WO2020159161A1

WO2020159161A1 - 비동심 다중나노도메인 베시클 및 나노리포좀을 포함하는 비경구 약물전달용 가역적 겔, 및 이를 포함하는 약물전달용 조성물

Info

Publication number: WO2020159161A1
Application number: PCT/KR2020/001169
Authority: WO
Inventors: 임용택; 송찬영; 하타이차녹푸엥캄
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2020-01-23
Publication date: 2020-08-06

Abstract

본 발명은 서로 접촉하고 연결되어 있는 둘 이상의 리포좀, 및 상기 둘 이상의 리포좀을 둘러싸는 외벽을 포함하는 비동심 다중나노도메인 베시클; 및 나노리포좀을 포함하고, 상기 비동심 다중나노도메인 베시클은 소수성 약물을 포함하는 유기상과, 친수성 약물을 포함하는 수용액상으로 이루어지고 음전하를 가지며, 상기 나노리포좀은 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔을 제공한다. 본 발명에 따른 비경구 약물전달용 가역적 겔은, 다양한 소수성 및 친수성 약물의 봉입효율을 높힐 수 있으면서도, 단일 시린지를 이용하여 쉽게 주입이 가능하며 주입 후에 체내에서 겔을 형성하는 특성을 가지기 때문에 단독 사용시 주변 조직으로 이동되어 서방형 방출거동을 유도하기 어려웠던 베시클 또는 리포좀 기반 약물전달 시스템의 한계를 극복하고, 수술부위 등에 사용할 수 있으며, 암세포 및 다양한 면역세포의 기능을 조절하는 약물이 로딩된 본 발명에 따른 비경구 약물전달용 가역적 겔은 면역관문억제제와 병용하였을 경우, 항암면역치료 효율을 획기적으로 향상 시킬 수 있다.

Description

비동심 다중나노도메인 베시클 및 나노리포좀을 포함하는 비경구 약물전달용 가역적 겔, 및 이를 포함하는 약물전달용 조성물

본 발명은 비동심 다중나노도메인 베시클(non-concentric multi-nanodomain vesicles) 및 나노리포좀(nanoliposome)을 포함하는 비경구 약물전달용 가역적 겔 및 이를 포함하는 약물전달용 조성물 등에 관한 것이다.

과량의 약물주입으로 인한 독성 및 부작용 문제를 해결하기 위해서, 다양한 특성을 갖는 서방형 약물전달시스템들이 개발되어 활용되고 있다.

이러한 서방형 약물전달시스템으로 개발된 대부분의 하이드로겔은 생체 내의 온도 또는 pH에 의하여 졸-겔 전이가 일어나는 현상을 이용하기 때문에 특정 고분자 그룹에 한정되어 개발되어 왔다(미국공개특허 4,761,288).

이중에서 생체친화성 소재, 또는 천연고분자를 이용하여 제조된 하이드로겔들은 대부분 1, 2일 사이에 체내에서 쉽게 분해되어 버리는 단점이 있었다.

또한, 합성고분자로 이루어진 하이드로겔들은 약물을 서방형으로 방출하는 특성을 갖고 있지만, 체내에서 장기간 동안 잔류되어 체내에서 부작용 및 독성문제를 야기할 수 있다는 단점을 갖고 있었다.

또한, 하이드로겔들은 겔 형성 이후 점성이 증가한 후에는 다시 흐름성을 나타내지 않는 비가역적 겔(irreversible gel)이 대부분이었다. 이러한 비가역적 겔은, 서로 다른 물리화학적 특성 및 기능을 갖는 2가지 이상의 약물을 로딩해야 하는 시스템에서 그 이용에 제한이 있다는 단점이 있었다.

예를 들어, 서로 다른 2개의 물질이 혼합되어 비가역적 겔을 형성하는 시스템에서는 단일 시린지 사용이 불가능하였고, 이에 투-베럴 시린지(two-barrel syringe)를 이용하여 시린지 끝 부분에서 서로 혼합이 된 후에 겔이 형성되도록 하는 시스템이 개발되어 사용되고 있었다. 그러나, 시린지 끝부분이 막히는 현상이 일어나거나, 빠르게 겔화가 일어나는 문제가 있어 그 활용에 어려움이 있었다.

