CN109498807A - 上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针及制备方法 - Google Patents

上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于有机化合物技术领域，公开了一种上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针及制备方法，由改性上转换纳米粒子和偶氮化合物组成；改性上转换纳米粒子由带正电改性上转换纳米粒子和带负电改性上转换纳米粒子组成；偶氮化合物为可在紫外光下发生光解的含氮氮双键的有机分子；由带负电偶氮化合物和带正电偶氮化合物组成。本发明基于上转换纳米粒子的光动力学探针，其光动力学治疗过程可以通过近红外光引发，克服了传统光动力学治疗因需直接使用紫外/可见光源造成的治疗深度不足的问题。同时，探针在近红外光照射下会有近红外二区发光，可以用于探针在体聚集及代谢状况的监测，同时在治疗前对肿瘤组织进行定位。

Description

上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针及制备方法
技术领域
本发明属于有机化合物技术领域，尤其涉及一种上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针及制备方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：目前，肿瘤临床治疗方法主要是放疗、化疗和手术疗法三大类，光动力学治疗相比于传统三大疗法由于其无创伤、毒副作用小等特点逐渐受到关注，其主要作用机理是光敏剂吸收激发光产生活性氧从而对肿瘤细胞的蛋白或DNA进行损伤，进而达到抑制肿瘤的目的。目前，除了将光敏剂药物单独应用于肿瘤治疗，更多的是将光敏剂与纳米载体结合起来，通过构建一种复合探针来提高治疗的深度以及靶向性等。常见的纳米载体有二氧化硅、改性上转换纳米粒子、高分子聚合物纳米粒子等，尤其是基于上转换纳米粒子的光动力学探针是近些年的研究热点之一。然而，由于肿瘤细胞新陈代谢旺盛、生长迅速、繁殖能力强，其对氧气以及葡萄糖等能量物质的消耗比正常细胞高出许多，因而肿瘤微环境为乏氧环境。但是光敏剂在光动力学治疗过程中需要依赖氧分压，肿瘤的乏氧环境就大大降低了其疗效；临床现有光敏剂所用激发光波长多处于可见光区，由于短波长生物组织散射和吸收强，因此治疗深度大大受限，且传统光敏剂由于其共轭结构在长时间光照下导致共轭体系破坏，电子跃迁受阻，因此导致其光稳定较差，这些都限制了光动力学纳米探针的应用。
综上所述，现有技术存在的问题是：光敏剂在光动力学治疗过程中需要依赖氧分压，肿瘤的乏氧环境就大大降低了其疗效；传统光敏剂治疗深度低，难以实现深度穿透，且传统光敏剂光稳定较差，这些都限制了光动力学纳米探针的应用。
解决上述技术问题的难度和意义：
如何解决传统光敏剂治疗过程中肿瘤的乏氧抑制，治疗深度低且稳定性差的问题，是提高光动力学治疗效果和应用的关键。肿瘤由于其代谢旺盛导致的乏氧微环境对临床氧依赖性光动力学治疗存在严重抑制性，导致PDT治疗效果非常有限，因此如何克服或规避乏氧抑制过程是实现肿瘤高效PDT治疗的关键。传统PDT治疗所用光敏剂光稳定性差，所用激发光源生物组织穿透性差及严重氧依赖性限制其临床应用。因此，如何开发一种治疗深度大，光学稳定性高且不存在肿瘤乏氧抑制性的PDT治疗探针是突破传统PDT治疗瓶颈的关键之一。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针及制备方法。
本发明是这样实现的，一种上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针，所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针由改性上转换纳米粒子和偶氮化合物按摩尔比组成为1:20-1:100；
改性上转换纳米粒子由带正电改性上转换纳米粒子和带负电改性上转换纳米粒子组成；
偶氮化合物为可在紫外光下发生光解的含氮氮双键的有机分子；由带负电偶氮化合物和带正电偶氮化合物组成。
进一步，所述带正电改性上转换纳米粒子为：上转换纳米粒子包覆介孔二氧化硅；
带负电改性上转换纳米粒子为：上转换纳米粒子包覆磷酸钙、上转换纳米粒子包覆聚多巴胺。
进一步，所述带正电偶氮化合物为：偶氮二异丁脒盐酸盐、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐、2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、偶氮二(2氨基丙脒)盐酸盐；
所述带负电偶氮化合物为：2,2'-偶氮双[N-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒]，4,4'-偶氮双(4-氰基缬草酸)，二甲基2,2'-偶氮双(异丁酸)等。
