CN113637667A - 一种基于双功能化纳米粒子和dna定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于双功能化纳米粒子和DNA定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法；所述固定化多酶系统以探针修饰的具有氨基和羧基的SiO2为载体，以所述探针为中间桥梁固定两种以上的酶，即得球形、粒径为20‑40nm的固定化多酶系统；其中，所述探针为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P1和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的探针DNA分子P2。本发明提供的固定化多酶系统反应条件温和，生物相容性良好，具有优异的稳定性和重复实用性。此外，本发明还可以通过改变壳聚糖与琥珀酸酐的添加量实现对双酶比例的精确控制，显著地提高了固定化多酶的催化活性，可广泛应用于多种生化催化领域。
Description
技术领域
本发明属于固定化多酶系统制备技术领域，具体涉及一种基于双功能化纳米粒子和DNA定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法。
背景技术
多酶共固定化技术，是在单酶固定化技术的基础上发展起来的。简单来说，通过物理、化学或生物亲和等方法，将多种酶或含酶细胞固定于同一个载体上，使多种酶之间协同作用，充分发挥其催化特性，具有稳定性好、重复使用性好、易于分离、催化效率高等优点，在生物检测、医学分析和生物化学传感器等领域应用广泛。
近年来，研究者们致力于探究多酶共固定化的新型方法，以实现固定化多酶系统催化活性的显著提高。其中，酶量比的控制是影响级联反应效率的关键因素之一，对提高固定化多酶系统的整体活性具有重要意义。然而，由于酶蛋白结构的相似性，在固定化过程中往往难以调节多酶的比例。在之前已报道的多酶固定化方案中，一些方法虽能对双酶比例进行控制，但也存在多种弊端：如载体改性过程繁琐、难以实现精确控制、耗费时间较长等。因此，本发明提供了一种基于双功能化纳米粒子和DNA定向固定化技术构建酶比可调的固定化多酶系统的方法。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种酶比可调的固定化多酶系统和其构建方法。
发明思路：本发明首先用壳聚糖(CS)改性SiO2纳米粒子，使其表面含有丰富氨基，添加琥珀酸酐与部分氨基进行反应，得到具有氨基/羧基双官能团的SiO2纳米粒子。在此基础上，通过DNA定向固定化技术将葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP)定向固定在纳米粒子表面，由此构建了多酶固定化系统。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种固定化多酶系统，以探针修饰的具有氨基和羧基的SiO2为载体，以所述探针为中间桥梁固定两种以上的酶，即得球形、粒径为20-40nm(优选为25nm)的固定化多酶系统；
其中，所述探针为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P1(5`COOH-GCTACCAGTACACATCCGCAGTCATGACCT)和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的探针DNA分子P2(5`NH2 C6-TAGCTTGTCGTAATACCAGGGTCGTAGTAG)。
其中，所述载体的制备方法包括如下步骤：
(1)将SiO2纳米粒子与壳聚糖和琥珀酸酐反应后，得到具有氨基和羧基的SiO2纳米粒子，即COOH/NH2-SiO2；
(2)将COOH/NH2-SiO2分散于Buffer-1中，经EDC和NHS活化羧基活化后，于Buffer-2中与探针DNA分子P1反应，用Buffer-2洗涤，去除未连接的探针DNA分子P1，得到探针DNA分子P1修饰的具有氨基和羧基的SiO2纳米粒子，即P1-COOH/NH2-SiO2；
(3)将探针DNA分子P2溶解于Buffer-2中，经EDC和NHS活化羧基活化后，于Buffer-2中与P1-COOH/NH2-SiO2反应，用Buffer-2洗涤，去除未连接的探针DNA分子P2，得到载体，即P1/P2-COOH/NH2-SiO2。
