CN104768538A - 具有光触发释放机制的聚合物纳米载体 - Google Patents

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Abstract

以在水中引起共振的波长的近红外辐射被用于远程地激活聚合物颗粒的热塑化以触发被包封的分子从颗粒释放。由生物可相容的亲水性聚合物形成的纳米载体可以用于以可逆转变将被包封的分子递送至组织，该可逆转变允许用于有效负载的持续释放的重复激活。

Description

具有光触发释放机制的聚合物纳米载体
相关申请
本申请要求于2012年8月28日提交的美国临时申请号61/694,179的优先权的权益。
政府权利
本发明用基于由国立卫生研究院授予的批准号OD006499的政府资助而作出。政府具有本发明中的某些权利。
发明领域
本发明涉及用于生物医学应用的聚合物纳米载体和一种用于从此类纳米载体光触发释放的方法。
发明背景
从聚合物胶囊光触发释放是用于将被包封的分子在空间和时间的控制下递送至靶组织的关键手段。响应于近红外(NIR)波长(650-1300nm)的系统是特别引人注目的，这归因于具有低衰减的深的穿透深度，该系统允许低的NIR辐照穿透具有最小细胞毒性的组织的若干厘米。NIR作为用于使药物从聚合物纳米载体释放的触发物的应用是研究的活跃领域，然而，至今报告的方法存在限制它们的生物医学相关性的显著缺点。
在一般方法中，金或其他金属纳米结构被并入聚合物胶囊以在吸收NIR光时产生热，使周围的聚合物基体松动以释放治疗剂。这种方法受到以下限制：金属纳米结构的有争议的生物相容性以及在NIR吸收时产生的可能对组织有害的相当多的热。例如，已报告了温度在以1.1W辐照30分钟后变化了高达～40℃，并且温度以1.5W在5分钟内从室温变化至水溶液的沸腾温度。这种周围的过度加热可能潜在地伤害细胞。还已知这种金辅助的热塑化构思受限于热稳定的装载物(cargo)，因为已显示金属颗粒周围的温度升高远高于250℃。随着时间的推移，金纳米结构的大量辐照与高功率NIR光也可能通过熔融对金属纳米颗粒引起不可逆的损害，随着时间的推移减弱其光热响应性。
可选择地，纳米载体也可以从包含光响应形式的聚合物来配制，所述聚合物通过化学变化例如异构化作用、氧化作用、二聚作用、和键裂解来响应。为了使用固有地低能量的NIR光，所有这些机制都需要同时的双光子吸收，需要具有可能超过生物组织的损伤阈值的能量的高功率且聚焦脉冲的NIR激光的应用。最近，通过使光敏聚合物纳米载体偶联至镧掺杂的上转换纳米颗粒(UCNP)，所述上转换纳米颗粒顺序地吸收多个NIR光子并且将其转换成UV区中的更高能量的光子，双光子光化学的限制已被克服。由于不需要激发光子的同时吸收，UCNP为响应于生物学良性的励磁功率密度的触发释放做准备。然而，UCNP包含在体外和体内证明是有毒性的稀土重元素。
尽管对某种应用很感兴趣，但是所有这些策略都对广泛应用、具体地是生物医学用途具有显著障碍。因此，需要更多的生物学良性策略以获得能克服这些限制的利用NIR光遥控的光释放。
简要概述
根据本发明，利用NIR光选择性地加热可生物降解的聚合物颗粒内的束缚水以引起被包含在颗粒内的有效负载(payload)的释放。由缺乏固有的光敏性的材料形成的聚合物颗粒当被暴露于低功率的NIR光时经历热塑化，引起了允许被包封的有效负载从颗粒扩散出来的相变。利用这种方法，有效负载的瞬时释放和控制释放可以利用低至170mW的功率的连续波NIR激光来实现，而不显著加热周围的水溶液。
在一个实施方案中，可以使用连续波NIR激光以选择性地加热存在于大部分聚合物颗粒中的痕量的水，引起聚合物颗粒的热塑化，增加它们的足以释放被包封的化合物而无聚合物降解的扩散率。选择在约980nm至1200nm的范围内的NIR光的波长以在水中产生共振。在示例性实施方案中，颗粒可以由聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)形成，然而，可以使用其他聚合物基体。可以利用多次连续的NIR曝光以释放多种有效负载剂量，而不引起载体的不可逆破坏。按需的释放比率取决于施加至系统的平均NIR光子能量并且与粒度成反比，可以利用这两方面来控制释放的材料的量。
这种NIR引起的基于热塑化的释放机制提供了超越现有技术的另外的益处，包括波长敏感度、低光强度要求和对各种各样被包封的化合物的广泛适用性。
在加热悬浮于溶液中的微粒时，聚合物损失其颗粒形态并且发生凝集。在低温下，该凝集经由声处理是可逆的，然而加热至大于～60℃的温度持续大于～5分钟导致聚合物的不可逆凝集。一般而言，当有效负载被包封时，加热至大于聚合物的玻璃化转变温度的温度引起有效负载的释放，并且加热至大于～60℃的温度引起有效负载的最大释放。在37℃下以500mW对悬浮的微粒施加980nm NIR辐射15分钟引起聚合物大量的但可逆的聚集。
本发明具有许多有用的应用，其提供了小分子至细胞或生物体内(至多几厘米深)的按需递送。考虑到神经递质的NIR解除对神经科学的巨大影响，使用发明的颗粒来递送几乎任何的小分子可以为涉及正常和病理发展的疑问提供答案。发明的递送方法可以通过大量生产包封通常用于细胞生物学的药物试剂的PLGA(或其他广泛地可得的聚合物)颗粒、或作为现有聚合物的新应用来商业化，这是因为聚合物生产公司可以提供配制方案。例如，包封治疗性有效负载的良好分散的PLGA微粒可以利用微型针被容易地注射至眼部中。通常，PLGA在身体内具有短的保留时间(2-3个月)，这归因于经由聚合物主链中的酯键的断裂的降解。然而，如果激光将用于使颗粒聚集和/或凝集成大的药物储器，那么药物的保留时间可以被增大以用于长期释放。
