CN109620816A - 一种纳米免疫制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纳米免疫制剂及其制备方法与应用,所述纳米免疫制剂为MSNs‑ICG‑YM155纳米颗粒,以介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)为载体,吲哚菁绿(ICG)为近红外(NIR)光热治疗剂,YM155为免疫治疗Survivin抑制剂,所述纳米免疫制剂形貌均一,分散性好,可进行高效的协同治疗,体外肿瘤细胞死亡率可达到75%‑80%,体内可诱导高水平的DC成熟(80‑90%),有效抑制肿瘤生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医药技术领域,尤其是一种纳米免疫制剂及其制备方法与应用。
背景技术
近年来,随着纳米医学技术的发展,纳米技术用于恶性肿瘤的治疗日渐成为人们研究的热点。随着多种肿瘤治疗方法的不断发展,人们发现单一的肿瘤治疗方法效果有限,所以以纳米材料为平台的联合治疗策略成为目前的研究热点之一。最近有研究表明,基于纳米材料的光热治疗可以产生一系列的免疫反应,从而达到免疫治疗的效果。在众多的纳米材料中,基于硅的纳米颗粒(实心、中空、介孔或其他形式)被认为是构建用于肿瘤免疫治疗的纳米药物的理想载体。目前,基于介孔二氧化硅的光热治疗主要通过包载光热剂来实现,吲哚菁绿是一种有效的光热剂,在808纳米激光的照射下,其可产生热量从而将肿瘤细胞杀死。YM155(Sepantronium Bromide)是一种有效的survivin抑制免疫佐剂,通过抑制Survivin启动子活性而发挥作用,能显著下调肿瘤细胞中survivin的表达,从而促进肿瘤细胞凋亡,增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,在恶性肿瘤的免疫治疗中起到重要作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种纳米免疫制剂,可以同时实现对原位肿瘤的光热和免疫协同治疗的MSNs-ICG-YM155纳米免疫制剂,可以有效抑制肿瘤。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述纳米免疫制剂的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述纳米免疫制剂的应用。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:
一种纳米免疫制剂,为MSNs-ICG-YM155纳米颗粒,以介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)为载体,吲哚菁绿(ICG)为近红外(NIR)光热治疗剂,YM155为免疫治疗Survivin抑制剂。
优选的,上述纳米免疫制剂,粒径为60-100纳米。
优选的,上述纳米免疫制剂,其中,ICG的载药率为8-10%,YM155载药率为0.5-1%。
上述纳米免疫制剂的制备方法,具体方法如下:
(1)制备介孔二氧化硅球;
(2)每称取3-5毫克吲哚菁绿,溶于4ml 10-20mg/ml的MSNs水溶液中,室温搅拌8-12小时,13000转每分钟离心收集沉淀,水洗2-3次,冷冻干燥得到MSNs-ICG纳米颗粒;
(3)将30-50微摩尔YM155加入到上述MSNs-ICG纳米颗粒溶液中,室温搅拌8-12小时,13000转每分钟离心收集沉淀,水洗2-3次,冷冻干燥得到MSNs-ICG-YM155纳米颗粒。
优选的,上述纳米免疫制剂的制备方法,所述步骤(1)中介孔二氧化硅球采用CTAB模板法进行制备。
上述纳米免疫制剂在制备肿瘤抑制药物方面的应用。
上述纳米免疫制剂制备的肿瘤抑制药物用于对原位肿瘤的光热和免疫的协同治疗,有效抑制肿瘤。
