CN103910794B - 磁性纳米粒子对地木耳藻蓝蛋白的分离纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种磁性纳米粒子对地木耳藻蓝蛋白的分离纯化方法，特别设及一种利用磁性纳米吸附材料从地木耳中分离纯化藻蓝蛋白的方法。采用Fe3O4纳米粒子为磁性核层，无定型SiO2包覆磁性纳米粒子，同时对核壳结构的纳米粒子进行表面改性，引入蛋白质亲和染料配基，制得了一种新型的磁性纳米粒子。该粒子加入地木耳粉的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2)中，在20℃下吸附24‑72h后达到饱和，吸附饱和的磁性纳米粒子加入磷酸盐缓冲液(pH＝4.5)，于37℃脱附24h。经磁性分离得到脱附液，放入‑4℃冰箱中过夜，离心分离得到固体酶粉。该方法将分离与纯化一步完成，方法简单，条件温和，对藻蓝蛋白的活力影响较小，回收率较高。吸附饱和的磁性纳米粒子经洗脱分离出藻蓝蛋白后，经简单处理可以应用于下一次的吸附分离过程，多次重复利用基本不影响对地木耳藻蓝蛋白的分离效率。

Description

磁性纳米粒子对地木耳藻蓝蛋白的分离纯化
技术领域
本发明涉及一种藻蓝蛋白的分离纯化，特别涉及一种利用磁性吸附材料从地木耳中分离纯化藻蓝蛋白的方法，属于精细化工技术领域。
背景技术
地木耳学名普通念珠藻，是陆生一种陆生固氮蓝藻，其在分类学中隶属于蓝藻门，蓝藻纲，念珠藻目，念珠藻科。普通念珠藻广泛分布于世界各地，生长在山丘和平原的岩石、砂石、砂土、草地、田埂以及近水堤岸上，耐干旱，干至手搓即碎时，得水亦能生长。平时所见的是其原植体，外由胶被包裹，内由藻丝弯曲、相互缠绕而成。
地木耳含有多种营养成分，为传统副食品其蛋白质含量高于鸡蛋、木耳、银耳等，总氨基酸含量与发菜、香菇相近，是人体蛋白质的很好来源。地木耳含有脂肪、碳水化合物、粗纤维、钙、磷、铁；其含量均显著高于其他藻类，是儿童缺钙症的良好补充食物，对人体补铁养血也极为有利。此外，还含有多种维生素，其中维生素C含量是紫菜的19倍。
地木耳不含叶绿素，其捕光色素为藻胆体，主要由水溶性的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白等组成。藻蓝蛋白是一类普遍存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，在光合作用中能以近乎100％的高效率将光能优先传递给光系统。藻蓝蛋白也是一种天然色素蛋白，具有水溶性，作为无毒副作用的天然色素蛋白，可取代合成染料应用于食品、化妆品以及医药中。藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能也有促进作用。另外，它还具有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要意义。
虽然藻蓝蛋白具有十分广阔的应用前景，但由于其分离纯化步骤繁琐，造成藻蓝蛋白商品价格昂贵，其应用受到了一定限制。藻蓝蛋白分离纯化过程的费用约占其成本的50％～90％，因此，解决问题的关键在于纯化方法的简化和高效性。传统藻蓝蛋白分离纯化方法包括粗提取和纯化精制两个阶段，首先进行细胞破碎以获取粗提物，常用超声、反复冻融、酶解和高压均质等方法。采用这些方法处理藻粉，能耗高，而且容易造成蛋白变性，使目标蛋白损失率增大。随后将硫酸铵沉淀法与多种色谱层析法(如羟基磷灰石柱、离子交换色谱、分子排阻色漕等)结合使用，达到纯化藻蓝蛋白的目的，不仅耗时长，而且因色谱填料的昂贵造成纯化成本的骤增。
磁性纳米粒子吸附技术是一种集目标产物分离和纯化为一体的新型生物分离技术，具有集成化优势，可以作为经济、高效、适合规模化生产的蛋白质纯化方法。采用该技术代替传统粗提与纯化方法，可以直接从细胞破壁液中捕获目标产物，克服传统分离纯化过程的缺点，简化操作步骤，缩短操作时间，降低纯化成本。