本发明的另一目的在于提供一种所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针的制备方法，所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针的制备方法包括以下步骤：
步骤一，带正电改性上转换纳米粒子包覆带负电偶氮化合物，通过稀土盐酸盐高温热反应合成808nm激发的上转换纳米粒子；利用表面活性剂CO520、正硅酸乙酯，通过反相微乳液法，在上转换纳米粒子表面沉积一层介孔二氧化硅，并利用mPEG-Saline进行稳定，通过静电吸附的方式将带负电偶氮化合物包覆到介孔二氧化硅中；
步骤二，带负电改性上转换纳米粒子包覆带负电偶氮化合物；通过稀土盐酸盐高温热反应合成808nm激发的上转换纳米粒子，并利用柠檬酸根离子配体取代的方法使其转到水相中；通过PEG与带负电染料静电作用而使偶氮化合物吸附于PEG分子链上，吸附偶氮化合物后的PEG在柠檬酸盐的乙醇/水溶液自组装形成模版；通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在上转换纳米粒子表面，形成染料包覆的纳米粒子；
步骤三，带负电改性上转换纳米粒子包覆带正电偶氮化合物；通过稀土盐酸盐高温热反应合成808nm激发的上转换纳米粒子，并利用柠檬酸根离子配体取代的方法使其转到水相中；通过PEG与带负电染料静电作用而使偶氮化合物吸附于PEG分子链上，吸附偶氮化合物后的PEG在柠檬酸盐的乙醇/水溶液自组装形成模版；通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在上转换纳米粒子表面，形成染料包覆的纳米粒子。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针的
NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@mSiO2/2,2'-氮杂双2-咪唑啉二盐酸盐探针。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针的
NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@CaP/偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐探针。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针的
NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@CaP/偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐探针。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
基于上转换纳米粒子的光动力学探针，其光动力学治疗过程可以通过近红外光引发，克服了传统光动力学治疗因需直接使用紫外/可见光源造成的治疗深度不足的问题。同时，探针在近红外光照射下会有近红外二区发光，可以用于探针在体聚集及代谢状况的监测，同时在治疗前对肿瘤组织进行定位。选用偶氮化合物作为光动力学治疗药物，通过其在紫外光下发生化学键断裂产生自由基来对肿瘤细胞进行杀伤，过程并不需要氧气参与，克服了传统光动力学疗法存在的肿瘤乏氧微环境对其疗效会有抑制这个问题，实现了一种非氧依赖性光动力学治疗。
本发明的上转换纳米粒子在近红外光照射下能够产生紫外光，包覆的偶氮药物在紫外光下能够产生自由基从而发挥光动力学治疗效果，选择可以是：上转换纳米粒子包覆介孔二氧化硅
(NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@mSiO2)、上转换纳米粒子包覆磷酸钙(NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@ NaNdF4:10％Yb@CaP)、上转换纳米粒子包覆聚多巴胺 (NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@PDA)；上转换纳米粒子具有生物相容性好、光学性质稳定等优点。偶氮化合物作为发挥光动力学效力的有机分子，在紫外光照射下，其结构中与氮氮双键相连的C-N会发生断裂产生自由基，对肿瘤细胞进行杀伤。偶氮化合物为含有氮氮双键的有机分子，基于偶氮化合物发生的光动力治疗不需要氧气参与，克服了传统光动力学疗法在肿瘤治疗过程中的乏氧抑制性。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于上转换纳米粒子的光动力学诊疗探针的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNd F4:10％Yb@mSiO2-OH TEM图。
图3是本发明实施例提供的NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNd F4:10％Yb@mSiO2-OH/偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐探针荧光光谱图。
