CN114410616B - 一种基于2d mof纳米材料和dna定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于2D MOF纳米材料和DNA定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法，其以核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P修饰的二维MOF纳米材料为载体，将酶与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子C结合，再固定于所述载体的探针上，即得固定化酶系统。本发明提供的固定化多酶系统具有高酶负载量、高催化活性、优异的稳定性和重复使用性。此外，本发明还实现了纳米材料载体功能与催化功能的一体化，简化了多酶共固定化的操作流程，并显著降低了用酶成本，可广泛应用于多种生化催化、医学分析、医疗器件等领域。
Description
技术领域
本发明属于固定化酶系统制备技术领域，具体涉及一种基于2D MOF纳米材料和DNA定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法。
背景技术
多酶系统是多步级联反应的高效催化剂，对于生物医学和工业生产具有重要意义。近年来，研究者们致力于探究新型载体材料和固定化方法，通过将多种酶共固定化，在实现多酶系统的复杂功能的同时，提高多酶的稳定性和重复使用性。然而，固定化多酶体系仍面临着两大难题：一方面，固定化后多酶活性位点受到破坏，造成酶活的大量损失，严重影响了级联反应的效率；另一方面，对于传统的载体，如SiO2纳米粒子、磁性纳米粒子、聚合物等，比表面积较小且易团聚，导致固定化后酶蛋白负载较低，限制了固定化酶的进一步应用。
DNA定向固定化技术是基于DNA分子杂交的一种新型固定化方法。由于DNA分子具有优越的生物相容性和机械刚性，制备的固定化酶系统往往具有良好的稳定性和耐受性。此外，不同于传统的固定化方法，DNA短链作为载体和酶分子之间连接的桥梁，能够保证酶分子活性位点的充分暴露，有利于与底物充分接触，提高催化反应的效率。近年来，金属有机骨架(MOFs)因其结构稳定性、可调性和大的比表面积引起了广泛关注。值得注意的是，二维MOF(2D MOF)纳米片Cu-TCPP(Fe)不仅是一种比表面大的优良载体，而且其自身具有类过氧化物酶性质，可以代替一种生物酶，在级联反应中发挥催化作用。
因此，本发明提供了一种基于2D MOF纳米材料和DNA定向固定化技术构建高催化效率、高酶负载的固定化多酶系统的方法。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高催化效率、高酶负载的固定化多酶系统的固定化酶系统。
本发明还要解决的技术问题是提供上述固定化酶系统的构建方法。
发明思路：本发明选用2D MOF纳米片Cu-TCPP(Fe)作为载体，同时利用其类过氧化酶性质，用以代替辣根过氧化物酶(HRP)，与葡萄糖氧化酶(GOD)形成级联反应。首先对2DMOF纳米片表面羧基进行活化，得到MOF-COOH；接着添加氨基化的探针DNA分子P进行反应，得到DNA分子修饰的纳米片MOF-DNA；在此基础上，通过DDI技术将GOD定向固定在纳米片表面，由此构建了MOF-DDI酶多酶固定化系统。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种固定化酶系统，以核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P修饰的具有类过氧化物酶性质二维MOF纳米材料为载体，将酶与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子C结合，再通过DNA定向固定化技术将酶固定于所述载体的探针上，即得纳米片状、尺寸为微米级的固定化酶系统。
其中，所述探针DNA分子P的核苷酸序列为5`NH2 C6-GCTACCAGTACACATCCGCAGTCATGACCT(SEQ ID NO：1)；所述DNA分子C的核苷酸序列为5`SH-AGGTCATGACTGCGGATGTGTACTGGTAGC(SEQ ID NO：2)。
其中，所述二维MOF纳米材料的尺寸为1000-4000nm。