그리고, 일반적인 고분자 기반 하이드로겔 시스템은 로딩된 친수성 또는 친유성 약물이 Burst release를 통하여 초기에 과량으로 방출되는 문제점이 있었다.

한편, 암세포는 일반 정상세포와 달리 면역세포인 T 세포에 의해 인식되고 파괴된다. 그러나, 이러한 암세포는 면역공격을 회피하기 위해서 종양미세환경을 변화시켜 면역기능을 억제하는 면역관문억제 타겟 단백질을 통해 T 세포의 기능을 억제하며, 이러한 단백질에는 PD-1, PD-L1, CTLA-4 등이 있다.

최근 이러한 면역회피기능을 해결하기 위해서 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor)를 사용하고 있다. 면역관문억제제(anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4 등)는 암세포를 직접 공격하지는 않고, 면역관문억제 단백질에 결합하여 이들의 기능을 무력화시켜 암세포의 면역회피 기능을 저해하여 면역세포의 힘이 증가되어 T세포가 암세포를 파괴하는 것을 돕는 역할을 한다. 특정한 신호전달을 통해서 면역세포를 비활성화 시키는 스위치 역할을 하는 면역세포의 "면역관문(Immune checkpoint)"에 대한 억제제는 면역치료시대의 도래를 이끈 대표적인 면역치료제이다.

이러한 면역관문억제제는 기존 항암제 대비 생존율을 증가시킬 수 있지만, 단독요법에서는 제한적인 치료효과가 나타나고, 치료제에 내성이 생기면 더이상 효과가 없는 한계를 가지고 있다. 이는 면역관문억제제 이외에도 다양한 면역억제세포 및 면역억제인자들이 존재하기 때문이다.

따라서, 종양세포 주위의 다양한 면역억제세포 및 면역억제인자들을 제어하기 위한 약물전달 시스템과 면역관문억제제를 병용한다면, 기존의 면역관문억제제 기반 항암면역 치료 효율을 획기적으로 향상시킬 수 있을 것으로 기대되고 있으나, 면역관문억제제와의 병용치료 효율을 높이기 위하여 이러한 약물을 혈관주사로 투입하게 되면 치료용 T 세포의 기능을 오히려 저하시키는 등 많은 부작용이 보고되고 있는 실정이다.

따라서, 로딩된 약물이 주입된 부위에서 일정기간 동안 서서히 서방형으로 방출될 수 있도록 하는 약물전달시스템 개발이 매우 중요하다.

이에 본 발명자들은 생체 내의 온도 및 pH와 같은 생리적 인자와 관계없이 겔을 형성할 수 있는 약물전달 시스템을 개발하기 위하여, 현재 인체 내 사용이 허가되어 사용되고 있는 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀을 이용하여 가역적인 특성을 갖는 신규 겔을 개발하였다.