图4是本发明实施例提供的NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNd F4:10％Yb@mSiO2-OH/偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐探针在不同介质中稳定性曲线。
图5是本发明实施例提供的纳米探针自由基产生验证实验紫外吸收光谱图。
图6是本发明实施例提供的纳米探针4T1细胞毒性实验。
图7是本发明实施例提供的纳米探针近红外光照下细胞毒性实验。
图8是本发明实施例提供的不同激光功率下纳米探针体外光动力学疗效验证实验。
图9是本发明实施例提供的不同探针浓度下纳米探针体外光动力学疗效验证实验。
图10是本发明实施例提供的纳米探针4T1皮下瘤成像实验。
图11是本发明实施例提供的纳米探针4T1皮下瘤治疗实验。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有光敏剂光稳定较差的问题；本发明的上转换纳米粒子在近红外光照射下能够产生紫外光，包覆的偶氮药物在紫外光下能够产生自由基从而发挥光动力学治疗效果。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针由改性上转换纳米粒子和偶氮化合物组成；
改性上转换纳米粒子由带正电改性上转换纳米粒子和带负电改性上转换纳米粒子组成。
带正电改性上转换纳米粒子为：上转换纳米粒子包覆介孔二氧化硅 (NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@mSiO2)。
带负电改性上转换纳米粒子为：上转换纳米粒子包覆磷酸钙 (NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@CaP)、上转换纳米粒子包覆聚多巴胺(NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb @NaNdF4:10％Yb@PDA)。
偶氮化合物为可在紫外光下发生光解的含氮氮双键的有机分子；由带负电偶氮化合物和带正电偶氮化合物组成。
带正电偶氮化合物为：偶氮二异丁脒盐酸盐、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、 2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐、2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、偶氮二 (2氨基丙脒)盐酸盐。
带负电偶氮化合物为：二甲基2,2'-偶氮双(异丁酸)，4,4'-偶氮双(4-氰基缬草酸)，2,2'-偶氮双[N-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒]n-水合物等。
如图1所示，本发明实施例提供的上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针的制备方法包括以下步骤：
S101：带正电改性上转换纳米粒子包覆带负电偶氮化合物，通过稀土盐酸盐高温热反应合成808nm激发的上转换纳米粒子；利用表面活性剂CO520、正硅酸乙酯，通过反相微乳液法，在上转换纳米粒子表面沉积一层介孔二氧化硅，并利用mPEG-Saline进行稳定，通过静电吸附的方式将带负电偶氮化合物包覆到介孔二氧化硅中；
S102：带负电改性上转换纳米粒子包覆带负电偶氮化合物；通过稀土盐酸盐高温热反应合成808nm激发的上转换纳米粒子，并利用柠檬酸根离子配体取代的方法使其转到水相中；通过PEG与带负电染料静电作用而使偶氮化合物吸附于PEG分子链上，吸附偶氮化合物后的PEG在柠檬酸盐的乙醇/水溶液自组装形成模版；通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在上转换纳米粒子表面，形成染料包覆的纳米粒子；
S103：带负电改性上转换纳米粒子包覆带正电偶氮化合物；通过稀土盐酸盐高温热反应合成808nm激发的上转换纳米粒子，并利用柠檬酸根离子配体取代的方法使其转到水相中；通过PEG与带负电染料静电作用而使偶氮化合物吸附于PEG分子链上，吸附偶氮化合物后的PEG在柠檬酸盐的乙醇/水溶液自组装形成模版；通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在上转换纳米粒子表面，形成染料包覆的纳米粒子。
在本发明的优选实施例中，步骤S101中：带正电改性上转换纳米粒子为上转换纳米粒子包覆介孔二氧化硅(NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@ NaNdF4:10％Yb@mSiO2)；带负电偶氮化合物为偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、偶氮二异丁脒盐酸盐、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐、2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、偶氮二(2氨基丙脒)盐酸盐。
