CN101519482B - 一种应用于蛋白质分离纯化的纳米磁性复合微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于蛋白质分离纯化的纳米磁性复合微球的制备方法，通过制备磁性纳米粒子，然后采用硅烷偶联剂对粒子表面进行修饰，再将修饰后的粒子和高分子单体、交联剂、引发剂混合分散于含有表面活性剂水相中，进行乳液聚合即得到磁性复合微球。本发明制备的纳米磁性复合微球粒径在50-500纳米之间，表面功能基团丰富，在介质中具有良好的分散稳定性，免疫配基偶联效率高，磁响应性强，适合应用于生物样品中蛋白质的快速分离及纯化。

Description

一种应用于蛋白质分离纯化的纳米磁性复合微球的制备方法

技术领域

本发明涉及纳米制品制备，具体涉及一种应用于蛋白质分离纯化的纳米磁性复合微球的制备方法。

背景技术

从样品中分离、提纯与检测各种蛋白质是生命科学及临床医学中的一个重要环节，传统的蛋白质分离方法如盐析、有机溶剂沉淀法、膜分离技术、和柱层析技术等，是通过改变PH值、温度、离子强度、介电常数等因素来达到分离的目的。但上述方法存在一些缺陷，如：分离过程繁杂、仪器成本高、蛋白质损失大等，从而使它们的应用受到限制。以磁性微球为固相介质对蛋白质进行提纯是一项新兴的蛋白质分离纯化技术。它是通过对磁性微球表面的改性，共价结合上能被目标蛋白质识别和可逆结合的配基，当目标蛋白质与磁性微球紧密结合后，利用外部磁场对蛋白质进行分离。同传统方法相比，蛋白质的磁分离纯化技术具有操作简单、快速、高效富集、高收率等优点。

目前磁性微球的制备方法主要包括化学沉淀法，包埋法，高分子微球磁化法，单体共聚法等。化学沉淀法是将铁离子和亚铁离子在碱性条件下分散于高分子溶液中，通过乳化复合技术，透析、干燥等手段得到生物高分子磁性微球。中国发明专利申请公开号：CN137630A公开了用共沉淀法制备琼脂糖微球。但所得到的微球磁响应性较弱，形状不规则。包埋法是制备磁性微球较早的一种方法，它是指将磁性粒子分散在高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段得到磁性高分子复合微球。此方法制备的磁性复合微球所需条件简单，易于进行，但所得微球粒径较大，单分散性较差，形状难以控制。高分子微球磁化法是指以高分子聚合单体为原料，通过高分子聚合反应，合成出的带有多孔的高分子微球，然后将微球反复浸渍在Fe²⁺和Fe³⁺混和溶液中，在强碱性环境下，在高分子微球的内部形成具有顺磁性微球，美国专利公开号：USP4654267公开了一种高分子微球磁化法。但这种方法需要重复多次，过程繁琐，难以控制，所得微球的磁响应程度低。单体共聚法通常是指采用两种或两种以上的单体在一定的条件下进行聚合反应，生成表面带有功能基团的磁性复合微球，主要的聚合方法包括分散聚合，乳液聚合，无皂乳液聚合，微乳液聚合法等。目前采用单体共聚法制备磁性微球已有文献报道，但该制备技术还不成熟，所制备的微球单分散性不够理想，磁响应性较弱，微球的生化活性以及分散稳定性都有待提高，限制了其在蛋白质分离纯化方面的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供一种应用于蛋白质分离纯化的磁性微球，该微球具有磁响应性强，表面功能团丰富，配基偶联效率高，分散稳定性强的特点。

本发明提供了一种应用于蛋白质分离纯化的磁性微球的制备方法。

本发明方法首先制备磁性纳米粒子，并通过带有双键结构的硅烷偶联剂对其进行表面改性，然后将改性粒子与高分子单体混合物进行乳液聚合制得表面带有羧基的磁性复合微球，最后通过偶联剂使磁性复合微球表面连接上特定的配基，即得到应用于蛋白质分离纯化的磁性微球。