步骤(1)中，向壳聚糖和醋酸溶液的混合溶液中加入SiO2纳米粒子，进行第一反应，结束后用NaOH溶液滴定，离心洗涤，得到具有氨基的SiO2纳米粒子，即NH2-SiO2；所得NH2-SiO2分散于溶液中，加入琥珀酸酐，进行第二反应，结束后用DMF和水洗涤，得到具有氨基和羧基的SiO2纳米粒子，即COOH/NH2-SiO2。
其中，所述第一反应中，所述醋酸溶液的浓度为1-5wt％，优选为3wt％。
其中，所述第一反应中，所述壳聚糖与醋酸溶液的用量比为1-60mg/mL。
其中，所述第一反应中，所述壳聚糖与SiO2纳米粒子的质量比为(0.1-0.6)：1。
其中，所述第一反应的温度为20-30℃，优选为室温。
其中，所述第一反应的时间为1-5h，优选为3h。
其中，所述第一反应中，所述NaOH溶液的浓度为1-7M，优选为4M。
其中，所述第一反应中，所述滴定的终点为pH＝11-13，优选为pH＝12。
其中，所述第二反应中，所述溶液为有机溶剂，优选为DMF。
其中，所述第二反应中，所述NH2-SiO2与琥珀酸酐的质量比为1：(1-20)，优选为1：(1-7)，进一步优选为1：4。
其中，所述第二反应的温度为20-30℃，优选为25℃。
其中，所述第二反应的时间为12h以上，优选为12-36h。
步骤(2)和步骤(3)中，所述羧基活化为经EDC和NHS活化。
其中，所述EDC和NHS的质量比为(2-4)：1。
优选地，所述COOH/NH2-SiO2与EDC和NHS的质量比为(0.4-0.85)：(2-4)：1。
优选地，所述探针DNA分子P2溶解于缓冲液中(1OD)，其与EDC和NHS的用量比为(40-60)μL：(2-4)mg：1mg。
其中，所述活化的时间为5-30min，进一步优选为15min。
步骤(2)中，所述COOH/NH2-SiO2与缓冲液的用量比为(15-35)mg：5mL，优选为25mg：5mL。
步骤(2)中，所述COOH/NH2-SiO2与探针DNA分子P1(1OD)的用量比为25mg：(400-600)μL，优选为25mg：500μL。
步骤(2)中，所述反应的温度为20-30℃，优选为25℃。
步骤(2)中，所述反应的时间为2-10h，优选为6h。
步骤(3)中，所述探针DNA分子P2(1OD)与缓冲液和P1-COOH/NH2-SiO2的用量比为(400-600)μL：(3-7)mL：25mg，优选为500μL：5mL：25mg。
步骤(3)中，所述反应的温度为20-30℃，优选为25℃。
步骤(3)中，所述反应的时间为2-10h，优选为6h。
其中，所述酶与目标DNA分子结合，得到酶-DNA复合物；所得酶-DNA复合物再与探针DNA分子结合。
其中，所述目标DNA分子为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的目标DNA分子C1(5`SH-TAGCTTGTCGTAATACCAGGGTCGTAGTAG)或核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的目标DNA分子C2(5`SH-CTACTACGACCCTGGTATTACGACAAGCTA)。
其中，所述结合包括如下步骤：
(i)将酶溶解于Buffer-2中，与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐(SMCC)和DMF的混合溶液反应后，超滤管超滤洗涤多次，去除未结合的SMCC，然后用Buffer-2分散，得到酶-SMCC复合物；
(ii)将目标DNA分子溶解于Buffer-2中，还原巯基后，与酶-SMCC复合物反应，反应结束后，超滤管超滤洗涤多次，去除未结合的SMCC，然后用Buffer-2分散，即得酶-DNA复合物。
其中，所述待结合的其他酶，也按照步骤(i)和(ii)的方式与目标DNA分子C1或目标DNA分子C2结合。
步骤(i)中，所述酶与缓冲液的用量比为1mg：(0.5-1.5)mL，优选为1mg：1mL。
步骤(i)中，所述SMCC和DMF的用量比为1mg：(40-60)μL，优选为1mg：50μL。
步骤(i)中，所述酶与SMCC的质量比为1：(0.5-1.5)，优选为1：1。
步骤(i)中，所述反应温度为20-30℃，优选为25℃。
步骤(i)中，所述反应的时间为6h以上。
