CN102718931B

CN102718931B - 一种生物医学用超顺磁性复合微球的制备方法

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Publication number: CN102718931B
Application number: CN2012101570111A
Authority: CN
Inventors: 杨冬芝; 于坤; 李春霞; 幺崇正; 聂俊
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2032-05-18
Also published as: CN102718931A

Abstract

本发明涉及一种生物医学用超顺磁性复合微球的制备方法。首先，采用共沉淀法制备具有超顺磁性的Fe₃O₄纳米粒子，制备出的Fe₃O₄纳米粒子经表面活性剂修饰，分散到去离子水中形成水基磁流体。其次，制备表面具有羧基官能团的无机/有机核壳微球，所述的超顺磁性复合微球为无机/有机核壳结构，具有复合物材料的特性和生物学效应，微球表面具有活性官能团，可以与多种生物活性物质结合。本发明方法制备的磁微球表面含有活性羧基基团，且具有超顺磁性，磁含量大，在外加磁场下很容易被磁化分离，移除磁场微球磁性立即消失。本发明制备的磁微球可广泛应用于生物医学领域中肿瘤细胞的检测及分离操作。此方法实验简单，快速、成本低。

Description

一种生物医学用超顺磁性复合微球的制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物技术与高分子磁微球结合，用于肿瘤细胞检测的功能性超顺磁性复合微球的制备方法。

背景技术

对于癌症患者，细胞在初期发生病变和癌细胞在形成时,组织和血液中便会存在微量癌细胞。如果能早期发现细胞癌变，治愈率可达80%，这是世界卫生组织的权威性结论。故及时简单的检测出循环血液中的微量的癌细胞，对预防肿瘤细胞继续扩散对癌症患者的治疗具有重要意义。

目前关于扩散肿瘤细胞检测的检测技术有荧光标记法、HE染色法、免疫组织化学法、PCR技术、流式细胞仪等检测手段，但是这些方法检测过程复杂、耗费时间和精力，对检测人员的要求高，检测成本高，对病人带来的痛苦大。利用具有超顺磁性带有特异性抗体的磁性微球，在外加磁场下，能够快速的将吸附有特异性抗原的微量细胞进行富集和分离，富集到的细胞用显微镜或特异性的检测试纸就能判断出组织或血液中是否有病原存在。本发明制备出的磁微球具备以上功能，具有很好的发展前景。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术所存在的上述问题，提供一种简单准确的检测肿瘤细胞的方法。为实现上述目的，本发明采用了下列技术方案：

用于肿瘤细胞检测的磁性复合微球，其粒径为纳米到微米级，具有高的比表面积，能够偶联高含量的单克隆抗体，能够更好的与特异性抗原结合，而对于没有抗原的细胞没有任何作用；又因为复合微球具有超顺磁性，在外加磁场下能够快速简单的进行分离。根据要检测的肿瘤细胞选择不同的单克隆抗体偶联到磁性微球表面，根据抗原抗体的特异靶向识别并结合目标抗原。借助外加磁场很容易的将吸附肿瘤细胞的磁性微球分离出来，在光学显微镜下就可以观察到磁性微球是否吸附了肿瘤细胞。本发明采用的免疫导向技术具有高度专一性、特异性有望于用于多种肿瘤细胞的检测。

本发明的主要目的是提供一种能够识别肿瘤细胞的磁性微球的制备方法：

可以偶联肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌等任何一种细胞抗体的磁性复合微球的制备方法主要由以下步骤组成：

一种生物医学用超顺磁性复合微球的制备方法，其特征在于：

（1）采用共沉淀法制备的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子；制备方法为：按0.5mol/L分别配FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O溶液，按[Fe³⁺]:[Fe²⁺]=1.5~2:1的配比分别量取FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O溶液，配成混合液，通氮气保护，50℃~80℃下加入氨水，调节体系pH=9~11，搅拌均匀后待体系冷却至室温，用去离子水洗涤至中性得到Fe₃O₄纳米粒子；

