CN110982811A - 一种基于Janus磁性纳米粒子和DNA定向固定技术构建人造细胞的方法 - Google Patents

一种基于Janus磁性纳米粒子和DNA定向固定技术构建人造细胞的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于Janus磁性纳米粒子和DNA定向固定技术构建人造细胞的方法，属于人造细胞制备领域。本发明分为以下步骤：首先制备单链DNA修饰的Janus磁性纳米粒子和互补单链DNA功能化的葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶；之后将Janus粒子与酶混合，通过DNA互补杂交实现酶的固定化；将固定化的双酶与单宁酸共同孵育，通过单宁酸的自聚实现对固定化酶的封装，构建具有隔室结构的人工细胞。本发明的人造细胞制备过程简单且条件温和，内部酶活性高，易于从反应体系中分离，稳定性优异，可用于模拟天然细胞内部的级联反应。

Description

一种基于Janus磁性纳米粒子和DNA定向固定技术构建人造细 胞的方法
技术领域
本发明属于人造细胞制备技术领域，具体涉及通过制备Janus磁性纳米粒子、双链DNA互补介导技术固定酶和单宁酸自聚封装酶模拟细胞膜的方法。
背景技术
细胞是生命的基本组成部分，对各种细胞活动(例如，生物级联反应，新陈代谢和繁殖)的深入研究能够有效地帮助我们理解生命的起源。尽管单个活细胞已被证明是研究体外细胞活动的有力工具，但其固有的复杂性和脆弱性严重影响了它们的进一步应用。目前，研究者们已经制备了多种人造细胞，在合成生物学中采用这种自下而上的方法的目的是设计区室化的微反应器，以帮助我们理解和操作在活细胞中发生的特定生化反应。本发明通过Janus磁性纳米粒子和DNA定向固定技术制备人造细胞，具有以下优点：其一，利用Janus粒子的两面不对称性，构建了具有亚微米尺度的区域化的细胞模拟物，精确还原细胞内的多隔室结构；其二，通过DNA定向固定的酶其活性位点完全暴露，解决了人造微反应器通常存在的活性下降的问题；其三，磁性核心的引入极大简化了细胞模拟物的分离步骤。
由于人造细胞成本较低、稳定性相比天然细胞有大幅的增强且已经可以实现单一蛋白表达、级联反应和DNA扩增等多种功能，目前被广泛应用于各种生物医学和工业用途，例如生物分子微反应器和生物传感器。近年来，以囊泡、金属有机骨架等载体进行人造细胞构建的研究得到了长足发展。尽管这些人造细胞已经被证明具有较好的酶促活性和稳定性，但此类人造细胞制备过程复杂，难以从反应体系中分离，活性和重复使用性较差，活性也存在很大问题。因此，需要进一步研究制备简便、高活性和易于分离的人造细胞用于模拟细胞生化过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用Janus磁性纳米粒子为载体用于构建人造细胞的方法，以DNA为桥梁定向固定酶分子，再通过单宁酸的自聚模拟细胞膜，以保护人造细胞不受复杂外界环境的干扰。本发明的人造细胞制备简单，条件温和，酶级联反应活性高，稳定性和重复使用性好，且易于从反应体系中分离。
该方法首先通过DNA定向固定化技术将葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶固定到Janus磁性纳米粒子的表面，再将其与单宁酸水溶液共同孵育，依靠交联多酚的自聚模拟细胞膜以实现对固定化酶的封装，构建人造细胞。
为了达到上述目的，本发明按照以下技术方案实现：
一种基于Janus磁性纳米粒子和DNA定向固定技术构建人造细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将sspDNA功能化的Janus磁性纳米粒子、sscDNA修饰的葡萄糖氧化酶辣根过氧化物酶在37℃、转速为400rpm的摇床中反应3h；反应结束后，用磷酸盐缓冲液将产物洗涤3次，得到的通过DNA定向固定技术固定的双酶系统，保存在4℃下备用；(2)将(1)中合成的固定化双酶系统与单宁酸溶液混合反应4h，得到聚单宁酸封装的人造细胞。
(1)称取0.25g SiO2@Fe3O4纳米粒子于100mL烧瓶中，加入4mL双十二烷基二甲基溴化铵溶液(DDAB，60mg L-1)，加热至80℃。将2.5g石蜡加入混合物中，温育15min以熔化蜡。将获得的混合物搅拌30min，反应结束后冷却至室温，用水洗涤三次，得到一半暴露一半包埋的蜡胶体。
