CN112553189B - 一种基于磁性层状双金属氢氧化物和酶-dna复合物构建多模式催化系统的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于磁性层状双金属氢氧化物和酶‑DNA复合物构建多模式催化系统的方法，属于多酶固定系统制备领域。本发明分为以下步骤：首先制备聚左旋多巴修饰的磁性微粒；之后将双金属氢氧化物(水滑石)原位修饰到磁性微球的表面得到具有核壳结构的磁性水滑石；最后，将通过双功能试剂交联法制备的DNA‑酶复合物与磁性水滑石共同孵育，通过化学吸附将酶固定到水滑石的表面，构建同时含有天然酶与模拟酶的多模式催化系统。本发明所制备的多模式催化系统制备过程相对简单且条件温和，级联催化活性高，易于从反应体系中分离且稳定性良好，可用于超灵敏传感分析。
Description
技术领域
本发明属于固定化多酶系统制备技术领域，具体涉及通过简单化学吸附将酶-DNA复合物固定到磁性层状双金属氢氧化物表面用于制备多模式催化系统的方法。
背景技术
生化反应的高效率源于自然界中级联反应的广泛使用。受该启发所开发的多模式催化系统，将酶的高活性、选择性与合成催化剂的耐用性结合在一起，可以有效避免繁琐的后处理过程、减少不稳定中间产物和副产物的积累并节约相关的时间和成本。然而，天然酶与合成催化剂反应参数的不同通常会导致其中一方在级联反应过程中失活。同时，由于两者在结构、尺寸、化学组成和活性位点的反应性上存在差异，如何将不同催化模块合理地整合到单个杂化纳米结构中而不影响其反应性和稳定性是一个巨大难题。迄今为止，已经出现了多种将天然酶与合成催化剂整合的策略，这些策略使用介孔二氧化硅、金属有机骨架(MOF)、还原氧化石墨烯和高分子聚合物等作为载体同时承载天然酶与模拟酶。然而，这些方法依旧存在载体与酶兼容性较差、活性位点暴露不足、异相反应性效率较低、传质阻力较大、固定方法繁琐以及回收困难等缺点，极大阻碍了它们在工业生产中的应用。因此，开发一种简单而通用的方法来构建稳定且高效的兼具化学和生物催化活性的双功能杂化催化剂仍然是一项重大挑战。
在可以用作酶载体的模拟酶候选者中，由交替的阳离子层M2+ 1-xM3+ x(OH)2 x+和水合的无机或有机阴离子中间层An-·zH2O组成的层状双氢氧化物(又称水滑石，LDH)由于其化学成分可调、横向尺寸可控、对环境无害且具有令人满意的催化活性等突出特性，目前已经受到了研究者的广泛关注。与传统的二维LDH相比，基于核壳结构的LDH基磁性复合材料具有独特的优势，它可以将多种功能组合到单一颗粒中，例如更大的比表面积和更好的分离能力。然而，LDH纳米片的自组装会显著减少其暴露的活性位点，从而降低催化性能；同时，它对于天然酶的固定效果也比较差。因此，需要在三维磁性水滑石的基础上进一步研究设计更高效的模拟酶-天然酶组装形式用于多模式催化系统的构建。本发明通过简单化学吸附将酶-DNA复合物固定到磁性水滑石的表面用于制备多模式催化系统，不仅避免了繁琐的锚定过程，还极大增强了多酶系统的催化活性；磁性核心的引入不但易于多酶反应器的分离，而且增大了水滑石的比表面积，提升了天然酶的负载量。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用磁性水滑石为载体用于构建多模式催化系统的方法，通过简单化学吸附，以单链DNA为桥梁，将天然酶固定到作为模拟酶的磁性水滑石表面。本发明的多模式催化系统制备过程简单，条件温和，催化活性高，稳定性和重复使用性好，且易于从反应体系中分离。
该方法以葡萄糖氧化酶(GOx)作为模型酶，首先通过双功能试剂交联策略制备酶-DNA复合物，再通过化学吸附将复合物固定到磁性水滑石的表面，构建磁性多模式催化系统。
为了达到上述目的，本发明按照以下技术方案实现：