（2）取洗涤至中性的Fe₃O₄分散到去离子水中，氮气保护升温至60℃~80℃，加入Fe₃O₄总质量22.3%~55.8%的油酸，反应30~60min，冷却至室温，加入油酸质量30%~50%的十二烷基苯磺酸钠；

（3）将100份分散介质，相对分散介质质量分数为0.5%-2.5%的分散剂分散到四口烧瓶中，升温搅拌至分散剂溶解；将体积份数为10~30份的磁流体，7~10份单体，0.7~2份二乙烯基苯交联剂，单体质量分数0.6%~4%的引发剂混合，超声分散均匀；氮气保护下，升温至65~80℃，控制转速在300~800rpm下，将上述超声分散均匀的混合物滴加入四口烧瓶中，反应4~10h；反应结束后用乙醇和去离子水洗涤产物，室温真空干燥得表面羧基化的超顺磁性复合微球备用；

所述的单体为苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯中的一种或两者混合物，与甲基丙烯酸或丙烯酸中的一种；引发剂为过氧化苯甲酰或过硫酸钾中的一种或两者混合物；分散介质为乙醇或去离子水中的一种或两者复合；分散剂为聚乙烯醇或聚乙烯基吡咯烷酮。

（4）偶联抗体的磁微球的制备方法为：取一定量权利要求1步骤（3）中制备的磁微球，浸泡到质量分数为1%的醋酸水溶液中，室温过夜；将处理后的磁微球用磷酸盐缓冲液洗涤，除去微球表面的醋酸，最后用磷酸盐缓冲液稀释磁微球，用移液器吸取200μL上述磷酸盐缓冲液稀释的磁微球悬浮液，按照微球与荧光二抗质量比为100:1的配比，按照微球与荧光二抗质量比为100:1的配比，将FITC标记山羊抗小鼠IgG溶液与磁微球悬浊液混合，在4℃~37℃恒温摇床中150r/min震荡2h~24h。

实验中的荧光二抗替换为肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌等任何一种细胞抗体或抗原。

本发明合成的磁性复合微球的粒径范围在10~150μm之间，磁含量可达30%，微球的饱和磁化强度可达18.35 emu/g，且具有超顺磁性，在外加磁场下30s就可将磁微球从溶液中完全分离，撤除磁场微球磁性消失且可被重新分散。磁微球表面含有亲水基团羧基，羧基可以与抗体偶合。通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜用波长为488nm的激发，可看到磁微球发绿光，实验证明了本发明制备的磁微球表面羧基可以成功偶联抗体。本发明合成的微球，磁含量较高，具有超顺磁性，表面羧基基团具有活性，并且磁微球制备工艺简单，陈本较低，在生物医学检测等方面具有很广的应用前景。

