，临床医疗和环境检测等领域。然而天然过氧化物酶的蛋白质骨架易受到外界环境的影响，导致了稳定性差，成本高和催化效率低等问题。因此开发一种能大规模生产，对恶劣环境稳定，能长期储存的天然酶替代品十分重要。通过分析天然酶的活性位点，尝试构造与天然酶活性中心空间结构和化学性质相似的微环境，并将辅酶因子负载在载体上，重塑天然过氧化物酶活性位点来构建模拟酶可以有效解决上述问题。此类构建模拟酶的方法一方面有效模拟了酶的空间结构与空间效应，加深对天然酶进化历程的理解；另一方面载体稳定的结构使构建的模拟酶不仅能在极端反应条件下(高温、强酸、强碱等)下稳定，而且有利于催化剂的分离与回收。
血红素(hemin)分子是天然过氧化物酶的辅酶因子。在催化过程中，周围的蛋白质残基起到了关键作用。其中，血红素远端的组氨酸通过氢键帮助H2O2定位在活性中心，并加速血红素形成高价氧化态中间体Fe4+＝O。近端的组氨酸充当强电子给体，以“推动”效应稳定高价氧化态中间体。尽管目前已报道了一些利用DNA、多肽、蛋白质等材料与血红素组合以模拟天然辣根过氧化物酶的方法，但由于其仍然需要使用生物大分子，导致这些模拟酶具有较差的稳定性和重复使用性。因此，需要进一步探索易于制备稳定的、能从反应体系中分离的血红素载体材料。
发明内容
本发明的目的是构建一种与天然辣根过氧化物酶具有相似活性位点的具有高催化活性的类酶催化剂，以克服酶在复杂外界环境下易失活的缺点。该模拟酶的制作方法简单，所选取的载体对血红素分子活性有明显的激活作用，并且与天然辣根过氧化物酶有相似的催化机理。在温和条件下具有高催化活性、良好的稳定性和重复使用性，且易于从反应体系中分离。
该方法首先合成由二维网络结构堆积形成的三维十字花状类沸石咪唑酯骨架化合物(ZIF-L)，将其在水溶液中与血红素分子共同孵育，凭借疏水作用力驱动血红素分子吸附在ZIF-L上，并进一步与层间的2-甲基咪唑分子相互作用，使二维单元相互分离，得到血红素分子插层于ZIF-L层间的ZIF-L-Hemin复合材料。
一种基于氯化血红素插层于金属有机骨架材料构建模拟酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取六水合硝酸锌和2-甲基咪唑于水中超声溶解；将溶液混合均匀，在室温下反应30min；反应结束后通过离心收集类沸石咪唑酯骨架化合物(ZIF-L)晶体粉末；所述的六水合硝酸锌、2-甲基咪唑和水的加入摩尔比为1:8:555；
(2)称取氯化血红素，通过涡旋和超声将其溶于二甲基亚砜中；
(3)取步骤(1)中合成的ZIF-L粉末加入去离子水中，通过涡旋和超声分散均匀；
(4)取步骤(2)中获得的氯化血红素溶液滴加入步骤(3)中的ZIF-L水分散液中；血红素与ZIF-L的质量比为13:50；将混合溶液在室温条件下，磁力搅拌12h，在疏水作用力的驱动下血红素分子插入ZIF-L的层间；反应结束后，通过离心将产物从溶液中分离出来，并用DMSO清洗；在真空干燥箱中保存烘干，得到绿色的模拟酶粉末(ZIF-L-Hemin)。
进一步：步骤(2)中氯化血红素溶液的浓度为10mM。步骤(3)中所述的ZIF-L质量浓度为0.25mg/mL。步骤(4)中所述的氯化血红素溶液与ZIF-L的水分散液的体积比为1:100。步骤(4)中所述的离心参数为10000rpm，5min。
(1)称取0.1487g六水合硝酸锌和0.6587g 2-甲基咪唑，并分别超声溶解于4.5mL水中。随后将六水合硝酸锌溶液滴加入2-甲基咪唑溶液中，并将混合溶液在室温下用磁力搅拌30分钟。待反应结束后，通过离心(10000rpm，5min)将白色固体粉末产物从反应溶液中分离出来，并用去离子水清洗三次。在50℃真空干燥箱中烘干12h，得到ZIF-L粉末。
(2)进一步，称取6.5mg氯化血红素，随后通过涡旋和超声，将其溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中。
(3)取2.5mg步骤(1)中合成的ZIF-L粉末加入10mL去离子水中，通过涡旋和超声分散均匀。
(4)取100μL步骤(2)中获得的氯化血红素溶液滴加入步骤(3)中的ZIF-L水分散液中。将混合溶液在室温条件下，磁力搅拌12h，在疏水作用力的驱动下血红素分子插入ZIF-L的层间。反应结束后，通过离心(10000rpm，5min)将产物从溶液中分离出来，并用DMSO清洗三次。在50℃真空干燥箱中保存12h烘干，得到绿色的模拟酶粉末(ZIF-L-Hemin)。
进一步，步骤(1)中所述的锌离子与2-甲基咪唑的摩尔比为1:8；
进一步，步骤(3)中所述的ZIF-L质量不高于2.5mg，是溶液pH低于血红素分子去质子化的pH条件。