在本发明的一方面，一种用于递送有效负载的纳米载体包含适合于包封分子的聚合物颗粒，其中聚合物包含水的纳米域并且在用NIR光辐照时经历相变，所述相变允许被包封的分子的至少一部分从颗粒扩散出来。相变优选地是可逆的并且聚合物可以不具有固有的光敏性。NIR光具有980nm的波长。聚合物可以是具有根据期望的释放速率或期望的粒度选择的丙交酯:乙交酯的比率的聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。被包封的分子可以是治疗性化合物或染料。纳米载体的聚集体可以用于在延长的时间段内递送有效负载。
在本发明的另一方面，一种用于将有效负载递送至靶组织的颗粒包含亲水性聚合物，所述亲水性聚合物具有被包封在其中的有效负载，其中，当用NIR光辐照时，聚合物经历光热转变，从而有效负载的至少一部分从颗粒扩散出来。NIR光优选地具有980nm的波长并且光热转变是可逆的。聚合物可以是具有根据期望的释放速率或期望的粒度选择的丙交酯:乙交酯的比率的聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。被包封的有效负载可以是治疗性化合物或染料。颗粒的聚集体可以用于在延长的时间段内递送有效负载。
在本发明的另一方面，一种用于递送有效负载的方法包括：将有效负载包封在纳米载体中，所述纳米载体包含不具有固有的光敏性的亲水性聚合物；使聚合物水合以形成水的纳米域；以及使纳米载体暴露于具有适合于引起共振光子与水的相互作用的波长的光，以局部地加热聚合物，以引起聚合物中的相变，从而使有效负载从纳米载体扩散出来。光优选地为具有980nm波长的NIR光。聚合物可以是具有根据期望的释放速率或期望的粒度选择的丙交酯:乙交酯的比率的聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。有效负载可以是治疗性化合物或染料。纳米载体的聚集体可以形成为用于在延长的时间段内递送有效负载。
附图简述
图1A-1D是通过热塑化的NIR引起的释放的示意图，其中图1A示出了干纳米结构，图1B示出了在水合之后在纳米结构中形成分离的水纳米域的颗粒；图1C示出了用NIR光加热纳米结构中的水，以及图1D示出了继颗粒内部的水滴的光热加热之后的被包封的分子的释放。
图2是水在NIR区中的吸收光谱的图。
图3示意性地示出了吸收的光子能通过内部转化转变成热。
图4A是用于形成纳米颗粒的示例性电喷雾装置的示意图；图4B是经由三种不同分子量的PLGA溶液的电喷雾形成的纳米颗粒的一组SEM图像。
图5A是示出球形的装载荧光素的PLGA 1、PLGA 2、和PLGA 3颗粒的大小分布的直方图；图5B是示出长形的装载荧光素的PLGA 3颗粒的大小分布的直方图；图5C是在辐照期间的不同大小的颗粒的释放速率的图。
图6A是在不同的激光波长下随时间推移的NIR引起的释放的图；图6B和图6C是(6B)未辐照的和(6C)辐照的装载荧光素的PLGA 1颗粒的每15分钟采集的荧光发射光谱的图。
图7A是去离子水(H2O)和氘化水(D2O)的吸收光谱的图；图7B示出了针对分散于H2O和D2O中的PLGA 1的荧光素的荧光强度对980nm脉冲激光曝光时间。
图8是针对辐照的和未辐照的PLGA和聚苯乙烯的随时间推移的荧光(归一化的)的图。
图9是利用差示扫描量热法测量的湿PLGA和干PLGA的玻璃化转变温度Tg的比较。
图10A是在与水的吸收光谱相同的图上的15min辐照之后累积荧光强度的图；图10B是辐照之后本体溶液的温度的图。
图11是辐照的和人工加热的装载荧光素的聚合物在溶液中的荧光强度的图。
图12A是在用980nm CW激光以不同的功率密度进行15min辐照增量之后在520nm(λex＝480nm)处测量的来自装载荧光素的PLGA 1颗粒的荧光强度的图；图12B绘制了在暴露于不同输出功率的CW激光曝光之后在含有PLGA颗粒的水溶液中的温度变化。
图13是针对980nm辐照的多次关-开循环的来自装载荧光素的PLGA1颗粒的阶梯式触发的释放的荧光强度的图。
图14A-14C分别地是尼罗蓝掺杂的PLGA颗粒、尼罗红掺杂的PLGA颗粒、以及IR780掺杂的PLGA颗粒的悬浮液的NIR辐照之后的荧光强度的图。
图15A和图15B是在NIR辐射不同的时间段时在被加热至不同温度的丙烯酰胺凝胶中的平均游离荧光寿命和平均游离荧光寿命的变化的图。
详细描述
根据本发明，NIR辐射被用于通过利用束缚于颗粒微结构内的水的独特行为来实现被包封的有效负载从固有的非光敏聚合物微粒的控制释放。图1A-1D提供了通过热塑化的NIR引起的释放的示意图。图1A示出了具有被包封的有效负载12的干颗粒10。颗粒通过在水中分散而被水合。如图1B所示，聚合物基体中的水的吸收在纳米结构中形成分离的水纳米域14。在图1C中，用NIR光16以适当波长的辐照产生聚合物颗粒10内部的束缚水滴(confined water droplet)14的光热加热。图2为水在NIR区中的吸收光谱的图，示出了在980nm处的峰值吸收。至聚合物基体的传导性热传递使聚合物变得有弹力，允许有效负载从颗粒扩散出来。图3是示出初始呈状态S0的水分子如何经由光子吸收(kab)30被激发至状态S1以及激发能(kic)32如何被转化成热34的示意图。图1D示出了继颗粒10的光热加热之后的被包封的分子(释放的有效负载12’)的释放。控制的加热和颗粒参数的选择为响应于单次辐照事件的有效负载分子的部分释放做准备，将有效负载12中的一些留在颗粒10内，以用于利用NIR光的后续释放。
