CN107638572A - 一种pH响应型超灵敏纳米荧光探针及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子影像技术领域，公开了一种pH响应型超灵敏纳米荧光探针及制备方法，由pH响应性基质材料和有荧光有机小分子染料组成。pH响应性基质材料为：磷酸钙、羟基磷酸钙、氟磷灰石、碳酸钙、ZIF系列；荧光有机小分子染料为带正电染料或带负电染料。制备方法包括：带负电基质材料包覆带正电染料；带负电基质材料包覆带负电染料；带正电的基质材料包覆带负电的染料。本发明相比于传统小分子荧光染料，可大大提高荧光成像的灵敏度和特异性，实现肿瘤微环境响应的超灵敏检测；肿瘤微环境的独特性质所制备的特异性响应探针具有靶向性高，背景信号低，信噪比高等优点，可以实现微小肿瘤的超灵敏检测。

Description

一种pH响应型超灵敏纳米荧光探针及制备方法
技术领域
本发明属于分子影像技术领域，尤其涉及一种pH响应型超灵敏纳米荧光探针及制备方法。
背景技术
分子影像技术因其能够在活体水平实现实时、无创、动态成像，可用于研究活体内疾病或肿瘤的发生、发展及转移等过程。光学成像技术具有无辐射、灵敏度高、生物组织光损伤小等优点，在肿瘤在体监测研究领域中展现出巨大的潜力。肿瘤组织部位由于细胞的快速增殖往往导致糖代谢较快，氧气消耗量大，肿瘤微环境中酸性代谢物(例如乳酸)积累多，因此肿瘤微环境一般具有弱酸性，乏氧，产生诸多细胞因子和生物酶高表达等特点。常规有机小分子荧光探针由于其在体非特异性分布，导致有机染料普遍存在生物分布特异性差，背景信号高，且光稳定性差，易光漂白等缺点，在生物在体成像应用中受到一定的限制，无法应用于微小肿瘤的检测。利用生物智能响应型纳米材料负载小分子荧光探针不仅可以提高小分子荧光探针的光稳定性，而且能够实现探针的高效特异性富集和pH调控的荧光增强，已经成为分子影像领域的热门研究方向。
综上所述，现有技术存在的问题是：常规有机小分子荧光探针普遍存在生物分布特异性差，背景信号高，光稳定性差。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种pH响应型超灵敏纳米荧光探针及制备方法。
本发明是这样实现的，一种pH响应型超灵敏纳米荧光探针，所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针由pH响应性基质材料和有荧光有机小分子染料组成；
所述带负电pH响应性基质材料为：磷酸钙(calcium phosphate，简称CaP)、羟基磷酸钙、氟磷灰石、碳酸钙。
进一步带正电pH响应性基质材料为沸石咪唑类骨架材料(ZIF)系列；
所述荧光有机小分子染料为带正电染料或带负电染料。
进一步，所述带正电染料为：IR780，RhB，IR800。
进一步，所述带负电染料为：Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ICG、ICG-Der-01、ICG-Der-02、ICG-Der-03、IR820、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor660、AlexaFluor 647、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 610、AlexaFluor 594、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 488、FITC。
本发明的另一目的在于提供一种所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针的制备方法，所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针的制备方法包括以下三种方法，具体为：