进一步，步骤(4)中DMSO与水的比例为1:100，以保证血红素分子疏水性吸附在ZIF-L上；
进一步，步骤(4)中离心后的上清液中不含血红素分子，ZIF-L对血红素的负载率为100％。
进一步，制备的ZIF-L与模拟酶ZIF-L-Hemin均为十字花形，轴向长度为1μm；
进一步，血红素分子插层在ZIF-L的二维平面之间，在插层过程中ZIF-L层间游离的2-甲基咪唑被释放，得到的ZIF-L-Hemin表面呈现明显裂痕；
进一步，血红素分子与ZIF-L的二维平面上的未完全配位的2-甲基咪唑配位，形成五配位和六配位共存的三价铁离子；
进一步，所合成的ZIF-L-Hemin催化机理与天然过氧化物酶相似，为乒乓反应过程，并存在稳定的高价铁中间体。
本发明的优点在于：
(1)在常温条件下，水溶液即可合成ZIF-L-Hemin，方法简单、温和、经济、环保，血红素分子在水溶液中自发嵌入ZIF-L中，负载效率高达100％；
(2)以2-甲基咪唑模拟组氨酸提供血红素分子轴向配体且为H2O2结合提供氢键，以锌离子代替精氨酸提供正电荷，能有效模拟天然辣根过氧化物酶活性位点微环境，充分激活血红素分子的催化活性。
(3)在没有生物大分子参与的情况下模拟了天然酶为血红素所提供的微环境，受益于稳定的ZIF-L框架结构，所制备的ZIF-L-Hemin具有优秀的物理化学稳定性；
(4)所构筑的模拟酶ZIF-L-Hemin相对于天然酶在更宽的温度范围内具有稳定的催化活性，且以微粒形式存在，具有良好的长期储存稳定与可回收性；
(5)此方法所构筑的模拟酶具有高催化活性与催化稳定性，可适应用于如食品加工、医药合成、生物能源、污染物降解等多种场景下的催化反应。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1：类沸石咪唑酯骨架化合物(ZIF-L)的合成。
称取0.1487g六水合硝酸锌和0.6587g 2-甲基咪唑，并分别超声溶解于4.5mL水中。随后将六水合硝酸锌溶液滴加入2-甲基咪唑溶液中，并将混合溶液在室温下用磁力搅拌30分钟。待反应结束后，通过离心(10000rpm，5min)将白色固体粉末产物从反应溶液中分离出来，并用去离子水清洗三次。在50℃真空干燥箱中保存12h，得到ZIF-L粉末。
实施例2：ZIF-L-Hemin模拟酶的制备。
称取6.5mg氯化血红素，随后通过涡旋和超声，将其溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，得到氯化血红素溶液。取2.5mg实施例1中合成的ZIF-L粉末加入10mL去离子水中，通过涡旋和超声分散均匀，得到ZIF-L的水分散液。取100μL氯化血红素溶液滴加入中的ZIF-L水分散液中。将混合溶液在室温条件下，磁力搅拌12h，在疏水作用力的驱动下血红素分子插入ZIF-L的层间。反应结束后，通过离心(10000rpm，5min)将产物从溶液中分离出来，并用DMSO清洗三次。在50℃真空干燥箱中烘干，得到绿色的模拟酶粉末(ZIF-L-Hemin)。
实施例3：ZIF-L-Hemin模拟酶活性与动力学考察
(1)ZIF-L-Hemin模拟酶的制备：同实施例2。
(2)配制溶液：50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(HEPES)，将其pH调节至7.0，并加入氯化钾，氯化钾的最终浓度为0.1M。5mM 2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)水溶液，5mM 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液，5mM邻苯二胺(OPD)水溶液和10mM H2O2水溶液。1mg/mL ZIF-L-Hemin水分散液。
(3)向样品管中加入100μL ZIF-L-Hemin水分散液，700μL HEPES缓冲溶液，100μLH2O2水溶液，并分别加入100μL ABTS、TMB、OPD溶液和10mM H2O2水溶液，配制成A、B、C三份混合溶液。在25℃的条件下避光反应5分钟，最后利用紫外可见分光光度计分别记录溶液A、B、C在200-800nm处的紫外-可见光吸收光谱图。分析结果表明，溶液A、B、C均出现了对应的氧化产物峰。证明ZIF-L-Hemin与天然过氧化物酶相似，能在温和条件下氧化芳香化合物。