본 발명은 비동심 다중나노도메인 베시클 및 나노리포좀을 포함하는 비경구 약물전달용 가역적 겔 및 이를 포함하는 약물전달용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서로 접촉하고 연결되어 있는 둘 이상의 리포좀, 및 상기 둘 이상의 리포좀을 둘러싸는 외벽을 포함하는 비동심(non-concentric) 다중나노도메인 베시클; 및 나노리포좀을 포함하고, 상기 비동심 다중나노도메인 베시클은 음전하를 가지며 유기상과 수용액상으로 이루어지고, 상기 나노리포좀은 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 음전하를 가지는 비동심 다중나노도메인 베시클과 양전하를 가지는 나노리포좀은 서로 정전기적 인력에 의하여 구조가 형성되고, 전단응력에 따라 구조가 일시적으로 붕괴되고, 이러한 현상이 반복될 수 있기 때문에 가역적 겔(reversible gel) 형태를 안정적으로 유지할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀의 비율은 정상적인 겔 형성을 위하여 바람직하게는 10:1 (w/w) 내지 10:9 (w/w) 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 10:3 (w/w) 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 비동심 다중나노도메인 베시클의 직경은 바람직하게는 1 내지 100 μm 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 10 내지 50 μm일 수 있으며, 나노리포좀의 직경은 바람직하게는 20 nm 내지 900 nm 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50 내지 500 nm일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 비동심 다중나노도메인 베시클의 유기상, 리포좀 멤브레인, 및/또는 외벽에는 일반적으로 당업계에서 사용되고 있는 소수성 약물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 친유성(lipophilic) 면역활성화 물질, 면역억제인자 제어물질, 면역항암제 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 이미퀴모드, MPLA(Monophosphoryl lipid A), 레시퀴모드, 플라겔렌(flagellin), 시피지(CpG), 폴리아이시(poly(I:C)) 등이나, 친유성 성질을 가지고 있는 약물이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 비동심 다중나노도메인 베시클의 수용액상, 즉, 리포좀의 내부에는 일반적으로 당업계에서 사용되고 있는 친수성 약물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 친수성(hydrophilic) 면역활성화 물질, 면역억제인자 제어물질, 면역항암제 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 젬시타빈, 클로드로네이트, 마이토마이신, 시스플라틴, 아드리아마이신 등이나, 친수성 성질을 가지고 있는 약물이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 나노리포좀의 내부에는 일반적으로 당업계에서 사용되고 있는 친수성 약물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 친수성(hydrophilic) 면역활성화 물질, 면역억제인자 제어물질, 면역항암제 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 젬시타빈, 클로드로네이트, 마이토마이신, 시스플라틴, 아드리아마이신 등이나, 친수성 성질을 가지고 있는 약물이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 나노리포좀의 멤브레인에는 일반적으로 당업계에서 사용되고 있는 소수성 약물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 친유성(lipophilic) 면역활성화 물질, 면역억제인자 제어물질, 면역항암제 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 이미퀴모드, MPLA(Monophosphoryl lipid A), 레시퀴모드, 플라겔렌(flagellin), 시피지(CpG), 폴리아이시(poly(I:C)) 등이나, 친유성 성질을 가지고 있는 약물이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 비동심 다중나노도메인 베시클은, 리포좀의 내부에 친수성 성질을 갖는 다양한 면역활성화 물질, 리포좀의 멤브레인 및/또는 상기 캡슐의 외벽에 친유성 면역활성화 물질을 동시에 로딩함으로써, 면역세포 활성화 기능의 유효 지속시간을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 비동심 다중나노도메인 베시클은, 리포좀의 내부에 친수성 성질을 갖는 다양한 면역억제인자 제어물질, 리포좀의 멤브레인 및/또는 상기 캡슐의 외벽에 친유성 면역억제인자 제어물질을 동시에 로딩함으로써, 면역억제세포 및 면역억제물질의 기능을 제어할 수 있는 면역억제인자 제어물질의 유효 지속시간을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 비경구 약물전달용 가역적 겔은 주입된 부위에서 주위로 퍼지거나 구조가 붕괴되지 않아 안정적으로 유지됨으로써 약물을 서방형으로 방출하게 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 비경구 약물전달용 가역적 겔; 및 소수성 약물 및 친수성 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 소수성 약물은 약물전달용 가역적 겔에 포함되어 있는 비동심 다중나노도메인 베시클의 유기상, 리포좀 멤브레인, 및/또는 외벽; 및/또는 나노리포좀의 멤브레인에 포함될 수 있으며, 상기 친수성 약물은 약물전달용 가역적 겔에 포함되어 있는 비동심 다중나노도메인 베시클의 리포좀 내부 및/또는 나노리포좀의 내부에 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 약물전달용 조성물은 주사제형으로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약물전달용 조성물은 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitors)를 더 포함할 수 있으며, 상기 면역관문억제제는 바람직하게는 anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4, anti-KIR, anti-LAG3, anti-CD137, anti-OX40, anti-CD276, anti-CD27, anti-GITR, anti-TIM3, anti-41BB, anti-CD226, anti-CD40, anti-CD70, anti-ICOS, anti-CD40L, anti-BTLA, anti-TCR, anti TIGIT 등이나, 당업계에서 사용되고 있는 면역관문억제제라면 제한이 없다.