其中，所述酶为葡萄糖氧化酶(GOD)。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述固定化酶系统的制备方法，包括如下步骤：
S1：将羧基活化后的二维MOF纳米材料分散于水中，与核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P反应，得到DNA分子接枝的复合纳米片，用纯水洗涤，去除未连接的探针DNA分子P，得到探针DNA分子P修饰的2D MOF复合纳米材料，即MOF-DNA；
S2：将酶溶解于水中，与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐(SMCC)和DMF的混合溶液反应后，超滤管超滤洗涤多次，去除未结合的SMCC，然后用纯水分散，得到酶-SMCC复合物；
S3：将核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子C溶于水中，还原巯基后，与所述酶-SMCC复合物反应，反应结束后，超滤管超滤洗涤多次，去除未结合的SMCC，然后用水分散，得到得酶-DNA复合物；
S4：于乙醇和水的混合溶液中，所述MOF-DNA与酶-DNA复合物反应，反应结束后，纯水洗涤多次，即得固定化酶系统。
步骤S1中，所述羧基活化为将二维MOF纳米材料分散于MES缓冲液中，与EDC和NHS反应，得到羧基活化的纳米片，即MOF-COOH。
其中，所述MES缓冲液为25mM，pH6.0的MES缓冲液；所述二维MOF纳米材料与EDC和NHS的质量比为(0.01-0.2)：(0.1-1)：1，优选为0.1：0.5：1；所述活化的温度为-5-5℃，优选为0℃；所述活化的时间为10-40min，优选为30min。
步骤S1中，所述二维MOF纳米材料与水和探针DNA分子P(1OD)的用量比为2mg：(3-7)mL：(500-1500)μL，优选为2mg：5mL：1000μL；所述反应的温度为20-30℃，优选为25℃；所述反应的时间为2-10h，优选为6h。
步骤S2中，所述酶与水的用量比为1mg：(0.5-1.5)mL，优选为1mg：1mL；所述酶与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐的质量比为1：(0.5-1.5)，优选为1：1；所述SMCC和DMF的用量比为1mg：(40-60)μL，优选为1mg：50μL；所述反应的温度为20-30℃，优选为25℃；所述反应的时间为6h以上。
步骤S3中，所述还原巯基为将DNA分子C经20-40mM(优选为30mM)的三(2羧乙基)膦的水溶液还原巯基；其中，所述DNA分子C与三(2羧乙基)膦的水溶液的体积比为38：(6-18)，优选为38：12；所述还原的温度为20-30℃，优选为25℃；所述还原的时间为1-3h，优选为2h。
步骤S3中，所述还原巯基后的DNA分子C与酶-SMCC复合物的用量比为(400-600)μL：1mL，优选为500μL：1mL；所述反应的温度为20-30℃，优选为25℃；所述反应的时间为12-36h，优选为24h。
步骤S4中，所述混合溶液中，乙醇的含量为0-100vt％，优选为50vt％；所述MOF-DNA与混合溶液的用量比为0.2-0.8mg/mL，优选为0.4mg/mL；所述MOF-DNA与酶-DNA复合物的质量比为(0.5-3.5)：1，优选为(1.5-2.5)：1，进一步优选为2：1；所述反应的温度为20-30℃，优选为25℃；所述反应的时间为1-5h，优选为3h。
其中，所述酶-DNA复合物中各个酶与目标分子的复合物的质量比为1：(0.5-1.5)，优选为1：1。
上述过程中，所述目标DNA分子C和探针DNA分子P的使用量均为1OD，溶解于1000μL纯水中。
本发明中所述2D MOF纳米片、2D MOF均指2D MOF纳米片Cu-TCPP(Fe)。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明提供了一种以2D MOF纳米材料为载体，用于构建固定化多酶系统的方法。以探针DNA分子为中间桥梁，通过DNA定向固定化技术定向固定化酶分子，能够充分暴露酶活性位点，解决了固定化后酶活下降的问题，显著提高了级联反应的催化效率。
(2)本发明所提供的2D MOF具有较大的比表面积，一方面能够显著提高了酶蛋白负载量；另一方面也有利于底物分子以较小扩散阻力接近其表面活性位点。因此，与传统的纳米材料相比，2D MOF纳米片在固定化酶应用方面具有更好的潜力。