(4)以TMB和H2O2为底物对ZIF-L-Hemin模拟酶进行动力学考察。测试TMB的米氏常数时，向样品管中加入100μL ZIF-L-Hemin水分散液，700μL HEPES缓冲溶液，100μL TMB(0.15，0.2，0.3，0.4，0.8，1.2，1.6mM)溶液和100μL H2O2(1.6mM)溶液。测试H2O2的米氏常数时，向样品管中加入100μL ZIF-L-Hemin水分散液，700μL HEPES缓冲溶液，100μL TMB(1.6mM)溶液和100μL H2O2(0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.5，3.2mM)溶液。将上述混合溶液在25℃的条件下避光反应5分钟，最后利用紫外可见分光光度计检测654nm处的吸光度，依此判定显色产物浓度。根据米氏方程(Michaelis-Menten equation)分别计算模拟酶对TMB和H2O2的动力学参数。结果表明，ZIF-L-Hemin对TMB和H2O2的米氏常数(Km)分别为0.90mM和1.72mM，最大反应速率(Vmax)分别为4.64×10-7和6.41×10-7M·s-1。表明模拟酶ZIF-L-Hemin具有较好的底物亲和性和较大的反应速率。
实施例4：ZIF-L-Hemin模拟酶重复使用性及稳定性考察
(1)ZIF-L-Hemin模拟酶的制备：同实施例2。
(2)重复使用性考察：向样品管中加入100μL ZIF-L-Hemin水分散液，700μL HEPES缓冲溶液，100μL H2O2水溶液(10mM)和100μL TMB溶液(5mM)。将上述混合溶液在25℃的条件下避光反应5分钟。
(3)反应结束后通过离心(10000rpm，1min)分离上清液与ZIF-L-Hemin，并将分离得到的固体用去离子水清洗后在此进行上述条件下的催化反应，重复十次。最后利用紫外可见分光光度计检测每次分离后上清液在654nm处的吸光度，依此判定显色产物浓度。
(4)经考察，本发明制备的ZIF-L-Hemin模拟酶具有很好的重复使用性。重复使用15次后仍可保持原模拟酶活性的94％，本发明制备的封装酶体系易于从反应体系中分离，重复使用性及易回收的特性使其具有很大优势。
(5)热稳定性考察：100μL实施例2中合成的ZIF-L-Hemin模拟酶水分散液(1mg/mL)和游离的自由辣根过氧化物酶分别在70℃中孵育0，15，30，45，60，75，90min，考察高温模拟酶活性的影响。孵育结束后，封装酶体系中分别加入700μL HEPES缓冲溶液，100μL H2O2水溶液(10mM)和100μL TMB溶液(5mM)，将上述混合溶液在25℃的条件下避光反应5分钟。待反应结束，用紫外可见分光光度计测量654nm处的吸光度。分析结果表明，模拟酶和自由酶的活性随热孵育时间的延长而降低，但模拟酶与自由酶相比具有较好的热稳定性。在孵育90分钟后，模拟酶依然保留了94％的初始模拟酶的活性，但游离酶的活性几乎观察不到。
(6)有机溶剂稳定性考察：100μL实施例2中合成的ZIF-L-Hemin模拟酶水分散液(1mg/mL)和游离的自由辣根过氧化物酶分别在浸泡在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、丙酮、乙醇、异丙醇、乙二醇和乙腈中，在37℃温度下孵育2小时，考察有机溶剂对模拟酶ZIF-L-Hemin活性的影响。孵育结束后，加入700μL HEPES缓冲溶液，100μL H2O2水溶液(10mM)和100μL TMB溶液(5mM)。将上述混合溶液在25℃的条件下避光反应5分钟。利用紫外可见分光光度计检测每次分离后上清液在654nm处的吸光度，依此判定显色产物浓度。测试结果表明，ZIF-L-Hemin模拟酶可以保持原酶活性的90％以上的初始活性，但游离酶的活性均低于40％。
(7)100μL实施例2中合成的ZIF-L-Hemin粉末以固体状态在室温条件下储存一周，通过显色反应观察每天ZIF-L-Hemin的活性变化。活性检测步骤:储存结束后，将上述粉末分散于水中制备成1mg/mL的分散液。取100μL ZIF-L-Hemin水分散液，加入700μL HEPES缓冲溶液，100μL H2O2水溶液(10mM)和100μL TMB溶液(5mM)。将上述混合溶液在25℃的条件下避光反应5分钟。利用紫外可见分光光度计检测每次分离后上清液在654nm处的吸光度，依此判定显色产物浓度。分析结果表明，在储存7天后，ZIF-L-Hemin未观测出明显的活性变化。
实施例6：ZIF-L-Hemin模拟酶用于环境水样中的放射性元素(铀)检测。
(1)铀在水中主要以铀酰离子(UO2 2+)形式存在。铀酰离子能与咪唑配位，阻断ZIF-L的咪唑与血红素之间的相互作用，从而抑制ZIF-L-Hemin的催化活性。基于这种抑制作用，能通过吸光度变化测定水溶液中UO2 2+浓度。