또한, 본 발명은 제1항의 비경구 약물전달용 가역적 겔; 및 소수성 약물 및 친수성 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 면역원성 세포사멸(immunogenic cell death)을 유도하거나, 수지상세포, 자연살해세포, 및/또는 T 세포의 활성화를 유도할 수도 있으며, 또는 regulatory T cell, myeloid derived suppressor cells, M2 macrophage의 기능을 저해함으로써 항암 효과를 나타낼 수도 있다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 바람직하게는 전신 항암면역(systemic antitumor immune response)를 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 암의 증식, 전이, 재발 등을 억제하거나, 항암 치료 요법에 대한 내성을 억제하는 것을 특징으로 하나, 일반적으로 사용되는 암 치료 방법의 일환이라면, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 종양과 같은 국소부위(local injection)에 주입할 수도 있으나, 일반적으로 암의 치료 방법으로 사용되는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 약물전달용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약물전달용 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약물전달용 조성물의 암 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 비경구 약물전달용 가역적 겔은, 다양한 물리화학적 특성 및 기능을 갖는 2가지 이상의 약물을 독립적으로 로딩이 가능하고, 단일 시린지를 이용하여 주입이 가능한 가역적인 특성을 가지며, 비동심 다중나노도메인 베시클에 로딩된 약물은 기존 리포좀에 로딩된 약물에 비하여 봉입효율이 15배 이상 증가하였으며, 로딩된 약물도 7 내지 30일 이상의 기간 동안 서방형으로 방출된다는 효과를 가진다.

그리고 본 발명에 따른 비경구 약물전달용 가역적 겔은, 다양한 소수성 및 친수성 약물의 봉입효율을 높일 수 있으면서도, 단일 시린지를 이용하여 쉽게 주입이 가능하며 주입 후에 체내에서 겔을 형성하는 특성을 가지기 때문에 단독 사용시 주변 조직으로 이동되어 서방형 방출거동을 유도하기 어려웠던 베시클 또는 리포좀 기반 약물전달 시스템의 한계를 극복하고, 수술부위 등에 사용할 수 있다.

또한, 암세포 및 다양한 면역세포의 기능을 조절하는 약물이 로딩된 본 발명에 따른 비경구 약물전달용 가역적 겔은 면역관문억제제와 병용하였을 경우, 항암면역치료 효율을 획기적으로 향상시킬 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따른 비경구 약물전달용 가역적 겔은 소수성 및/또는 친수성 약물을 모두 포함할 수 있으므로, 암 치료 외에도 다양한 질환의 치료에 폭넓게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 음전하를 갖는 비동심 다중나노도메인 베시클과 양전하를 갖는 나노크기의 리포좀이 정전기적 인력에 의해 구조가 형성되고, 전단응력에 따라 구조가 일시적으로 붕괴되고, 이러한 현상이 반복될 수 있는 가역적 겔(reversible gel)에 관한 모식도를 나타낸 것이다.

도 2는 이미퀴모드(Imiquimod)와 젬시타빈(Gemcitabine)을 포함하는 비동심 다중나노도메인 베시클의 구조를 나타낸 것이다.

도 3은 비동심 다중나노도메인 베시클과 일반 리포좀의 약물 봉입효율 및 지속성을 비교한 그래프이다.

도 4는 주입형 겔을 구성하는 비동심 다중나노도메인 베시클의 안정성 확인 결과이다.

도 5는 주입형 겔을 구성하는 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀의 비율 차이에 따른 구조를 관찰한 결과이다.