(3)本发明所使用的2D MOF纳米材料Cu-TCPP(Fe)具有良好的类过氧化物酶性质，可以代替一种生物酶(过氧化物酶)，与GOD形成级联反应。从而减少了一种酶的使用，降低了经济成本，并简化了多酶共固定化的操作流程。
(4)得益于DNA链和2D MOF纳米材料均具有良好的物理化学稳定性和生物相容性，制备的固定化多酶系统具有良好的稳定性和重复使用性，且易于分离，大幅度降低了其应用成本。
(5)本发明以GOD为模型酶，固定在具有类过氧化物酶性质的2D MOF纳米材料上，该方法也可广泛应用于不同类型的多酶固定化过程，是一种通用型固定化策略。
(6)本发明以MOF为载体，可有效解决载体复杂的修饰过程，本发明中MOF体系固定化酶仅需一天多。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为羧基活化前(上图)后(下图)2D MOF的TEM图。
图2为MOF、MOF-COOH、MOF-DNA和MOF-DDI酶的Zeta位图。
图3为MOF和MOF-DNA的紫外全波长扫描图。
图4为GOD添加量对级联反应催化活性的影响。
图5为固定化过程中乙醇含量对级联反应催化活性的影响。
图6为温度对不同类型双酶系统催化活性的影响。
图7为pH对不同类型双酶系统催化活性的影响。
图8为不同类型双酶系统的热稳定性(60℃)比较。
图9为不同类型双酶系统的机械稳性比较。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中葡萄糖氧化酶(GOD，G130084-0.1MU)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，DNA链均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明中2D MOF纳米材料Cu-TCPP(Fe)为实验室自制，将Cu(NO3)2·3H2O(2.4mg)、三氟乙酸(40μL,1.0M)和PVP(10mg)溶解在DMF(9mL)和乙醇(3mL)的混合液中。然后，将TCPP(Fe)(4.4mg)溶于DMF(3mL)和乙醇(1mL)中，在搅拌下将该混合溶剂滴加到上述体系中。将反应混合物超声20分钟，在80℃加热4小时。所得产物洗涤、离心10min,12,000rpm，得到的二维纳米片冻干[1]。
实施例1：MOF-DNA复合纳米材料的制备
称取2mg 2D MOF纳米材料分散于MES缓冲液(25mM，pH6.0)中，分别加入10mg EDC和20mg NHS，放置于在冰水浴中，活化载体羧基30min，离心洗涤，得到MOF-COOH；将MOF-COOH分散于5mL纯水中，加入探针DNA分子P(1OD，1mL)，于25℃、转速为300rpm的摇床中反应6h，结束后用纯水洗涤3次，去除未连接的P，得到MOF-DNA。
从2D MOF分散液的TEM图(如图1所示)可以看出2D MOF呈薄纳米片状，尺寸为微米级，活化后形貌未被破坏，整体结构仍保持良好。Zeta电位(如图2所示)的结果显示：与MOF分散液相比，MOF-COOH分散液表面的电负性增加，这正是因为载体表面羧基活化成功引起的；进一步地，经探针DNA分子P修饰后的分散液，由于DNA上磷酸基团带负电荷，电负性再次增加；此外，紫外全波长扫描光谱(如图3所示)显示了DNA接枝前后载体分散液在各个波长处的吸光度，与MOF分散液的全波扫描相比，MOF-DNA分散液在260nm附近的吸光度陡然增加，证实探针DNA分子已成功接枝。
实施例2：酶-DNA复合物的制备
(1)将目标DNA分子C溶解于纯水中(1OD，380μL)，并加入120μL，30mM三(2羧乙基)膦水(TECP)溶液，于25℃、转速为300rpm的摇床中还原巯基2h，结束后用Amicon-3K超滤管超滤洗涤多次，去除多余的TCEP溶液。
(2)称取1mg葡萄糖氧化酶(GOD)溶于1mL纯水中，振荡混合均匀；取1mg4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐(SMCC)溶解于50μL DMF中，并加入上述GOD溶液，混合均匀；将混合液放入摇床中，于25℃、转速为300rpm的摇床中进行反应6h。反应结束后，用Amicon-10K超滤管超滤洗涤多次，去除未结合的SMCC，然后用纯水分散为1mL，得到GOD-SMCC复合物。