(2)ZIF-L-Hemin模拟酶的制备：同实施例2。
(3)硝酸铀酰离子的标准曲线的绘制：首先称取UO2(NO3)2·6H2O配制一系列浓度的UO2 2+标准溶液。将ZIF-L-Hemin(50μL，1mg/mL)加入含有HEPES缓冲溶液(550μL，pH 7.0，0.5M，0.1M KCl)、TMB(200μL，10mM)、H2O2(100μL，10mM)和100μL一系列浓度的UO2 2+(2.5，5，10，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000μM)的溶液中，进行显色反应。反应温度为25℃，反应时间为3分钟。反应结束后，在紫外可见分光光度计中测量混合物的在654nm处的吸光度A1。初始吸光度A0被定义为0mM UO2 2+时的信号强度。由抑制作用引起的吸光度差值是用初始吸光度A0减去A1得到的，记作△A。将得到的△A与反应体系中的UO2 2+浓度(0.25，0.5，1，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μM)做线性拟合，表明UO2 2+浓度在0.25-40μM范围内，吸光度差值与UO2 2+浓度具有较好的线性关系(R2＝0.992)。进一步对UO2 2+浓度进行分析，表明基于ZIF-L-Hemin模拟酶的比色法对UO2 2+检出限为0.079μM。
(4)共存离子的影响：为了探究ZIF-L-Hemin对UO2 2+是否具有良好的选择性，在实验中，选取了海水中常见的离子(Li+,Na+,K+,Ni+,Ag+,Mg2+,Ba2+,Ca2+,Zn2+,Fe3+,Br-,Cl-,I-和PO 3-)考察基于ZIF-L-Hemin模拟酶的比色法的抗干扰能力。将ZIF-L-Hemin(50μL，1mg/mL)分别加入含有HEPES缓冲溶液(550μL，pH 7.0，0.5M，0.1M KCl)、TMB(200μL，10mM)、H2O2(100μL，10mM)和100μL不同离子溶液(1mM)的混合溶液中。反应温度为25℃，反应时间为3分钟。反应结束后，在紫外可见分光光度计中测量混合物在654nm处的吸光度。实验表明，干扰离子对ZIF-L-Hemin模拟酶催化TMB的显色反应并没有明显的抑制效果，表明ZIF-L-Hemin模拟酶的比色法对UO2 2+具有良好的选择性。

Claims (5)

1.一种基于氯化血红素插层于金属有机骨架材料构建模拟酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取六水合硝酸锌和2-甲基咪唑于水中超声溶解；将溶液混合均匀，在室温下反应30min；反应结束后通过离心收集类沸石咪唑酯骨架化合物(ZIF-L)晶体粉末；所述的六水合硝酸锌、2-甲基咪唑和水的加入摩尔比为1:8:555；
(2)称取氯化血红素，通过涡旋和超声，将其溶于二甲基亚砜中；
(3)取步骤(1)中合成的ZIF-L粉末加入去离子水中，通过涡旋和超声分散均匀；
(4)取步骤(2)中获得的氯化血红素溶液滴加入步骤(3)中的ZIF-L水分散液中；血红素与ZIF-L的质量比为13:50；将混合溶液在室温条件下，磁力搅拌12h，在疏水作用力的驱动下血红素分子插入ZIF-L的层间；反应结束后，通过离心将产物从溶液中分离出来，并用DMSO清洗；在真空干燥箱中保存烘干，得到绿色的模拟酶粉末(ZIF-L-Hemin)。
2.按照权利要求1所述的一种基于氯化血红素插层于金属有机骨架材料构建模拟酶的方法，其特征在于:步骤(2)中氯化血红素溶液的浓度为10mM。
3.按照权利要求1所述的一种基于氯化血红素插层于金属有机骨架材料构建模拟酶的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的ZIF-L质量浓度为0.25mg/mL。
4.按照权利要求1所述的一种基于氯化血红素插层于金属有机骨架材料构建模拟酶的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的氯化血红素溶液与ZIF-L的水分散液的体积比为1:100。
5.按照权利要求1所述的一种基于氯化血红素插层于金属有机骨架材料构建模拟酶的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的离心参数为10000rpm，5min。
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