CN102921357B - 海胆状结构纳米免疫磁珠的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
海胆状结构纳米免疫磁珠的制备方法及其应用,属于免疫学、细胞生物学及磁力学等多方面领域,本发明通过顺序制备二氧化硅纳米球、SiO2Fe3O4结构体、SiO2Fe3O4TiO2核壳结构体、空心Fe3O4TiO2结构体,最后对海胆状的空心Fe3O4TiO2结构体的表面进行修饰。本发明制备方法所需的设备投资少,原料低廉且利用率高、生产费用低、工艺简单、易于操作、反应条件温和、所的材料污染小。达到了现代技术对于绿色环保的要求,是一种非常具有前景的制备免疫磁珠的可行方法。
Description
技术领域
本发明属于免疫学、细胞生物学及磁力学等多方面领域,尤其涉及一种核壳结构纳米免疫纳米磁珠制备技术领域。
背景技术
众所周知,样品前处理是个非常重要的手段,它的成功与否对样品的检测至关重要。利用免疫磁性颗粒来筛选和分离在食物、临床、土壤等环境中的微生物、细胞、化学元素等目标奋力的方法得到越来越多的肯定。由于免疫磁珠的分离筛选方法的快速、高浓缩比、操作简单等优点,在实际中应用很广泛。免疫磁珠基于抗体对抗原的特异性识别.磁性微珠直接或者间接偶联在抗体上,从而与细胞相连在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的等许多优点。
海胆状结构纳米免疫磁珠是一种较新型的免疫磁珠类型,具有显著地优点。在作为免疫磁珠分离目标抗体时由于其为中间空的特殊结构类型。大大减小了微球的密度,使得微球可以在溶液中悬浮,增大了免疫磁珠与目标抗体的接触面积,便于分离。在结构上另外一个显著地优点是多孔结构纳米免疫磁珠最外层为海胆状,很大程度上增加了微球的外比表面积,从而更大的增加了免疫磁珠与目标抗体的接触面积。海胆状结构纳米免疫磁珠体积极小,为微米甚至纳米级别的微球。具有最大的生物相溶性和最小的抗原性。
发明内容
本发明的目的是针对免疫磁珠功能的进一步改进,提供一种海胆状结构纳米免疫磁珠的制备方法。
本发明技术方案包括如下步骤:
1)制备二氧化硅纳米球:以正硅酸乙酯正硅酸乙酯为前驱物,氨水为催化剂,乙醇为溶剂采用St?ber法制备单分散的二氧化硅纳米球;
2)制备SiO2 Fe3O4结构体:以二氧化硅纳米球作为Fe3O4壳层形成的模板,在25~50℃的温度条件下将FeCl2水溶液与二氧化硅纳米球分散液混合,然后经离心,固体物质以水与乙醇交替洗涤后,干燥,制备SiO2 Fe3O4结构体;
3)制备SiO2 Fe3O4TiO2核壳结构体:将SiO2 Fe3O4结构体与氧化钛反应,形成SiO2 Fe3O4TiO2核壳结构体,离心分离,取固体物质用无水乙醇和蒸馏水清洗;
4)制备空心 Fe3O4TiO2结构体:通过碱水热处理SiO2 Fe3O4TiO2核壳结构体,得到海胆状的空心Fe3O4TiO2结构体;
5)对海胆状的空心Fe3O4TiO2结构体的表面进行修饰:修饰空心 Fe3O4TiO2结构体的表面。
与对免疫磁珠功能的进一步改进,本发明的有益效果为:本发明制备方法所需的设备投资少,原料低廉且利用率高、生产费用低、工艺简单、易于操作、反应条件温和、所的材料污染小。达到了现代技术对于绿色环保的要求,是一种非常具有前景的制备免疫磁珠的可行方法。
在所述步骤3)中,先将SiO2 Fe3O4结构体溶解于乙醇中,然后加入氨水,温度保持在60℃,搅拌后滴加钛酸丁酯,经水解缩合反应形成SiO2 Fe3O4TiO2核壳结构体。
在所述步骤4)中,将SiO2 Fe3O4TiO2核壳结构体分散水中,加入碱溶液后,再将溶液于110℃环境温度下反应,得到空心 Fe3O4TiO2结构体。
