CN101972636B - 一种功能型吸附剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种功能型吸附剂的制备方法,包括:(1)将磁性纳米颗粒分散在乙醇和蒸馏水的混合溶液中,然后与正硅酸四乙酯在碱性条件下于35~40℃进行反应20~24h,然后与3~5ml硅烷偶联剂进行反应10~12h,得到表面含有双键的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒悬浮液;(2)以NVCL为单体,MBA为交联剂,TEMED为加速剂,在60~70℃条件下,通过引发剂APS的作用,与悬浮液反应5~7h,即得。本发明操作简便、反应温和,样品来源方便,便于大规模提取纯化;本发明所得到的功能性磁性复合颗粒,粒径均一,化学稳定性高,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物大分子的分离吸附领域,特别涉及一种功能型吸附剂的制备方法。
背景技术
目前,智能型材料(环境敏感型聚合物、刺激-响应型聚合物)作为新型的功能材料已成为当今研究的热点。聚N-乙烯基己内酰胺(PNVCL)是一种具有最低临界溶液温度(LCST)特性的热敏性智能聚合物材料,随着外界温度的变化可在其LCST附件发生可逆相变。它属于乙烯基化的内酰胺化合物,其LCST正好处于生理温度的范围内(30~40℃)。它不仅具有良好的离子型水溶性、热敏性,同时还具有一定的生物相容性。正是由于这些优良的特性,PNVCL在生物大分子的分离、富集、固定化以及药物的包裹和缓释等领域具有潜在的应用价值。
磁性纳米颗粒因其其具有小尺寸效应、生物相容性,以及独特的磁学特性,如超顺磁性和高矫顽力,在生物分离和检测、酶的固定化和靶向药物投递等领域展现了广阔的应用前景。但是由于它具有较高的比表面积,强烈的聚集倾向,所以通常需对其表面进行修饰,降低粒子的表面,进而得到分散性较好的多功能性磁性纳米粒子。适当的表面修饰不仅可以改善其分散稳定性和生物相容性,还可以调节磁性纳米颗粒表面的反应活性,从而更利于其在细胞、蛋白质、核酸等生物大分子分离中的应用。
通过将热敏性聚合物对磁性纳米颗粒的表面进行改性修饰,不仅可以有效的提高磁性粒子的稳定性和分散性,而且可以赋予磁性粒子新的功能特性(即温度响应性),当外界温度高于包含磁性纳米颗粒的热敏性聚合物的LCST时,磁性复合纳米颗粒的表面呈疏水性,由于蛋白质内部存在一定的疏水区域,通过疏水作用,能够有效的吸附蛋白质。当外界温度低于其LCST时,蛋白质可以快速地从热敏性磁性复合颗粒上解离出来,大大改进了磁性纳米粒子对生物大分子的分离。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种功能型吸附剂的制备方法,本发明操作简便、反应温和,样品来源方便,便于大规模提取纯化;本发明所得到的功能性磁性复合颗粒,粒径均一,化学稳定性高,具有良好的应用前景。
本发明的一种功能型吸附剂的制备方法,包括:
(1)将400~600mg磁性纳米颗粒分散在80ml乙醇和20ml蒸馏水的混合溶液中,然后与1~2ml正硅酸四乙酯在碱性条件下于35~40℃进行反应20~24h,制得二氧化硅修饰的磁性纳米颗粒;然后与3~5ml硅烷偶联剂进行反应10~12h,得到表面含有双键的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒悬浮液;
(2)以4~6ml 40~50wt%的N-乙烯基己内酰胺NVCL为单体,10~12ml 5~6wt%的N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA为交联剂,10~12μl 0.5~0.6wt%四甲基乙二胺TEMED为加速剂,在60~70℃条件下,通过10~12ml 0.2~0.4wt%引发剂过硫酸铵APS的作用,与上述悬浮液反应5~7h,制得热敏性聚合物包覆的磁性二氧化硅复合颗粒。
所述步骤(1)中的碱性条件为pH=8~10。
所述步骤(1)中的硅烷偶联剂为三氯乙烯基硅烷。
将制得的热敏性磁性复合颗粒投入到配制好的含有BSA的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中进行吸附反应,反应时,1.5~2.0mg/ml BSA溶液,4~6ml 60~80wt%的热敏磁性复合吸附剂,摇床转速100r/min,35℃反应3h;反应结束后,在外磁场的作用下分离出吸附有BSA功能型吸附剂,再将其投入到Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中,将溶液温度降低于热敏性磁性复合颗粒的低临界溶解温度(LCST),进行洗脱,即可得到所需的BSA。
通过改变吸附的条件,优化吸附的条件,选择最大限度吸附分离牛血清白蛋白(BSA)的条件。
有益效果