第一种方法，带负电基质材料包覆带正电染料，通过聚丙烯酸(Polyacrylicacid,简称PAA)与带正电染料静电作用而使染料吸附于PAA分子链上，吸附染料后的PAA在异丙醇中自组装形成模版，同时通过聚集淬灭染料的荧光；PAA上裸露羧基通过与Ca2+配位，通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在PAA球表面，形成染料包覆的纳米粒子；
第二种方法，带负电基质材料包覆带负电染料，通过聚乙烯亚胺(Polyetherimide，简称PEI)PEI对带负电染料的吸附使染料富集在PEI链，同时加入带负电的PAA，PEI同时吸附染料和PAA，自组装成PEI/PAA纳米球，PAA上裸露羧基通过与Ca2+配位，通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在PAA球表面，形成染料包覆的纳米粒子；
第三种方法，带正电的基质材料包覆带负电的染料，利用甲基咪唑和包覆染料的互相静电吸附作用使染料分子吸附配体分子，同时导致染料的聚集，加入金属离子与配体配位形成稳定的三维立体结构，形成染料包覆的纳米粒子。
进一步，所述第一种方法中：带负电的pH响应性基质材料是磷酸钙，碳酸钙，羟基磷酸钙，氟磷灰石；带正电染料是IR780、RhB、IR800。
进一步，所述第二种方法中：带负电pH响应性基质材料是磷酸钙，碳酸钙，羟基磷酸钙，氟磷灰石；负电染料是ICG、IR820、Alexa Fluor系列染料以及Cy系列染料。
进一步，所述第三种方法中：pH响应性基质材料是ZIF系列的MOF材料；负电染料可以是ICG、IR820、AlexaFluor系列染料以及Cy系列染料。
本发明的另一目的在于提供一种所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针的使用方法，所述使用方法包括：
纳米粒子尾静脉注射进入小鼠体内，通过EPR效应到达肿瘤部位并在肿瘤部位达到富集，在正常组织和血液中，pH呈中性或弱碱性，纳米粒子中荧光分子处于聚集淬灭状态，在肿瘤部位由于其弱酸性条件引起基质材料CaP溶解并释放荧光分子，IR780恢复自由分子状态后荧光恢复，实现荧光增强。
本发明的另一目的在于提供一种由所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针制备的CaP/IR780探针、CaCO3/RhB探针。
本发明的另一目的在于提供一种由所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针制备的CaP/ICG探针、CaCO3/Cy5探针。
本发明的另一目的在于提供一种由所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针制备的ZIF-8/ICG探针。
本发明的优点及积极效果为：通过基质材料对肿瘤微环境弱酸性的响应可实现小分子荧光探针在肿瘤部位的特异性高效富集和可控释放，释放后的探针荧光强度显著增强，实现了对肿瘤原发灶和转移灶的超灵敏检测；基质纳米材料具有pH响应特性，在中性条件下，纳米粒子中负载的荧光分子因为处于聚集状态而导致荧光淬灭；在肿瘤微环境中的弱酸性条件下，基质材料溶解，使得纳米粒子中负载的荧光分子恢复单分子状态，荧光恢复，实现肿瘤微环境酸性响应的荧光增强，可实现肿瘤早期精准成像和实时监测。
本发明通过纳米材料在肿瘤部位的被动靶向(EPR)效应，能够实现在肿瘤部位的高效富集，能够利用对肿瘤微环境具有pH响应的特性，实现肿瘤特异性的荧光增强。在到达肿瘤部位之前，探针中的荧光分子由于负载于基质材料中形成聚集态而导致荧光淬灭，荧光信号处于关闭(OFF)的状态；而当探针处于肿瘤微环境的弱酸性条件下时，有机荧光分子被从基质材料中释放出来，实现pH响应的“解聚集”，使得荧光信号恢复(ON)。OFF-ON的开关可以最大程度地降低荧光探针的背景信号，显著提高成像信噪比近3倍。相比于传统小分子荧光染料，可大大提高荧光成像的灵敏度和特异性，实现肿瘤微环境响应的超灵敏检测；肿瘤微环境的独特性质所制备的特异性响应探针具有靶向性高，背景信号低，信噪比高等优点，可以在体实现小于1mm的微小肿瘤的超灵敏检测。