在示例性实施方案中，因为聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)是FDA批准的，被广泛地用于多种生物材料应用，并且作为药物载体被深入地研究，所以选择聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)作为聚合物基体。在水环境中，可生物降解的聚合物例如PLGA膨胀并吸收水，在聚合物微结构的非晶区内形成分离的纳米域(参见图1B)。令人感兴趣地，在聚合物颗粒的微尺度几何结构内的纳米尺寸的水滴的束缚对聚合物的玻璃化转变温度(Tg)具有影响。纳米尺寸的水滴通过增加聚合物链的自由体积并且随后使聚合物的Tg降低而在聚合物基体内起到塑化剂的作用。另外，聚合物基体内部的束缚水就其对共振激光辐照的响应而言与本体水(bulk water)起不同的作用。在暴露于NIR光的共振波长时，水分子经由光子吸收被激发并且激发能被转换成热。
选择NIR波长以允许有效的光子至热能的转换以及生物学相关的穿透深度，将该范围限制至比1300nm短的波长。在该限度以下，水吸收1200nm和980nm附近的波长。由于1200nm激光不是容易地可得的，因此选择980nm光用于本研究。当用980nm NIR光辐照时，在本体水的情况下，能量经由扩散性热传递被迅速地消散。然而，由于通过聚合物保护外部本体水，因此聚合物微结构内部捕获的亚微粒水滴经由传导性热传递将能量消散至组成性聚合物基体。因此，可以利用对共振NIR激光辐射的暴露来升高内部液滴温度，而不显著加热本体溶液。这种聚合物基体的局部加热似乎通过Tg引起热相变，引起聚合物链的非晶区经历从刚性的、玻璃态转变成柔性的、橡胶态，这可逆地激发被包封的有效负载从颗粒扩散出来。因此，聚合物基体的局部加热的作用与由于水的聚合物Tg降低结合，可以容易地被应用以精确地控制被包封的内容物从聚合物微粒释放。可以将这种释放机制应用到大量的无固有的光敏性的聚合物体系，例如脂质体和纳米凝胶。
在示例性实施方案中，通过电喷雾制造包含模型释放化合物的PLGA聚合物胶囊，电喷雾是采用高压以向液体注入电荷，导致液体破碎成被推向金属板收集器的一股细小的气溶胶微液滴的配制方法。图4A提供了可以用于形成纳米颗粒的基础电喷雾系统的示意图。简单来说，对容纳聚合物溶液40的注射器42的金属喷嘴施加来自电压电源40的高压，导致液体变成带如向收集器48注入的电荷。由于溶剂快速蒸发，因此生成了稠密的、固态的聚合物微粒46。可以调整多种参数，例如外加电压、溶液注射速率、和板收集器高度以控制产生的颗粒的大小和形态。此外，活性分子例如荧光染料、荧光素可以通过在电喷雾之前使化合物溶解在聚合物溶液中来包封。这种多价的方法以高的包封效率获得高度可再现的包裹有效负载的颗粒。Almeria B等人的“Controlling the morphology ofelectrospray-generated PLGA microparticles for drug delivery”,Journal ofcolloid and interface science(2010)343(1):125-133描述了利用电喷雾来形成PLGA颗粒的程序的另外的细节。
为了测试，使用三种不同分子量的PLGA溶液:PLGA 1(比率：50:50；Mw:7-17kDa；封端的烷基酯；Aldrich)；PLGA 2(比率：50:50；Mw:24-38kDa；封端的烷基酯；Aldrich)和PLGA 3(比率：50:50；Mw:54-69kDa；封端的烷基酯；Aldrich)。得到的颗粒的大小与聚合物链的长度成比例，如图4B的SEM显微图所示，图4B从左到右示出了的不同的颗粒PLGA 1、PLGA 2、和PLGA 3。由PLGA 1和PLGA 2分别地生成具有0.5±0.1μm和2±1μm的平均直径的球形颗粒。对于PLGA 3而言，获得了球形颗粒(3.5±0.5μm)和长形颗粒(宽度＝2.1±0.4μm，长度＝10±2μm)两种。
如下获得了掺杂有荧光素(游离酸，95％Aldrich)或视黄酸的PLGA颗粒。将PLGA(100mg)溶解于0.75mL的氯仿(CHCl3，99.8％，EMD)中并用含有在DMF(二甲基甲酰胺，99％，Aldrich)中以10％w/v的活性化合物(荧光素(游离酸，95％，Aldrich)：40mg/mL，0.25mL；紫杉醇：4mg/mL，0.25mL)的溶液来稀释。PLGA 1溶液原样电喷雾，但PLGA 2和PLGA 3被分别地进一步稀释至5％和2.5％以防止伴随的纳米纤维的形成。利用25号针在20kV(γ高压，ES30)下以0.5mL/小时(KD Scientific)的流速电喷雾聚合物溶液。为了获得相同的最终电喷雾的聚合物的质量，调整PLGA样品之间的持续时间。将样品收集到相距20cm的铝板收集器上的显微镜载玻片上。颗粒(～2mg/载玻片)通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS，20×，pH 7.4，Cellgro)中声处理从该颗粒的载玻片基质被除去，用PBS洗涤并且最后被分散在5mL PBS中。
通过荧光显微镜(具有软件的)和SEM(Agilent,8500)来检查聚合物微粒的形态。从使用 软件和ImageJ软件(NIH)记录的荧光图像和SEM照片提取颗粒直径分布。在图5A和图5B中示出了相应的大小分布的直方图。通过用CHCl3溶解颗粒、在水环境中释放染料分子来确定并入各种颗粒样品中的荧光素的量。通常，将1mL CHCl3添加至5mL微粒悬浮液，涡旋5min并用去离子水稀释至50mL的最终体积。测量混合物的荧光并且通过用基体匹配的水溶液标准品线性校正来定量染料浓度。
粒度可以通过有效负载从水环境中扩散出来所需的距离来影响动力学。通过比较来自由PLGA 1、PLGA 2和PLGA 3制成的不同直径的颗粒的荧光素的释放来检查粒度和Tg对经由NIR引起的加热的释放动力学的影响。如图5C中所示，具有较低Tg的较小颗粒比具有较高Tg的较大颗粒(PLGA 1、PLGA 2和PLGA 3的值分别地为42℃、52℃和54℃)更迅速地释放其有效负载，这可以归因于：较小颗粒的表面积比体积的比率较大，从颗粒扩散出来所需的曲折路径较少，以及热塑化所需的能量较低。