上述纳米免疫制剂制备的肿瘤抑制药物通过808纳米激光连续照射进行光热治疗,从而清除肿瘤细胞。
本发明结构有如下有益效果:
上述纳米免疫制剂,为MSNs-ICG-YM155纳米颗粒,形貌均一,分散性好,可进行高效的协同治疗,体外肿瘤细胞死亡率可达到75%-80%,体内可诱导高水平的DC成熟(80-90%),有效抑制肿瘤生长。
附图说明
图1a:制备的MSNs-ICG-YM155纳米颗粒的透射电镜图。
图1b:制备的MSNs-ICG-YM155纳米颗粒的粒径分布。
图2:制备的MSNs-ICG-YM155纳米颗粒的光热性能验证。
图3:制备的MSNs-ICG-YM155纳米颗粒与对照组分别对B16F10细胞进行处理后的死活细胞染色图。
图4:制备的MSNs-ICG-YM155纳米颗粒与对照组分别对B16F10细胞进行处理后的流式细胞术分析结果图。
图5:制备的MSNs-ICG-YM155纳米颗粒与对照组对小鼠体内DC细胞成熟的促进结果。
具体实施方式
为进一步说明本发明,现通过具体实施实例对本发明进行详细阐述。下述实施例中:
(1)采用传统的CTAB模板法制备介孔二氧化硅球;
(2)将步骤(1)得到的MSNs冷冻干燥为白色粉末,称取40-60毫克MSNs溶于4毫升去离子水中配置成浓度为10-15毫克每毫升的MSNs溶液;称取4-6毫克吲哚菁绿溶于上述MSNs溶液,室温搅拌8-12小时,13000转每分钟离心10-15分钟,收集沉淀,去离子水洗涤2-3次,冷冻干燥得到MSNs-ICG纳米颗粒,重悬于去离子水中保存;
(3)在步骤(2)得到的MSNs-ICG纳米颗粒溶液中加入30-50微摩尔YM155,室温搅拌8-12小时,13000转每分钟离心10-15分钟,收集沉淀,去离子水洗涤2-3次,冷冻干燥得到MSNs-ICG-YM155纳米颗粒,重悬于去离子水中保存,粒径为60-100纳米(如图1a,b所示)。
评估本发明制备的纳米材料的光热性能实验技术如下:
将0.1-0.2毫克每毫升的MSNs-ICG-YM155水溶液(1毫升)加入到石英比色皿中,用2.5瓦每平方厘米的808纳米激光照射10-15分钟,用数显温度计隔30秒记录一次温度。实验结果显示其水溶液的温度可升高20-22℃(如图2所示)。
评估本发明制备的纳米免疫抑制剂的体外肿瘤细胞杀伤性能实验技术如下:
将B16F10细胞(5000个/孔)在96孔板中培养24小时,吸出培养液,加入含有0.1-0.2毫克每毫升MSNs-ICG-YM155(吲哚菁绿:0.01-0.02毫摩尔每毫升,YM155:100-200纳摩尔每升)的培养基,继续孵育6-8小时。随后向每孔中加入200微升的磷酸盐缓冲液,清洗三遍后用2.5瓦每平方厘米的808纳米激光照射B16F10细胞5-10分钟。继续培养72小时,最后将对照组、单一治疗组和经过光热及化疗的B16F10细胞用Calcein-AM/PI混合荧光染料进行死活细胞染色10分钟。在倒置荧光显微镜下通过观察绿色荧光(活细胞)和红色荧光(死细胞)的比例来判断肿瘤细胞杀伤效果。同时,相同处理方式的样品通过流式细胞术来定量判断肿瘤细胞杀伤效果,结果显示肿瘤细胞死亡率可达到75%-80%。
评估本发明制备的纳米免疫抑制剂的体内肿瘤细胞杀伤性能实验技术如下:
(1)黑色素肿瘤模型的建立:将B16F10细胞复苏并稳定传代3-4次。取处于对数生长期的细胞,用胰酶消化后制成单细胞悬液(密度为1×106每毫升)。取8周龄左右的C57/B6小鼠30只,用1毫升注射器吸取100-200微升的B16F10细胞悬液,注射入小鼠右腿上侧的皮下位置,注入的细胞数量约为2×106。注射完毕后将小鼠置于动物房中饲养。
(2)小鼠分组及不同治疗方式:当B16F10荷瘤小鼠的肿瘤直径达到约4-6毫米的时候,开始进行分组治疗。一共分为5组,每组3只老鼠。具体治疗方案如下:
组一:局部注射磷酸盐缓冲液