附图说明
图1是本发明实施例提供的pH响应型超灵敏纳米荧光探针的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的CaP/IR780-PEG TEM图。
图3是本发明实施例提供的CaP/IR780-PEG SEM图。
图4是本发明实施例提供的CaP/IR780-PEG DLS图。
图5是本发明实施例提供的CaP/IR780pH响应特性紫外吸收光谱示意图。
图6是本发明实施例提供的CaP/IR780pH响应特性荧光光谱示意图。
图7是本发明实施例提供的ZIF8/ICG SEM图。
图8是本发明实施例提供的CaP/IR780在不同介质中稳定性曲线。
图9是本发明实施例提供的纳米探针细胞毒性实验。
图10是本发明实施例提供的纳米探针4T1皮下瘤成像实验。
图11是本发明实施例提供的纳米探针MCF7皮下瘤成像实验。
图12是本发明实施例提供的纳米探针脑原位瘤成像实验。
图13是本发明实施例提供的纳米探针4T1淋巴结转移瘤成像实验。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的pH响应型超灵敏纳米荧光探针由pH响应性基质材料和有荧光有机小分子染料组成。
pH响应性基质材料对pH有较快的响应速度，通过其对弱酸性条件的响应实现pH响应型染料分子释放，其主要选择可以是：磷酸钙，羟基磷酸钙，氟磷灰石，碳酸钙，ZIF系列等pH响应性基质材料；基质材料具有生物相容性好，pH响应速度快，代谢产物安全无毒等优点。
荧光有机小分子染料为荧光信号来源，通过pH响应型聚集和解聚集实现荧光的淬灭/恢复的转变来实现pH响应性荧光增强(OFF-ON)。有机荧光小分子为具有聚集淬灭效应的染料分子，可以是：IR780，RhB，IR800等带正电染料，也可以是Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ICG、ICG-Der-01、ICG-Der-02、ICG-Der-03、IR820、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 700、AlexaFluor 680、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor546、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor488、FITC等带负电染料，荧光有机小分子染料具有发射波长较长，在体光散射信号弱，探测深度深，碱稳定性好等优点。
如图1所示，本发明实施例提供的pH响应型超灵敏纳米荧光探针的制备方法包括以下步骤：
S101：通过PAA与带正电染料静电作用而使染料料吸附于PAA分子链上，吸附染料后的PAA在异丙醇中自组装形成模版；
S102：通过聚集淬灭染料的荧光；PAA上裸露羧基通过与Ca2+配位，通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在PAA球表面，形成染料包覆的纳米粒子；
带负电基质材料可以是磷酸钙，碳酸钙，羟基磷酸钙，氟磷灰石等，应用于此例的正电染料可以是IR780、RhB、IR800等。可合成的探针包括CaP/IR780、CaCO3/RhB等。
本发明实施例提供的pH响应型超灵敏纳米荧光探针的制备方法还包括：带负电基质材料包覆带负电染料，通过PEI对带负电染料的吸附使染料富集在PEI链，同时加入带负电的PAA，PEI同时吸附染料和PAA，自组装成PEI/PAA纳米球，PAA上裸露羧基通过与Ca2+配位，通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在PAA球表面，形成染料包覆的纳米粒子；
带负电基质材料可以是磷酸钙，碳酸钙，羟基磷酸钙，氟磷灰石等，应用于此例的负电染料可以是ICG、IR820、Alexa Fluor系列染料以及Cy系列染料。可用此方法合成的探针包括CaP/ICG、CaCO3/Cy5等。