(2)将(1)中合成的蜡胶体分散在5mL甲醇中，加入0.5mL-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，然后在25℃下孵育12h。随后加入氯仿以溶解石蜡，从而释放出氨基改性的磁性纳米粒子，用氯仿，无水乙醇和水洗涤(各三次)。洗涤后，将得到的氨基改性的SiO2@Fe3O4纳米颗粒添加到5mL甲醇和0.5mL二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮(TESPSA)中，并在25℃下孵育12小时，分别用水和乙醇洗涤三次后获得Janus磁性纳米粒子(MJNPs)。
(3)将(2)中制备的MJNPs(10mg)在29℃下与戊二醛溶液(5wt％)反应3小时。将所得颗粒与300μL单链探针DNA-α(sspDNA，28μM)和氰基硼氢化钠(1mg mL-1，0.5mL)的混合物在29℃下孵育3.5h。反应结束后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，5mg mL-1)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，2.5mg mL-1)溶液反应0.5h，随后在29℃下加入300μLsspDNA-β(28μM)孵育6h，得到单链DNA修饰的Janus次性纳米粒子(sspDNA@MJNPs)。
进一步，向0.5OD互补单链DNA(sscDNA)中加入200μL磷酸缓冲盐溶液，涡旋至DNA完全溶解，再加入60μL三(2-羧乙基)膦(TCEP)水溶液(30mM)，在25℃、转速为400rpm的摇床中反应1h。反应结束后，混合物用3K超滤离心管过滤洗涤6次，22min/次，离心机转速为8000xp，除去未参加反应的DNA。称取2mg葡萄糖氧化酶(GOx)或辣根过氧化物酶(HRP)溶于400μL磷酸缓冲溶液中，涡旋混合均匀。称取1mg 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(suflo-SMCC)加入酶溶液中，涡旋混合均匀。将混合液放置于摇床中，在摇床温度为25℃、转速为400rpm下反应1h。反应结束后，混合物用10K超滤离心管过滤洗涤6次，10min/次，离心机转速为8000xp，除去未参加反应的sulfo-SMCC。之后，将过滤好的酶溶液与DNA溶液混合在一起，在37℃、转速为400rpm的摇床中反应48h。反应结束后，混合物用10K超滤离心管过滤洗涤6次，10min/次，离心机转速为8000xp，除去未反应完全的sscDNA。得到的sscDNA-GOx(或sscDNA-HRP)共轭物保存在4℃下备用。
进一步，将步骤(3)中制备的sspDNA@MJNPs和互补单链DNA修饰的酶复合物(sscDNA-GOx和sscDNA-HRP)以及1mL磷酸缓冲溶液(10mM，pH＝7.4)在37℃、转速为400rpm的摇床中反应3h，得到DNA定向固定的固定化酶(GOx-HRP@DNA@MJNPs)，保存在4℃下备用。
进一步，将单宁酸(TA)溶于500μL HEPES缓冲溶液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，25mM，pH＝7.4)中，加入GOx-HRP@DNA@MJNPs(200μL，1mg mL-1)形成悬浮液，将悬浮液混合4h后，用磁铁分离产物，用缓冲溶液洗涤三次，得到的人造细胞。
进一步，制备过程中所述的sspDNA的序列为：5’-NH2-GCTACCAGTACACATCCGCAGTCATGACCT-3’和5’-NH2-TAGCTTGTCGTAATACCAGGGTCGTAGTAG-3’；
进一步，制备过程中所述的sscDNA的序列为：5’-SH-AGGTCATGACTGCGGATGTGTACTGGTAGC-3’和5’-SH-CTACTACGACCCTGGTATTACGACAAGCTA-3’；
进一步，修饰硅层后的磁性四氧化三铁纳米粒子粒径为250nm，Janus磁性纳米粒子粒径为270nm；人造细胞的粒径为300nm，呈规则的球形；
进一步，所述的人造细胞保持了良好的磁饱和强度，在磁场的控制下易于从反应体系中分离；
进一步，所述的人造细胞的天然酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，此方法能够扩展到其他酶与超分子保护层组成的模拟细胞系统，具有广泛的应用范围。