(3)将上述步骤(1)所得已还原的目标DNA分子C(1OD，500μL)与步骤(2)所得的1mLGOD-SMCC复合物相混合，于25℃、转速为300rpm的摇床中反应24h。反应结束后，用Amicon-10K超滤管超滤洗涤多次，去除未结合的C，然后用纯水散为1mL，得到的GOD-DNA(C)复合物，于4℃储存备用。
下述实施例中所述MOF-DNA复合纳米材料为实施例1制备所得，所述GOD-DNA(C)复合物为实施例2制备所得。
实施例3：MOF-DDI酶的制备
将2mg MOF-DNA复合纳米材料分散于5mL乙醇/水(乙醇体积百分数50％)混合溶液中，加入的1mg GOD-DNA(C)复合物，于25℃、转速为300rpm的摇床中反应3h。反应结束后，用纯水洗涤多次，得到通过DNA定向固定化技术固定的MOF-DDI固定化酶系统(以下简称MOF-DDI酶)。分散于5mL纯水中，4℃下储存备用。
从元素分析数据(如表1所示)可以看出：MOF-DDI酶中出现了P、S元素，且N、O元素含量明显增加，表明双酶已通过DNA双链定向固定到载体上。
表1
实施例4：固定化多酶系统合成中的条件优化
载体与酶的比例、固定化溶剂中乙醇的含量等因素对固定化多酶系统的催化活性具有重要影响，因此本发明对制备过程中的多个影响因素进行考察。
(1)载体与酶比例的影响：取2mg 2D MOF纳米材料，分别添加不同含量(0.4mg、0.6mg、0.8mg、1.0mg、1.2mg)的酶-DNA复合物，制备MOF-DDI酶，其余步骤参数同实施例3。以ABTS为显色底物做催化反应，用分光光度法在415nm处测量上清液中ABTS氧化物的吸光度，以确定固定化酶的活性。结果表明(如图4所示)，当酶-DNA复合物的添加量为1mg时，即载体：酶＝2：1时，级联反应的活性最高。
(2)固定化过程中乙醇含量的影响：取2mg 2D MOF纳米材料，添加1mg酶-DNA复合物，两者在5mL不同含量的乙醇溶剂中进行固定化，制备MOF-DDI酶，结束后离心洗涤，其余步骤参数同实施例3。ABTS为显色底物做催化反应，用分光光度法在415nm处测量上清液中ABTS氧化物的吸光度，以确定固定化酶的活性。实验结果表明(如图5所示)，当固定化溶剂中乙醇含量为50％时，MOF-DDI酶的活性最高。这可能是因为一定含量的乙醇能够使酶结构舒展，使活性位点充分暴露从而提高了催化效率，但过高浓度的乙醇也会破坏酶的构象，导致酶活损失。
实施例5：不同固定化多酶系统的比较
(1)吸附固定化酶的制备和共价固定化酶的制备
吸附固定化酶的制备：取2mg 2D MOF纳米材料，分散于5mL乙醇/水(乙醇体积百分数50％)混合溶液中，加入1mL GOD(1mg/mL)，混合液于25℃、转速为300rpm的摇床中反应3h。反应结束后，用纯水洗涤多次，得吸附法制备的MOF-吸附酶固定化多酶系统。分散于5mL纯水中，4℃下储存备用。
共价固定化酶的制备：取2mg 2D MOF纳米材料，分散于5mLMES缓冲液中，添加10mgEDC和15mgNHS，在冰水浴中活化羧基30min。结束后离心洗涤，分散于5mL乙醇/水(乙醇体积百分数50％)混合溶液中，加入1mLGOD(1mg/mL)，混合液于25℃、转速为300rpm的摇床中反应3h。反应结束后，用纯水洗涤多次，得共价法制备的MOF-共价酶固定化多酶系统。分散于5mL纯水中，4℃下储存备用。
其中，所述GOD(1mg/mL)指的是1mg的GOD溶解于1mL的纯水中。
(2)催化活性的测定：取0.2mg上述制备好的MOF-DDI酶(实施例3制备)、MOF-吸附酶和MOF-共价酶分别加入5mL 20mM葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应30min，离心取上清，用分光光度法在415nm处测量上清液中ABTS氧化物的吸光度，以确定固定化酶的活性。此外，用考马斯亮蓝法测定各固定化酶的蛋白负载量。
结果表明(如表2所示)，本发明制备的MOF-DDI酶比MOF-吸附酶和MOF-共价酶具有更好的酶促活性，这得益于DNA的定向固定化保证了酶活性位点充分暴露，以及双酶的共定位缩短了反应物的传质距离。此外，固定化酶负载量显著增加，均大于100μg/mg，远大于传统固定化材料。
表2
实施例6：最佳反应条件测定