步骤(ii)中，所述还原巯基为经三(2羧乙基)膦(TECP)的水溶液还原。
其中，所述三(2羧乙基)膦的水溶液的浓度为20-40mM，优选为30mM。
其中，所述目标DNA分子和缓冲液(1OD)，与TECP水溶液的体积比为38：(6-18)，优选为38：12。
其中，所述还原的时间为1-3h，优选为2h。
步骤(ii)中，还原巯基后的目标DNA分子(1OD)与酶-SMCC复合物的用量比为(400-600)μL：1mL，优选为500μL：1mL。
步骤(ii)中，所述反应的温度为20-30℃，优选为25℃。
步骤(ii)中，所述反应的时间为12-36h，优选为24h。
其中，所述固定的方法为将载体分散于Buffer-2中，加入酶-DNA复合物，反应，反应结束后，Buffer-2洗涤，即得固定化多酶系统。
其中，所述载体与缓冲液的用量比为2-8mg/mL，优选为5mg/mL。
其中，所述载体与酶-DNA复合物的质量比为(15-35)：2，优选为(20-30)：2，进一步优选为25：2；所述酶-DNA复合物中各个酶与目标分子的复合物的质量比为1：(0.5-1.5)，优选为1：1。
优选地，当待固定的酶为两个时，所述载体与第一酶、第二酶的质量比为(20-30)：1：1，优选为25：1：1。
其中，所述反应的温度为20-30℃，优选为25℃。
其中，所述反应的时间为1-5h，优选为3h。
优选地，以探针修饰的具有氨基和羧基的SiO2为载体，以所述探针为中间桥梁固定葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP)。
其中，所述载体P1/P2-COOH/NH2-SiO2、与GOD-C1和HRP-C2的质量比为(20-30)：1：1，优选为25：1：1。
其中，通过改变琥珀酸酐的添加量从而改变双酶的比例，GOD/HRP摩尔比范围为1：(1-5)，优选为1：2。
上述过程中，所述Buffer-1为MES缓冲液(25mM，pH6.0)，所述Buffer-2为PBS缓冲液(20mM，pH 7.4，0.15M NaCl)。
上述过程中，所述目标DNA分子C1、目标DNA分子C2、探针DNA分子P1、探针DNA分子P2的使用量均为1OD，溶解于500μL Buffer-2中。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明提供了一种采用壳聚糖/琥珀酸酐双功能化的SiO2纳米粒子为载体用于构建固定化多酶系统的方法，以探针DNA分子为中间桥梁定向固定化酶分子，并通过调节氨基/羧基的比例，实现对双酶比例的精确控制，以显著提高固定化多酶体系的催化活性。
(2)SiO2纳米粒子聚集体中含有大量的多孔结构，为固定化多酶系统提供了合适的反应微环境，通过提高中间物的浓度加大了反应催化效率。
(3)由于DNA定向固定化技术的优异性和DNA链良好的物理化学稳定性能，制备的DNA定向固定化多酶系统不仅能够充分暴露其活性位点，解决了固定化后酶活下降的问题；而且具有增强的活性、稳定性和重复使用性。
(4)得益于DNA链良好的物理化学稳定性和生物相容性，制备的固定化多酶系统具有良好的稳定性和重复使用性，且易于分离，大幅度降低了其应用成本。
(5)本发明中的固定化多酶系统制备过程简单，条件温和，具有良好的稳定性和重复使用性，且能够方便地调节酶量比。
(6)本发明利用功能生物材料壳聚糖对SiO2纳米粒子表面进行改性，操作简单，温和而有效。改性后的纳米粒子不仅含有丰富的氨基，而且具有增强的亲水性和良好的生物相容性。
(7)本发明以GOD和HRP作为模型酶，也可广泛应用于不同类型的多酶固定化过程，是一种通用型酶比可调的固定化策略。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为壳聚糖改性SiO2纳米粒子前后的FT-IR图像。
图2为壳聚糖改性SiO2纳米粒子前(A)后(B)的TEM图像。
图3为琥珀酸酐的添加量对固定化GOD/HRP双酶比例的影响。
图4为酶与目标DNA结合前后的全扫描波谱图(反应时间t＝24h)。
图5为不同GOD/HRP酶量比对DDI酶活性的影响。
图6为温度对DDI酶催化活性的影响。
图7为pH对DDI酶催化活性的影响。
图8为不同类型双酶系统的热稳定性比较。
图9为不同类型双酶系统的储存稳性比较。
图10为DDI酶的重复使用性。