本发明的优点在于：
(1)Janus磁性纳米粒子的两面不对称性为模拟细胞提供了区室化的结构，通过“软分离”的方法将不同的酶有序固定到指定的区域，避免了不同酶之间不利的相互作用；
(2)受益于DNA双链优秀的特异性、机械刚性和温和的反应条件，固定化酶保持了优秀的生物相容性、活性和稳定性；
(3)利用单宁酸自聚封装酶的方法简单、温和而高效，其柔软多孔的表面结构在封装过程中未对酶的二级、三级结构产生影响，能够在充分保持酶活性的基础上，大幅度提升其对外界条件的耐受性，是模拟细胞膜的良好选择；
(4)与其他人造细胞相比，本发明制备的人工细胞在磁场的控制下易于从反应体系中分离，且制备过程相对简单，反应条件温和；
(5)本发明以葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶作为模型酶，是一种通用型制备人造细胞的策略，可广泛应用于生化领域。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1：单链DNA修饰的Janus磁性纳米粒子(sspDNA@MJNPs)的制备
0.5OD sspDNA中加入300μL磷酸盐缓冲液，涡旋至DNA完全溶解。取150μL DNA溶液加Janus磁性纳米粒子(MJNPs)中，在37℃、转速为400rpm的摇床中反应3.5h。将产物用buffer A洗涤两次后，再加入3mL牛血清白蛋白溶液(BSA，5％wt)，在37℃、转速为400rpm的摇床中反应30min，对磁性纳米粒子表面的非特异性结合位点进行封闭。反应后，将sspDNA@MJNPs用缓冲盐溶液洗三次，在4℃下保存备用。
实施例2：酶-单链DNA共轭复合物(sscDNA-GOx和sscDNA-HRP)的制备
向0.5OD sscDNA中加入200μL磷酸盐缓冲溶液，涡旋至DNA完全溶解，再加入60μLTCEP水溶液(30mM)，在25℃、转速为400rpm的摇床中反应1h。反应结束后，混合物用3K超滤离心管过滤洗涤6次，22min/次，离心机转速为8000xp，除去未参加反应的DNA。称取2mg GOx(或HRP)溶于200μL缓冲溶液中，涡旋混合均匀。称取1mg suflo-SMCC超声溶解于200μL缓冲溶液中，并将其加入GOx溶液中，涡旋混合均匀。将混合液放置于摇床中，在摇床温度为25℃、转速为400rpm下反应1h。反应结束后，混合物用10K超滤离心管过滤洗涤6次，10min/次，离心机转速为8000xp，除去未参加反应的sulfo-SMCC。之后，将过滤好的GOx溶液与DNA溶液混合在一起，在37℃、转速为400rpm的摇床中反应48h。反应结束后，混合物用10K超滤离心管过滤洗涤6次，10min/次，离心机转速为8000xp，除去未反应完全的sscDNA。得到的sscDNA-GOx(或sscDNA-HRP)共轭物保存在4℃下备用。
实施例3：聚单宁酸封装固定化酶用于制备人造细胞。
(1)单链DNA修饰的磁性纳米粒子(sspDNA@MJNPs)的制备：同实施例1和实施例2。
(2)实施例1中制备的单链DNA修饰的磁性纳米粒子、实施例2中制备的酶-单链DNA共轭复合物和1mL磷酸盐缓冲溶液在37℃、转速为400rpm的摇床中反应3h，得到的DNA定向固定化酶(GOx-HRP@DNA@MJNPs)。接下来，将单宁酸(TA)溶于500μL HEPES缓冲溶液(25mM，pH＝7.4)中，加入GOx-HRP@DNA@MJNPs(200μL，1mg mL-1)形成悬浮液，将悬浮液混合4h后，用磁铁分离产物，用缓冲溶液洗涤三次，得到的人造细胞。
实施例4：人造细胞模拟级联反应的条件优化及动力学考察
(1)反应环境的pH和温度均对人造细胞的活性和稳定性有影响，因此本发明对制备的人造细胞的反应条件进行考察。
(2)分别制备pH为3、4、5、6、7、8、9、10和11的磷酸盐缓冲溶液，加入100mM葡萄糖，得到不同pH的酶促底物。
(3)取0.5mg人造细胞分别加入1mL不同pH值的酶促底物100mM葡萄糖和0.5mMABTS，摇床反应10min，400rpm，考察pH值对固定化酶体系影响，得到最优pH为6。用紫外可见分光光度计测量产物在415nm处的吸光度。
(4)取0.5mg人造细胞分别加入1mL酶促底物100mM葡萄糖和0.5mM ABTS，在不同温度下(10℃、20℃、30℃、37℃、40℃、50℃、60℃和70℃)摇床反应10min，400rpm，考察温度对固定化酶体系影响，得到最优温度为40℃。用紫外可见分光光度计测量产物在415nm处的吸光度。