(1)最佳反应温度：取0.2mg上述制备好的MOF-DDI酶、MOF-吸附酶和MOF共价酶，加入5mL反应底物20mM葡萄糖和0.5mM ABTS，在不同温度下(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)，300rpm的摇床中反应30min，离心取上清，用分光光度法在415nm处测量上清液中ABTS氧化物的吸光度，以确定不同温度下固定化酶的活性。如图6所示)，结果表明最佳反应温度为40℃。
(2)最佳反应pH：取0.2mg上述制备好的MOF-DDI酶、MOF-吸附酶和MOF共价酶，加入5mL不同pH缓冲液(2、3、4、5、6、7)配制的反应底物20mM葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应30min，离心取上清，用分光光度法在415nm处测量上清液中ABTS氧化物的吸光度，以确定不同pH下固定化酶的活性。(如图7所示)，结果表明最佳反应pH为5。
实施例7：固定化多酶系统稳定性考察
(1)热稳定性考察
取0.2mg上述制备好的MOF-DDI酶、MOF-吸附酶和MOF共价酶，分别在60℃下孵育不同时间(15、30、45、60、75、90min)，考察高温对多酶系统催化活性的影响。孵育结束后，在各个多酶系统中分别加入5mL 20mM葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应30min，离心取上清，用分光光度法在415nm处测量上清液中ABTS氧化物的吸光度，以确定不同孵育时间下固定化酶的活性。。测定结果表明(如图8所示)，在60℃的高温下，随着孵育时间的延长，MOF-DDI酶、MOF-吸附酶和MOF共价酶的催化活性均逐渐降低，MOF-DDI酶的热稳定明显高于其他三者，90min后仍保留70％以上的催化活性。
(2)机械耐受性考察
取0.2mg上述制备好的MOF-DDI酶、MOF-吸附酶和MOF共价酶，在超声清洗仪中超声不同的时间(0-60min)，每隔10min取样一次，探究其机械稳定性。孵育结束后，在各个多酶系统中分别加入5mL20mM葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应30min，离心取上清，用分光光度法在415nm处测量上清液中ABTS氧化物的吸光度，以确定不同超声时间下固定化酶的活性。测定结果表明(如图9所示)，在室温下，随着储存时间的延长，MOF-DDI酶、MOF-吸附酶和MOF共价酶的催化活性均逐渐降低，但MOF-DDI酶60min后认可保留80％左右的催化活性，而另外两种酶的剩余活性却不足40％。
(3)有机溶剂稳定性考察
取0.2mg上述制备好的MOF-DDI酶、MOF-吸附酶和MOF共价酶，分别在加入1mL的乙腈(50wt％，溶剂为水)、丙酮(50wt％，溶剂为水)、DMF(50wt％，溶剂为水)，混合液在25℃下孵育2h。孵育结束后，在各个多酶系统中分别加入5mL 2％葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应30min，离心取上清，用分光光度法在415nm处测量上清液中ABTS氧化物的吸光度，以确定不同有机溶剂下固定化酶的活性。测定结果表明(如表3所示)，在有机溶剂中，多酶系统的活性普遍降低，但与MOF-吸附酶和MOF-共价酶相比，MOF-DDI酶仍保持了较好的酶促反应活性。
表3
综上，本发明所提供的固定化多酶系统具有高酶负载量、高催化活性、优异的稳定性和重复使用性。此外，本发明还实现了纳米材料载体功能与催化功能的一体化，简化了多酶共固定化的操作流程，并显著降低了用酶成本，可广泛应用于多种生化催化、医学分析等领域。
本发明提供了一种基于2D MOF纳米材料和DNA定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
[1]Liu,Xinping et al.“Two-Dimensional Metal-Organic Framework/EnzymeHybrid Nanocatalyst as a Benign and Self-Activated Cascade Reagent for inVivo Wound Healing.”ACS nano vol.13,5(2019):5222-5230.