图11为葡萄糖检测的线性标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中葡萄糖氧化酶(GOD，S10020)和辣根过氧化物酶(HRP，S10064)均购自上海源叶生物科技有限公司，DNA链均购于生工生物工程(上海)股份有限公司，Buffer-1和Buffer-2均为实验室自制，Buffer-1为MES缓冲液(25mM，pH6.0)，Buffer-2为PBS缓冲液(20mM，pH 7.4，0.15M NaCl)。
实施例1
(1)壳聚糖/琥珀酸酐双功能化SiO2纳米粒子的制备
称取0.4g壳聚糖(CS)，在50℃下溶于100mL 3％的醋酸溶液中。加入1g SiO2纳米粒子，室温下磁力搅拌3h；结束后，用NaOH(4M)溶液滴定至pH＝13，保证壳聚糖充分沉积于纳米粒子表面，然后用纯水洗涤6次，冻干，得NH2-SiO2。FT-IR(如图1所示)表明SiO2纳米粒子经CS修饰后，3340cm-1处的-NH2和-OH的联合伸缩振动峰明显变宽，且2883cm-1处出现了-CH3的伸缩振动峰，1425cm-1处出现了苯环的C＝C骨架振动，1371cm-1处附近出现了C-N伸缩振动，进一步说明了CS修饰成功。此外，TEM图像(如图2所示)表明SiO2纳米粒子在CS改性前后形貌变化不大，尺寸略有增加，聚集度明显增加。
称取25mgNH2-SiO2分散于DMF溶液中，并加入0.1g琥珀酸酐，于25℃、转速为300rpm的摇床中反应24h；反应结束后用DMF和纯水分别洗涤2次得COOH/NH-2SiO2。分别取25mgNH2-SiO2和COOH/NH2-SiO2分散于5mL纯水中，对琥珀酸酐修饰前后的pH进行比较。结果表明，未经琥珀酸酐修饰时溶液的pH为7.38，修饰后的pH为4.91，这种pH的下降正是由于琥珀酸酐修饰后游离出来的羧基引起的，表明改性成功。
(2)探针DNA分子在载体上的连接
取25mgCOOH/NH2-SiO2分散于5mLBuffer-1中，分别加入120mgEDC和40mgNHS，活化载体上的羧基15min，离心洗涤，并分散于5mL Buffer-2中；加入探针DNA分子P1(1OD，500μL)，于25℃、转速为300rpm的摇床中反应6h，结束后用Buffer-2洗涤3次，去除未连接的P1，得到P1-COOH/NH2-SiO2。将探针DNA分子P2溶解于Buffer-2中(1OD，500μL)，并加入30mgEDC和10mgNHS，活化P2上的羧基15min。结束后，将探针DNA分子P2(1OD，500μL)加入到25mg制备的P1-COOH/NH2-SiO2中，并加入5mL Buffer-2，于25℃、转速为300rpm的摇床中反应6h。结束后用Buffer-2洗涤3次，去除未连接的P2，得到P1/P2-COOH/NH2-SiO2。
(3)酶-DNA复合物的制备
(i)将目标DNA分子C1、C2分别溶解于Buffer-2中(1OD，380μL)，并加入120μL，30mM三(2羧乙基)膦水(TECP)溶液，于25℃、转速为300rpm的摇床中还原巯基2h，结束后用Amicon-3K超滤管超滤洗涤多次，去除多余的TCEP溶液。
(ii)称取1mg葡萄糖氧化酶(GOD)溶于1mLBuffer-2中，振荡混合均匀；取1mg4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐(SMCC)溶解于50μL DMF中，并加入上述GOD溶液，混合均匀；将混合液放入摇床中，于25℃、转速为300rpm的摇床中进行反应。反应结束后，用Amicon-10K超滤管超滤洗涤多次，去除未结合的SMCC，然后用Buffer-2分散为1mL，得到GOD-SMCC复合物。用同样的方法制备HRP-SMCC复合物。
(iii)将步骤(i)所得已还原的目标DNA分子C1(1OD，500μL)与步骤(ii)所得的1mLGOD-SMCC复合物相混合，于25℃、转速为300rpm的摇床中反应24h。反应结束后，用Amicon-10K超滤管超滤洗涤多次，去除未结合的C1，然后用Buffer-2分散为1mL，得到的GOD-C1复合物。用相同的方法制备HRP-C2复合物，并将这两种酶-DNA复合物于4℃储存备用。
(4)DNA定向固定化酶的制备