도 6은 비동심 다중나노도메인 베시클 사이에서 가교역할을 하는 나노리포좀을 관찰한 결과이다.

도 7은 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔의 점성과 전단응력을 비교한 그래프이다.

도 8은 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔의 안정성 확인 결과이다.

도 9는 비동심 다중나노도메인 베시클과 주입형 겔의 약물 지효성을 비교한 그래프이다.

도 10a는 주입형 겔의 지속성을 실제 마우스 체내에서 확인한 결과이다.

도 10b는 형광물질만 주입한 대조군(G1), 비동심 다중나노도메인 베시클만 주입한 그룹(G2), 비동심 다중나노도메인 베시클과 양전하를 띠는 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔(G3), 및 비동심 다중나노도메인 베시클과 음전하를 띠는 나노리포좀을 같이 주입한 그룹(G4)의 형광신호 측정 결과이다.

도 10c는 2주 이후 실제 마우스에서 주입 부위를 확인한 결과이다.

도 11a는 주입형 겔의 생체 안정성 확인을 위한 마우스 혈청 내 사이토카인(IL-6) 농도와 마우스 몸무게를 비교한 결과이다.

도 11b는 주입형 겔의 생체 안정성 확인을 위한 ALT(alanine aminotransferase), AST(aspartate transaminase), 및 BUN(blood urea nitrogen) 비교 데이터를 그래프로 나타낸 것이다.

도 12는 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔 항암면역치료 관련 모식도이다.

도 13은 젬시타빈에 의해 유도되는 면역원성 세포사멸(immunogenic cell death)을 측정한 것이다.

도 14는 젬시타빈과 이미퀴모드에 의해 증가하는 면역 반응을 확인한 그래프이다.

도 15는 젬시타빈에 의해 유도되는 4T1 세포주와 골수유래면역억제세포의 세포자멸사(apoptosis)를 보여주는 그래프이다.

도 16은 대식세포를 이용한 양전하성 클로드로네이트-나노리포좀의 효능을 확인한 그래프이다.

도 17은 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔을 이용한 수술 방법을 나타낸 것이다.

도 18은 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔의 종양 성장 억제와 생존율 증가를 확인한 그래프이다.

도 19는 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔의 종양 전이 억제 효능을 확인한 것이다.

도 20은 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔에 의한 종양 내 면역 세포 비율 변화를 나타낸 그래프이다.

도 21은 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔에 의한 종양 내 사이토카인 변화를 확인한 그래프이다.

도 22는 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔에 의한 림프기관 내 면역세포 비율 변화를 확인한 그래프이다.

도 23은 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔에 의한 항원 특이적 면역 반응을 측정한 결과이다.

도 24는 주입형 겔에 의해 억제되는 종양 전이 자기공명영상 이미지이다.

도 25는 항암면역치료에 있어 면역 세포 종류에 따른 영향을 확인한 결과이다.

도 26은 이차종양을 이용한 주입형 겔의 항암면역치료 효능을 확인한 결과이다.

도 27은 주입형 겔에 의해 유도되는 기억 T 세포(memory T cell)에 의한 면역 반응을 확인한 것이다.

도 28은 비동심 다중나노도메인 베시클 및 나노리포좀으로 구성된 가역적 주입형 겔을 이용한 면역관문억제제와의 병용요법에 관한 모식도이다.

도 29는 4T1 종양 세포주를 사용한 동물실험에서 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔의 면역관문 (immune checkpoint) 시스템 활성화를 비교한 그래프이다.

도 30은 4T1 종양 세포주를 사용한 동물실험에서 비동심 다중나노도메인 베시클과 클로드로네이트(Chlodronate)를 포함한 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔 및 면역관문억제제 병용요법 효능 평가 결과이다.

도 31은 4T1 종양 세포주를 사용한 동물실험에서 비동심 다중나노도메인 베시클과 클로드로네이트(Chlodronate)를 포함한 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔 및 면역관문억제제 병용요법의 면역세포 비율을 비교한 그래프이다.