附图说明

图1 本发明超顺磁性复合微球光学显微镜照片

图2 本发明超顺磁性微球包被荧光二抗后a.显微镜照片b.荧光照片

图3 本发明超顺磁性微球包被荧光二抗激光共聚焦显微镜照片

图4 本发明超顺磁性微球热失重曲线

图5 本发明超顺磁性微球微球磁滞回线

图6 本发明超顺磁性微球红外谱图

具体实施方式

实施例一：按0.5mol/L分别配制100mL标准FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O溶液，取63mL Fe³⁺溶液和37mL Fe²⁺溶液置于250ml四口烧瓶中。氮气保护下高速搅拌，水浴加热体系至80℃，迅速加入浓氨水，调节体系pH=10。此时体系立即变为黑色，水解产生大量的黑色Fe₃O₄纳米粒子。反应1h，继续通氮气至体系冷却至室温，用去离子水洗涤多次至上清液的pH值至中性。称取净含量为3g的Fe₃O₄纳米粒子，分散到100mL去离子水中，氮气保护升温至80℃，加入1.34g油酸，反应40min，冷却至室温，加入0.67g十二烷基苯磺酸钠，搅拌半小时，制得磁流体，将制备出的磁流体密封保存。取20ml磁流体，6mL苯乙烯，2mL甲基丙烯酸，0.7mL二乙烯基苯，0.28g过氧化苯甲酰，将上述物质混合超声20min。在四口烧瓶中加入100mL去离子水，1g聚乙烯醇。氮气保护下，升温至75℃，控制转速为500rpm下，将上述超声结束的混合物滴加入四口烧瓶中，反应4h。反应结束分别用乙醇和去离子水洗涤3次，室温真空干燥备用。取制备的磁性复合微球3mg浸泡到质量分数为0.1%的醋酸中，室温过夜。用PBS缓冲液（PBS，pH=7.2~7.4）洗涤除去微球表面的醋酸，最后用PBS稀释磁微球至浓度为50mg/mL，用移液器吸取200μL上述PBS磁微球悬浮液，加入0.5mg/mL 200μL FITC标记的山羊抗小鼠IgG。在25℃恒温震荡培养箱中，调节转速为150r/min，震荡12h。

实施例二：本实施方式与实施例一的不同点在于：按0.5mol/L分别配制100mL标准FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O溶液，取60mL Fe³⁺溶液和40mL Fe²⁺溶液置于250ml四口烧瓶中。氮气保护下高速搅拌，水浴加热体系至50℃，迅速加入浓氨水，调节体系pH=9。此时体系立即变为黑色，水解产生大量的黑色Fe₃O₄纳米粒子。反应1h，继续通氮气至体系冷却至室温，用去离子水洗涤多次至上清液的pH值至中性。称取净含量为3g的Fe₃O₄纳米粒子，分散到100mL去离子水中，氮气保护升温至60℃，加入1.67g油酸，反应30min，冷却至室温，加入0.5g十二烷基苯磺酸钠，搅拌半小时，制得磁流体。

实施例三：本实施方式与实施例一的不同点在于：按0.5mol/L分别配制100mL标准FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O溶液，取66.5mL Fe³⁺溶液和33.5mL Fe²⁺溶液置于250ml四口烧瓶中。氮气保护下高速搅拌，水浴加热体系至75℃，迅速加入浓氨水，调节体系pH=11。此时体系立即变为黑色，水解产生大量的黑色Fe₃O₄纳米粒子。反应60min，继续通氮气至体系冷却至室温，用去离子水洗涤多次至上清液的pH值至中性。称取净含量为3g的Fe₃O₄纳米粒子，分散到100mL去离子水中，氮气保护升温至70℃，加入0.67g油酸，反应1h，冷却至室温，加入0.26g十二烷基苯磺酸钠，搅拌半小时，制得磁流体。

实施例四：本实施方式与实施例二的不同点在于：取10mL磁流体，6mL苯乙烯，2mL甲基丙烯酸甲酯，2mL甲基丙烯酸，2mL二乙烯基苯，0.15g过氧化苯甲酰和0.05g过硫酸钾。在四口烧瓶中加入80mL去离子水和20mL乙醇，2.4g聚乙烯醇。氮气保护下，升温至80℃，控制转速在800rpm下，将上述超声结束的混合物滴加入四口烧瓶中，反应6h。反应结束后分别用乙醇和去离子水洗涤3次，室温真空干燥备用。取制备的磁性复合微球3mg浸泡到质量分数为0.1%的醋酸中，室温过夜。用PBS缓冲液洗涤除去微球表面的醋酸，最后用PBS稀释磁微球至浓度为50mg/mL，用移液器吸取200μL上述PBS磁微球悬浮液，加入0.5mg/mL200μL FITC标记的山羊抗小鼠IgG。在37℃恒温震荡培养箱中，调节转速为150r/min，震荡2h。