所述碱溶液为NaOH水溶液,或KOHLiOHCa(OH)2 NH3·H2O。
所述碱溶液的浓度为1.0~2.0 mol/l。
由于碱浓度对表面氧化钛的形貌也起着重要的调节作用,本发明通过控制碱的浓度以增强海胆状结构纳米免疫磁珠的最外层纤维化程度,从而增大海胆状构纳米免疫磁珠的外比表面积。
本发明还提出了海胆状结构纳米免疫磁珠在作为免疫磁珠分离目标抗体时的应用。
先将海胆状结构纳米免疫磁珠加入被检测样品中,使被检测样品中的目标和免疫磁珠上已固定的抗体产生特异性反应;然后通过磁场下吸附免疫磁珠和已经被免疫磁珠捕获的被检测样品中的目标;最后收集免疫磁珠和已经被免疫磁珠捕获的被检测样品中的目标,用于生物检测或铺盘。
本发明海胆状结构纳米免疫磁珠具有良好的磁性。在分离步骤中免疫磁分离效率高,15分钟分离率可达到 99~100%。
海胆状空心Fe3O4TiO2结构磁分离优点:
1、分离速度快、效率高、可重复性好;
2、操作简单、不需要复杂手段或昂贵的设备;
3、不影响被分离细胞或其他生物的生物学性状和性能。
附图说明
图1为本发明中采用溶胶-凝胶法与模板法等相结合的方法制备多孔海胆状结构纳米免疫磁珠的制备示意图。
图2为SiO2球模板的SEM图片。
图3为为SiO2Fe3O4 的SEM图片。
图4为SiO2 Fe3O4 TiO2 的SEM图片。
图5为海胆状空心Fe3O4TiO2的SEM图片。
具体实施方式
一、如图1所示,制备海胆状结构纳米免疫磁珠:
1、利用改进的St?ber法制备单分散氧化硅纳米球:
采用St?ber法,以10 ml TEOS(正硅酸乙酯正硅酸乙酯)为前驱物,30 ml氨水为催化剂,200 ml乙醇为溶剂,制备单分散的二氧化硅纳米球,干燥后待用。
取得的二氧化硅纳米球的SEM图片如图2所示。
2、制备SiO2 Fe3O4结构体:
配制0.6g/100ml的FeCl2水溶液,待用。
以二氧化硅纳米球作为Fe3O4壳层形成的模板,在25~50℃的温度条件下,将FeCl2水溶液加入到二氧化硅纳米球分散液中,FeCl2水溶液和二氧化硅纳米球的混合质量比为1︰1,经2小时后,将混合物离心,取固体物质以水与乙醇交替洗涤,再经50℃干燥,即取得SiO2 Fe3O4结构体,待用。
取得的 SiO2Fe3O4 的SEM图片如图3所示。
3、制备SiO2 Fe3O4TiO2核壳结构体:
取0.5 g SiO2 Fe3O4结构体,超声溶解在200ml乙醇中,加1.2ml氨水。温度保持在60℃,搅拌10min,逐滴加入2ml钛酸丁酯,发生水解缩合反应,反应时间为2小时即可,生成的二氧化钛包覆在SiO2 Fe3O4表面,获得SiO2 Fe3O4TiO2核壳结构体,离心分离,取固体物质,用无水乙醇和蒸馏水清洗,待用。
取得的SiO2 Fe3O4 TiO2 的SEM图片如图4所示。
4、制备空心 Fe3O4TiO2结构体:
将0.1g制备得到的SiO2 Fe3O4TiO2,超声分散在15ml水中,再加入浓度为1~2mol/L的NaOH水溶液,或者KOHLiOHCa(OH)2 NH3·H2O溶液15ml,然后,将溶液转移至50ml反应釜中,110℃反应2个小时,得到空心 Fe3O4TiO2结构体。
取得海胆状的空心Fe3O4TiO2的SEM图片如图5所示。
5、对海胆状的空心Fe3O4TiO2结构体的表面进行抗体修饰。
取0.1g海胆状的空心Fe3O4TiO2结构体,对具有磁性的海胆状的空心Fe3O4TiO2结构体依次进行氨基化修饰、醛基化修饰。
海胆状的空心Fe3O4TiO2结构体的氨基化修饰:将0.4mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)滴加到海胆状的空心Fe3O4TiO2结构体的乙醇悬浮液中,并在室温下搅拌7h。然后,利用外加磁场,将APTES修饰的磁性颗粒从反应介质中分离出,并用乙醇溶液对其清洗5次,取得氨基化复合颗粒。