利用分光荧光计(Horiba Jobin-Yvon)和石英比色皿(体积：1.5mL，光程长度：1.0cm)进行稳定状态的荧光测量。荧光素在480nm处被激发并且在520nm处测量。在用CHCl3溶解颗粒之后，通过LC-MS(具有QUADRUPOLETM 6120的Agilent 1260系列)测定并入颗粒中的紫杉醇的量。
装载荧光素的PLGA颗粒的光学落射荧光显微图示出了良好的包封效率，而无染料泄露的迹象。荧光测定法证实对于所有制剂的高的荧光素包封效率，这与～8％w/w的装载容量相对应。高的药物含量促进体系中的水渗透并且引起更多的多孔聚合物网络的生成，这是高度合意的，因为其增强了对NIR引起的热加热的响应性。
PLGA的膨胀行为及其吸收水的能力也与其结晶度有关，结晶度取决于共聚物链中的各自的单体成分(丙交酯比乙交酯)的摩尔比。乳酸比羟基乙酸更疏水，并且因此富含乙交酯的PLGA共聚物吸收更多的水。PLGA 1、PLGA 2和PLGA 3分别具有50:50、75:25和85:15的丙交酯:乙交酯的比率。由于PLGA 1的较高的亲水性，因此其表现出最高的水含量并且因此应是对NIR辐照最敏感的。
实施例1：光引起的释放
为了确定低功率是否能够引起束缚于PLGA 1颗粒内的水的充足的局部加热以允许释放，而用980nm光脉冲(1W)辐照颗粒在PBS pH 7.4中的溶液。
从聚合物颗粒的释放通过利用Ti:Sapphire激光器(Mai Tai HP,SpectraPhysics，100fs脉冲宽度，80MHz重复率，1W)或CW激光二极管(Thorlabs，仅980nm，170-350mW)以980nm、900nm或800nm辐照微型石英比色皿中的250μl等分试样(0.4mg/mL)持续特定的时间段来光引发。波片/偏振镜组合用于确保在980nm、900nm和800nm处的相等的输出功率。荧光素的释放遵循荧光光谱法，并且在每个辐照周期之后立即地记录发射光谱，而紫杉醇释放遵循LC-MS。通过光学显微镜和SEM研究被辐照的颗粒的形态。在用NIR光源辐照的同时，溶液温度利用浸没于颗粒溶液中且连接至温度控制器(J-Kem Scientific)的细线热电偶(J-Kem Scientific)测量溶液温度。利用Panasonic DMC-ZS5获取数字图像。
当PBS溶液从无色变成亮绿色时，可以用肉眼注视随时间推移的荧光素释放。落射荧光显微观察进一步证实了NIR触发释放--在NIR辐照之前，荧光素被明确地装载在PLGA 1颗粒内部，而在辐照之后，荧光表现为不规则形状的干图案，而不是界限清晰的纳米域。令人感兴趣地，被辐照的颗粒的SEM图像(图4)示出了在颗粒形态(即，大小、形状、表面纹理)上无变化迹象。甚至以1W的980nm脉冲辐照90分钟之后，也未观察到降解。这些观察表明束缚水的光热加热而非其他可能的机制例如光学气穴作用引起被包封的有效负载的释放，而不破坏聚合物基体。光学气穴作用或响应于光的蒸发气体的气泡的形成由短激光脉冲的水吸收引起，该短激光脉冲在焦点处发生电介质击穿，产生了扩张并制造声冲击波的等离子体。由于激光引起的气穴作用需要以0.5-5μm的光斑尺寸(42)聚焦的强激光(>200nJ/脉冲)，并且在本研究中仅使用具有脉冲能量≤60nJ且斑点尺寸直径≥2mm的激光束，所观察到的光释放不可能由光学气穴作用引起。尽管通过SEM未观察到颗粒变形的明确迹象，但是辐照确实看起来降低了通过收缩和凝聚所反映的颗粒稳定性。聚集体可以由被加热至其玻璃化转变(Tg)以上并且达到更好的橡胶态的颗粒产生。尽管如此，本体溶液的温度升高仍比周围环境上的少几度。本体溶液的温度升高似乎取决于激光功率和样品体积。0.25mL、1mL和2mL等分试样的颗粒悬浮液的980nm辐照分别地引起约10℃、5℃和2℃的最大温度升高。为了避免在释放实验中因体相加热而产生的不必要的可变性，温度升高通过用大样品体积工作来使温度升高最小化。
通过荧光光谱法来监测荧光素从颗粒的光引起的释放速率。荧光素从颗粒悬浮液的排放在释放时增大，因为荧光素在极性环境中更强地发荧光，并且，当其相对浓度超过～10-3M时，例如当其被包裹入PLGA颗粒内时(每kg PLGA 0.2mol荧光素)，其像大多数的有机染料一样自猝灭。
图6A绘制了在用脉冲激光(1W)以980nm(圆圈)、900nm(蓝三角形)、和800nm(倒三角形)的15min辐照增量之后来自PLGA 1颗粒的荧光素在520nm处(λex＝480nm)测量的荧光强度。当在980nm(1W)处激发时，荧光强度在第一个30min内迅速地增加，表明染料从PLGA 1颗粒快速释放进入极性介质(图6A，具有圆圈的上部曲线；还参见图6B的发射光谱(激发波长＝480nm))，并且在约60min(I/I0＝16)时饱和。相反，未暴露至光(关闭状态)或者未900nm或800nm辐照的颗粒在几个小时的过程内仅表现出很轻微的荧光增加(I/I0＝2)(图6A，下部曲线；还参见图6C的发射光谱)。这种波长选择性示出了只有当共振光子相互作用高，即以980nm辐照时，由PLGA颗粒吸收的能量才足以引起加热以及随后的有效负载的释放。而且，低背景泄露表明在不存在辐照时荧光素分子在PLGA颗粒内部保持良好的包封。计算出用980nm MR光(开/关的比率)曝光时的荧光素释放速率的25倍增加。由于荧光强度与激光曝光时间成比例，因此释放的材料的量与提供至系统的能量的量(光子的数目)成比例。
实施例2：有效负载释放中的水的作用
