CN105267965A - 一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，包括：基体，所述基体由吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物制备得到；包覆于所述基体外部的聚(乳酸-羟基乙酸)。本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物在近红外区具有较好的光学吸收性能，在激光的照射下能够产生热量杀死原发性肿瘤，肿瘤细胞的碎片可以作为抗原引发进一步的抗肿瘤免疫反应；而且本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物在免疫抑制剂的作用下能够抑制调节性T细胞的活性；本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物使光热治疗和免疫治疗产生协同作用，不仅抑制二次肿瘤的生长，还能抑制肿瘤细胞转移。本发明还提供了一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及聚(乳酸-羟基乙酸)技术领域，尤其涉及一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物及其制备方法。
背景技术
癌症是威胁人类健康的重大恶性疾病之一，从上世纪50年代起，数十年中大量的人力、物力、财力被投入到癌症的预防和治疗中，但在治疗癌症方面所取得的进展十分有限。
在癌症治疗方法中，光热治疗是一种肿瘤细胞热消融的治疗方法，其主要原理为：在激发光的照射下，利用光热转换产生的热效应来直接杀死肿瘤细胞。因此，能否在癌细胞上产生强光照吸收以及高光热转换效率是光热治疗是否成功的关键因素。近红外光是一种非侵入性的用于肿瘤光热治疗的光源，能够有效穿透正常组织到达肿瘤部位，减少对正常组织的伤害。免疫治疗包括细胞因子治疗、免疫检查点封锁方法、获得性免疫治疗和嵌合抗原受体修饰T细胞免疫治疗(CAR-T)，对癌症治疗有重要的意义。
目前，对于肿瘤的治疗学者们一致认为，选用作用机制、作用时象和作用途径不同的多种治疗方法联合应用是较为有效且切实可行的方法。因此急需一种可将多种肿瘤治疗方法联合应用的制剂，以使肿瘤治疗达到更好的治疗效果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物可应用于光热治疗和免疫治疗的联合应用中，具有较好的肿瘤治疗效果。
本发明提供了一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，包括：
基体，所述基体由吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物制备得到；
包覆于所述基体外部的聚(乳酸-羟基乙酸)。
优选的，所述聚(乳酸-羟基乙酸)、吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物的质量比为1:(0.01～0.02):(0.015～0.025)。
优选的，所述聚(乳酸-羟基乙酸)、吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物的质量比为1:(0.012～0.014):(0.017～0.022)。
优选的，所述聚(乳酸-羟基乙酸)中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为(45～55):(55～45)。
优选的，所述聚(乳酸-羟基乙酸)中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为(48～52):(52～48)。
优选的，所述聚(乳酸-羟基乙酸)的数均分子量为7000Da～17000Da。
优选的，所述聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的粒径为70nm～400nm。
本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物在近红外区具有较好的光学吸收性能，在激光的照射下能够产生热量杀死原发性肿瘤，肿瘤细胞的碎片可以作为抗原引发进一步的抗肿瘤免疫反应；而且本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物在免疫抑制剂的作用下能够抑制调节性T细胞的活性；本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物使光热治疗和免疫治疗产生协同作用，不仅抑制二次肿瘤的生长，还能抑制肿瘤细胞扩散。
此外，本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物还具有较好的水溶性和生物相容性，在水和生理条件下都具有较好的分散性，对注射部位无刺激。
本发明提供了一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的制备方法，包括：
将聚(乳酸-羟基乙酸)溶液和混合液混合后进行超声处理，得到聚(乳酸-羟基乙酸)复合物；
所述混合液中含有吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物。
优选的，所述超声处理在分散剂存在下进行，所述分散剂为聚醋酸乙烯酯。
优选的，所述聚(乳酸-羟基乙酸)溶液中的溶剂为二氯甲烷；
所述混合液中的溶剂为二甲基亚砜。