将探针DNA分子修饰的载体25mgP1/P2-COOH/NH2-SiO2分散于5mLBuffer-2中，加入步骤(3)所得的1mLGOD-C1复合物和1mL HRP-C2复合物，混合液于25℃、转速为300rpm的摇床中反应3h。反应结束后，用Buffer-2洗涤多次，得到通过DNA定向固定化技术固定的GOD/HRP固定化酶系统(以下简称DDI酶)。分散于5mLBuffer-2中，4℃下储存备用。元素分析表明(如表1所示)：经壳聚糖和琥珀酸酐修饰后，载体粒子表面的C、N元素明显增加，说明载体改性成功；此外，DDI酶中出现了P、S元素，表明双酶已通过DNA双链定向固定到载体上。
表1
实施例2：固定化多酶系统合成中的条件优化
壳聚糖的含量、琥珀酸酐的添加量、酶与目标DNA的结合时间等因素对固定化多酶系统的催化活性具有重要影响，因此本发明对制备过程中的多个影响因素进行考察。
(1)壳聚糖添加量优化：取1g SiO2纳米粒子，分别制备不同CS添加量条件下(0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g)的SiO2-CS复合物。以茚三酮为显色剂，在110℃下反应15min，测定CS修饰后SiO2纳米粒子上的氨基含量。反应后用紫外分光光度计测量产物在570nm处的吸光度，用透射电镜(TEM)和红外光谱仪(FT-IR)分析纳米粒子在最佳CS添加量下修饰前后的形貌差异和官能团变化。结果表明，随着CS添加量的增多，茚三酮显色愈加明显。当添加量为0.4g时，显色最为明显，继续添加则颜色变化不大，因此，综合考虑CS的最佳添加量为0.4g。
(2)琥珀酸酐添加量对固定化双酶比例的影响：当壳聚糖最佳添加量条件下，加入不同含量的琥珀酸酐(0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g)，并连接探针DNA分子P1、P2，得到P1/P2-COOH/NH2-SiO2，然后进一步加入1mg的GOD-C1复合物和1mg HRP-C2复合物，制备一系列不同酶比的固定化多酶系统，琥珀酸酐的添加量对固定化后GOD/HRP双酶比例的影响，实验结果表明(如图3所示)，当琥珀酸酐添加量改变时，氨基/羧基的比例也随之改变，进而实现了对GOD/HRP双酶比例的定量调控。
(3)酶-DNA复合物合成时间的优化：分别制备反应时间为6h、12h、24h、36h、48h时的酶-DNA结合物。经超滤管过滤多次后，用紫外特征峰法测定其结合率。随着时间的增加，酶-DNA复合物在275nm处ABTS自由基的吸光度显著增加(即结合率高)，且在24h时结合率最大(此时酶与目标DNA结合前后的全扫描波谱如图4所示)。此后，酶-DNA复合物出现部分解离，结合率减小。因此，t＝24h为最佳反应时间。
实施例3：固定化多酶系统的催化活性及最佳反应条件测定
(1)吸附固定化酶和戊二醛固定化酶的制备
吸附固定化酶的制备：取25mgSiO2纳米粒子，分散于5mLBuffer-2中，加入1mLGOD(1mg/mL)和1mLHRP(1mg/mL)，混合液于25℃、转速为300rpm的摇床中反应3h。反应结束后，用Buffer-2洗涤多次，得吸附法制备的GOD/HRP固定化多酶系统。分散于5mL Buffer-2中，4℃下储存备用。
戊二醛固定化酶的制备：取25mg NH2-SiO2纳米粒子，加入5mL浓度为2.5％的戊二醛溶液，分散均匀，于25℃、转速为300rpm的摇床中反应3h。反应结束后用纯水洗涤多次，并分散于5mLBuffer-2中，加入1mLGOD(1mg/mL)和1mLHRP(1mg/mL)，混合液于25℃、转速为300rpm的摇床中反应3h。反应结束后，用Buffer-2洗涤多次，得的戊二醛交联法制备的GOD/HRP固定化酶系统。分散于5mL Buffer-2中，4℃下储存备用。
其中，所述GOD(1mg/mL)和HRP(1mg/mL)分别指1mg的GOD和1mg的HRP溶解与1mL的Buffer-2中。
(2)催化活性测定：取0.3mg实施例1中的DDI酶和相同酶量的游离酶、吸附固定化酶及戊二醛固定化酶，分别加入5mL 2％葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应5min，离心取上清，在415nm处测ABTS氧化自由基的吸光度。此外，用考马斯亮蓝法测定各固定化酶的蛋白负载量。结果表明(如表2所示)，本发明制备的DDI酶具有比游离酶和其他固定化酶更好的酶促活性，这得益于DNA的定向固定化保证了酶活性位点充分暴露，以及双酶的共定位缩短了反应物的传质距离.