磁性粒子是指在外界磁场存在下能定向运动的粒子。由于它的这一特殊性能，使其在细胞分离、固定化酶、免疫诊断及肿瘤靶向治疗、DNA分离及核酸杂交等方面均有广泛应用。磁性纳米Fe3O4粒子是常见的磁性纳米粒子，具有优异的磁性能、极高的比表面积、优良的热稳定性和表面活性，并且其表面易修饰功能基团，因而在吸附分离方面具有良好的效果。但是，磁性纳米粒子之间强烈的磁性偶极-偶极之间的吸引力导致磁性粒子容易发生聚集。因此，常利用一些带有一些特殊官能团的聚合物来修饰磁性纳米粒子，从而提高磁性纳米粒子的稳定性。磁性纳米粒子一般为核-壳结构，即由磁性纳米Fe3O4粒子组成核，采用有机材料或无机材料为壳层，对磁性纳米Fe3O4粒子进行包覆，形成复合磁性纳米粒子，核壳型纳米复合材料作为新颖功能化结构材料，具有单分散性、核壳结构的可操作性、稳定性、可调控性、自组装性等独特性能。复合纳米粒子的表面进行修饰，引入特定官能团，在保证材料生物安全性的前提下使材料带有磁性和吸附专一性，使回收变得更加易于操作更加有效，并扩展其在其他生物领域的应用。基于磁性分离技术具有操作简便、绿色无毒、内扩散阻力小、置于外加磁场中能够快速从溶液中分离，被吸附的蛋白质或酶可通过洗脱，实现循环利用等优点。因此，研究磁性纳米材料对蛋白质的吸附分离已成为国内外重要的研究课题。
发明内容
本发明是为解决传统藻蓝蛋白分离纯化耗时时间长，步骤繁琐，色谱填料昂贵等问题，提出采用Fe3O4纳米粒子为磁性核层，无定型SiO2包覆磁性纳米粒子，同时对核壳结构的纳米粒子进行表面改性，引入蛋白质亲和配基，制得了一种新型的蛋白亲和磁性纳米粒子，结构式如式1所示。该粒子可以直接从地木耳的细胞破碎液中选择性的吸附分离藻蓝蛋白。
本发明的技术方案由以下部分组成。
1)磁性Fe3O4纳米粒子的制备：将硫酸亚铁和氯化铁溶解在水中，室温下，在氮气保护下，向其中缓慢滴加2mol/L的氢氧化钠溶液，直至溶液的pH值为10-12，搅拌反应3-6h后停止反应，反应过程如式2所示。磁性分离得到的固体粒子用醇水混合溶液、去离子水多次至粒子表面呈中性，得到磁性Fe3O4纳米粒子。
2)Fe3O4@SiO2纳米粒子的制备：将磁性Fe3O4纳米粒子放入乙醇与水的混合溶液中，调节pH值为10，在氮气保护下，滴加正硅酸乙酯的醇水混合溶液，室温下反应3-6h后结束，反应过程如式3所示。利用磁性分离后，用醇水混合溶液、去离子水、无水乙醇洗涤三次至粒子表面呈中性，得到磁性Fe3O4@SiO2纳米粒子。
3)改性Fe3O4@SiO2纳米粒子的制备：Fe3O4@SiO2纳米粒子放入甲苯溶液中，超声分散30min形成悬浮液，在室温条件下滴加γ-胺丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，滴加完毕后，继续反应12-24h，反应过程如式4所示。反应结束后，磁性分离得到的固体，用甲苯洗涤颗粒表面，去掉未反应的胺基硅烷，得到的固体即为胺基改性Fe3O4@SiO2纳米粒子。
4)磁性纳米粒子的制备：将胺基改性Fe3O4@SiO2纳米粒子放入乙醇与水的混合溶液中，调节pH值为10-12，滴加蛋白质亲和染料的水混合溶液，升温至60-90℃反应2-4h。反应结束后利用磁性分离固体粒子，用去离子水洗涤去除未反应的染料，得到磁性纳米粒子，反应过程如式5所示。
5)地木耳原料的预处理。对地木耳原料进行机械粉碎，地木耳粉中加入10-20倍质量的0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2)，温度为18-32℃时浸泡2-6h。浸泡结束后，将其放入超声波破碎机中，开启超声30-90min，对地木耳粉细胞进行破壁处理。过滤去除固体粉末，取上清液待用。
6)藻蓝蛋白的吸附分离：取地木耳粉上清液，向其中加入磁性纳米粒子，混合液放置恒温振荡器中，在20℃下以150r/min速度吸附24-72h，磁性分离取得其中的固体粒子。将吸附饱和的磁性纳米粒子加入磷酸盐缓冲液(pH＝4.5)，放置于37℃恒温振荡器中，以150r/mm速度脱附24h。经磁性分离得到脱附溶液，放入-4℃冰箱中冷冻过夜，离心分离得到固体藻蓝蛋白粉。