本发明提供的方法制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物在近红外区具有较好的光学吸收性能能够应用于光热治疗，而且其在免疫抑制剂的作用下能够抑制调节性T细胞的活性；本发明提供的方法制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物使光热治疗和免疫治疗联合应用产生协同作用，不仅抑制二次肿瘤的生长，还能抑制肿瘤细胞扩散。
此外，本发明提供的方法制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物还具有较好的水溶性和生物相容性，在水和生理条件下都具有较好的分散性，对注射部位无刺激。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的透射电镜图片；
图2为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的激光粒径分布图；
图3为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的紫外吸收光谱图；
图4为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物刺激DC细胞的成熟率；
图5为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物对小鼠细胞免疫的检测结果；
图6为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物对小鼠体液免疫的检测结果；
图7为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物应用于光热治疗后对小鼠细胞免疫的检测结果；
图8为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物应用于光热治疗后对小鼠体液免疫的检测结果；
图9为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物应用于光热治疗和免疫治疗联合治疗后抑制二次肿瘤的检测结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，包括：
基体，所述基体由吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物制备得到；
包覆于所述基体外部的聚(乳酸-羟基乙酸)。
本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物包括基体，所述基体由吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物制备得到。在本发明中，所述吲哚菁绿(ICG)是一种长波长的三碳菁的染料，可用于医学临床诊断，ICG基本没有毒性并且可以迅速从体内清除出去，主要用于检查脉络膜肿瘤、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、各种脉络膜炎症、血管样条纹和血管阻塞病等。本发明对所述吲哚菁绿没有特殊的限制，可由市场购买获得。在本发明的实施例中，所述吲哚菁绿的分子量为774.9Da。在本发明中，所述咪唑喹啉化合物是人工合成的低分子量的免疫调节剂，其受体是TLR7和TLR8，可以在多种细胞中诱导iv型IFNs和其他细胞因子的合成，能有效抑制多种病毒感染。在本发明的实施例中，所述咪唑喹啉化合物包括咪唑莫特(iniquinod，R837)或resiquinod(R848)；在其他的实施例中，所述咪唑喹啉化合物为R837。在本发明的实施例中，所述咪唑喹啉化合物R837的分子量为313.4Da。
本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物包括包覆于所述基体外部的聚(乳酸-羟基乙酸)。在本发明的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为(45～55):(55～45)；在其他的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为(48～52):(52～48)；在另外的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为50:50。在本发明的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)的数均分子量为7000Da～17000Da；在其他的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)的数均分子量为9000Da～15000Da；在另外的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)的数均分子量为12000Da～14000Da。
在本发明的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)、吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物的质量比为1:(0.01～0.02):(0.015～0.025)；在其他的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)、吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物的质量比为1:(0.012～0.014):(0.017～0.022)；在另外的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)、吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物的质量比为1:0.0125:0.019。