夹带水(entrapped water)似乎通过降低聚合物玻璃化转变温度以及吸收NIR光以引起微粒内部的局部加热以促进释放在有效负载释放中起重要作用。为了测试这种假设，在氘化水中评估从PLGA微粒的荧光素释放。测试过程与在上面实施例1中所描述的相同。图7A提供了水和D2O的吸收光谱的比较，示出了D2O(下部曲线)在980nm处未显著吸收。其对应的振动跃迁的全部通过同位素质量的增加被转移到较低的能量，并且H2O在980nm处的振动谱带因此被转移到1300nm处。在氘化水中，光引起的荧光团分子的释放只能是通过聚合物纳米结构的光子吸收的结果。对于悬浮在D2O中的装载荧光素的微粒而言，无光触发释放的迹象；动力学特点与在图7B中所示的非辐照样品的那些相匹配。这与之前的示出在本研究中使用的激光光子强度(<1W)不引起PLGA颗粒形态的变化的结果一致，并且支持释放需要水对NIR的强吸收的结论。
为了进一步测试该假设，将荧光素包封在疏水性聚合物苯聚乙烯(PS)中并且用980nm光辐照以研究有效负载释放。证实PS颗粒包封与PLGA颗粒相同的量的荧光素。如图8所示，未观察到从PS颗粒的明显释放，无论是否施加980nm辐射。这些结果与提出的方案良好地相关并且证明了在这种释放机制中的水的作用。
水的作用似乎是双重的：微粒中的水使聚合物塑化以降低其Tg，并且也是使聚合物局部加热至其湿Tg以上的原因。在文献中已示出，水和被包封的小分子可能对聚合物的Tg有影响(参见，例如，Tsavalas JG&SundbergDC(2010)，“Hydroplasticization of Polymers:Model Predictions andApplication to Emulsion Polymers”,Langmuir 26(10):6960-6966)。
利用差示扫描量热法(DSC)测量具有和不具有被包封的荧光素的PLGA微粒的干Tg和湿Tg。图9示出了该比较的结果，其导致了以下观察结果：包封荧光素具有轻微地增加聚合物的干Tg的效果，但看起来不具有增加PLGA的湿Tg的效果，这可能归因于其在溶液中的强烈的爆发式释放以及最初包裹在颗粒内的有效负载的一些的消除。另外，使用由Tsavalas等人(上述)提出的模型以基于测量的41.6℃的干Tg值计算出27.1℃的湿Tg值。这种计算值与依据DSC测量的实验测量的湿Tg值非常密切的吻合-表明饱和水环境的存在引起PLGA颗粒的Tg从42.6℃降低至27.9℃，从而证实了胶囊内部的水的存在。这被用于计算颗粒中的5％的水含量的重量分数。
PLGA载体为复杂的3D系统，该3D系统由遍及球体的其中水可以迅速渗透的整个体积分布的不同大小和弯曲度的相互连接的孔和通道组成。在相似组成和大小的PLGA颗粒中发现的预先存在的孔(与降解时产生的动态地形成的孔形成对比)呈现在3-20nm之间的直径。由于水域的大小和形状与孔径密切地联系，看起来束缚水也采用相似的圆柱状形态。
因为系统的显著加热是不合意的，所以由水引起的降低的Tg是这种释放机制的重要方面。DSC结果表明为了观察到释放，颗粒内的局部温度必须至少与测量的聚合物的湿Tg一样高。
实施例3：内部颗粒温度的评估
荧光分子温度计代表了用于颗粒内部温度测量的有前景的工具，是因为其以分子水平起作用，并且，因此在微尺度域内监测温度的方面将是有效的。温度对分子探针的荧光性能的强烈影响已被认知有相当一段时间并且已经导致最常基于发射波长和/或荧光强度上的变化的各种传感策略。另外，荧光分子的激发态寿命受温度强烈地影响，在大多数情况下，在较高的温度下示出了较短的寿命。这种温度依赖性主要地归因于非辐照的衰减率方面的变化，为此在较高温度下其重要性增大。这本研究中，FLIM用于借助于使荧光素寿命作为温度依赖变量来提取颗粒内部的温度测绘。用这种测温方法，可以进行聚合物颗粒内部的具有高的空间和温度分辨率的温度测量，这明确地揭示出在980nm辐照时的温度的升高。
为了探测延长的时间段的个体颗粒，使颗粒在丙烯酰胺水凝胶中稳定化。含有颗粒的水凝胶通过使250μL颗粒等分试样(0.4mg/mL)与丙烯酰胺(60mg)、双丙烯酰胺(1.4mg)和酰基亚磷酸锂盐(58mg/mL，10μK)混合来获得。胶凝在UV辐照(30sec，Luzhem)下被光子引发。为了获得包埋于水凝胶中的游离染料，首先在65℃下将250μL荧光素掺杂的PLGA颗粒等分试样(0.4mg/mL)加热15min以从PLGA颗粒释放染料分子，并且空的聚合物颗粒在应用相同的胶凝过程之前通过离心除去。
荧光寿命光谱学利用配备有NanoLED激发源(488nm，1MHz脉冲重复率，Horiba)和R928P检测器(Hamamatsu Photonics，日本)的时间相关的单光子计数(TCSPC)系统(Horiba)来获得。检测器设定为520nm以用于荧光素的检测。狭缝宽度在2nm和20nm之间变化以实现适当的计数率。仪器响应函数(IRF)通过利用Ludox-40(Sigma-Aldrich)在水中的散射溶液(提醒物(prompt))以480nm发射来获得。在半微型石英比色皿中测量样品和提醒物。寿命按450ns比例来记录。以0.110通道/ns的时间校正使用总共4094个通道。所有的衰减曲线都符合一个指数。利用DAS6v6.6衰减分析软件(Horiba)推导荧光寿命。符合的优良度通过χ2值、Durbin-Watsin参数以及应当在零周围随机分布的拟合线和残差的目视观察来判断。