组二:局部注射MSNs-ICG纳米粒子,并用808纳米激光照射5-10分钟。
组三:局部注射MSNs-ICG-YM155纳米粒子,并用808纳米激光照射5-10分钟。
治疗结束后每天测量小鼠的的体重及肿瘤大小,6-7天后收集淋巴结,用胰酶消化成单细胞,并用CD80/CD86荧光抗体标记,上流式细胞仪对DCs的含量进行分析。结果显示,组三诱导了高水平的DC成熟(80-90%),肿瘤生长明显低于其他两组,有效抑制肿瘤。
实施例1
(1)介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)的制备:采用CTAB模板法制备介孔二氧化硅球。
(2)包载吲哚菁绿的MSNs-ICG纳米颗粒的制备:将步骤(1)得到的MSNs冷冻干燥为白色粉末,称取40毫克MSNs溶于4毫升去离子水中配置成浓度为10毫克每毫升的MSNs溶液;称取4毫克吲哚菁绿溶于上述MSNs溶液,室温搅拌8小时,13000转每分钟离心10分钟,收集沉淀,去离子水洗涤2次,得到MSNs-ICG纳米颗粒,重悬于去离子水中保存。
(3)包载YM155的MSNs-ICG-YM155纳米颗粒的制备:在步骤(2)得到的MSNs-ICG纳米颗粒溶液中加入30微摩尔YM155,室温搅拌8小时,13000转每分钟离心10分钟,收集沉淀,去离子水洗涤2次,得到MSNs-ICG-YM155纳米颗粒,重悬于去离子水中保存。
实施例2
(1)介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)的制备:采用CTAB模板法制备介孔二氧化硅球。
(2)包载ICG的MSNs-ICG纳米颗粒的制备:将步骤(1)得到的MSNs冷冻干燥为白色粉末,称取50毫克MSNs溶于4毫升去离子水中配置成浓度为12.5毫克每毫升的MSNs溶液;称取5毫克吲哚菁绿溶于上述MSNs溶液,室温搅拌10小时,13000转每分钟离心12分钟,收集沉淀,去离子水洗涤2次,得到MSNs-ICG纳米颗粒,重悬于去离子水中保存。
(3)包载YM155的MSNs-ICG-YM155纳米颗粒的制备:在步骤(2)得到的MSNs-ICG纳米颗粒溶液中加入40微摩尔YM155,室温搅拌10小时,13000转每分钟离心12分钟,收集沉淀,去离子水洗涤2次,得到MSNs-ICG-YM155纳米颗粒,重悬于去离子水中保存。
实施例3
(1)介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)的制备:采用CTAB模板法制备介孔二氧化硅球。
(2)包载ICG的MSNs-ICG纳米颗粒的制备:将步骤(1)得到的MSNs冷冻干燥为白色粉末,称取60毫克MSNs溶于4毫升去离子水中配置成浓度为15毫克每毫升的MSNs溶液;称取6毫克吲哚菁绿溶于上述MSNs溶液,室温搅拌12小时,13000转每分钟离心15分钟,收集沉淀,去离子水洗涤3次,得到MSNs-ICG纳米颗粒,重悬于去离子水中保存。
(3)包载YM155的MSNs-ICG-YM155纳米颗粒的制备:在步骤(2)得到的MSNs-ICG纳米颗粒溶液中加入50微摩尔YM155,室温搅拌12小时,13000转每分钟离心15分钟,收集沉淀,去离子水洗涤3次,得到MSNs-ICG-YM155纳米颗粒,重悬于去离子水中保存。
实施例4
MSNs-ICG-YM155纳米粒子的光热性能测试:将不同样品(水、ICG、MSNs和MSNs-ICG-YM155)的水溶液(1毫升)加入到石英比色皿中,然后用2.5瓦每平方米的808纳米激光照射10分钟。体外监测样品的产热性能,并用数显温度计隔30秒记录一次温度。在2.5瓦每平方米的808纳米激光连续照射10分钟后,其水溶液的温度升高了21.2℃,而对照组(水和MSNs水溶液组)只升高了3.7℃和5.1℃,说明其具有良好的产热性能(如图3所示)。并且与相同浓度下的ICG水溶液组(20.7℃)相比,其升高的温度也略大于ICG水溶液组,说明ICG被MSNs包载之后产热性能有一定的提高,更加有利于光热治疗的进行。