在本发明的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)复合物中吲哚菁绿的装载率为65％～75％；在其他的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)复合物中吲哚菁绿的装载率为68％～72％。在本发明的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)复合物中咪唑喹啉化合物的装载率为20％～30％；在其他的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)复合物中咪唑喹啉化合物的装载率为24％～26％。
在本发明的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的粒径为70nm～400nm；在其他的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的粒径为80nm～200nm；在另外的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的粒径为100nm～150nm。
本发明提供了一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的制备方法，包括：
将聚(乳酸-羟基乙酸)溶液和混合液混合后进行超声处理，得到聚(乳酸-羟基乙酸)复合物；
所述混合液中含有吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物。
在本发明的实施例中，可以在分散剂的作用下，将聚(乳酸-羟基乙酸)溶液和混合液混合后进行超声处理，得到聚(乳酸-羟基乙酸)复合物。在本发明的实施例中，可以将聚(乳酸-羟基乙酸)溶液、混合液和分散剂混合后进行超声处理，得到聚(乳酸-羟基乙酸)复合物；在另外的实施例中，可以将混合液和分散剂加入到聚(乳酸-羟基乙酸)溶液中混合后进行超声处理，得到聚(乳酸-羟基乙酸)复合物。在本发明的实施例中，所述超声处理的时间为10分钟～30分钟；在其他的实施例中，所述超声处理的时间为15分钟～25分钟；在另外的实施例中，所述超声处理的时间为20分钟。
在本发明中，所述混合液中含有吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物。在本发明的实施例中，所述混合液中的溶剂为二甲亚砜。在本发明的实施例中，所述混合液中吲哚菁绿的浓度为8mg/mL～12mg/mL；在其他的实施例中，所述混合液中吲哚菁绿的浓度为10mg/mL。在本发明的实施例中，所述混合液中咪唑喹啉化合物的浓度为3mg/mL～7mg/mL；在其他的实施例中，所述混合液中咪唑喹啉化合物的浓度为4mg/mL～6mg/mL；在另外的实施例中，所述混合液中咪唑喹啉化合物的浓度为5mg/mL。在本发明的实施例中，所述混合液的制备方法为：
将吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物溶于二甲亚砜中，得到混合液。
在本发明的实施例中，所述聚(乳酸-羟基乙酸)溶液中的溶剂为二氯甲烷。
在本发明中，所述混合液中吲哚菁绿、咪唑喹啉化合物和聚(乳酸-羟基乙酸)溶液中的聚(乳酸-羟基乙酸)质量比与上述技术方案所述吲哚菁绿、咪唑喹啉化合物和聚(乳酸-羟基乙酸)的质量比一致，在此不再赘述。
在本发明的实施例中，所述分散剂为聚醋酸乙烯酯。在本发明的实施例中，所述分散剂的加入量为聚(乳酸-羟基乙酸)溶液和混合液总质量的3％～7％；在其他的实施例中，所述分散剂的加入量为聚(乳酸-羟基乙酸)溶液和混合液总质量的4％～6％；在另外的实施例中，所述分散剂的加入量为聚(乳酸-羟基乙酸)溶液和混合液总质量的5％。
在本发明的实施例中，所述超声处理完成后可以将得到的产物进行搅拌，得到聚(乳酸-羟基乙酸)复合物。在本发明的实施例中，所述搅拌的时间为3小时～5小时；在另外的实施例中，所述搅拌的时间为4小时。
在本发明的实施例中，所述搅拌完成后，将得到的搅拌产物进行离心处理，得到聚(乳酸-羟基乙酸)复合物。在本发明的实施例中，通过离心处理去除搅拌产物中未形成颗粒的聚(乳酸-羟基乙酸)、吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物。在本发明的实施例中，所述离心处理的离心力为3000g～4000g；在其他的实施例中，所述离心处理的离心力为3200g～3800g；在另外的实施例中，所述离心处理的离心力为3400g～3600g。在本发明的实施例中，所述离心处理的时间为15分钟～25分钟；在另外的实施例中，所述离心处理的时间为20分钟。
在本发明的实施例中，所述离心处理完成后，可以将得到的离心处理后的产物进行超滤处理，除去其中的溶剂和分散剂。在本发明的实施例中，所述超滤处理的设备为超滤管。在本发明的实施例中，所述超滤过程中超滤膜的标称分子量为90KD～110KD；在其他的实施例中，所述超滤过程中超滤膜的标称分子量为95KD～105KD；在另外的实施例中，所述超滤过程中超滤膜的标称分子量为100KD。
本发明以下实施例所用到的原料均为市售商品。
实施例1
将吲哚菁绿(ICG)和咪唑喹啉化合物(R837)溶于二甲亚砜(DMSO)中，得到混合液，所述混合液中ICG的浓度为10mg/mL，R837的浓度为5mg/mL；将5mg聚(乳酸-羟基乙酸)(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，得到PLGA溶液；向所述PLGA溶液中加入19μLR837溶液和6.25μLICG溶液组成的上述混合液以及聚醋酸乙烯酯(PVA)混合后在100W功率下进行20分钟的超声处理，然后搅拌4小时，得到搅拌产物；将所述搅拌产物3500g离心20min，取上清，除去未形成颗粒的聚(乳酸-羟基乙酸)、吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物，然后用100KD的超滤管进行超滤除去有机溶剂及聚醋酸乙烯酯，得到聚(乳酸-羟基乙酸)复合物。