一种基于磁性层状双金属氢氧化物和酶-DNA复合物构建多模式催化系统的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)称取Fe3O4纳米粒子分散于Tris溶液中(10mM)，加入左旋多巴(DOPA)，其中Fe3O4与DOPA与Tris溶液的质量比为1:1:300。常温下搅拌8小时后，用去离子水洗涤三次，得到聚左旋多巴改性的磁性复合材料PDOPA@Fe3O4。
(2)将(1)中合成的PDOPA@Fe3O4微球分散在去离子水中，加入稀硝酸和勃姆石，其中PDOPA@Fe3O4与勃姆石与去离子水的质量比为1:6:5，稀硝酸与去离子水的体积比为1:1，浓度为1M，然后在25℃下反应12h。反应结束后，分别用水和乙醇洗涤三次后获得勃姆石修饰的磁性粒子AlOOH@PDOPA@Fe3O4。
(3)将(2)中制备的AlOOH@PDOPA@Fe3O4与Ni(NO3)2·6H2O、NH4NO3和去离子水混合，其中AlOOH@PDOPA@Fe3O4与Ni(NO3)2·6H2O与NH4NO3与去离子水的质量比为1:0.29:0.12:100，机械搅拌30min后转移至高压反应釜中120℃下反应24h。反应结束后，分别用水和乙醇洗涤三次后获得，得到磁性水滑石(mLDHs)。
(4)向单链DNA中加入磷酸缓冲盐溶液，涡旋震荡至DNA完全溶解，再加入三(2-羧乙基)膦水溶液(TCEP，50mM)，其中每单位(OD)DNA对应的缓冲盐为100μL，缓冲溶液与TCEP水溶液的体积比为4:1，在37℃的摇床中反应1h。反应结束后，混合物用超滤管洗涤6次，24min/次，离心机转速为11000rpm，除去多余的TCEP和游离的硫醇。接下来，将GOx、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液中，其中每OD的DNA对应2mg GOx与400μL HEPES溶液，GOx与SPDP的质量比为1:1，涡旋混合均匀后，在25℃摇床中反应1h，使双官能试剂与蛋白质表面的赖氨酸残基充分反应。反应结束后，混合物用超滤管洗涤6次，12min/次，离心机转速为11000rpm，除去未反应的SPDP。之后，将以上制备的酶溶液与DNA溶液混合在一起，在37℃摇床中反应36h。反应结束后，混合物用超滤管洗涤6次，12min/次，离心机转速为11000rpm，除去未反应完全的单链DNA。其中，洗DNA所用的超滤管的规格为3kDa，洗酶和酶-DNA复合物所用的超滤管的规格为10kDa。得到的酶-DNA复合物(GOx-DNA)，保存在4℃冰箱中备用。
进一步，将步骤(3)中制备的mLDHs,和步骤(4)中制备的酶-DNA复合物以及HEPES缓冲溶液(25mM，pH＝5)在37℃摇床中反应2h，其中mLDHs与酶-DNA复合物与HEPES缓冲溶液的质量比为1:0.4:0.4，反应结束后用磁铁分离产物，用缓冲溶液洗涤三次，得到多模式催化系统(GOx-DNA@mLDHs)，保存在4℃下备用。
进一步，制备过程中所述的单链DNA的序列为：5’-SH-TGACTGGACCTCGATGAAGTCAAG-3’；
进一步，制备的多模式催化系统呈花状；
进一步，磁性四氧化三铁纳米粒子粒径为270nm，修饰PDOPA后的磁球粒径为300nm；磁性水滑石的粒径为530nm；
进一步，所述的多模式催化系统具有较好的磁响应性，在磁场的控制下易于从反应体系中分离；
进一步，所述的多模式催化系统细胞毒性较小，有利于避免使用过程中的“二次污染”；
进一步，所述的多模式催化系统中的天然酶为葡萄糖氧化酶，此方法能够扩展到其他酶与磁性水滑石组成的仿生多酶系统中，具有较好的通用性。
本发明的优点在于：