在本发明的优选实施例中，步骤S102中：带负电改性上转换纳米粒子为上转换纳米粒子包覆磷酸钙(NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@ NaNdF4:10％Yb@CaP)、上转换纳米粒子包覆聚多巴胺 (NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@PDA)；带负电偶氮化合物为偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、偶氮二异丁脒盐酸盐、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐、2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、偶氮二(2氨基丙脒)盐酸盐。
在本发明的优选实施例中，步骤S103中：带负电改性上转换纳米粒子为上转换纳米粒子包覆磷酸钙(NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@ NaNdF4:10％Yb@CaP)、上转换纳米粒子包覆聚多巴胺 (NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@PDA)；带正电偶氮化合物为。
本发明实施例提供的基于上转换纳米粒子的非氧依赖性光动力学探针的使用方法包括：基于上转换纳米粒子的非依赖性光动力学诊疗探针尾静脉注射进入小鼠肿瘤部位，通过EPR效应到达肿瘤部位并在肿瘤部位达到富集，通过给以低能量近红外光照射，结合近红外二区成像设备，利用纳米探针的近红外二区发光，可以通过纳米粒子在体的富集状况定位肿瘤的位置；然后对肿瘤部位给以高能量近红外光照，纳米粒子发出紫外光会使得偶氮化合物中与氮氮双键相连的C-N键发生断裂产生自由基，从而对癌细胞造成非氧依赖性的光动力学杀伤。
本发明的另一目的在于提供一种由基于上转换纳米粒子的非氧依赖性光动力学探针制备的
NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@mSiO2/2,2'-氮杂双2-咪唑啉二盐酸盐探针。
本发明的另一目的在于提供一种由基于上转换纳米粒子的非氧依赖性光动力学探针制备的NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@CaP /偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、
NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@CaP/偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1
NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@mSiO2/偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐探针的制备；
合成原理：首先通过稀土盐酸盐高温热反应生成808nm激发的上转换纳米粒子，利用表面活性剂CO520、正硅酸乙酯，通过反相微乳液法，可以在上述上转换纳米粒子表面沉积一层介孔二氧化硅，并利用mPEG-Saline进行稳定，最后通过静电吸附的方式将偶氮化合物包覆到介孔二氧化硅中。
具体合成步骤：
1、808nm激发CSS结构上转换纳米粒子的合成
(1)NaYF4:30％Yb,0.5％Tm的合成(2mmol体系)
称取0.2714g水合氯化钇,0.1676g水合氯化镱,0.0027g水合氯化铥，加入 100mL三口烧瓶，并加入12mL油酸，30mL 1-十八烯，用封口膜密封，利用双排管使体系处于氩气流中，加热至160℃，保温一段时间直到反应物完全溶解。降至室温(20℃)。
称取0.2g氢氧化钠，0.296g氟化铵溶于20mL甲醇，加至上述反应物中，搅拌30min，之后升温至100℃除去甲醇及多余水分，迅速升温至300℃，反应 1h。反应结束后，撤去加热装置，使其自然冷却至室温，用离心管收集产物，通过加入适量乙醇，离心收集，并用环己烷清洗三遍，最后分散于20mL环己烷待用。
(2)NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb的合成
①RE-OA前驱体的制备
Y-Yb-OA前驱体
称量0.5mmol的水合氯化钇(90％,0.0879g),水合氯化镱(10％，0.0140g) 加入1mL油酸、2.5mL 1-十八烯，在氩气流中加热溶解备用。
Y-Nd-OA前驱体