本发明实施例提供的pH响应型超灵敏纳米荧光探针的制备方法还包括：带正电的基质材料包覆带负电的染料，利用配体(甲基咪唑)和包覆染料的互相静电吸附作用使染料分子吸附配体分子，同时导致染料的聚集，加入金属离子与配体配位形成稳定的三维立体结构，形成染料包覆的纳米粒子；
带正电基质材料可以是ZIF系列的MOF材料，例如ZIF-8等，应用于此例的负电染料可以是ICG、IR820、Alexa Fluor系列染料以及Cy系列染料。可用此方法合成的探针包括ZIF-8/ICG等。
本发明所制备的探针用于肿瘤在体成像的具体操作方法是：
纳米粒子尾静脉注射进入小鼠体内，通过EPR效应到达肿瘤部位并在肿瘤部位达到一定量的富集，在正常组织和血液中，pH呈中性(或弱碱性)，纳米粒子中荧光分子处于聚集淬灭状态，在肿瘤部位由于其弱酸性条件可引起基质材料中文CaP溶解并释放荧光分子，IR780恢复自由分子状态后荧光恢复，从而实现荧光增强，整个成像过程实现了pH响应性的荧光增强。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1
CaP/IR780纳米探针的制备
合成原理：通过PAA与IR780静电作用而使染料聚集，从而实现荧光淬灭，吸附染料后的PAA在异丙醇中自组装形成模版，通过矿化使磷酸钙沉积在PAA球表面，从而形成CaP/IR780纳米粒子。
具体合成步骤：60～80μL 20％PAA(MW＝2000)溶解于10mL水中，加入5～8mg Ca(OH)2搅拌使其溶解，加入50～1000μg IR780，搅拌30min，使其充分混合。缓慢加入10～50mL异丙醇，形成乳白色溶液，加入6～9.6mg(NH4)2HPO4搅拌24h，离心，水洗3次，重新分散于5mL水中备用。通过透射电镜(TEM)，扫描电镜(SEM)和动态光散射(DLS)进行粒子尺寸表征，如图2，图3和图4所示。利用紫外分光光度计分别测量不同染料包覆量的纳米粒子的紫外吸收光谱，如图5所示；分别外pH＝6.5中测量不同染料包覆量的纳米粒子的紫外吸收光谱，如图6所示。为提高纳米探针稳定性以及在动物血液中循环时间，探针表面通过PEG稳定，从而提高探针稳定性。10mg EDC，12mg NHS和5mg PEG-NH2加入上述粒子分散体系中，调节pH＝7.2，室温搅拌24h，离心，用水洗3次，分散于5mLPBS中备用。
实施案例2
CaP/RhB纳米探针的制备
合成原理：通过PAA与RhB静电作用而使染料聚集，从而实现荧光淬灭，染料后的PAA在异丙醇中自组装形成模版，通过矿化使磷酸钙沉积在PAA球表面，从而形成CaP/RhB纳米粒子。
具体合成步骤：60～90μL 20％PAA(MW＝4500)溶解于10mL水中，加入5～10mg Ca(OH)2搅拌使其溶解，加入100～1000μg RhB，搅拌30min，使其充分混合。缓慢加入30mL异丙醇，形成乳白色溶液，加入6.2～12mg(NH4)2HPO4搅拌24h，离心，水洗3次，重新分散于5mL水中。为提高纳米探针稳定性以及在动物血液中循环时间，探针表面通过PEG稳定，从而提高探针稳定性。5mg PEG-COOH加入上述粒子分散体系中，调节pH＝7.2，室温搅拌24h，离心，用水洗3次，分散于5mLPBS中备用。
实施例3
CaCO3/ICG探针的制备
合成原理：通过PEI对ICG的吸附使染料富集在PEI链上，通过调节pH并加入碳酸盐矿化使碳酸钙沉积在PEI链表面，从而形成ICG包覆的CaCO3纳米粒子。
具体合成步骤：10mL 10～50μg·mL-1ICG溶液，其中包含0.2～1mg PEI中加入20～100μL 0.1M CaCI2搅拌均匀，加入25～75μL 0.1M NaHCO3，70℃反应2h，离心，分散于去离子水中。加入5mg HOOC-PEG5K，调节pH＝7.2搅拌过夜，离心，重新分散于5mLPBS中备用。
实施例4
CaP/ICG纳米探针的制备