对本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物进行透射电镜测试，测试结果如图1所示，图1为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的透射电镜图片，由图1可知，本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的粒径为70nm～80nm，PLGA成功包裹了ICG和R837并形成稳定的纳米粒子。
采用颗粒粒度分析仪(MalvernInstruments,UK)，在水中测试本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的粒径分布，测试结果如图2所示，图2为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的激光粒径分布图，由图2可知，本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的水化半径为100nm～110nm，本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物为纳米粒子。
采用紫外可见吸收光谱仪(UV-VIS)测试本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物(PLGA-R837-ICG)中ICG装载率，测试结果如图3所示，图3为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的紫外吸收光谱图，由图3可知，本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物中ICG装载率为74％，其在近红外区具有较强的光学吸收性能。
采用高效液相色谱仪(HPLC)测试本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物中R837的含量，以计算R837的装载率，具体过程为：将本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物溶在色谱纯的乙腈中，在室温下育孵12小时，14800rpm离心10min除去沉淀后待测；检测波长为325nm；流动相为体积比为1:1的乙腈和水的混合物。检测结果为，本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物中R837的装载率为30％。
检测本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物对抗原提呈细胞(DC)的刺激作用：
从BALB/c老鼠的骨髓中提取DC细胞，培养7天后将其分别与实验组的物质共孵育12小时，通过流式细胞仪来检测DC细胞的成熟；实验组1的物质为脂多糖(LPS)，实验组2的物质为负载有ICG的PLGA(PLGA-ICG)，实验组3的物质为R837(freeR837)，实验组4的物质为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物(PLGA-ICG-R837)，实验组5的物质为本发明实施例1制备得到的PLGA-ICG-R837与4T1细胞在0.5W/cm2的激光下照射10分钟残留的细胞碎片(PLGA-ICG-R837+L)，实验组6的物质为PLGA-ICG与4T1细胞在0.5W/cm2的激光下照射10分钟残留的细胞碎片(PLGA-ICG+L)，实验组7的物质为4T1细胞(free4T1)；将DC细胞培养7天后不做任何处理作为对照组(Control)。
检测结果如图4所示，图4为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物刺激DC细胞的成熟率，由图4可知，单纯的PLGA-ICG-R837、freeR837、光热治疗残留的癌细胞碎片都能在细胞水平刺激DC细胞的成熟；PLGA-ICG-R837和光热治疗的联合应用能够更加有效地刺激DC细胞的成熟。
检测本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物对小鼠基体免疫反应的影响：
将24只雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)随机分为4组，每组6只，分为空白对照组(Untreated)、PLGA-ICG对照组(PLGA-ICG)、R837对照组(FreeR837)、本发明实施例1制备得到的(PLGA-ICG-R837)试验组；将对照组和实验组中的每只小鼠皮内注射2mg的相应物质；72小时每组处死3只小鼠并取其淋巴结，来检测淋巴结处的DC细胞的成熟，确定材料对小鼠机体细胞免疫水平的影响；每组另外3只小鼠，不同时间点通过眼球取血并分离小鼠血清，利用ELISA(Enzyme-linkedimmunosorbentassay)方法检测材料对抗体滴度的影响；具体方法为：
小鼠淋巴结细胞的制备
处死小鼠之后，用75％的酒精浸泡小鼠尸体并将其置于无菌超净工作台中；
无菌采集小鼠淋巴结，将采集到的小鼠淋巴结置于0.5mL的RPMI1640完全培养基(Gibco公司，含10％胎牛血清，FBS)中并剪碎；