(5)在最佳反应条件下对人造细胞的内部酶级联反应进行动力学考察。根据米氏方程(Michaelis-Menten equation)分别考察人造细胞和游离葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶双酶的动力学参数。以人造细胞中葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶为模型酶衡量对比人造细胞和自由酶的动力学参数。人造多酶系统的米氏常数(Km)及最大反应速率(Vmax)分别为1.19mM和8.24×10-8M s-1，游离酶的Km和Vmax分别为3.45mM和4.83×10-8M s-1，表明与自由酶相比，该人造细胞具有较好的底物亲和性和较大的反应速率。
实施例5：人造细胞的重复使用性及稳定性测试
(1)人造细胞的制备：同实施例3。
(2)重复使用性考察：配制1mL 100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，加入到0.5mg实施例3中合成的人造细胞，摇床反应10min，37℃，400rpm。
(3)反应完后，用紫外可见分光光度计测量产物上清液在415nm处的吸光度，(2)中的人造细胞用缓冲液洗涤三次，去除其表面粘有的底物溶液，加入1mL 100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，摇床反应10min，37℃，400rpm，用紫外可见分光光度计测量产物在415nm处的吸光度。反复批次催化1mL100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，考察人造多酶系统的重复使用性。
(4)经考察，本发明制备的人造细胞拥有很好的重复使用性。重复使用20次后仍可保持原酶活性的82％；与其他模拟细胞相比，本发明制备的人造细胞在磁场控制下易于从反应体系中分离，重复使用性及易回收的优势明显。
(5)热稳定性考察：0.5mg(100μL)实施例3中合成的细胞模拟物和相同酶量的游离葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶双酶(100μL)分别在50℃和60℃中孵育0，20，40，60，80，100，120min，考察高温对人造细胞活性的影响。孵育结束后，在人造多酶系统中分别加入1mL 100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，摇床反应10min，37℃，400rpm，用磁铁分离后，上清液和游离酶反应溶液分别用紫外可见分光光度计测量415nm处的吸光度。测试结果表明，人造细胞和游离酶的活性随热孵育时间的延长而降低，但人造细胞与游离酶相比具有较好的热稳定性，在50℃和60℃中孵育120min后仍可分别保留原酶活性的89％和67％，是相同条件下游离酶酶活性的3.5和5.2倍。
储存稳定性考察：0.5mg(100μl)实施例3中合成的人造细胞和相同酶量的游离葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶双酶(100μL)分别在4℃和室温条件下分别储存0，6，12，18，24，30，36，42、48天，考察不同储存条件对人造多酶系统活性的影响。储存结束后，封装酶体系中分别加入1mL 100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，摇床反应5min，37℃，400rpm，用磁铁分离后，上清液和游离酶反应溶液分别用紫外可见分光光度计测量415nm处的吸光度。测试结果表明，人造细胞和游离酶的活性随储存时间的延长而降低，但人造细胞与游离酶相比具有较好的储存稳定性，在4℃储存48天后，封装酶仍可保持原酶活性的97％，在室温储存48天后，人造细胞仍可保持原酶活性的77％，然而自由酶在相同条件下仅分别保留原酶活性的35％和1％。
实施例6：人造细胞用于低聚异麦芽糖中葡萄糖的去除。
(1)人造细胞的制备：同实施例3。
(2)5mg实施例3中合成的人造细胞，分别加入5mL商业用低聚异麦芽糖(500mg/mL)，摇床中反应，37℃，400rpm。用磁铁分离人造细胞后，取不同反应时间的上清液分别用超高效液相色谱(UFLC)监测低聚异麦芽糖中葡萄糖的降解情况。