荧光寿命成像术利用60×水浸物镜(LUMPLFLN 60XW,NA＝1.0,Olympus)在SliceScope双光子显微镜(Scientifica,UK)上进行。以980nm调谐的Chameleon Ultra II IR激光器(Coherent)(80MHz重复率，100-150fs脉冲)用于激发荧光素和束缚水二者。ScanImage r3.8用于控制扫描镜(50)。荧光发射借助于GFP发射滤光片(ET 515/50,Chroma)利用490-540nm之间的混合型PMT检测器(HPM-100-40,Becker and Hickl，德国)来检测。荧光寿命的采集通过TCSP模块(SPC-150,Becker and Hickl)同步。以下参数对所有采集的图像保持恒定：像素大小(30nm；全部512×512像素)、像素停留时间(3.2μs)、激光发射强度(显微镜物镜后10mW)、以及FLIM采集时间(60秒/图像)。荧光寿命图像用SPCimage(Becher and Hick)分析。为了最小化寿命计算误差，我们使用在峰值(对应于～1000光子每像素)处的15个光子的最小阈值和在2像素和10像素之间的像素组合因素(binningfactor)以确保在感兴趣的区域中的足够的光子。相同的计算的IRF用于所有的实验。游离荧光素在聚丙烯酰胺凝胶中的对照图像用单指数模型来分析，而PLGA颗粒图像更好地符合双指数模型。符合的优良度用χ2值以及拟合线和残差的目视观察来评估。
游离荧光素寿命和温度之间的关系用作用于温度成图的校准曲线。这通过手动地将含有荧光素分子的丙烯酰胺凝胶从20℃(室温)加热至79℃并且利用分光荧光计上的TCSPC系统获取寿命衰减曲线来实现。然后，平均激发态衰减时间(τav。)从该衰减曲线推导出并且绘制为作为温度的函数的寿命变化(Δτav。＝τav。(X℃)-τav。(20℃))(图15A)。随着升高温度而减少激发态寿命遵循与计算的-8皮秒/℃的敏感度的负线性关系。对于FLIM测量而言，将含有荧光素掺杂的PLGA颗粒的凝胶放置在容纳水的读取室中。使单独的颗粒或小颗粒聚集体在光栅扫描运动中方式经历连续的以980nm的辐照(10mW)，以确保整个颗粒/聚集体的完全辐照。每5min采集FLIM图像并且通过全部像素的集成从每个图像推导出平均寿命。由于荧光素可以通过双光子吸收在980nm处被激发，在我们刺激束缚水加热时，可以用单激光束装置采集衰减曲线。颗粒内的荧光素的、从FLIM图像推导的并且被绘制为寿命变化对辐照时间的平均寿命(图15B，空心圆圈)，揭示了寿命(Δτav＝-267ps，tirr＝25min)遵循指数趋势的明显下降。根据在图15A中所示的寿命对温度的变化的校准曲线，在5min、15min和25min辐照后分别地达到34℃、45℃和54℃的平均内部温度；这些温度远高于染料掺杂的PLGA颗粒的湿Tg。另一方面，包埋于丙烯酰胺凝胶中的游离荧光素不存在相似的辐照引起的寿命上的减少(图15B，实心圆圈)。该数据表明吸收的光能可以遍及整个本体水凝胶被有效地消散，这防止了局部加热。在以980nm辐照时，内部温度升高，这对应于寿命的减少。虽然染料掺杂的颗粒在辐照之前存在不同的平均寿命值(可能归因于颗粒大小和染料装载量的不同)，但是无论其初始值如何，作为辐照时间的函数的每个颗粒的寿命的变化是可比的。观察到的荧光表明，热变化(寿命的减少)在颗粒内部排他性地发生；在水凝胶区域未观察到明显变化。此外，由于FLIM系统的高空间分辨率，寿命的强变化的区域遍及整个聚合物基体是可辨识的，这表明能够生成大量热的富含水的区域存在于PLGA颗粒内。该温度变化比其它热引起的释放机制中温度变化、特别地与包含金纳米结构的那些相比更适度，温度升高报告为远高于250℃，这提高了关于装载物在此高温下的稳定性的关注。
束缚水相对于本体水环境的观察到的选择性加热归因于这二者之间的巨大的体积差异。由于热容量是广度性能，因此对于引入系统中的相同量的能量而言，水的纳米域将被加热至比其本体水相应物显著地更高的温度。然而，加热由于纳米液滴的高的表面积比体积的比率而被减弱，这是因为激发的束缚水通过传导性热转移迅速地将热消散至周围的聚合物基体。此外，由于使整体颗粒升温，因此对本体水的对流热传递同时地将热从颗粒的表面除去。尽管如此，由于从激发的水滴到周围环境(聚合物基体、水)的热消散(毫秒)远慢于光子能量的振动吸收中涉及的动力学(皮秒)，当暴露于980nm激光辐照时，电磁能仍然可以在颗粒内积累并且提高束缚水域的温度。如之前提到的，与金属纳米结构相比，在颗粒内部达到的最大观察温度小得多。例如，与金相比，水具有高得多的热容(Cp，水＝4.186J/g.℃；Cp，金＝0.129J/g·℃)(44)，这意味着在相同的量下其需要更多的光能来升高其温度。最终，在大多数可生物降解的聚合物具有低于60℃(45)的Tg的情况下，产生的局部加热足以软化聚合物基体并且引起被包封的有效负载的释放。增加光子到热的转换效率并且因此在较低的激光功率下保持相同的释放功效的有吸引力的选择将用于开发具有较大吸收率的水吸收带(即，1200nm、1450nm、1950nm)(43)。这可以证明对高度散射环境中的释放实验是特别有用的，因为激光束在穿过样品的同时将快速地变宽并且损失其高的峰值功率。
实施例4：波长选择性
光子-热过程的波长选择性通过在辐照前和辐照后监测样品的荧光强度和温度来探究。含有聚合物微粒的等分试样通过在DI H2O中以0.5mg/mL的浓度悬浮颗粒并且以不同的波长(50nm增量，以780nm开始)辐照15min来制备。为了一致性而在每个波长处将功率调节至500mW并且监测温度。当以与980nm附近的水吸收带一致的波长辐照时，指示释放的荧光变化显著较高。以非共振波长辐照后的曲线(profile)与未辐照的样品的曲线相似。图10A绘制了在与水的吸收光谱相同的图上的15min辐照后的样品的累积强度。数据的重叠强烈地表明NIR辐射的波长选择性。还监测本体溶液的温度(在图10B中绘制)并且发现当以水吸收带(980nm)的最大值辐照时是最高的，再次表明980nm辐射的波长选择性。