称取0.5mmol的水合氯化钇(90％,0.0879g),六水合氯化钕(10％，0.0179g) 加入1mL油酸、2.5mL 1-十八烯，在氩气流中加热溶解备用。
②F-OA前驱体的制备
称量0.105g氢氧化钠，0.155g氟化铵溶于10mL甲醇，加入3mL油酸、 7.5mL 1-十八烯，加热，在氩气流中除去甲醇，溶解备用。
③壳层生长(CS)
取10mL上述NaYF4:30％Yb,0.5％Tm环己烷溶液，加入50mL三口烧瓶中，并加入12mL油酸，30mL 1-十八烯，用封口膜密封，加热，在氩气流中除去环己烷，继续升温至300℃，将Y-Yb-OA前驱体与F-OA前驱体混合滴入，反应1h,反应结束后，撤去加热装置，使其自然冷却至室温，用离心管收集产物，通过加入适量乙醇，离心收集，并用环己烷清洗三遍，最后分散于10mL 环己烷备用。
④壳层生长(CSS)
取壳层生长(CS)反应产物，加入50mL三口烧瓶中，并加入12mL油酸， 30mL 1-十八烯，用封口膜密封，加热，在氩气流中除去环己烷，继续升温至 300℃，将Y-Nd-OA前驱体与F-OA前驱体混合滴入，反应1h,反应结束后，撤去加热装置，使其自然冷却至室温，用离心管收集产物，通过加入适量乙醇，离心收集，并用环己烷及乙醇清洗三遍，最后分散于10mL环己烷备用。
2、808nm激发上转换包覆介孔二氧化硅 (NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@mSiO2)
取2mL上述溶于环己烷的上转换纳米粒子，加入20mL环己烷，加入1mL Igepal CO-520,室温搅拌三小时形成澄清溶液，加入0.5mL 2M氢氧化钠溶液，搅拌4h，获得水油乳液，加入0.3mL原硅酸四乙酯(TEOS),搅拌24h，反应结束后，用离心管离心收集，并用乙醇洗涤三遍，最后溶于5mL甲醇备用。
3、偶氮药物的包覆(NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@ NaNdF4:10％Yb@mSiO2/drug-PEG)
取上述1mL NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@ NaNdF4:10％Yb@mSiO2甲醇溶液，加入10mg mPEG-Saline(分子量5000)50μL 1M氨水，搅拌10h，反应结束后，离心收集，并用去离子水洗涤三遍，分散于 1mLPBS中备用。在上述PBS溶液中加入0.5mL 10mg/mL的偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐溶液，避光震荡12h，反应结束后离心收集，最后分散于1mL PBS溶液备用。
实施例2
NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@CaP/偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐探针的制备
实验原理：首先通过稀土盐酸盐高温热反应合成808nm激发的上转换纳米粒子，并利用柠檬酸根离子配体取代的方法使其转到水相中。通过PEG与带负电染料静电作用而使偶氮化合物吸附于PEG分子链上，吸附偶氮化合物后的 PEG在柠檬酸盐的乙醇/水溶液自组装形成模版；通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在上转换纳米粒子表面，形成染料包覆的纳米粒子；
具体合成步骤：
1、808nm激发CSS结构上转换纳米粒子的合成
(1)NaYF4:30％Yb,0.5％Tm的合成(2mmol体系)
称取0.2714g水合氯化钇,0.1676g水合氯化镱,0.0027g水合氯化铥，加入 100mL三口烧瓶，并加入12mL油酸，30mL 1-十八烯，用封口膜密封，利用双排管使体系处于氩气流中，加热至160℃，保温一段时间直到反应物完全溶解。降至室温(20℃)。
称取0.2g氢氧化钠，0.296g氟化铵溶于20mL甲醇，加至上述反应物中，搅拌30min，之后升温至100℃除去甲醇及多余水分，迅速升温至300℃，反应 1h。反应结束后，撤去加热装置，使其自然冷却至室温，用离心管收集产物，通过加入适量乙醇，离心收集，并用环己烷清洗三遍，最后分散于20mL环己烷待用。
(2)NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb的合成
①RE-OA前驱体的制备
Y-Yb-OA前驱体
称量0.5mmol的水合氯化钇(90％,0.0879g),水合氯化镱(10％，0.0140g) 加入1mL油酸、2.5mL 1-十八烯，在氩气流中加热溶解备用。
Y-Nd-OA前驱体
称取0.5mmol的水合氯化钇(90％,0.0879g),六水合氯化钕(10％，0.0179g) 加入1mL油酸、2.5mL 1-十八烯，在氩气流中加热溶解备用。
②F-OA前驱体的制备
称量0.105g氢氧化钠，0.155g氟化铵溶于10mL甲醇，加入3mL油酸、 7.5mL 1-十八烯，加热，在氩气流中除去甲醇，溶解备用。
