CN114350346B - 一种制备稳定icg染料敏化上转换纳米颗粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒的方法，利用FNP方法制备UCNPs‑ICG，步骤包括：(1)NaYF4:20％Yb,2％Er(core)的合成；(2)NaYF4:20％Yb,2％Er@NaYF4:20％Nd(core‑shell)的合成：(3)UCNPs‑ICG NPs的制备。通过限域空间内的对冲混合技术制备ICG染料敏化的上转换纳米颗粒，其尺寸和电荷可控，并且聚合物大大低了了ICG以及UCNPs被水淬灭的效率，极大提高了ICG的水相稳定性，并且利用ICG敏化了上转化粒子，提高了上转化粒子的发光效率及时间，在治疗诊断学方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种高度稳定的染料敏化上转换纳米颗粒，具体为通过限域空间内的强对冲混合技术制备稳定ICG染料敏化的上转换纳米颗粒，属于新材料技术领域。
背景技术
近几年来，稀土掺杂的上转换纳米颗粒(UCNPs)因其良好的低毒性、光稳定性、化学稳定性等特性，而具有巨大应用潜力，如用于光动力和光热癌症治疗，药物传递，食物中病原体的检测，生物成像等。UCNPs可以利用近红外光，通常为980nm或808nm激发发射出可见光或近红外光等，发射峰较窄，无自体荧光，其荧光性能几乎不受外界温度、湿度及酸度的影响，因此适合在复杂的生物体系中用作生物标记材料。但是UCNPs有限的亮度而且较低的上转换效率，阻止了其在生物医学当中的进一步应用。目前，为了解决这些问题，研究尝试了构建核壳结构的UCNPs、优化掺杂的镧系金属浓度、利用等离子体结构或采用染料敏化等方案。
其中，利用染料敏化UCNPs的方案是将有强吸收光谱的有机染料通过配位作用或者疏水作用在UCNPs表面，与镧系离子直接吸收激发光不同，采用吸收截面大的染料作为“天线”吸收光子能量，通过共振能量传递将激发态能量传递给镧系离子，借此来提高上转换效率。
然而，在水相中有机染料因其疏水性导致敏化效率受到严重限制，为了解决这一问题，一般采用传统混合等简单自组装方法，通过将两亲性聚合物包裹在染料及UCNPs外部，形成亲水的纳米颗粒。从而使得有机染料可以在水相环境中，有效的敏化UCNPs。
目前传统的纳米颗粒制备的方法主要分为乳化溶剂挥发法、喷雾干燥、透析法等，然而这些制备纳米颗粒的方法都有其局限。相较于传统混合制备纳米颗粒的方法，一种限域空间内的强对冲混合技术5瞬时纳米沉淀技术(Flash Nanoprecipitation,FNP)作为一种新型混合沉淀制备纳米颗粒的工艺，具有过程可控等优点，制备得到的两亲性聚合物包覆的纳米颗粒分散性好，粒径尺寸可控，电荷可控且具有高稳定性。FNP工艺将混合的发生缩小到纳米尺度，通过反应器的限域高湍流混合，实现高效混合分散，并且由此制备得到的纳米颗粒具有可重复性，可以批量生产，并且操作简单。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明采用FNP工艺，快速制备高度稳定的染料敏化上转换纳米粒子，与传统方法相比，应用这种方法制备的有机染料敏化UCNPs被两亲性聚合物包裹形成新的纳米颗粒，可以在水相中有良好的上转换发光效率，并且得到的纳米颗粒尺寸更小、分散性更好、稳定性更好，在生物应用中极有潜力。本发明可将制备得到的纳米颗粒应用于肿瘤的光热治疗。
本发明的具体技术方案是：一种制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒(UCNPs-ICG NPs)的方法，利用FNP方法制备UCNPs-ICG的具体技术方案如下：
(1)NaYF4:20％Yb,2％Er(core)的合成：