将上述浸泡有小鼠淋巴结的培养基通过无菌纱布(2层)进行过滤，以1200rpm离心3min，弃去上清，再次敲击沉淀物使其均匀悬浮，进行细胞计数，调整细胞浓度至1×106/mL；
最后用CD11-c，CD80，CD86流式抗体进行染色，再采用流式细胞仪来检测DC细胞的成熟。
检测结果如图5所示，图5为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物对小鼠细胞免疫的检测结果，由图5可知，PLGA-ICG本身不能刺激小鼠淋巴结处DC细胞的成熟；相同剂量的R837和PLGA-ICG-R837处理的小鼠，淋巴结处DC细胞都有成熟，但PLGA-ICG-R837处理的小鼠淋巴结处DC成熟最为明显，说明PLGA能提高R837进细胞的能力，提高机体免疫的效果。
ELISA检测免疫后小鼠的体液免疫反应：
将小鼠血清用磷酸盐缓冲液进行稀释之后向ELISA试剂盒中每孔加入100μL稀释溶液在l37℃条件下孵育1h；
弃去血清，用PBST(PhosphatebufferedsalineTween-20，Dakewebiotech)洗涤8次，拍干，用PBS将酶标二抗(Dakewebiotech)进行1:5000的稀释，向试剂盒中每孔加入100μL的稀释液，在37℃条件下孵育1h；
弃去二抗后PBST洗涤8次，拍干，于试剂盒各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液(ELISA试剂盒自带，Dakewebiotech公司生物)0.1mL，在37℃下避光反应10min，待显色完全后加入50μL的2mol/L的硫酸终止反应；
利用酶标仪于450nm处(以630nm为参考波长)，以空白对照孔调零后检测各孔光密度(OD)值；
检测结果如图6所示，图6为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物对小鼠体液免疫的检测结果，由图6可知，PLGA-ICG-R837试验组的抗体滴度明显升高，说明PLGA-ICG-R837可作为免疫佐剂，能更好地促进机体的细胞免疫水平，同时能提高机体产生的抗体滴度。
本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物可作为免疫佐剂，显著提高机体的细胞免疫和体液免疫水平，在细胞及活体水平能促进树突状细胞(DC)的成熟及抗肿瘤细胞因子的产生。
测试将本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物应用于光热治疗后对小鼠基体免疫反应的影响：
将18只雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)随机分为3组，每组6只，分为空白对照组(Untreated)、本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物(PLGA-ICG-R837)对照组、PLGA-ICG-R837+光热治疗试验组(PLGA-ICG-R837+Laser)；对照组和实验组中的每只小鼠皮内注射2mg的相应物质，光热治疗时光照使肿瘤部位温度升至50℃并保持5分钟以杀死癌细胞；按照上述技术方案所述的方法，72小时后同样每组处死3只小鼠并取其淋巴结，来检测淋巴结处的DC细胞的成熟，确定材料对小鼠机体细胞免疫水平的影响；每组另外3只小鼠，不同时间点通过眼球取血并分离小鼠血清，利用ELISA(Enzyme-linkedimmunosorbentassay)方法检测材料对抗体滴度的影响；
检测结果如图7和图8所示，图7为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物应用于光热治疗后对小鼠细胞免疫的检测结果，由图7可知，PLGA-ICG-R837+光热治疗处理的小鼠淋巴结处DC成熟更明显，说明光热治疗烧死原发性肿瘤，癌细胞的碎片可以作为抗原引发进一步的抗肿瘤免疫反应，本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物应用于光热治疗中具有良好的效果。图8为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物应用于光热治疗后对小鼠体液免疫的检测结果，由图8可知，PLGA-ICG-R837+光热治疗的实验组抗体滴度明显升高，说明将本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物应用于光热治疗可将烧死癌细胞产生的碎片作为抗原，促进机体的细胞免疫和体液免疫水平。
测试本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物应用于光热治疗在抑制肿瘤转移方面的效果，具有方法为：
在BALB/c小鼠左边通过皮下注射接种第一个4T1肿瘤，一个星期后，当第一个肿瘤达到100mm3～150mm3后将第二个4T1肿瘤接种在小鼠右侧；
接种第二个4TI肿瘤后的第二天，对第一个4T1肿瘤进行处理；将第二个4T1肿瘤用来模拟转移性肿瘤，并监测第二个4T1肿瘤的生长；处理1为手术切除第一个4T1肿瘤(Surgery)，处理2为向第一个4T1肿瘤内注射本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物后手术切除第一个4T1肿瘤(Surgery+PLGA-ICG-R837)，处理3为向第一个4T1肿瘤中注射本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物后在激光照射下进行光热治疗(PLGA-ICG-R837+Laser)；
通过监测第二个肿瘤发现，基于PLGA-ICG-R837的光热治疗激起的免疫反应虽然不能完全抑制第二个肿瘤的增长，但是使第二个肿瘤的平均增长速度比通过手术切除的原位肿瘤慢。