合成原理：通过PEI对ICG的吸附使染料富集在PEI链上，同时加入带负电的PAA，PEI同时吸附染料和PAA，自组装成PEI/PAA纳米球，PAA上裸露羧基通过与Ca2+配位，通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在PAA球表面，从而形成ICG包覆的CaP纳米粒子。
具体合成步骤：50～70μL 20％PAA(MW＝2000)溶解于10mL水中，加入5～10mg Ca(OH)2搅拌使其溶解。0.05～1mg ICG溶于0.2～1mL 0.2mg·mL-1PEI溶液，震荡0.5h，缓慢滴加至上述溶液中，搅拌10min，缓慢加入30mL异丙醇，形成乳白色溶液，加入6.2～10mg(NH4)2HPO4搅拌24h，离心，水洗3次，分散于5mL水中。为提高纳米探针稳定性以及在动物血液中循环时间，探针表面通过PEG稳定，从而提高探针稳定性。10mg EDC，12mg NHS和5mg PEG-NH2加入上述粒子分散体系中，调节pH＝7.2，室温搅拌24h，离心，用水洗3次，分散于5mLPBS中备用。
实施例5
CaCO3/IR808纳米探针的制备
合成原理：通过PEI对IR808的吸附使染料富集在PEI链上，通过调节pH并加入碳酸盐矿化使碳酸钙沉积在PEI链表面，从而形成IR808包覆的CaCO3纳米粒子。
具体合成步骤：10mL 50～1000μg·mL-1IR808溶液中加入5～20mg氯化钙和0.2～2mg PEI，超声分散，剧烈搅拌加入0.2～1mL 0.1M NaHCO3，25℃反应12h，离心，分散于5mL去离子水中。为提高纳米探针稳定性以及在动物血液中循环时间，探针表面通过PEG稳定，从而提高探针稳定性。5mg PO4-PEG5K加入上述粒子分散体系中，调节pH＝7.2，室温搅拌24h，离心，用水洗3次，分散于5mLPBS中备用。
实施例6
CaP/IR820纳米探针的制备
合成原理：通过PEI对IR820的吸附使染料富集在PEI链上，同时加入带负电的PAA，PEI同时吸附染料和PAA，自组装成PEI/PAA纳米球，PAA上裸露羧基通过与Ca2+配位，通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在PAA球表面，从而形成ICG包覆的CaP纳米粒子。
具体合成步骤：50～70μL 20％PAA(MW＝2000)溶解于10mL水中，加入5～10mg Ca(OH)2搅拌使其溶解。0.05～1mg IR820溶于0.2～1mL 0.2mg·mL-1PEI溶液，震荡0.5h，缓慢滴加至上述溶液中，搅拌10min，缓慢加入30mL异丙醇，形成乳白色溶液，加入6.2～10mg(NH4)2HPO4搅拌24h，离心，水洗3次，分散于5mL水中。
实施例7
ZIF-8/ICG探针制备
合成原理：利用甲基咪唑和ICG的互相静电吸附作用使染料分子吸附配体分子，同时导致染料的聚集，在此体系中加入锌离子与配体配位形成稳定的三维立体结构，从而形成染料包覆的纳米粒子。
具体合成步骤：1mmol Zn(NO3)2和1mmol 2-甲基咪唑溶于10mL甲醇中，加入5～300μL冰乙酸，超声30min，离心分散于甲醇中。通过扫描电镜确定粒子尺寸，如图7所示。向上述溶液中加入100μL 1mg·mL-1ICG甲醇溶液，震荡过夜，离心，分散于5mL甲醇中。加入5mgmPEG-COOH震荡过夜，离心，分散于5mLPBS中备用。
实施例8
ZIF-8/Cy5.5纳米探针的制备
合成原理：利用甲基咪唑和Cy5.5的互相静电吸附作用使染料分子吸附配体分子，同时导致染料的聚集，在此体系中加入锌离子与配体配位形成稳定的三维立体结构，从而形成染料包覆的纳米粒子。
具体合成步骤：1mmol Zn(CH3COO)2和1mmol 2-甲基咪唑溶于10mL甲醇中，加～300μL冰乙酸，超声30min，离心分散于甲醇中。向上述溶液中加入100μL 0.5mg·mL-1Cy5.5甲醇溶液，震荡过夜，离心，分散于5mL甲醇中。加入5mg mPEG-COOH震荡过夜，离心，分散于5mLPBS中备用。
下面结合试验对本发明的应用效果作详细的描述。