上述4)中的胺基改性Fe3O4@SiO2纳米粒子与蛋白质亲和染料的质量比例为1g∶(0.03-0.08)g。
上述6)磁性纳米粒子与地木耳粉上清液的比例为1g∶(50-150)mL。
本发明所采用的磁性纳米粒子具有纳米尺度结构，比表面积很大，实现大容量吸附；粒子中的磁性颗粒能够强化分离速度实现快速分离过程；粒子中的蛋白质亲和染料可以实现粒子对藻蓝蛋白的选择性吸附。因此，本发明制备的磁性纳米粒子能够从地木耳上清液中通过吸附-脱附作用选择性的分离藻蓝蛋白。该方法将分离与纯化一步完成，方法简单，条件温和，对藻蓝蛋白的活力影响较小，回收率较高。
吸附饱和的磁性纳米粒子经洗脱分离出藻蓝蛋白后，经简单处理可以应用于下一次的吸附分离过程，多次重复利用基本不影响对地木耳藻蓝蛋白的分离效率。
下面结合实例对本发明内容进行描述。
具体实施例
实施例1
将5.5g FeCl3.6H2O和2.8g FeSO4.7H2O溶解在50mL去离子水中，室温下，在氮气保护下，向其中缓慢滴加2mol/L的氢氧化钠溶液，直至溶液的pH值为11，搅拌反应60min后停止反应。利用磁性分离后，用醇水混合溶液、去离子水多次至粒子表面呈中性，得到磁性Fe3O4纳米粒子。将0.5g磁性Fe3O4纳米粒子放入150mL乙醇与水的混合溶液(体积比4∶1)中，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为10，在氮气保护下，滴加正30mL硅酸乙酯的醇水混合溶液(含硅酸乙酯1.0mL)，室温下反应5h后结束。磁性分离得到固体颗粒用醇水混合溶液、离子水、无水乙醇洗涤三次至粒子表面呈中性，得到磁性Fe3O4@SiO2纳米粒子。将0.5gFe3O4@SiO2纳米粒子放入150mL甲苯溶液中，超声分散30min形成悬浮液，在室温条件下滴加30mLγ-胺丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液(含γ-胺丙基三乙氧基硅烷1.5mL)，滴加完毕后，继续反应24h，反应结束后，磁性分离得到的固体，用甲苯洗涤颗粒表面，去掉未反应的胺基硅烷，得到的固体即为胺基改性Fe3O4@SiO2纳米粒子。将2g胺基改性Fe3O4@SiO2纳米粒子放入100mL乙醇与水的混合溶液(体积比2∶1)中，调节pH值为10，滴加5.2g蛋白质亲和染料的水混合溶液100mL，升温至80℃反应4h。反应结束后利用磁性分离固体粒子，用去离子水洗涤去除未反应的染料，得到磁性纳米粒子。
对地木耳原料进行机械粉碎，取10g地木耳粉，加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2)150mL，温度为25℃时浸泡5h。浸泡结束后，将其放入功率为1000W，40kHz超声波破碎机中，开启超声30min，对地木耳粉细胞进行破壁处理。过滤去除固体粉末，取上清液待用。向其中加入磁性纳米粒子1.2g，混合放置恒温振荡器中，在20℃下以150r/min速度吸附48h，磁性分离取得其中的固体粒子。将吸附饱和的磁性纳米粒子加入200mL磷酸盐缓冲液(pH＝4.5)，放置于37℃恒温振荡器中，以150r/min速度脱附24h。经磁性分离得到脱附溶液，放入-4℃冰箱中冷冻过夜，离心分离得到固体藻蓝蛋白粉。
经上述方法获得的藻蓝蛋白的提取率为1.2％。
实施例2