③壳层生长(CS)
取10mL上述NaYF4:30％Yb,0.5％Tm环己烷溶液，加入50mL三口烧瓶中，并加入12mL油酸，30mL 1-十八烯，用封口膜密封，加热，在氩气流中除去环己烷，继续升温至300℃，将Y-Yb-OA前驱体与F-OA前驱体混合滴入，反应1h,反应结束后，撤去加热装置，使其自然冷却至室温，用离心管收集产物，通过加入适量乙醇，离心收集，并用环己烷清洗三遍，最后分散于10mL 环己烷备用。
④壳层生长(CSS)
取壳层生长(CS)反应产物，加入50mL三口烧瓶中，并加入12mL油酸， 30mL 1-十八烯，用封口膜密封，加热，在氩气流中除去环己烷，继续升温至 300℃，将Y-Nd-OA前驱体与F-OA前驱体混合滴入，反应1h,反应结束后，撤去加热装置，使其自然冷却至室温，用离心管收集产物，通过加入适量乙醇，离心收集，并用环己烷及乙醇清洗三遍，最后分散于10mL环己烷备用。
2、808nm激发上转换纳米粒子包覆磷酸钙载药 (NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@CaP/偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐)
取上述10mL含壳层生长(CSS)产物的环己烷溶液，加入含10mg四氟硼酸亚硝的DMF溶液，轻微震荡待溶液分层后离心收集产物，并用DMF溶液洗涤3遍，最终产物溶于2mL DMF中，加入10mg柠檬酸钠隔夜震荡,反应结束后离心收集并用乙醇洗涤数遍，最后溶于10mL乙醇待用。
称量0.975mg的柠檬酸钠溶于10mL乙醇/30mL水的溶液中，加入0.54g硝酸钙、0.184g磷酸氢二铵以及含20mg 2,2'-氮杂双2-咪唑啉二盐酸盐的溶液，通过加入氨水调节pH值至7.2，加入2g PEG，超声至反应物完全溶解，室温搅拌1h。在以上反应体系中加入上述待用溶液，室温搅拌反应3h。反应完成后，离心收集，水洗3遍，最后溶于10mL水中。为提高纳米探针稳定性以及在动物血液中循环时间，探针表面通过PEG稳定，从而提高探针稳定性。5mgPEG-COOH加入上述粒子分散体系中，调节pH＝7.2，室温搅拌24h，离心，用水洗3次，分散于5mLPBS中备用。
实施例3
NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@PDA/偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐探针的制备
下面结合实验对本发明的应用效果作详细的描述。
1、纳米探针体外稳定性实验
制备的纳米探针分别分散于PBS和FBS中，利用DLS分别监测纳米探针的尺寸在0h，1h，2h，4h，8h，12h的变化。实验结果如图5所示。
2、自由基产生验证实验
①配制10mL 1mol/L的亚甲基蓝溶液备用。
②取200μL上述亚甲基蓝溶液，分别加入三个2.5mL的EP管中，加水稀释为原来的1/5，分别向两支EP管中加入200μL纳米探针溶液，记作溶液1，溶液2。
③溶液1常温避光静置。若加入探针为基于上转换纳米粒子的探针，则溶液2用808nm或980nm光源，以1W/cm2功率照射十分钟。完成后对样品溶液1，溶液2紫外吸收光谱进行测量。
实验结果如图6所示。
3、纳米粒子细胞毒性实验
将处于对数期的U87，MCF-7和4T1细胞中的培养基吸出，用PBS洗涤细胞，用含0.02％EDTA的0.25％trypsin消化，离心，收集细胞。加入配好的细胞培养基配成细胞浓度约为5×104cells·mL-1的细胞悬浮液，在96孔板中每孔加入100μL，在培养箱中放置12h。在孔板中加入不同浓度(0μg·mL-1， 5μg·mL-1，10μg·mL-1，25μg·mL-1，50μg·mL-1，100μg·mL-1，200μg·mL-1，300 μg·mL-1)的探针溶液100μL，同时设计对照组，分别与细胞孵育12h、24h， MTT进行实验。细胞存活率(％)计算方法为：(实验组吸收值平均值/对照组吸收值平均值)×100％。对每组的五个平行实验数据求平均值和标准偏差后获得最终实验数据。实验结果如图7所示。
4、探针体外光动力学疗效验证实验
(1)探针的摄取
乳腺癌细胞培养：选择乳腺癌细胞4T1，用含10％的胎牛血清(Gibco澳洲血清)、90％的DMEM-H(Gibco)，1％双抗的完全培养基，置于37℃，5％CO2中进行培养。常规培养4T1细胞，当细胞处于对数生长期时，按照2*104cells/well 的密度接种到96孔板中，使细胞分散均匀，置于37℃，空气的培养箱中培养24h。吸去旧的培养基，将4T1细胞分别与新的完全培养基以及含不同浓度的探针进行孵育，在孵育不同的时间，如1,3,6,12,24,48h后，用200MW/cm2强度的808nm 激光照射，在500-560nm波长处采集图像。与细胞质染色共定位。
(2)近红外照射下探针对细胞毒性作用实验
1)对于基于稀土元素上转换纳米粒子的光动力学探针
功率对细胞存活率的影响