(1)本发明操作简便、反应温和,不会因为反应过度剧烈而使得蛋白质变性,样品来源方便,便于大规模提取纯化,所使用的聚N-乙烯基己内酰胺,无毒,具有良好的生物相容性,不会让蛋白质变性,当其包覆完磁性复合颗粒后,其LCST依旧接近于人体的生理温度;
(2)本发明所得到的功能性磁性复合颗粒,粒径均一,形态规整,比表面积大,化学稳定性高,具有一定的生物相容性,吸附蛋白质后,易于从反应体系中分离、蛋白质的吸附量高,且可回收反复的使用,能够有效的降低生产成本,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为热敏性磁性功能复合颗粒的合成流程示意图;
图2为具有生物相容性的热敏性磁性功能复合颗粒的扫描电镜图;
图3为热敏性磁性功能复合颗粒的差示扫描量热(DSC)图;
图4为蛋白质浓度对于蛋白质吸附量的影响;
图5为温度对于蛋白质吸附与解吸附量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.含有双键的二氧化硅修饰的磁性纳米颗粒的制备,具体步骤如下:
1)取5ml质量浓度为80%的磁流体,80ml的乙醇和20ml的蒸馏水一起加入到250ml的三口烧瓶中,在强烈机械搅拌作用下,使之混合均匀。
2)再逐滴加入2ml质量分数为30%的氨水,将溶液pH调至9.0,随后再缓慢滴加1.5ml的正硅酸四乙酯(TEOS),在40℃的条件下,强力搅拌24h。
3)再向上述反应液中逐滴加入3ml的三氯乙烯基硅烷(VTES),持续搅拌12h在外磁性的作用下分离出交联VTES的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒,然后用乙醇和水反复将其清洗3次,除去多余的VTES,最后将产物悬浮于水溶液中。
2.热敏性磁性功能复合颗粒的制备,具体步骤如下:
1)取5ml质量浓度为40%的带有双键的磁性二氧化硅复合颗粒悬浮液与10ml质量浓度5%的NVCL,10ml质量浓度0.5%的MBA,10μl的TEMED以及40ml的蒸馏水一起加入到250ml的三口烧瓶中。
2)将溶液温度升温至70℃,伴随着强力机械搅拌,向溶液中持续通氮气30min,然后再向溶液中用1ml的注射器缓慢注入10ml质量浓度为0.2%的引发剂APS,继续反应5h。
3)在外磁场的作用下将产物分离出来,用双蒸水将产物反复冲洗3次,通过真空冷冻干燥制成粉末。
实施例2
利用热敏性磁性功能复合颗粒从水溶液中吸附分离牛血清白蛋白,具体步骤如下:
1)将50mg(60wt%)的热敏性磁性复合颗粒与10mi浓度为1.6mg/ml的BSA溶液共混在50ml的圆底烧瓶中进行吸附反应,在35℃,100r/min的条件下,反应3h。
2)反应结束后,在外磁场的作用下分离出吸附有BSA功能型吸附剂,再将其投入到1M的NaCl洗脱液中(pH 8.0~9.0),将溶液温度降低于热敏性磁性复合颗粒的低临界溶解温度(LCST),进行洗脱,即可得到所需的BSA。
以热敏性磁性功能复合颗粒为载体分离牛血清白蛋白的条件优化:
1)蛋白质溶液的浓度确定。取5组各50mg (60wt%)的热敏磁性微球,分别加入到浓度为0.4mg/ml,0.8mg/ml,1.2mg/ml,1.6mg/ml,2.0mg/ml的BSA溶液中进行吸附。实验结果如图4,最适的蛋白质浓度为1.6mg/ml。
2)反应温度的确定。取4组各50mg(60wt%)的热敏磁性微球,分别加入到反应温度为20℃、25℃、30℃、40℃的1.6mg/ml的BSA溶液中,进行吸附,反应结束后然后,在20℃的条件下,进行解吸附,分别测定吸附量和解吸附量。实验结果如图5,反应体系温度为35℃时为最适反应条件。
Claims (2)
1.一种功能型吸附剂的制备方法,包括:
(1)将400~600mg磁性纳米颗粒分散在80ml乙醇和20ml蒸馏水的混合溶液中,然后与1~2ml正硅酸四乙酯在碱性条件下于35~40℃进行反应20~24h,制得二氧化硅修饰的磁性纳米颗粒;然后与3~5ml硅烷偶联剂进行反应10~12h,得到表面含有双键的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒悬浮液;所述的碱性条件为pH=8~10;
(2)以4~6ml 40~50wt%的N-乙烯基己内酰胺为单体,10~12ml 5~6wt%的N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,10~12μl 0.5~0.6wt%的四甲基乙二胺为加速剂,在60~70℃条件下,通过10~12ml 0.2~0.4wt%的引发剂过硫酸铵的作用,与上述悬浮液反应5~7h,制得热敏性聚合物包覆的磁性二氧化硅复合颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种功能型吸附剂的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中的硅烷偶联剂为三氯乙烯基硅烷。
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