具体包括下列步骤：

步骤1：磁性纳米粒子的制备及表面改性

磁性纳米粒子为粒径小于30nm的铁锌氧体、四氧化三铁、钴铁氧体、γ-三氧化二铁中的一种，可采用共沉淀法、氧化还原法、高温裂解法中的任何一种制备。

由于磁性纳米粒子表面亲水，为了增强其与非极性高分子单体的相容性与反应性，选用带有双键的硅烷偶联剂对粒子进行表面改性，可以是γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，乙烯基三乙氧基硅烷，乙烯基三甲氧基硅烷中的一种。改性时首先将硅烷偶联剂、磁性纳米粒子、去离子水、无水乙醇配成混合液，其中：无水乙醇占混合液总质量的10-50％，磁性纳米粒子占25-50％，硅烷偶联剂占1.25-15％，去离子水占20-60％，并用乙酸将混合液PH值调至5.5，在配有回流冷凝管、机械搅拌器，通有氮气的容器中加热到70℃恒温反应1-5小时后，然后用去离子水洗涤多次，磁分离，最后经减压干燥即得硅烷偶联剂修饰的磁性纳米颗粒。

步骤2：制备羧基磁性复合微球

将硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒子与功能单体马来酸酐或甲基丙烯酸，共聚单体苯乙烯，交联剂二乙烯基苯混合，然后加入到含有表面活性剂十二烷基硫酸钠的水相中。超声乳化均匀后，加入引发剂过硫酸钾或过氧化苯钾酰中的一种或混合物，所得混合相中各组分的质量分数为：共聚单体7-13％，硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒子1-13％，功能单体0.5-6％，交联剂0.1-1％，表面活性剂0.3-4％，引发剂0.05-0.4％，去离子水75％-88％。接着将混合相在配有回流冷凝管、机械搅拌器，通有氮气的容器中，70-80℃恒温反应10-20小时。最终得到表面羧基化的磁性复合微球。

本发明方法制得的磁性复合微球应用于目标蛋白的分离纯化时作微球表面偶联配基处理：

通过偶联剂使磁性复合微球表面连接上特定的配基，利用这些配基与目标蛋白质的亲和性，在磁场下实现对目标蛋白的分离纯化。表面连接的配基可以是(1)蛋白A、蛋白G、凝集素、或(2)Ni-NTA中的一种。

(1)偶联蛋白A、蛋白G或凝集素

用去离子水将羧基磁性微球洗涤三次并磁分离，取10-40mg磁性微球分散于1ml缓冲溶液中，接着向溶液中加入0.8mg-20mg偶联剂EDC.HCl，震荡均匀，即得到表面羧基被活化的磁性微球。再将表面活化的1ml磁性微球和1ml含有1-5mg蛋白A、蛋白G或凝集素的缓冲溶液混合，在25℃的摇床中反应2-4小时，经磁性分离，用缓冲溶液洗涤2次。然后将微球分散于含乙醇胺或BSA的缓冲溶液中，封闭活性位点，再用缓冲液洗涤微球两次并重新分散，即得到表面偶联有蛋白A、蛋白G或凝集素的磁性微球。该磁性微球适用于体液、细胞、腹水或组织等样品中分离与纯化相应的蛋白质。偶联中所用的缓冲溶液为PBS(PH＝7.4)、磷酸钠缓冲液(0.01-0.05mol/l，PH＝7.0-9.0)、硼酸钠缓冲液(0.01-0.05mol/l，PH＝7.0-9.0)中的一种。