在修饰完APTES之后,对海胆状的空心Fe3O4TiO2结构体的醛基化修饰:将氨基化复合颗粒加入到50 mL质量分数为3%的戊二醛的磷酸缓冲溶液(PBS)中,并在37℃下搅拌3h后,用PBS溶液对其清洗3次,取得磁珠。
醛基化磁珠与多克隆抗体偶联:取400μL磁珠,加5ml多克隆抗体(用Na2CO3-NaHCO3 1:500稀释),37℃振荡(确保颗粒不沉淀)反应2h。用Na2CO3-NaHCO3清洗3次。
利用生物素共轭修饰的办法可以把抗体稳定地修饰到抗生蛋白链菌素上。为了避免交叉反应,试验过程中利用亲和纯化的多克隆抗体。改变不同的保护基团,如牛血浆蛋白可以降低蛋白质或其他生物分子的非特异性吸附。另外,实验过程中通过SPR, QCM, SEM, AFM等方法对抗体固定进行跟踪表征以确保抗体的良好连接。
二、海胆状结构纳米免疫磁珠在作为分离目标抗体示例:
将待检测样品和海胆状核壳结构纳米免疫磁珠加入到样品管中。样品管在匀速旋转、变速旋转、静止富集或正反向旋转状态的不同组合下,样品管中的被检测样品中的目标和免疫磁珠上已固定的抗体产生特异性反应;在固定磁场下,把免疫磁珠和已经被免疫磁捕获的被检测样品中的目标吸附在样品管内壁;收集免疫磁珠和已经被免疫磁捕获的被检测样品中的目标,用于生物检测或铺盘。
海胆状空心Fe3O4TiO2结构磁分离优点:
1、分离速度快、效率高、可重复性好;
2、操作简单、不需要复杂手段或昂贵的设备;
3、不影响被分离细胞或其他生物的生物学性状和性能。
Claims (2)
1.一种海胆状结构纳米免疫磁珠的制备方法,包括如下步骤:
1)制备二氧化硅纳米球:采用St?ber法,以10 ml正硅酸乙酯为前驱物,30 ml氨水为催化剂,200 ml乙醇为溶剂,制备单分散的二氧化硅纳米球,干燥;
2)制备SiO2 Fe3O4结构体:配制0.6g/100ml的FeCl2水溶液,以二氧化硅纳米球作为Fe3O4壳层形成的模板,在25~50℃的温度条件下,将FeCl2水溶液加入到二氧化硅纳米球分散液中,FeCl2水溶液和二氧化硅纳米球的混合质量比为1:1,经2小时后,将混合物离心,取固体物质以水与乙醇交替洗涤,再经50℃干燥;
3)制备SiO2 Fe3O4TiO2核壳结构体:取0.5 g SiO2 Fe3O4结构体,超声溶解在200ml乙醇中,加1.2ml氨水,温度保持在60℃,搅拌10min,逐滴加入2ml钛酸丁酯,发生水解缩合反应,反应时间为2小时即可,生成的二氧化钛包覆在SiO2 Fe3O4表面,获得SiO2 Fe3O4TiO2核壳结构体,离心分离,取固体物质,用无水乙醇和蒸馏水清洗;
4)制备空心 Fe3O4TiO2结构体:将0.1g制备得到的SiO2 Fe3O4TiO2,超声分散在15ml水中,再加入浓度为1~2mol/L的NaOH水溶液15ml,然后,将溶液转移至50ml反应釜中,110℃反应2个小时,得到空心 Fe3O4TiO2结构体;
5)对海胆状的空心Fe3O4TiO2的表面进行修饰:对具有磁性的海胆状的空心Fe3O4TiO2结构体依次进行氨基化修饰、醛基化修饰。
2. 如权利要求1所述方法制备的海胆状结构纳米免疫磁珠在作为免疫磁珠分离目标抗体时的应用,其特征在于:先将海胆状结构纳米免疫磁珠加入被检测样品中,使被检测样品中的目标和免疫磁珠上已固定的抗体产生特异性反应;然后通过磁场下吸附免疫磁珠和已经被免疫磁珠捕获的被检测样品中的目标;最后收集免疫磁珠和已经被免疫磁珠捕获的被检测样品中的目标,用于生物检测或铺盘。
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