将六水合三氯化铒(ErCl3·6H2O)、六水合三氯化镱(YbCl3·6H2O)和六水合三氯化钇(YCl3·6H2O)添加到100mL三口烧瓶中，加入油酸(OA)和十八烯(ODE)，在氮气保护和磁力搅拌下，加热110℃反应20min后，将温度升高到160℃反应40min。将氟化铵(NH4F)和氢氧化钠(NaOH)溶于甲醇中，待反应液冷却至室温后，加入准备好的甲醇溶液，在氮气保护下将反应液加热到50℃反应30min，而后升温至110℃反应30min，随后再加热到310℃反应40min。待反应液冷却至室温后加入过量乙醇，在11000rpm下离心20min收集沉淀，将得到的产物再用乙醇洗涤后，分散在环己烷中。
进一步的，所述ErCl3·6H2O添加的量是0.02mmol，YbCl3·H2O添加的量是0.20mmol，YCl3·H2O添加的量是0.78mmol。
进一步的，所述油酸添加的量是7.50mL，十八碳烯添加的量是15.00mL。
进一步的，所述甲醇添加的量是10.00ml，NH4F添加的量是4.00mmol，NaOH添加的量是2.50mmol。
(2)NaYF4:20％Yb,2％Er@NaYF4:20％Nd(core-shell)的合成：
将六水合三氯化钕(NdCl3·6H2O)和六水合三氯化钇(YCl3·6H2O)添加到100mL三口烧瓶中，加入油酸(OA)和十八烯(ODE)，在氮气保护和磁力搅拌下，将反应液加热到110℃反应30min，之后将温度升高到150℃反应30min。待反应液冷却到室温，将(1)中制备得到的产物加入到该体系中，加热至100℃反应30min。将氟化铵(NH4F)和氢氧化钠(NaOH)溶于甲醇中，再将反应液冷却到50℃，加入准备好的甲醇溶液，在氮气保护下反应30min，然后再将反应液加热到120℃反应30min，而后迅速加热到310℃反应30min。待反应液冷却至室温后，加入过量的乙醇，在11000rpm下离心20min收集沉淀，将沉淀物用乙醇洗涤几次后，分散在四氢呋喃中。
进一步的，所述NdCl3·6H2O添加的量是0.10mmol，YCl3·H2O添加的量是0.40mmol。
进一步的，所述油酸添加的量是7.50mL，十八碳烯添加的量是15.00mL。
进一步的，所述甲醇添加的量是10.00ml，NH4F添加的量是2.00mmol，NaOH添加的量是1.25mmol。
(3)UCNPs-ICG NPs的制备：
通过FNP技术，利用四通道快速对冲涡流混合器，将(2)得到的UCNPs、嵌段共聚物及有机染料溶于四氢呋喃中，作为1号液流。2号液流、3号液流和4号液流为超纯水。将所述1号、2号、3号和4号四股液流同时注入MIVM中进行快速混合，把得到的纳米颗粒悬浮液以11000rpm的速度离心10min得到纳米颗粒。
进一步的，所述UCNPs的浓度是1mg/mL。
进一步的，所述嵌段共聚物是PEG-b-PLGA。
进一步的，所述嵌段共聚物PEG-b-PLGA的浓度是1mg/mL。
进一步的，所述有机染料是吲哚菁绿(Indocyanine Green，ICG)。
进一步的，所述ICG的浓度是4μM。
进一步的，所述调节四股液流之间的流速比是通过调节1号液流与2号液流、3号液流和4号液流之间的流速比。所述1号液流的注射流速为12mL/min；所述2号液流的注射流速为20～36mL/min；所述3号液流的注射流速为20～36mL/min；所述4号液流的注射流速为20～36mL/min。
进一步的，所述四股流液间隔90度，同时注入涡流中心。
本发明的创新点在于采用了一种新方法，制备出了具有高度稳定性的染料敏化的上转换纳米粒子，该方法简单便捷且容易控制，在生物医学应用上有广阔的前景。
附图说明
图1是FNP法和传统混合(TM)法制备水溶性UCNPs-ICG NPs示意图；
图2是实施例1-4制备的通过FNP法采取不同的水/THF比例得到的UCNPs-ICG NPs和传统方法制备的UCNPs-ICG NPs的透射电镜(TEM)图。
图3是实施例1-4制备的通过FNP法采取不同的水/THF比例得到的UCNPs-ICG NPs和传统方法制备的UCNPs-ICG NPs的粒径分布(DLS)。