(2)偶联Ni-NTA

用去离子水将羧基磁性微球洗涤三次，磁分离后分散于MES(0.05M；pH6.5)缓冲液中，微球浓度1×10⁸个/ml。向每毫升微球中加入0.1mg NHS和1mg EDC，在22℃下搅拌10min，活化羧基。活化后的羧基微球磁分离后以1×10⁸个/ml重悬于HEPES中(0.1M，pH 8.0)，然后向每毫升中加入5×10¹⁰分子NTA，在22℃下温育18h后，磁分离，羧基微球分散于Tris缓冲液(0.05M；pH 8)，封闭多余的羧基。然后用PBS(PH＝7.4)缓冲液洗涤微球两次，再将微球于NiCl₂溶液(500uM)中22℃温育2h，最后以PBS洗涤三次后，重新分散保存于4℃，即得表面偶联有Ni-NTA配基的磁性微球。该磁性微球适用于纯化带组氨酸标签的蛋白质。

制备的磁性微球单分散性好，微球粒经小表面积大连接配基的量大(是传统方法的2～10倍)，而且磁含量高、磁响应性强，又因其具有顺磁性，在外磁场作用下，固液相的分离十分简单，可省去离心、过滤等繁杂的操作，实现样品的快速、高效的分离纯化。

具体实施方式

实施例1：

采用共沉淀法制备Fe₃O₄纳米磁性粒子，取16gFeCl₃和19gFeSO₄·7H₂O，溶于50ml去离子水中，然后加入到250ml三口烧瓶中，在氮气保护，300rpm下，升温至70℃，接着加入NaOH调节PH值至8-9，持续反应半小时，然后用去离子水，无水乙醇分别洗涤三次，最后将Fe₃O₄纳米磁性粒子分散于无水乙醇中，配成固含量50wt％的混合液。取40g混合液，加入4g乙烯基三乙氧基硅烷，20g去离子水，并用乙酸将混合液PH值调至5.5，在配有回流冷凝管、机械搅拌器，通有氮气的三口烧瓶中加热到70℃恒温反应2小时后，然后用去离子水洗涤多次，磁分离，最后经减压干燥即得平均粒径10nm左右的经修饰的Fe₃O₄纳米粒子。

称取10g苯乙烯，0.2g二乙烯基苯，1.4g马来酸肝和4g硅烷偶联剂修饰的Fe₃O₄纳米粒子，混合后加入到含有1g十二烷基硫酸钠的水相中，超声乳化均匀后，加入0.1g引发剂过硫酸钾，在配有回流冷凝管、机械搅拌器，通有氮气的三口烧瓶中，70℃恒温反应20小时。最终得到表面羧基化的磁性复合微球。该微球平均粒径100纳米左右，具有较强的磁响应性。

用去离子水将羧基磁性微球洗涤三次并磁分离，取10mg磁性微球分散于1mlPBS(PH＝7.4)缓冲溶液中，接着向溶液中加入2mg偶联剂EDCHCl，震荡均匀。再将磁性微球和1ml含有1mg蛋白A的PBS(PH＝7.4)缓冲溶液混合，在25℃的摇床中反应2小时，磁性分离去上清，用PBS(PH＝7.4)缓冲溶液洗涤2次。接着将微球分散于BSA中，封闭多余的羧基，然后用以PBS(PH＝7.4)缓冲液洗涤微球两次并重新分散，即得到表面偶联有蛋白A的磁性微球。该磁性微球适用于血浆、腹水或克隆细胞培养上清等样品中IgG的分离与纯化。

实施例2：

操作方法和条件同实施例1，不同在于硅烷偶联剂为γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷。

实施例3：

操作方法和条件同实施例1，不同在于硅烷偶联剂为乙烯基三甲氧基硅烷。

实施例4：

操作方法和条件同实施例1，不同在于缓冲溶液为磷酸钠缓冲液(0.01-0.05mol/l，PH＝7.0-9.0)