1、纳米探针体外稳定性试验
制备的纳米探针分别分散于PBS和FBS中，利用DLS分别监测纳米探针的尺寸在0h，1h，2h，4h，8h，12h的变化，如图8所示。制备的纳米探针分散于FBS中，分别在0h，1h，2h，4h，8h，12h，24h离心，测量上清液的紫外吸收光谱，在最大吸收波长处定量测定上清液中染料的吸收强度，通过吸收强度的测定可确定染料在纳米粒子中的稳定性。如图8所示。
2、纳米粒子体外pH响应性实验
制备的纳米粒子分别分散在pH＝7.2，pH＝6.8，pH＝6.0的PBS中，测量溶液的荧光光谱，定量测定荧光发射波长处荧光强度，通过荧光强度的变化定量确定纳米粒子的pH响应特性。
3、纳米粒子细胞毒性实验
将处于对数期的U87，MCF-7和4T1细胞中的培养基吸出，用PBS洗涤细胞，用含0.02％EDTA的0.25％trypsin消化，离心，收集细胞。加入配好的细胞培养基配成细胞浓度约为5×104cells·mL-1的细胞悬浮液，在96孔板中每孔加入100μL，在培养箱中放置12h。在孔板中加入不同浓度(0μg·mL-1，5μg·mL-1，10μg·mL-1，25μg·mL-1，50μg·mL-1，100μg·mL-1，200μg·mL-1，300μg·mL-1)的探针溶液100μL，同时设计对照组，分别与细胞孵育12h、24h，MTT进行实验。细胞存活率(％)计算方法为：(实验组吸收值平均值/对照组吸收值平均值)×100％。对每组的五个平行实验数据求平均值和标准偏差后获得最终实验数据。实验结果如图9所示。
4、纳米探针乳腺癌皮下瘤检测试验
将培养的乳腺癌细胞MCF-7和4T1(1×106，100μL)接种于雌性小鼠的后肢，构建小鼠的乳腺皮下肿瘤模型。对肿瘤直径和体积(肿瘤体积＝0.52×a×b2，a和b分别是肿瘤的长径和短径)进行测量，监测肿瘤的生长情况和表面血管的生长情况。将荷瘤裸鼠用气体麻醉，将尾静脉用加热垫加热，通过尾部静脉注射，将200μL(1mg·mL-1)探针注入小鼠体内，并在注射后的不同时间点(0.5h，l h，3h，6h，8h，12h，24h，36h，48h，72h，96h，108h)对其进行荧光成像。通过对荧光信号的检测，进一步考查探针在体内的分布及(被动)靶向的能力。如图10,11所示。
5、纳米探针原位脑胶质瘤检测试验
健康Babl/c小鼠，用异氟烷麻醉后，小鼠头部用脑立体定位仪固定，用碘伏对头部皮肤进行消毒，经矢正中线切开头皮暴露出颅骨，用颅钻于中线旁1.2mm，冠线上1.2mm处钻出骨窗，将微量注射器固定于骨窗内，向下进针1-2mm，接种10uL 1*106·mL-1的U87细胞液，注射完后留针5min，缝合头皮。小鼠培养2周成瘤，构建小鼠脑胶质瘤原位模型。
将荷瘤裸鼠用气体麻醉，将尾静脉用加热垫加热，通过尾部静脉注射，将200μL(1mg·mL-1)探针注入小鼠体内，并在注射后的不同时间点(0.5h，l h，3h，6h，8h，12h，24h，36h，48h)对其进行荧光成像。通过对荧光信号的检测，进一步考查探针在体内的分布及(被动)靶向的能力。如图12所示。
6、脑胶质瘤淋巴结转移检测试验
对实施案例8中皮下荷4T1的小鼠切除病灶，培养3天将术后裸鼠用气体麻醉，将尾静脉用加热垫加热，通过尾部静脉注射，将200μL(1mg·mL-1)探针注入小鼠体内，并在注射后0.5h，lh，3h，6h，8h，12h，24h对其进行荧光成像，观测淋巴部位转移灶。如图13所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种pH响应型超灵敏纳米荧光探针，其特征在于，所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针由pH响应性基质材料和有荧光有机小分子染料组成；
所述pH响应性基质材料为带正电或带负电pH响应性材料：磷酸钙、羟基磷酸钙、氟磷灰石、碳酸钙、ZIF系列；
所述荧光有机小分子染料为带正电染料或带负电染料。
2.如权利要求1所述的pH响应型超灵敏纳米荧光探针，其特征在于，所述带正电染料为：IR780，RhB，IR800。