实施例五：本实施方式与实施例三的不同点在于：取30mL磁流体，6mL苯乙烯，2mL甲基丙烯酸甲酯，1mL丙烯酸，1mL二乙烯基苯，0.05g过氧化苯甲酰，将上述物质混合分散20min。在四口烧瓶中加入100mL乙醇，0.4g聚乙烯吡咯烷酮。氮气保护下，升温至65℃，控制转速在300rpm下，将上述超声结束的混合物滴加入四口烧瓶中，反应10h。反应结束后分别用去乙醇和去离子水洗涤3次，室温真空干燥备用。取制备的磁性复合微球3mg浸泡到质量分数为0.1%的醋酸中，室温过夜。用PBS缓冲液洗涤除去微球表面的醋酸，最后用PBS稀释磁微球至浓度为50mg/mL，用移液器吸取200μL上述PBS磁微球悬浮液，加入0.5mg/mL 200μL FITC标记的山羊抗小鼠IgG。在4℃恒温震荡培养箱中，调节转速为150r/min，震荡24h。

附图为具体实施例五条件下制备的微球的测试结果，其余条件下制备出的微球与具体实施例五制备出的微球只是在微球粒径大小，粒径分布，微球的磁含量，饱和磁化强度和表面羧基含量上有区别，但是所有条件下制备出的磁微球均能用于肿瘤细胞检测，且实施例中的FITC标记的山羊抗小鼠IgG可被肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌等任何一种细胞抗体或抗原所替代。

Claims

1.一种生物医学用超顺磁性复合微球的应用，其特征在于：取超顺磁性复合微球，浸泡到质量分数为1%的醋酸水溶液中，室温过夜；将处理后的磁微球用磷酸盐缓冲液洗涤，除去微球表面的醋酸，最后用磷酸盐缓冲液稀释磁微球，按照微球与荧光二抗质量比为100:1的配比，将FITC标记山羊抗小鼠IgG溶液与磁微球悬浊液混合，在4℃～37℃恒温摇床中150r/min震荡2h～24h；

其中超顺磁性复合微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）采用共沉淀法制备的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子；制备方法为：按0.5mol/L分别配FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O溶液，按[Fe³⁺]:[Fe²⁺]=1.5～2:1的配比分别量取FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O溶液，配成混合液，通氮气保护，50℃～80℃下加入氨水，调节体系pH=9～11，搅拌均匀后待体系冷却至室温，用去离子水洗涤至中性得到Fe₃O₄纳米粒子；

（2）取洗涤液至中性的Fe₃O₄纳米粒子分散到去离子水中，氮气保护升温至60℃～80℃，加入Fe₃O₄总质量22.3%～55.8%的油酸，反应30～60min，冷却至室温，加入油酸质量30%～50%的十二烷基苯磺酸钠，得到表面被改性的Fe₃O₄纳米粒子磁流体；

（3）将100份分散介质，相对分散介质质量分数为0.5%～2.5%的分散剂分散到四口烧瓶中，搅拌至分散剂溶解；将体积份数为10～30份的磁流体，7～10份单体，0.7～2份二乙烯基苯交联剂，单体质量分数0.6%～4%的引发剂混合，超声分散均匀；氮气保护下，升温至65～80℃，控制转速在300～800rpm下，将上述超声分散均匀的混合物滴加入四口烧瓶中，反应4～10h；反应结束后用乙醇和去离子水洗涤产物，室温真空干燥得表面羧基化的超顺磁性复合微球备用；

所述的单体为苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯中的一种或两者混合物，与甲基丙烯酸或丙烯酸中的一种；引发剂为过氧化苯甲酰或过硫酸钾中的一种或两者混合物；分散介质为乙醇或去离子水中的一种或两者复合；分散剂为聚乙烯醇或聚乙烯基吡咯烷酮；

2.根据权利要求1所述应用，其中荧光二抗替换为肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌任何一种细胞抗体或抗原。