将细胞悬浮液按照100μL/孔加入96孔板中，待细胞贴壁后将上清液吸出，每孔加入100μL探针溶液(100μg·mL-1)，与细胞共同孵育6h。用波长808nm 的激光，分别在功率为0.2W·cm-2,0.5W·cm-2,0.7W·cm-2,1W·cm-2，1.5W·cm-2和2W·cm-2条件下对细胞进行照射，光照后放回培养箱中继续孵育，1h后进行 MTT实验。
浓度对细胞存活率的影响
首先用完全培养基配制浓度依次为0,5，10,25,50,100,200,300μg·mL-1的纳米探针溶液。将细胞配成浓度为5×104cells/mL细胞悬浮液，取100μL加入到96孔板中。待细胞贴壁后，将上清液吸出，加入200μL纳米探针溶液，与细胞共同孵育6h。用波长808nm的激光在功率强度为1W·cm-2的条件下对细胞照射2min，操作和细胞存活率计算同上。实验结果见图8。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针，其特征在于，所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针由改性上转换纳米粒子和偶氮化合物组成；
改性上转换纳米粒子由带正电改性上转换纳米粒子和带负电改性上转换纳米粒子组成；
偶氮化合物为可在紫外光下发生光解的含氮氮双键的有机分子；由带负电偶氮化合物和带正电偶氮化合物组成。
2.如权利要求1所述的上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针，其特征在于，所述带正电改性上转换纳米粒子为：上转换纳米粒子包覆介孔二氧化硅；
带负电改性上转换纳米粒子为：上转换纳米粒子包覆磷酸钙、上转换纳米粒子包覆聚多巴胺。
3.如权利要求1所述的上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针，其特征在于，所述带负电偶氮化合物为：偶氮二异丁脒盐酸盐、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐、2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐、偶氮二(2氨基丙脒)盐酸盐。
4.一种如权利要求1所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针的制备方法，其特征在于，所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针的制备方法包括以下步骤：
步骤一，带正电改性上转换纳米粒子包覆带负电偶氮化合物，通过稀土盐酸盐高温热反应合成808nm激发的上转换纳米粒子；利用表面活性剂CO520、正硅酸乙酯，通过反相微乳液法，在上转换纳米粒子表面沉积一层介孔二氧化硅，并利用mPEG-Saline进行稳定，通过静电吸附的方式将带负电偶氮化合物包覆到介孔二氧化硅中；
步骤二，带负电改性上转换纳米粒子包覆带负电偶氮化合物；通过稀土盐酸盐高温热反应合成808nm激发的上转换纳米粒子，并利用柠檬酸根离子配体取代的方法使其转到水相中；通过PEG与带负电染料静电作用而使偶氮化合物吸附于PEG分子链上，吸附偶氮化合物后的PEG在柠檬酸盐的乙醇/水溶液自组装形成模版；通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在上转换纳米粒子表面，形成染料包覆的纳米粒子；
步骤三，带负电改性上转换纳米粒子包覆带正电偶氮化合物；通过稀土盐酸盐高温热反应合成808nm激发的上转换纳米粒子，并利用柠檬酸根离子配体取代的方法使其转到水相中；通过PEG与带负电染料静电作用而使偶氮化合物吸附于PEG分子链上，吸附偶氮化合物后的PEG在柠檬酸盐的乙醇/水溶液自组装形成模版；通过调节pH并加入磷酸盐矿化使磷酸钙沉积在上转换纳米粒子表面，形成染料包覆的纳米粒子。
5.一种包含权利要求1所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针的NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@mSiO2/2,2'-氮杂双2-咪唑啉二盐酸盐探针。
6.一种包含权利要求1所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针的NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@CaP/偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐探针。
7.一种包含权利要求1所述上转换纳米粒子非氧依赖性光动力学诊疗探针的NaYF4:30％Yb,0.5％Tm@NaYF4:10％Yb@NaNdF4:10％Yb@CaP/偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐探针。
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