实施实例5：

操作方法和条件同实施例1，不同在于缓冲溶液为硼酸钠缓冲液(0.01-0.05mol/l，PH＝7.0-9.0)。

实施例6：

操作方法和条件同实施例1，不同在于偶联的配基为蛋白G或凝集素。

实施例7：

制备表面偶联Ni-NTA的磁性微球，其中羧基磁性复合微球的制备过程同实施实例1。偶联Ni-NTA的步骤为：用去离子水将羧基磁性微球洗涤三次，磁分离后分散于MES(0.05M；pH6.5)缓冲液中，微球浓度1×10⁸个/ml。向每毫升微球中加入0.1mgNHS和1mg EDC，在22℃下搅拌10min，活化羧基。活化后的羧基微球磁分离后以1×10⁸个/ml重悬于HEPES中(0.1M，pH 8.0)，然后向每毫升中加入5×10¹⁰个分子NTA(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)，在22℃下温育18h后，磁分离，羧基微球分散于Tris缓冲液(0.05M；pH 8)，封闭多余的羧基。然后用PBS(PH＝7.4)缓冲液洗涤微球两次，再将微球于NiCl₂溶液(500uM)中22℃温育2h，最后以PBS洗涤三次后，重新分散保存于4℃，即得表面偶联有Ni-NTA配基的磁性微球。该磁性微球适用于纯化带组氨酸标签的蛋白质。

实施例8：

用于蛋白质的分离纯化，将0.5mL兔血清用0.01mol/L的磷酸盐溶液稀释为5mL，加入100mg实施实例1中制得的表面偶联有蛋白A的磁性微球，摇匀，在室温下反应10分钟后，将反应液置于磁铁上两分钟后，弃去上清液。用0.01mol/L pH＝7.4的磷酸盐缓冲液洗涤磁性颗粒，至上清液在波长为280nm处的吸光光度值小于0.01。加入0.05mol/L pH＝2.3的甘氨酸缓冲液作解离剂，将结合在磁性颗粒上的兔IgG洗脱下来，在4℃下用0.02mol/L，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液透析处理，得到纯化的兔免疫球蛋白(IgG)。用紫外分光光度计测定兔IgG浓度，用SDS-PAGE电泳分析兔IgG的纯度，纯度大于98％。

Claims (2)

1.一种应用于蛋白质分离纯化的纳米磁性复合微球的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)将硅烷偶联剂、磁性纳米粒子、去离子水、无水乙醇配成混合液，其中：无水乙醇占混合液总质量的10-50％，磁性纳米粒子占25-50％，硅烷偶联剂占1.25-15％，去离子水占20-60％；用乙酸将混合液PH值调至5.5，在配有回流冷凝管、机械搅拌器，通有氮气的容器中加热到70℃恒温反应1-5小时后，然后用去离子水洗涤多次，磁分离，最后经减压干燥即得硅烷偶联剂修饰的磁性纳米颗粒；

(2)将步骤1得到的硅烷偶联剂修饰的磁性纳米颗粒与功能单体、共聚单体，交联剂混合后加入到含有表面活性剂的水相中，超声乳化均匀后，加入引发剂，然后在配有回流冷凝管、机械搅拌器，通有氮气的容器中，70-80℃恒温反应10-20小时，得到表面功能化的磁性复合微球；

步骤(1)所述的硅烷偶联剂为带端位双键的γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷或乙烯基三甲氧基硅烷；所述的磁性纳米粒子为铁锌氧体、铁钴氧体、四氧化三铁或γ-三氧化二铁，其平均粒径5-30nm，饱和磁化强度40-60emu/g；步骤(2)所述的功能单体为马来酸酐或甲基丙烯酸，共聚单体为苯乙烯；交联剂为二乙烯基苯；引发剂为过硫酸钾或过氧化苯甲酰或它们的混合物；表面活性剂为十二烷基硫酸钠。

2.根据权利要求1所述的一种应用于蛋白质分离纯化的纳米磁性复合微球的制备方法，其特征在于步骤(2)所述硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒子、功能单体、共聚单体、交联剂、表面活性剂、引发剂的各组分占混合物的质量百分比为：硅烷偶联剂修饰的磁性纳米粒子1-13％，功能单体0.5-6％，共聚单体7-13％，交联剂0.1-1％，表面活性剂0.3-4％，引发剂0.05-0.4％，去离子水75％-88％。