为了进一步提高基于PLGA-ICG-R837的光热治疗诱导抗肿瘤的免疫效应，选取临床批准的抗体Anti-CTLA4抑制调节性T细胞和增强效应T细胞活性，具体方法为：
在消除原发肿瘤后的1天、4天、7天后，通过尾静脉向小鼠体内注射Anti-CTLA4抗体(克隆9h10)，对第一个4T1肿瘤处理后观察第二个4T1肿瘤的生长情况，处理4为手术切除第一个4T1肿瘤(Surgery+Anti-CTLA4)，处理5为向第一个4T1肿瘤中注射本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物后手术切除第一个4T1肿瘤(Surgery+PLGA-ICG-R837+Anti-CTLA4)，处理6为向第一个4T1肿瘤内注射本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物后进行光热治疗(PLGA-ICG-R837+Laser+Anti-CTLA4)。
观察结果如图9所示，图9为本发明实施例1制备得到的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物应用于光热治疗和免疫治疗联合治疗后抑制二次肿瘤的检测结果，由图9可知，基于PLGA-ICG-R837的光热治疗消除了原发性肿瘤，同时在Anti-CTLA-4帮助下来抑制调节性T细胞的活性，可以有效地抑制二次肿瘤的发展；因此，基于PLGA-ICG-R837光热治疗激起的免疫反应能部分延迟第二肿瘤的生长，其与免疫抑制剂(Anti-CTLA4)的联合使用能有效地抑制二次肿瘤的生长。
由以上实施例可知，本发明提供了一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，包括：基体，所述基体由吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物制备得到；包覆于所述基体外部的聚(乳酸-羟基乙酸)。本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物在近红外区具有较好的光学吸收性能，在激光的照射下能够产生热量杀死原发性肿瘤，肿瘤细胞的碎片可以作为抗原引发进一步的抗肿瘤免疫反应；而且本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物在免疫抑制剂的作用下能够抑制调节性T细胞的活性；本发明提供的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物使光热治疗和免疫治疗产生协同作用，不仅抑制二次肿瘤的生长，还能抑制肿瘤细胞扩散。
Claims (10)
1.一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，包括：
基体，所述基体由吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物制备得到；
包覆于所述基体外部的聚(乳酸-羟基乙酸)。
2.根据权利要求1所述的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，其特征在于，所述聚(乳酸-羟基乙酸)、吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物的质量比为1:(0.01～0.02):(0.015～0.025)。
3.根据权利要求2所述的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，其特征在于，所述聚(乳酸-羟基乙酸)、吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物的质量比为1:(0.012～0.014):(0.017～0.022)。
4.根据权利要求1所述的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，其特征在于，所述聚(乳酸-羟基乙酸)中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为(45～55):(55～45)。
5.根据权利要求4所述的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，其特征在于，所述聚(乳酸-羟基乙酸)中乳酸和羟基乙酸的摩尔比为(48～52):(52～48)。
6.根据权利要求1所述的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，其特征在于，所述聚(乳酸-羟基乙酸)的数均分子量为7000Da～17000Da。
7.根据权利要求1所述的聚(乳酸-羟基乙酸)复合物，其特征在于，所述聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的粒径为70nm～400nm。
8.一种聚(乳酸-羟基乙酸)复合物的制备方法，包括：
将聚(乳酸-羟基乙酸)溶液和混合液混合后进行超声处理，得到聚(乳酸-羟基乙酸)复合物；
所述混合液中含有吲哚菁绿和咪唑喹啉化合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述超声处理在分散剂存在下进行，所述分散剂为聚醋酸乙烯酯。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述聚(乳酸-羟基乙酸)溶液中的溶剂为二氯甲烷；
所述混合液中的溶剂为二甲基亚砜。
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