序列表
<110> 南京工业大学
郑州大学
<120> 一种基于2D MOF纳米材料和DNA定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 探针DNA分子P(DNA)
<400> 1
gctaccagta cacatccgca gtcatgacct 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> DNA分子C(DNA)
<400> 2
aggtcatgac tgcggatgtg tactggtagc 30
Claims (10)
1.一种固定化酶系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将羧基活化后的二维MOF纳米材料与核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P反应，得到DNA分子接枝的复合纳米片，即MOF-DNA；
S2：将酶与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐反应后，得到酶-SMCC复合物；
S3：将核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子C还原巯基后，与所述酶-SMCC复合物反应，得到得酶-DNA复合物；
S4：于乙醇和水的混合溶液中，所述MOF-DNA与酶-DNA复合物反应，即得固定化酶系统；所述混合溶液中，乙醇的含量为50vt%。
2.根据权利要求1所述方法制备得到的固定化酶系统，其特征在于，以核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P修饰的二维MOF纳米材料为载体，将酶与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子C结合，再固定于所述载体的探针上，即得固定化酶系统。
3.根据权利要求2所述的固定化酶系统，其特征在于，所述酶为葡萄糖氧化酶。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述羧基活化为将二维MOF纳米材料与EDC和NHS反应；其中，所述二维MOF纳米材料与EDC和NHS的质量比为（0.01-0.2）：（0.1-1）：1；所述活化的温度为-5-5℃；所述活化的时间为10-40min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述二维MOF纳米材料与探针DNA分子P的用量比为2mg：（500-1500）μL；所述反应的温度为20-30℃；所述反应的时间为2-10h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述酶与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐的质量比为1：（0.5-1.5）；所述反应的温度为20-30℃；所述反应的时间为6h以上。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述还原巯基为将DNA分子C经20-40mM的三（2羧乙基）膦的水溶液还原巯基；其中，所述DNA分子C与三（2羧乙基）膦的水溶液的体积比为38：（6-18）；所述还原的温度为20-30℃；所述还原的时间为1-3h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述还原巯基后的DNA分子C与酶-SMCC复合物的用量比为（400-600）μL：1mL；所述反应的温度为20-30℃；所述反应的时间为12-36h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述MOF-DNA与酶-DNA复合物的质量比为（0.5-3.5）：1。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述反应的温度为20-30℃；所述反应的时间为1-5h。
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN113637667A (zh) * | 2021-09-01 | 2021-11-12 | 郑州大学 | 一种基于双功能化纳米粒子和dna定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Two-Dimensional Metal-Organic Framework/Enzyme Hybrid Nanocatalyst as a Benign and Self-Activated Cascade Reagent for in Vivo Wound Healing.;Liu X, Yan Z, Zhang Y, Liu Z, Sun Y, Ren J, Qu X.;《ACS Nano》;第13卷(第5期);5222-5230 * |
| 氨基树脂表面活化提高固定化核酸酶P_1连续催化性能;何林姣;刘晓静;黄金莎;庄伟;应汉杰;;化工学报(第09期);3850-3860 * |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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