将5.5g FeCl3.6H2O和2.8g FeSO4.7H2O溶解在50mL去离子水中，室温下，在氮气保护下，向其中缓慢滴加2mol/L的氢氧化钠溶液，直至溶液的pH值为11，搅拌反应4h后停止反应。利用磁性分离后，用醇水混合溶液、去离子水多次至粒子表面呈中性，得到磁性Fe3O4纳米粒子。将0.5g磁性Fe3O4纳米粒子放入150mL乙醇与水的混合溶液(体积比4∶1)中，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为10，在氮气保护下，滴加正30mL硅酸乙酯的醇水混合溶液(含硅酸乙酯1.0mL)，室温下反应5h后结束。磁性分离得到固体颗粒用醇水混合溶液、离子水、无水乙醇洗涤三次至粒子表面呈中性，得到磁性Fe3O4@SiO2纳米粒子。将0.5g Fe3O4@SiO2纳米粒子放入150mL甲苯溶液中，超声分散30min形成悬浮液，在室温条件下滴加30mLγ-胺丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液(含γ-胺丙基三乙氧基硅烷1.5mL)，滴加完毕后，继续反应24h，反应结束后，磁性分离得到的固体，用甲苯洗涤颗粒表面，去掉未反应的胺基硅烷，得到的固体即为胺基改性Fe3O4@SiO2纳米粒子。将2g胺基改性Fe3O4@SiO2纳米粒子放入100mL乙醇与水的混合溶液(体积比2∶1)中，调节pH值为10，滴加5g蛋白质亲和染料的水混合溶液100mL，升温至90℃反应3h。反应结束后利用磁性分离固体粒子，用去离子水洗涤去除未反应的染料，得到磁性纳米粒子。
对地木耳原料进行机械粉碎，取0.5kg地木耳粉，加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2)50L，温度为25℃时浸泡6h。浸泡结束后，将其放入功率为10000W，40kHz超声波破碎机中，开启超声90min，对地木耳粉细胞进行破壁处理。过滤去除固体粉末，取上清液待用。向其中加入磁性纳米粒子1.0kg，混合放置恒温振荡器中，在20℃下以150r/min速度吸附72h，磁性分离取得其中的固体粒子。将吸附饱和的磁性纳米粒子加入100L磷酸盐缓冲液(pH＝4.5)，放置于37℃恒温振荡器中，以150r/min速度脱附24h。经磁性分离得到脱附溶液，放入-4℃冰箱中冷冻过夜，离心分离得到固体藻蓝蛋白粉。
经上述方法获得的藻蓝蛋白的提取率为0.92％。
实施例3
将实例2中的磁性纳米粒子经0.1mol/L盐酸洗涤，随后用去离子水洗涤值中性，干燥备用。
取100g地木耳粉，加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2)1.5L，温度为25℃时浸泡4h。浸泡结束后，将其放入功率为1000W，40kHz超声波破碎机中，开启超声60min，对地木耳粉细胞进行破壁处理。过滤去除固体粉末，取上清液待用。向其中加入磁性纳米粒子10g，混合放置恒温振荡器中，在20℃下以150r/min速度吸附48h，磁性分离取得其中的固体粒子。将吸附饱和的磁性纳米粒子加入500mL磷酸盐缓冲液(pH＝4.5)，放置于37℃恒温振荡器中，以150r/min速度脱附24h。经磁性分离得到脱附溶液，放入-4℃冰箱中冷冻过夜，离心分离得到固体藻蓝蛋白粉。
经上述方法获得的藻蓝蛋白的提取率为0.94％。

Claims (1)

1.磁性纳米粒子对地木耳藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于所用的磁性纳米粒子具有式(1)所示结构；分离纯化方法包括地木耳原料的预处理和藻蓝蛋白的吸附分离；对地木耳原料进行机械粉碎，地木耳粉中加入10-20倍质量的0.02mol/L的pH=7.2 的磷酸盐缓冲溶液，温度为18-32℃时浸泡2-6h；浸泡结束后，将其放入超声波破碎机中，开启超声30-90min，对地木耳粉细胞进行破壁处理；过滤去除固体粉末，取上清液待用；取地木耳粉上清液，向其中加入磁性纳米粒子，混合液放置恒温振荡器中，在20℃下以150r/min速度吸附24-72h，磁性分离取得其中的固体粒子；将吸附饱和的磁性纳米粒子加入pH=4.5 的 磷酸盐缓冲液，放置于37℃恒温振荡器中，以150r/min速度脱附24h；经磁性分离得到脱附溶液，放入-4℃冰箱中冷冻过夜，离心分离得到固体藻蓝蛋白粉，
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