图4是实施例1-4制备的通过FNP法采取不同的水/THF比例得到的UCNPs-ICG NPs和传统方法制备的UCNPs-ICG NPs，在波长808nm，强度1W/cm2的激光照射下，在542nm处的上转换荧光发射强度图。
图5是实施例1、4制备的UCNPs-ICG NPs在波长808nm，强度1W/cm2的激光照射下，在水相中542nm处的上转换发射强度趋势图
图6是实施例1、4制备的UCNPs-ICG NPs在波长808nm，强度1W/cm2的激光照射下，在水相中848nm处的ICG荧光发射强度趋势图。
图7是实施例1、4制备的UCNPs-ICG NPs培育SMMC-7721细胞，在波长808nm，能量0.5W/cm2的激光连续照射20min后的CLSM图。
具体实施方式
本发明制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒(UCNPs-ICG NPs)的方法，利用FNP方法制备UCNPs-ICG的具体技术方案如下：
(1)NaYF4:20％Yb,2％Er(core)的合成：
将六水合三氯化铒(ErCl3·6H2O)，六水合三氯化镱(YbCl3·6H2O)和六水合三氯化钇(YCl3·6H2O)添加到100mL三口烧瓶中，加入油酸(OA)和十八烯(ODE)，在氮气保护和磁力搅拌下，加热110℃反应20min后，将温度升高到160℃反应40min。将氟化铵(NH4F)和氢氧化钠(NaOH)溶于甲醇中，待反应液冷却至室温后，加入准备好的甲醇溶液，在氮气保护下将反应液加热到50℃反应30min，而后升温至110℃反应30min，随后再加热到310℃反应40min。待反应液冷却至室温后加入过量乙醇，在11000rpm下离心20min收集沉淀，将得到的产物再用乙醇洗涤后，分散在环己烷中。
所述ErCl3·6H2O添加的量是0.02mmol，YbCl3·H2O添加的量是0.20mmol，YCl3·H2O添加的量是0.78mmol。
所述油酸添加的量是7.50mL，十八碳烯添加的量是15.00mL。
所述甲醇添加的量是10.00ml，NH4F添加的量是4.00mmol，NaOH添加的量是2.50mmol。
(2)NaYF4:20％Yb,2％Er@NaYF4:20％Nd(core-shell)的合成：
将六水合三氯化钕(NdCl3·6H2O)和六水合三氯化钇(YCl3·6H2O)添加到100mL三口烧瓶中，加入油酸(OA)和十八烯(ODE)，在氮气保护和磁力搅拌下，将反应液加热到110℃反应30min，之后将温度升高到150℃反应30min。待反应液冷却到室温，将(1)中制备得到的产物加入到该体系中，加热至100℃反应30min。将氟化铵(NH4F)和氢氧化钠(NaOH)溶于甲醇中，再将反应液冷却到50℃，加入准备好的甲醇溶液，在氮气保护下反应30min，然后再将反应液加热到120℃反应30min，而后迅速加热到310℃反应30min。待反应液冷却至室温后，加入过量的乙醇，在11000rpm下离心20min收集沉淀，将沉淀物用乙醇洗涤几次后，分散在四氢呋喃中。
所述NdCl3·6H2O添加的量是0.10mmol，YCl3·H2O添加的量是0.40mmol。
所述油酸添加的量是7.50mL，十八碳烯添加的量是15.00mL。
所述甲醇添加的量是10.00ml，NH4F添加的量是2.00mmol，NaOH添加的量是1.25mmol。
3)UCNPs-ICG NPs的制备：
通过FNP技术，利用四通道快速对冲涡流混合器，将(2)得到的UCNPs、嵌段共聚物及有机染料溶于四氢呋喃中，作为1号液流。2号液流、3号液流和4号液流为超纯水。将所述1号、2号、3号和4号四股液流同时注入MIVM中进行快速混合，把得到的纳米颗粒悬浮液以11000rpm的速度离心10min得到纳米颗粒。
所述UCNPs的浓度是1mg/mL。
所述嵌段共聚物是PEG-b-PLGA。
所述嵌段共聚物PEG-b-PLGA的浓度是1mg/mL。
所述有机染料是吲哚菁绿(Indocyanine Green，ICG)。