도 32는 4T1 종양 세포주를 사용한 동물실험에서 비동심 다중나노도메인 베시클과 클로드로네이트(Chlodronate)를 포함한 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔 및 면역관문억제제 병용요법의 항원 특이적 면역반응을 비교한 그래프이다.

도 33은 TC1 종양 세포주를 사용한 동물실험모델에서 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔의 면역관문(immune checkpoint) 시스템 활성화를 비교한 그래프이다.

도 34는 TC1 종양 세포주를 사용한 동물실험모델에서 비동심 다중나노도메인 베시클과 클로드로네이트(Chlodronate)를 포함한 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔 및 면역관문억제제 병용요법 효능을 평가한 그래프이다.

도 35는 TC1 종양 세포주를 사용한 동물실험에서 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔 및 면역관문억제제 병용요법의 면역세포 비율을 비교한 그래프이다.

도 36은 TC1 종양 세포주를 사용한 동물실험에서 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔 및 면역관문억제제 병용요법의 항원 특이적 면역 반응을 비교한 그래프이다.

이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 비경구 약물전달용 가역적 겔과 이를 포함하는 약물전달용 조성물 등에 관하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.

종래 하이드로겔들은 겔 형성 이후 점성이 증가한 후에는 다시 흐름성을 나타내지 않는 비가역적 겔이 대부분이었다. 이러한 비가역적 겔은, 서로 다른 물리화학적 특성 및 기능을 갖는 2가지 이상의 약물을 로딩해야 하는 시스템에서 그 이용에 제한이 있다는 단점이 있었다. 또한, 종양세포 주위의 다양한 면역억제세포 및 면역억제인자들을 제어하기 위한 약물전달 시스템과 면역관문억제제를 병용한다면, 기존의 면역관문억제제 기반 항암면역치료효율을 획기적으로 향상시킬 수 있을 것으로 기대되고 있으나, 면역관문억제제와의 병용치료 효율을 높이기 위하여 이러한 약물을 혈관주사로 투입하게 되면 치료용 T 세포의 기능을 오히려 저하시키는 등 많은 부작용이 보고되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 생체 내의 온도 및 pH와 같은 생리적 인자와 관계없이 겔을 형성할 수 있는 약물전달 시스템을 개발하기 위하여, 현재 인체 내 사용이 허가되어 사용되고 있는 비동심 다중나노도메인 베시클과 리포좀을 이용하여 가역적인 특성을 갖는 신규 겔을 개발하였다.

본 발명은, 음전하를 가지는 마이크로미터 크기의 비동심 다중나노도메인 베시클과 양전하를 가지는 나노크기의 나노리포좀이 정전기적 인력에 의해 구조가 형성되고, 전단응력에 따라 구조가 일시적으로 붕괴되고, 이러한 현상이 반복될 수 있는 가역적 겔(reversible gel) 및 여기에 약물이 로딩된 약물전달 시스템을 제공할 수 있다.

본 발명에서는, 다양한 수용성 및 난용성 약물의 봉입효율을 높일 수 있는 수십 마이크로미터 크기의 비동심 다중나노도메인 베시클을 이용하였으며, 이러한 음전하를 띠는 비동심 다중나노도메인 베시클과의 정전기적 인력에 의해서 겔을 형성할 수 있도록 도와주는 가교제로서 양전하를 띠는 나노리포좀을 조합하여 새로운 형태의 겔을 제조하였다.

또한, 단일 시린지를 이용한 주입과정 중에 작용하는 전단응력(shear force)에 의해 쉽게 그 구조가 일시적으로 붕괴되고, 주입된 부위에서는 전단응력이 제거됨에 따라 다시 정전기적 인력에 의해 겔이 형성되게 하기 위하여, 비동심 다중나노도메인 베시클과 양이온성 나노리포좀의 구성비율을 조절함으로써, 가역적 겔 형성을 유도하였다.