虽然结果似乎表明激光在引起释放方面是成功的，但是仍产生了关于释放是否归因于本体水的加热的疑问。为了证实有效负载的释放是由于束缚水的局部加热，而不是由于本体水的加热，使含有聚合物颗粒的1mL等分试样人工地在25℃和37℃下加热15分钟并且测量样品荧光。将这些测量结果与归因于以980nm辐照所收集的结果相比较。人工加热至25℃与未加热的对照样品相比不引其显著释放，而在37℃下的人工加热引起了与通过以980辐照引起的释放可比的释放。在图11中所示的这种数据与测量的聚合物的湿Tg相符：人工加热至湿Tg以下的温度不引起有效负载的显著释放，而人工加热至湿Tg以上的温度引起有效负载的显著释放。此外，如人们可以预料的，本体溶液的温度升高是体积依赖的。以1w辐照水的0.25mL、1mL和2mL等分试样15分钟分别地引起温度升高约10℃、5℃和2℃。如果这些颗粒将被应用到基本上作为大的散热器的主体中，那么周围的本体环境的温度升高应当是可忽略的。
触发有效负载释放的光物理转换过程通过泛频振动吸收疏水(overtonevibration absorption hydrophobiv)的激发而发生，并且因此不必递送作为短的、聚焦的光脉冲的980nm光，这与同时的双光子吸收过程形成对照。因此，有效的光触发释放也可以利用更经济且生物学相关的连续波(CW)激光装置在低激发功率下实现。图12A是在用980nm CW激光以不同的功率密度进行15分钟辐照增量后在520nm(λex＝480nm)处测量的来自PLGA 1的荧光素的荧光强度的图。这些结果示出：通过将激发功率密度从170mW变化至350mW，释放速率取决于用于激发PLGA颗粒的平均NIR光子能量。如所期望的，荧光素的释放在较高的CW功率密度下更迅速地发生，其中与当以260mW和170mW辐照时分别为14和5的开/关比相比，当以350mW辐照时为18的开/关比。在90分钟之后，在350mW、260mW、和170mW的CW输出功率下从PLGA颗粒分别地释放累积69％、52％、和20％的荧光素。在90分钟之后，在350mW、260mW、和170mW的CW输出功率下从PLGA 1颗粒分别地释放累积69％、52％、和20％的荧光素。图12B绘制了继暴露于170mW、260mW和350mW的输出功率的CW激光曝光之后在含有PLGA颗粒的水溶液中的温度变化。
这些实验显示：样品的环境温度升高至聚合物的Tg以上的温度有助于释放，这是因为在本体水中累积的能量也可以被转移至聚合物胶囊。然而，这些显著的温度变化比利用其他热引起的释放机制发生的温度变化相当地更适度。例如，已报告了金纳米结构产生范围为从以1.1W辐照30min后的67℃到以1.5W辐照5分钟内的沸腾温度的温度变化。已显示当用800nm附近的NIR激光照射时在金属颗粒周围的温度升高远高于250℃(11-12)，限制了热稳定的装载物的基于金的光热释放；我们报告的机制对广泛范围的分子是适用的。基于金的光热释放的另一个缺点在于，用高功率的NIR光的大量辐照导致对金属NP的不可逆损害，随着时间推移使其光热响应性劣化。
实施例5：释放的可逆性
由于需要释放的鲁棒控制，因此测试释放机制的可逆性是重要的。永久性影响将导致辐照结束后的持续释放，而可逆的按需的影响将导致继激光辐照终止后的减缓的释放曲线。为了测试可逆性，利用NIR光(脉冲激光，980nm，1W)重复地辐照荧光素掺杂的PLGA 1微球体悬浮液5min，接着是期间关闭激光的15min的间隔。图13中示出结果，图13是在关状态(15min)的六个循环和开状态(15min辐照，980nm，脉冲激光，1W)的五个循环的期间测量的荧光的图。在NIR辐照时观察到从PLGA颗粒的荧光素释放的迅速增加，但是当NIR辐照被关闭时释放速率实际上下降至其初始速率。在多个连续曝光期间观察到相似的开/关释放比率。这种阶梯式的触发释放实验证明了这种光化学机制的可逆性，表明在NIR辐照时PLGA颗粒保持其完整性。在这种情况下，在关状态中观察到的小的有效负载释放被认为是归因于扩散至由荧光素从颗粒流失而产生的空隙中的水分子，这进而促进从颗粒的扩散。
实施例6：疏水性的释放效应
由于PLGA胶囊能够以高的效率包封疏水性化合物和亲水性化合物二者，研究了这种光-热过程释放不同疏水性的小有效负载的能力。利用电喷雾，将IR780、尼罗红、和尼罗蓝(以增加的极性的顺序)分别地装载至尺寸为0.7±0.1μm、1.4±0.3μm和1.2±0.4μm的球形PLGA胶囊(～10％w/w)中。对于装载染料的PLGA颗粒的所有水悬浮液而言，持续的NIR曝光(980nm，脉冲激光，1W)引起染料随时间的连续释放。图14中示出了尼罗蓝(λex＝460nm，λem＝475-750nm)(图14A)、尼罗红(λex＝560nm，λem＝570-750nm)(图14B)和IR780(λex＝740nm，λem＝750-900nm)(图14C)的结果。在每一种情况下，对照为未辐照(实心圆圈)。
这些发现揭示了这种光-热过程能够持续释放亲水性化合物和疏水性化合物二者。令人感兴趣地，可以观察到与染料极性的差异有关的在释放动力学方面值得注意的趋势，即，较大极性的染料被较快地释放。这种差异可以由水吸收的变化引起：亲水性内容物促进聚合物载体中的水渗透并且导致更多孔且膨胀的聚合物网络的生成，而更多的疏水性化合物阻碍水扩散至结构中。包封亲水性装载物的颗粒接下来将对NIR辐照更敏感，并且更容易地释放其内容物。释放速率的变化也与引起从基体的扩散所需的能量有关，用于亲水性化合物的能量应该比用于疏水性化合物的低，因为疏水性化合物对疏水性载体具有更高的亲和力。
本发明提供了一种用于基于利用980nm NIR光加热被包封的水从聚合物颗粒控制释放有效负载的程序。不具有固有光敏性的聚合物颗粒含有被包封的纳米水滴，所述被包封的纳米水滴可以被选择性地加热以将热传递至聚合物基体，升高聚合物颗粒的内部温度并且使其达到更好的橡胶态，允许有效负载从颗粒扩散出来。在980nm处共振光子与水的相互作用可以引起亲水性分子和疏水性分子二者的显著释放。按需的释放速率取决于施加至系统的平均NIR光子能量并且与粒度成反比。可以利用多次连续的NIR曝光以获得多种释放剂量，而无载体的不可逆破坏，并且，考虑到电喷雾技术的高的包封效率，允许大量的释放循环。这种NIR引起的基于热塑化的释放机制提供了超越包括波长选择性和高敏感度、低的CW激光功率要求的现有的释放策略的显著益处，避免了过度加热。本发明提供了用于光活化的自复原胶囊；用于对细胞增殖、分化、或迁移而按需提供线索的细胞外支架(纳米纤维，水凝胶)；基于热变色染料的可活化的荧光颗粒；以及光触发的药物递送系统的应用。