表2
(3)GOD/HRP最佳摩尔比：取0.3mg不同GOD/HRP摩尔比的固定化多酶系统(DDI酶)，加入5mL反应底物2％葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应5min，离心取上清，在415nm处测ABTS氧化自由基吸光度，探究双酶比例对催化活性的影响(如图5所示)，结果表明GOD/HRP的最佳摩尔比为1：2。
(4)最佳反应温度：取0.3mg固定化多酶系统(DDI酶)，加入5mL反应底物2％葡萄糖和0.5mM ABTS，在不同温度下(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)，300rpm的摇床中反应5min，离心取上清，在415nm处测ABTS氧化自由基吸光度，探究反应温度对催化活性的影响(如图6所示)，结果表明最佳反应温度为40℃。
(5)最佳反应pH：取0.3mg固定化多酶系统(DDI酶)，加入5mL不同pH缓冲液(4、5、6、7、8、9、10)配制的反应底物2％葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应5min，离心取上清，在415nm处测ABTS氧化自由基吸光度，探究反应pH对催化活性的影响(如图7所示)，结果表明最佳反应pH为7。
实施例4：固定化多酶系统稳定性和重复使用性考察
(1)热稳定性考察
取0.3mg实施例1中的DDI酶和相同酶量的游离酶、吸附固定化酶及戊二醛固定化酶，分别在60℃下孵育30、60、90、120、150min，考察高温对多酶系统催化活性的影响。孵育结束后，在各个多酶系统中分别加入5mL2％葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应5min，离心取上清，在415nm处测ABTS氧化自由基吸光度。测定结果表明(如图8所示)，在60℃的高温下，随着孵育时间的延长，DDI酶、游离酶、吸附固定化酶及戊二醛固定化酶的催化活性均逐渐降低，但DDI酶的热稳定明显高于其他三者，在孵育150min后仍可保留73％的催化活性，是相同条件下游离酶，吸附固定化酶和戊二醛固定化酶的4.3倍、2.8倍和1.6倍。
(2)储存稳定性考察
取0.3mg实施例1中的DDI酶和相同酶量的游离酶、吸附固定化酶及戊二醛固定化酶，分别在室温下孵育5、10、15、20、25、30天，考察不同储存时间对多酶系统催化活性的影响。孵育结束后，在各个多酶系统中分别加入5mL2％葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应5min，离心取上清，在415nm处测ABTS氧化自由基吸光度。测定结果表明(如图9所示)，在室温下，随着储存时间的延长，DDI酶、游离酶、吸附固定化酶及戊二醛固定化酶的催化活性均逐渐降低，但DDI酶的热稳定明显高于其他三者，在储存30天后仍可保留79％的催化活性，而游离酶，吸附固定化酶和戊二醛固定化酶仅保留原来活性的14％、28％和41％。
(3)有机溶剂稳定性考察
取0.3mg实施例1中的DDI酶和相同酶量的游离GOD/HRP、吸附固定化酶及戊二醛固定化酶，分别在加入1mL的乙醇(50wt％)、异丙醇(50wt％)、胰蛋白酶，混合液在25℃下孵育2h。孵育结束后，在各个多酶系统中分别加入5mL2％葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应5min，离心取上清，在415nm处测ABTS氧化自由基吸光度。测定结果表明(如表3所示)，在有机溶剂中，多酶系统的活性普遍降低，但与游离GOD/HRP、吸附固定化酶及戊二醛固定化酶相比，DDI酶仍保持了较好的酶促反应活性。
表3
(4)重复使用性考察
取0.3mg实施例1中的DDI酶，加入5mL2％葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应5min，离心取上清，在415nm处测ABTS氧化自由基吸光度。测量结束后离心，用buffer-2洗涤多次，重新加入5mL2％葡萄糖和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应5min。重复操作以上催化过程多次，考察多酶固定化系统的重复使用性。经测定，本发明制备的DDI酶具有很好的重复使用性(如图10所示)，在重复催化10个循环后仍可保持89％的催化活性，而吸附固定化酶和戊二醛固定化酶在使用5个循环后活性仅保留32％和55％。
实施例5：固定化多酶系统的对葡萄糖的检测
取0.3mg实施例1中的DDI酶，加入不同浓度的葡萄糖溶液和0.5mM ABTS，在37℃，300rpm的摇床中反应5min，离心取上清，在415nm处测ABTS氧化自由基吸光度，考察固定化多酶系统对葡萄糖检测的效果。实验结果表明(如图11所示)，葡萄糖的浓度和反应液的吸光度具有良好的线性关系(R2＝0.9989)，且葡萄糖的最低检测限为0.2μM。
本发明制备DDI酶与文献中已报的GOD/HRP多酶体系相比，对葡萄糖含量检测具有高度的灵敏性，且检测限较低，在生物医学(如血糖中葡萄糖的检测)、生物催化和生物化学传感器等领域具有广阔的应用前景。