(3)通过(2)中的分析方法进行葡萄糖的酶法去除，发现随着反应时间的增加，人造细胞对于葡萄糖的去除率逐步提升，反应1h后，去除率达到了94％，说明该人造细胞在食品工业方面也有着广阔的应用前景。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 一种基于Janus磁性纳米粒子和DNA定向固定技术构建人造细胞的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
gctaccagta cacatccgca gtcatgacct 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
tagcttgtcg taataccagg gtcgtagtag 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
aggtcatgac tgcggatgtg tactggtagc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ctactacgac cctggtatta cgacaagcta 30

Claims (7)

1.一种基于Janus磁性纳米粒子和DNA定向固定技术构建人造细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将sspDNA功能化的Janus磁性纳米粒子、sscDNA修饰的葡萄糖氧化酶辣根过氧化物酶在37℃、转速为400rpm的摇床中反应3h；反应结束后，用磷酸盐缓冲液将产物洗涤3次，得到的通过DNA定向固定技术固定的双酶系统，保存在4℃下备用；
(2)将(1)中合成的固定化双酶系统与单宁酸溶液混合反应4h，得到聚单宁酸封装的人造细胞。
2.根据权利要求1所述的构建人造细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中所用的Janus磁性纳米粒子为修饰了原硅酸四乙酯并用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷和二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮功能化的四氧化三铁。
3.根据权利要求1所述的构建人造细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的sspDNA的序列为5’-NH2-GCTACCAGTACACATCCGCAGTCATGACCT-3’和5’-NH2-TAGCTTGTCGTAATACCAGGGTCGTAGTAG-3’，sscDNA的序列为5’-SH-AGGTCATGACTGCGGATGTGTACTGGTAGC-3’和5’-SH-CTACTACGACCCTGGTATTACGACAAGCTA-3’。
4.根据权利要求1所述的构建人造细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中sspDNA和sscDNA的使用量为0.5OD。
5.根据权利要求1所述的构建人造细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中sspDNA功能化的磁性纳米粒子加入量为10mg，sscDNA修饰的酶的加入量为2mg。
6.根据权利要求1所述的构建人造细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中固定化酶的加入量和浓度分别为200μL、1mg/mL；单宁酸的加入量和浓度分别为100μL、50mM。
7.根据权利要求1所述的构建人造细胞的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的磷酸盐缓冲溶液配制方法为10mM磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，pH 7.4，0.1M NaCl。
CN201911252362.9A 2019-12-09 2019-12-09 一种基于Janus磁性纳米粒子和DNA定向固定技术构建人造细胞的方法 Active CN110982811B (zh)

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