所述ICG的浓度是4μM。
所述调节四股液流之间的流速比是通过调节1号液流与2号液流、3号液流和4号液流之间的流速比。所述1号液流的注射流速为12mL/min；所述2号液流的注射流速为20～36mL/min；所述3号液流的注射流速为20～36mL/min；所述4号液流的注射流速为20～36mL/min。
所述四股流液间隔90度，同时注入涡流中心。
下面，用实施例来进一步说明本发明内容，但本发明的保护范围并不仅限于实施例。对本领域的技术人员在不背离本发明精神和保护范围的情况下做出的其它变化和修改，仍包括在本发明保护范围之内。
实施例1
将上述步骤1、2制得的UCNPs、ICG与PEG-b-PLGA添加于四氢呋喃中，浓度分别为1mg/mL、4μM、1mg/mL，作为1号液流，流速设置为12mL/min。2号液流、3号液流和4号液流为超纯水，流速设置为36mL/min。将所述1号、2号、3号和4号四股液流分别用泵同时注入四通道涡流混合器内进行快速混合，收集制备的纳米粒子悬浮液，以11000rpm的速度离心10min，沉淀用水洗涤几次后，分散在纯水中，得到水/THF体积比为9:1的UCNPs-ICG NPs。
实施例2
将上述步骤1、2制得的UCNPs、ICG与PEG-b-PLGA添加于四氢呋喃中，浓度分别为1mg/mL、4μM、1mg/mL，作为1号液流，流速设置为12mL/min。2号液流、3号液流和4号液流为超纯水，流速设置为28mL/min。将所述1号、2号、3号和4号四股液流分别用泵同时注入四通道涡流混合器内进行快速混合，收集制备的纳米粒子悬浮液，以11000rpm的速度离心10min，沉淀用水洗涤几次后，分散在纯水中，得到水/THF体积比为7:1的UCNPs-ICG NPs。
实施例3
将上述步骤1、2制得的UCNPs、ICG与PEG-b-PLGA添加于四氢呋喃中，浓度分别为1mg/mL、4μM、1mg/mL，作为1号液流，流速设置为12mL/min。2号液流、3号液流和4号液流为超纯水，流速设置为20mL/min。将所述1号、2号、3号和4号四股液流分别用泵同时注入四通道涡流混合器内进行快速混合，收集制备的纳米粒子悬浮液，以11000rpm的速度离心10min，沉淀用水洗涤几次后，分散在纯水中，得到水/THF体积比为5:1的UCNPs-ICG NPs。
实施例4
将上述步骤1、2制得的UCNPs、ICG与PEG-b-PLGA添加于四氢呋喃中，浓度分别为1mg/mL、4μM、1mg/mL。然后在剧烈搅拌下，向配制的四氢呋喃溶液中加入水/THF的体积比为9的水。收集制备的纳米粒子悬浮液，以11000rpm的速度离心10min，沉淀用水洗涤几次后，分散在纯水中，得到水/THF体积比为9:1的UCNPs-ICG NPs(TM)。
请参见附图。
图1是FNP法和传统混合(TM)法制备水溶性UCNPs-ICG NPs示意图；
图2是实施例1-4制备的通过FNP法采取不同的水/THF比例得到的UCNPs-ICG NPs和传统方法制备的UCNPs-ICG NPs的透射电镜(TEM)图。
图3是实施例1-4制备的通过FNP法采取不同的水/THF比例得到的UCNPs-ICG NPs和传统方法制备的UCNPs-ICG NPs的粒径分布(DLS)。
图4是实施例1-4制备的通过FNP法采取不同的水/THF比例得到的UCNPs-ICG NPs和传统方法制备的UCNPs-ICG NPs，在波长808nm，强度1W/cm2的激光照射下，在542nm处的上转换荧光发射强度图。
图5是实施例1、4制备的UCNPs-ICG NPs在波长808nm，强度1W/cm2的激光照射下，在水相中542nm处的上转换发射强度趋势图
图6是实施例1、4制备的UCNPs-ICG NPs在波长808nm，强度1W/cm2的激光照射下，在水相中848nm处的ICG荧光发射强度趋势图。
图7是实施例1、4制备的UCNPs-ICG NPs培育SMMC-7721细胞，在波长808nm，能量0.5W/cm2的激光连续照射20min后的CLSM图。