3.如权利要求1所述的pH响应型超灵敏纳米荧光探针，其特征在于，所述带负电染料为：Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ICG、ICG-Der-01、ICG-Der-02、ICG-Der-03、IR820、Alexa Fluor750、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 647、AlexaFluor 635、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor500、Alexa Fluor 488、FITC。
4.一种如权利要求1所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针的制备方法包括以下三种方法，具体为：
第一种方法，带负电基质材料包覆带正电染料，通过PAA与带正电染料静电作用而使染料吸附于PAA分子链上，吸附染料后的PAA在异丙醇中自组装形成模版，同时通过聚集淬灭染料的荧光；PAA上裸露羧基通过与Ca2+配位，通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在PAA球表面，形成染料包覆的纳米粒子；
第二种方法，带负电基质材料包覆带负电染料，通过PEI对带负电染料的吸附使染料富集在PEI链，同时加入带负电的PAA，PEI同时吸附染料和PAA，自组装成PEI/PAA纳米球，PAA上裸露羧基通过与Ca2+配位，通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在PAA球表面，形成染料包覆的纳米粒子；
第三种方法，带正电的基质材料包覆带负电的染料，利用甲基咪唑和包覆染料的互相静电吸附作用使染料分子吸附配体分子，同时导致染料的聚集，加入金属离子与配体配位形成稳定的三维立体结构，形成染料包覆的纳米粒子。
5.如权利要求4所述的pH响应型超灵敏纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，所述第一种方法中：pH响应性基质材料是磷酸钙，碳酸钙，羟基磷酸钙，氟磷灰石；带正电染料是IR780、RhB、IR800。
6.如权利要求4所述的pH响应型超灵敏纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，所述第二种方法中：pH响应性基质材料是磷酸钙(CaP)，碳酸钙，羟基磷酸钙，氟磷灰石；负电染料是ICG、IR820、Alexa Fluor系列染料以及Cy系列染料。
7.如权利要求4所述的pH响应型超灵敏纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，所述第三种方法中：pH响应性基质材料是ZIF系列的MOF材料；负电染料可以是ICG、IR820、AlexaFluor系列染料以及Cy系列染料。
8.一种如权利要求1或4所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
纳米粒子尾静脉注射进入小鼠体内，通过EPR效应到达肿瘤部位并在肿瘤部位达到富集，在正常组织和血液中，pH呈中性或弱碱性，纳米粒子中荧光分子处于聚集淬灭状态，在肿瘤部位由于其弱酸性条件引起基质材料CaP溶解并释放荧光分子，IR780恢复自由分子状态后荧光恢复，实现荧光增强。
9.一种由权利要求1～3任意一项所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针制备的CaP/IR780探针、CaCO3/RhB探针。
10.一种由权利要求1～3任意一项所述pH响应型超灵敏纳米荧光探针制备的CaP/ICG探针、CaCO3/Cy5探针、ZIF-8/ICG探针。
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