本发明具有用于按需将小分子递送至细胞或生物体内的许多有用的应用。发明的递送方法可以通过大量生产包封通常用于细胞生物学的药物试剂的PLGA(或其他广泛地可得的聚合物)颗粒、或作为现有聚合物的新应用来商业化，这是因为聚合物生产公司可以提供配制方案。例如，包封治疗性有效负载的良好分散性的PLGA微粒可以利用微型针被容易地注射至眼部中。通常，PLGA在身体内具有短的保留时间(2-3个月)，这归因于经由聚合物主链中的酯键的断裂的降解。然而，如果激光将用于使颗粒聚集和/或凝集起成大的药物储器，那么药物的保留时间可以被增大以用于长期(持续)释放。
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Claims (34)

1.一种用于递送有效负载的纳米载体，包含：
聚合物颗粒，所述聚合物颗粒适合于包封分子，其中所述聚合物包含水的纳米域并且在用NIR光辐照时经历相变，所述相变允许被包封的分子的至少一部分从所述颗粒扩散出来。
2.如权利要求1所述的纳米载体，其中所述相变是可逆的。
3.如权利要求1所述的纳米载体，其中所述NIR光具有980nm的波长。
4.如权利要求1所述的纳米载体，其中所述聚合物不具有固有的光敏性。
5.如权利要求1所述的纳米载体，其中所述聚合物为聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。
6.如权利要求5所述的纳米载体，其中所述PLGA具有根据所期望的释放速率选择的丙交酯:乙交酯的比率。
7.如权利要求5所述的纳米载体，其中所述丙交酯:乙交酯的比率选自由50:50、75:25和85:15组成的组。
8.如权利要求5所述的纳米载体，其中所述PLGA具有根据所期望的粒度选择的丙交酯:乙交酯的比率。
9.如权利要求8所述的纳米载体，其中所述丙交酯:乙交酯的比率选自由50:50、75:25和85:15组成的组。
10.如权利要求1所述的纳米载体，其中所述被包封的分子包括治疗性化合物。
11.如权利要求1所述的纳米载体，其中所述被包封的分子包括染料。
12.一种用于在延长的时间段内递送有效负载的如权利要求1所述的纳米载体的聚集体。
13.一种用于将有效负载递送至靶组织的颗粒，包含：
亲水性聚合物，所述亲水性聚合物具有被包封在其中的有效负载，其中，当用NIR光辐照时，所述聚合物经历光热转变，从而所述有效负载的至少一部分从所述颗粒扩散出来。
14.如权利要求13所述的颗粒，其中所述光热转变是可逆的。
15.如权利要求13所述的颗粒，其中所述NIR光具有980nm的波长。
16.如权利要求13所述的颗粒，其中所述聚合物不具有固有的光敏性。
17.如权利要求13所述的颗粒，其中所述聚合物为聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。
18.如权利要求17所述的颗粒，其中所述PLGA具有根据所期望的释放速率选择的丙交酯:乙交酯的比率。
19.如权利要求17所述的颗粒，其中所述丙交酯:乙交酯的比率选自由50:50、75:25和85:15组成的组。
20.如权利要求17所述的颗粒，其中所述PLGA具有根据所期望的粒度选择的丙交酯:乙交酯的比率。
21.如权利要求21所述的颗粒，其中所述丙交酯:乙交酯的比率选自由50:50、75:25和85:15组成的组。
22.如权利要求13所述的颗粒，其中被包封的有效负载包括治疗性化合物。
23.如权利要求13所述的颗粒，其中被包封的有效负载包括染料。
24.一种用于在延长的时间段内递送有效负载的如权利要求17所述的颗粒的聚集体。
25.一种用于递送有效负载的方法，包括：
将所述有效负载包封在纳米载体中，所述纳米载体包含不具有固有的光敏性的亲水性聚合物；
使所述聚合物水合以形成水的纳米域；
使所述纳米载体暴露于具有适合于引起共振光子与所述水的相互作用的波长的光，以局部地加热所述聚合物，以引起所述聚合物中的相变，从而使所述有效负载从所述纳米载体扩散出来。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述光为具有980nm的波长的NIR光。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述聚合物为聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述PLGA具有根据所期望的释放速率选择的丙交酯:乙交酯的比率。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述丙交酯:乙交酯的比率选自由50:50、75:25和85:15组成的组。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述PLGA具有根据所期望的粒度选择的丙交酯:乙交酯的比率。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述丙交酯:乙交酯的比率选自由50:50、75:25和85:15组成的组。
32.如权利要求25所述的方法，其中所述有效负载包括治疗性化合物。
33.如权利要求25所述的方法，其中所述有效负载包括染料。
34.如权利要求25所述的方法，还包括：形成纳米载体的聚集体以用于在延长的时间段内递送所述有效负载。
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