Claims (9)
1.一种制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)NaYF4:20％Yb,2％Er的合成：
在六水合三氯化铒，六水合三氯化镱和六水合三氯化钇混合物中，加入油酸和十八烯，在氮气保护和磁力搅拌下，加热反应，反应完成后待反应液冷却至室温后，加入氟化铵和氢氧化钠溶于甲醇的甲醇溶液，在氮气保护下加热反应，反应完成后待反应液冷却至室温后加入过量乙醇，离心分离，将得到的产物再用乙醇洗涤后，分散在环己烷中；
(2)NaYF4:20％Yb，2％Er@NaYF4:20％Nd的合成：
在六水合三氯化钕和六水合三氯化钇混合物中，加入油酸和十八烯，在氮气保护和磁力搅拌下，加热反应，反应完成后待反应液冷却到室温，将步骤(1)中制备得到的产物加入到该体系中，加热反应，反应完成后待反应液冷却后加入氟化铵和氢氧化钠溶于甲醇的甲醇溶液，在氮气保护下加热反应，待反应液冷却至室温后，加入过量的乙醇，离心分离，将沉淀物用乙醇洗涤几次后，分散在四氢呋喃中；
(3)UCNPs-ICGNPs的制备：
通过限域空间内的强对冲混合沉淀方法，利用四通道快速对冲涡流混合器，将步骤(2)得到的UCNPs、嵌段共聚物及有机染料溶于四氢呋喃中，作为1号液流；2号液流、3号液流和4号液流为超纯水；将所述1号、2号、3号和4号四股液流同时注入MIVM中进行快速混合，将得到的纳米颗粒悬浮液离心分离后得到纳米颗粒；
所述步骤(3)中嵌段共聚物是PEG-b-PLGA，所述有机染料是吲哚菁绿。
2.根据权利要求1所述的一种制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中ErCl3·6H2O添加的量是0.02mmol，YbCl3·H2O添加的量是0.20mmol，YCl3·H2O添加的量是0.78mmol。
3.根据权利要求1所述的一种制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中油酸添加的量是7.50mL，十八碳烯添加的量是15.00mL；甲醇添加的量是10.00ml，NH4F添加的量是4.00mmol，NaOH添加的量是2.50mmol。
4.根据权利要求1所述的一种制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒的方法，其特征在于，所述步骤(2)中NdCl3·6H2O添加的量是0.10mmol，YCl3·H2O添加的量是0.40mmol；油酸添加的量是7.50mL，十八碳烯添加的量是15.00mL；甲醇添加的量是10.00ml，NH4F添加的量是2.00mmol，NaOH添加的量是1.25mmol。
5.根据权利要求1所述的一种制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中UCNPs的浓度是1mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中嵌段共聚物是PEG-b-PLGA；浓度是1mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述有机染料是吲哚菁绿；浓度是4μM。
8.根据权利要求1所述的一种制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤(3)中有机染料液流之间的流速比是：所述1号液流的注射流速为12mL/min；所述2号液流的注射流速为20～36mL/min；所述3号液流的注射流速为20～36mL/min；所述4号液流的注射流速为20～36mL/min。
9.根据权利要求8所述的一种制备稳定ICG染料敏化上转换纳米颗粒的方法，其特征在于，四股流液间隔90度，同时注入涡流中心。
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