(1)通过化学吸附将酶-DNA超分子复合物固定到磁性载体上，避免了繁琐的锚定过程；
(2)酶通过单链DNA与NiAl水滑石之间的配位作用与载体相连，稳定性相比于简单吸附的酶更强；
(3)单链DNA作为连接天然酶与磁性水滑石之间的桥梁，可以使天然酶和作为模拟酶的水滑石的活性位点完全暴露，极大增强了多酶系统的催化活性；
(4)磁性核心的引入将传统二维水滑石转换为三维水滑石，不仅易于分离，还增大了比表面积来负载更多的天然酶；
(5)本发明以葡萄糖氧化酶作为模型酶，是一种通用型制备多模式催化系统的策略，可广泛应用于生化领域。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1：磁性水滑石(mLDHs)的制备
称取Fe3O4纳米粒子分散于Tris溶液中(10mM)，加入左旋多巴(DOPA)，其中Fe3O4与DOPA与Tris溶液的质量比1:1:300，为常温下搅拌8小时后，用去离子水洗涤三次，得到聚左旋多巴改性的磁性复合材料PDOPA@Fe3O4。接下来，将PDOPA@Fe3O4微球分散在去离子水中，加入稀硝酸和勃姆石，其中PDOPA@Fe3O4与勃姆石与去离子水的质量比为1:6:5，稀硝酸与去离子水的体积比为1:1，浓度为1M，然后在25℃下反应12h。反应结束后，分别用水和乙醇洗涤三次后获得勃姆石修饰的磁性粒子AlOOH@PDOPA@Fe3O4。将AlOOH@PDOPA@Fe3O4与Ni(NO3)2·6H2O、NH4NO3和去离子水混合，其中AlOOH@PDOPA@Fe3O4与Ni(NO3)2·6H2O与NH4NO3与去离子水的质量比为1:0.29:0.12:100，机械搅拌30min后转移至高压反应釜中120℃下反应24h。反应结束后，分别用水和乙醇洗涤三次后获得，得到磁性水滑石(mLDHs)。
实施例2：酶-DNA复合物(DNA-GOx)的制备
向单链DNA中加入磷酸缓冲盐溶液，涡旋震荡至DNA完全溶解，再加入三(2-羧乙基)膦水溶液(TCEP，50mM)，其中每单位(OD)DNA对应的缓冲盐为100μL，缓冲溶液与TCEP水溶液的体积比为4:1，在37℃的摇床中反应1h。反应结束后，混合物用超滤管洗涤6次，24min/次，离心机转速为11000rpm，除去多余的TCEP和游离的硫醇。接下来，将GOx、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液中，其中每OD的DNA对应2mg GOx与400μL HEPES溶液，GOx与SPDP的质量比为1:1，涡旋混合均匀后，在25℃摇床中反应1h，使双官能试剂与蛋白质表面的赖氨酸残基充分反应。反应结束后，混合物用超滤管洗涤6次，12min/次，离心机转速为11000rpm，除去未反应的SPDP。之后，将以上制备的酶溶液与DNA溶液混合在一起，在37℃摇床中反应36h。反应结束后，混合物用超滤管洗涤6次，12min/次，离心机转速为11000rpm，除去未反应完全的单链DNA。其中，洗DNA所用的超滤管的规格为3kDa，洗酶和酶-DNA复合物所用的超滤管的规格为10kDa。得到的酶-DNA复合物(GOx-DNA)，保存在4℃冰箱中备用。
实施例3：磁性水滑石化学吸附酶-DNA复合物用于制备多模式催化系统。
(1)磁性水滑石(mLDHs)和酶-DNA复合物的制备：同实施例1和实施例2。
(2)实施例1中制备的磁性水滑石、实施例2中制备的酶-DNA复合物和HEPES缓冲溶液(25mM，pH＝5)在37℃摇床中反应2h，其中mLDHs与酶-DNA复合物与HEPES缓冲溶液的质量比为1:0.4:0.4，反应结束后用磁铁分离产物，用缓冲溶液洗涤三次，得到多模式催化系统(GOx-DNA@mLDHs)，保存在4℃下备用。