本发明提供了一种基于双功能化纳米粒子和DNA定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 郑州大学
南京工业大学
<120> 一种基于双功能化纳米粒子和DNA定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 探针DNA分子P1(P1)
<400> 1
gctaccagta cacatccgca gtcatgacct 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 探针DNA分子P2(P2)
<400> 2
tagcttgtcg taataccagg gtcgtagtag 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 目标DNA分子C1(C1)
<400> 3
tagcttgtcg taataccagg gtcgtagtag 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 目标DNA分子C2(C2)
<400> 4
ctactacgac cctggtatta cgacaagcta 30
Claims (10)
1.一种固定化多酶系统，其特征在于，以探针修饰的具有氨基和羧基的SiO2为载体，以所述探针为中间桥梁固定两种以上的酶，即得球形、粒径为20-40nm的固定化多酶系统；
其中，所述探针为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P1和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的探针DNA分子P2。
2.根据权利要求1所述固定化多酶系统，其特征在于，所述载体的制备方法包括如下步骤：
(1)将SiO2纳米粒子与壳聚糖和琥珀酸酐反应后，得到具有氨基和羧基的SiO2纳米粒子，即COOH/NH2-SiO2；
(2)将COOH/NH2-SiO2的羧基活化后，与探针DNA分子P1反应，得到探针DNA分子P1修饰的具有氨基和羧基的SiO2纳米粒子，即P1-COOH/NH2-SiO2；
(3)将探针DNA分子P2的羧基活化后，与P1-COOH/NH2-SiO2反应，得到载体，即P1/P2-COOH/NH2-SiO2。
3.根据权利要求2所述固定化多酶系统，其特征在于，步骤(1)中，向壳聚糖和醋酸溶液的混合溶液中加入SiO2纳米粒子，进行第一反应，得到具有氨基的SiO2纳米粒子，即NH2-SiO2；所得NH2-SiO2分散于溶液中，加入琥珀酸酐，进行第二反应，得到具有氨基和羧基的SiO2纳米粒子，即COOH/NH2-SiO2；
其中，所述第一反应中，所述壳聚糖与SiO2纳米粒子的质量比为(0.1-0.6)：1；
其中，所述第二反应中，所述NH2-SiO2与琥珀酸酐的质量比为1：(1-20)。
4.根据权利要求2所述固定化多酶系统，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中，所述羧基活化为经EDC和NHS活化；所述EDC和NHS的质量比为(2-4)：1；所述活化的时间为5-30min。
5.根据权利要求1所述固定化多酶系统，其特征在于，所述酶与目标DNA分子结合，得到酶-DNA复合物；所得酶-DNA复合物再固定于探针；
其中，所述目标DNA分子为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的目标DNA分子C1或核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的目标DNA分子C2。
6.根据权利要求5所述所述固定化多酶系统，其特征在于，所述结合包括如下步骤：
(i)将酶与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐反应后，得到酶-SMCC复合物；
(ii)将目标DNA分子还原巯基后，与酶-SMCC复合物反应，即得酶-DNA复合物。
7.根据权利要求6所述固定化多酶系统，其特征在于，步骤(i)中，所述酶与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐的质量比为1：(0.5-1.5)；所述反应的时间为6h以上。
8.根据权利要求6所述固定化多酶系统，其特征在于，步骤(ii)中，所述还原巯基为经三(2羧乙基)膦的水溶液还原；所述三(2羧乙基)膦的水溶液的浓度为20-40mM；所述还原的时间为1-3h。
9.根据权利要求1所述固定化多酶系统，其特征在于，所述固定的方法为将载体分散于缓冲液中，加入酶-DNA复合物，反应，即得固定化多酶系统；
其中，所述载体与酶-DNA复合物的质量比为(15-35)：2；
其中，所述酶-DNA复合物中各个酶与目标分子的复合物的质量比为1：(0.5-1.5)。
10.根据权利要求1所述固定化多酶系统，其特征在于，以探针修饰的具有氨基和羧基的SiO2为载体，以所述探针为中间桥梁固定葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶。
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