实施例5
检验MSNs-ICG-YM155纳米粒子的体外抗肿瘤疗效。将B16F10细胞(5000个/孔)在96孔板中培养24小时,吸出培养液,加入含有0.2毫克每毫升MSNs-ICG-YM155(吲哚菁绿:0.02毫摩尔每毫升,YM155:200纳摩尔每升)的培养基,继续孵育6小时。随后向每孔中加入200微升的磷酸盐缓冲液,清洗三遍后用2.5瓦每平方厘米的808纳米连续激光照射B16F10细胞5分钟。继续培养72小时,最后将对照组、单一治疗组和经过光热及化疗的B16F10细胞用Calcein-AM/PI混合荧光染料进行死活细胞染色10分钟。在倒置荧光显微镜下通过观察绿色荧光(活细胞)和红色荧光(死细胞)的比例来判断肿瘤细胞杀伤效果。同时,相同处理方式的样品通过流式细胞术来定量判断肿瘤细胞杀伤效果,结果显示肿瘤细胞死亡率为77.4%(如图4所示)。
实施例6
检验MSNs-ICG-YM155纳米粒子的体内抗肿瘤疗效。
(1)黑色素肿瘤模型的建立:将B16F10细胞复苏并稳定传代3次。取处于对数生长期的细胞,用胰酶消化后制成单细胞悬液(密度为1×106每毫升)。取8周龄左右的C57/B6小鼠30只,用1毫升注射器吸取100微升的B16F10细胞悬液,注射入小鼠右腿上侧的皮下位置,注入的细胞数量约为2×106。注射完毕后将小鼠置于动物房中饲养。
(2)小鼠分组及不同治疗方式:当B16F10荷瘤小鼠的肿瘤直径达到约5毫米的时候,开始进行分组治疗。一共分为5组,每组3只老鼠。具体治疗方案如下:
组一:局部注射磷酸盐缓冲液
组二:局部注射MSNs-ICG纳米粒子,并用808纳米激光照射5分钟。
组三:局部注射MSNs-ICG-YM155纳米粒子,并用808纳米激光照射5分钟。
治疗结束后每天测量小鼠的的体重及肿瘤大小,6天后收集淋巴结,用胰酶消化成单细胞,并用CD80/CD86荧光抗体标记,上流式细胞仪对DCs的含量进行分析。结果显示,组三诱导了高水平的DC成熟(86%)(如图5所示),肿瘤生长明显低于其他两组,有效抑制肿瘤。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种纳米免疫制剂,其特征在于:为MSNs-ICG-YM155纳米颗粒,以介孔二氧化硅纳米颗粒为载体,吲哚菁绿为近红外光热治疗剂,YM155为免疫治疗Survivin抑制剂。
2.根据权利要求1所述的纳米免疫制剂,其特征在于:粒径为60-100纳米。
3.根据权利要求1所述的纳米免疫制剂,其特征在于:所述ICG的载药率为8-10%,YM155载药率为0.5-1%。
4.权利要求1所述纳米免疫制剂的制备方法,其特征在于:具体方法如下:
(1)制备介孔二氧化硅球;
(2)每称取3-5毫克吲哚菁绿,溶于4ml 10-20mg/ml的MSNs水溶液中,室温搅拌8-12小时,13000转每分钟离心收集沉淀,水洗2-3次,冷冻干燥得到MSNs-ICG纳米颗粒;
(3)将30-50微摩尔YM155加入到上述MSNs-ICG纳米颗粒溶液中,室温搅拌8-12小时,13000转每分钟离心收集沉淀,水洗2-3次,冷冻干燥得到MSNs-ICG-YM155纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的纳米免疫制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中介孔二氧化硅球采用CTAB模板法进行制备。
6.权利要求1所述纳米免疫制剂在制备肿瘤抑制药物方面的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190416 |
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