实施例4：多模式催化系统的反应条件优化及动力学考察
(1)反应环境的pH和温度均对多模式催化系统的活性和稳定性有影响，因此本发明对制备的人造细胞的反应条件进行考察。
(2)分别制备pH为3、4、5、6、7、8、9和10的HEPES缓冲溶液，加入50mM葡萄糖和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，其中葡萄糖与TMB的摩尔比为50:1，得到不同pH的酶促底物。
(3)取GOx-DNA@mLDHs分别加入不同pH值的酶促底物，其中每1mL酶促底物对应0.25mg的GOx-DNA@mLDHs，37℃摇床反应10min后，磁铁分离催化系统，用紫外可见分光光度计测量上清液在652nm处的吸光度。考察pH值对催化体系影响，得到最优pH为5。
(4)取GOx-DNA@mLDHs分别加入酶促底物，其中每1mL酶促底物对应0.25mg的GOx-DNA@mLDHs，在不同温度下(20℃、30℃、37℃、40℃、50℃和60℃)摇床反应10min后，磁铁分离催化系统，用紫外可见分光光度计测量上清液在652nm处的吸光度。考察温度对固定化酶体系影响，得到最优温度为40℃。
(5)在最适条件下对GOx-DNA@mLDHs催化级联反应的动力学进行考察。根据Michaelis-Menten模型分别考察多模式催化系统和游离双酶(GOx和辣根过氧化物酶HRP)的动力学参数。多模式催化系统的米氏常数(Km)及最大反应速率(Vmax)分别为1.39mM和8.34×10-8M s-1，游离酶的Km和Vmax分别为3.13mM和3.85×10-8M s-1，表明与自由酶相比，该多模式催化系统具有较好的底物亲和性和较大的反应速率。
实施例5：多模式催化系统的重复使用性及稳定性测试
(1)多模式催化系统的制备：同实施例3。
(2)重复使用性考察：配制酶促底物溶液，加入到0.25mg实施例3中合成的GOx-DNA@mLDHs，40℃摇床中反应10min。
(3)孵育结束后，磁铁分离催化系统，用紫外可见分光光度计测量上清液在652nm处的吸光度，(2)中的多模式催化系统用HEPES缓冲液洗涤三次后，重新加入酶促底物溶液，40℃摇床反应10min，磁铁分离后用紫外可见分光光度计测量上清液在652nm处的吸光度。重复上述操作，记录每次反应的上清液吸光度，考察多模式催化系统的重复使用性。
(4)经考察，本发明制备的多模式催化系统拥有较好的重复使用性。重复使用20次后仍可保持原酶活性的91％；与其他多酶催化体系相比，本发明制备的多模式催化系统不仅易于分离，且重复使用性优异，有助于在实际应用中节约成本。
(5)热稳定性考察：将实施例3中合成的多模式催化系统和相同酶量的游离GOx/HRP(均分散于HEPES缓冲液，其中每100μL HEPES对应0.25mg的GOx-DNA@mLDHs)分别在60℃中孵育0，30，60，90和120min，考察高温对多模式催化系统活性的影响。孵育结束后，在多模式催化系统和游离酶系统中分别加入酶促底物溶液，37℃摇床反应10min，上清液和游离酶反应溶液分别用紫外可见分光光度计测量652nm处的吸光度。测试结果表明，多模式催化系统和游离酶的活性随热孵育时间的延长而降低，但本发明中制备的多模式催化系统与游离酶相比具有较好的热稳定性，在60℃中孵育120min后仍可分别保留原酶活性的54％，是同一条件下游离GOx/HRP活性的3.6倍。
储存稳定性考察：将实施例3中合成的多模式催化系统和相同酶量的游离葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶双酶(100μL)分别在冰箱中(4℃)和室温条件下(25℃)分别储存0，5，10，15，20，25，30，35、40天，考察不同储存条件对多酶系统活性的影响。储存结束后，将GOx-DNA@mLDHs和游离酶分别加入酶促底物溶液中，37℃摇床中反应10min，上清液和游离酶反应溶液分别用紫外可见分光光度计测量652nm处的吸光度。测试结果表明，GOx-DNA@mLDHs与游离酶相比具有较好的储存稳定性，在4℃储存40天后，多模式催化系统仍可保持原酶活性的76％，室温下储存40天后，仍可保持初始活性的47％，然而自由酶在相同条件下仅分别保留初始活性的44％和2％。
实施例6：多模式催化系统用于葡萄糖的比色传感。
(1)多模式催化系统的制备：同实施例3。
(2)1mg实施例3中合成的多模式催化系统，分别加入5，25，50，100，150，200，250μM葡萄糖和1mM TMB，40℃摇床反应10min。GOx-DNA@mLDHs用磁铁分离，上清液分别用紫外可见分光光度计测量652nm处的吸光度。
(3)将得到的吸光度与葡萄糖浓度做线性拟合，发现该多模式催化系统与葡萄糖浓度在5-250μM范围内具有较好的线性关系(R2＝0.9991)。通过三倍信噪比分析，计算葡萄糖检测的检出限为0.42μM。实验结果证明，本发明制备的多模式催化系统具有较好的葡萄糖浓度响应性能，可将其应用于实际样中葡萄糖浓度的检测。
Claims (6)
1.一种基于磁性层状双金属氢氧化物和DNA-酶复合物构建多模式催化系统的方法，其特征在于，为以下步骤：
（1）将聚左旋多巴改性的磁性复合材料PDOPA@Fe3O4分散在去离子水中，加入稀硝酸和勃姆石，然后在25 oC下反应12 h；反应结束后，分别用水和乙醇洗涤三次后获得勃姆石修饰的磁性粒子AlOOH@PDOPA@Fe3O4；接下来，将AlOOH@PDOPA@Fe3O4与Ni(NO3)2·6H2O、NH4NO3和去离子水混合，机械搅拌30 min后转移至高压反应釜中120 oC下反应24 h；反应结束后，分别用水和乙醇洗涤三次后获得，得到磁性层状双金属氢氧化物磁性水滑石，mLDHs；
（2）将（1）中合成的mLDHs与葡萄糖氧化酶-DNA复合物GOx-DNA分散到缓冲溶液中，通过简单化学吸附将酶-DNA复合物固定到磁性水滑石的表面，在37 oC下混合反应2 h，得到多模式催化系统。
2.根据权利要求1所述的构建多模式催化系统的方法，其特征在于：步骤（1）中勃姆石与PDOPA@Fe3O4的质量比为1:6，与去离子水的质量比为1:5，稀硝酸与去离子水的体积比为1:1，浓度为1 M；AlOOH@PDOPA@Fe3O4与Ni(NO3)2·6H2O与NH4NO3与去离子水的质量比为1:0.29:0.12:100。
3.根据权利要求1所述的构建多模式催化系统的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的磁性水滑石与的酶-DNA复合物的质量比为5:2。
4.根据权利要求1所述的构建多模式催化系统的方法，其特征在于：步骤（2）中DNA的使用量为1 OD对应2 mg GOx。
5.根据权利要求1所述的构建多模式催化系统的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的酶-DNA复合物中DNA的序列为5’-SH-TGACTGGACCTCGATGAAGTCAAG-3’。
6.根据权利要求1所述的构建多模式催化系统的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的缓冲溶液为25 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES，其pH= 5。
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