상기 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀의 비율은 10:1(w/w) 내지 10:9(w/w) 일 수 있고, 바람직하게는 10:3(w/w) 일 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀을 포함하는 겔은 주입된 부위에서 정전기적 인력에 의해서 다시 겔이 형성되어, 저장모듈러스(G')과 손실모듈러스(G") 값이 겔의 특성을 회복하는 가역적 겔의 특성을 보일 수 있다.

그리고 로딩된 약물이 혈관으로 급격하게 유입되어 사이토카인 스톰(cytokine storm)이나 약물에 의한 부작용이 생기는 것을 방지할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 다양한 약물이 로딩된 비경구 약물전달용 가역적 겔은, 암 조직에서 암세포의 사멸유도, 치료용 면역세포 활성화 및 면역억제 세포의 기능을 저해함으로써 항암치료 효과를 향상시키는 기능을 가지고, 암세포를 사멸하고 사멸된 암세포에 의해 형성된 암 항원을 수지상세포 및 마크로파지와 같은 항원제시세포에 의해 효과적으로 인지되는 것을 도울 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 약물전달용 가역적 겔; 및 소수성 약물 및 친수성 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 암세포를 Immunogenic cell death를 유도함으로써, carleticulin이나 HMGB1의 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 면역억제세포인 MDSC의 사멸을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 면역억제세포인 대식세포의 M2-->M1 polarization을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 주입형 겔은 면역억제세포인 regulatory T 세포의 사멸을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 주입형 겔은 항원제시세포인 수지상세포와 메크로파지의 활성화를 유도함으로써, proinflammatory cytokine의 발현을 촉진할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 수지상세포의 활성화를 통해 Type I interferon(IFN-alpha, IFN-beta)를 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 CD4+ T 세포의 활성을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 CD8+ T 세포의 활성을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 자연살해세포(NK)의 활성을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 치료 부위에서 암세포의 성장이나 재발(recurrence)을 방지하는 기능을 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 순환계 면역 반응(systemic immune response)을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 국소부위에서 약물을 방출함으로써, 림프노드(lymph node)에서 면역활성화를 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 국소부위에서 약물을 방출함으로써, 스플린(spleen)에서 면역활성화를 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 원발암이 폐나 간 등으로 전이되는 것을 방지하는 기능을 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔은 원발암의 재발 방지뿐만 아니라, 다른 조직이나 부위에서 2차 암이 생성되는 것을 방지하는 기능을 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 약물이 로딩된 비동심 다중나노도메인 베시클-나노리포좀으로 구성된 겔에 의해 암세포가 complete regression된 그룹에서, 메모리 T 세포(memory T cells)가 생성되어, 암의 재발을 방지하는 기능을 가질 수 있다.

기존 면역관문억제제에 대한 비-반응 그룹(non-responding group)과 내성 그룹(resistance group)에서 면역관문억제제의 효과를 극대화하기 위해서는 면역관문 이외의 다양한 면역억제 세포 및 면역억제 인자를 추가적으로 제어하는 기술이 매우 중요하다.

이러한 면역억제 세포 및 면역억제 인자를 제어하는 약물은 기존 면역관문억제제에 의해 활성화된 치료용 T 세포의 기능을 저해하지 않아야 하며, 독성 및 부작용을 초래하지 않아야 하기 때문에, 혈관 약물전달시스템(systemic drug delivery)보다는, 국소부위 주입형(local treatment) 약물전달 시스템이 유리하다.

다양한 특성을 갖는 서방형 약물전달시스템들이 개발되어 활용되고 있지만, 생체친화성 소재를 이용하여 제조된 하이드로겔들은 대부분 1, 2일 사이에 체내에서 쉽게 분해되어 버리는 단점이 있고, 합성고분자로 이루어진 하이드로겔들은 체내에서 오랜 기간 동안 남아 있어 약물을 서방형으로 방출하는 특성을 갖고 있지만, 체내에서 부작용 및 독성문제를 야기할 수 있다는 단점을 갖고 있다.

그러나 본 발명에 따른 약물전달용 가역적 겔, 및 약물을 포함하는 약물전달용 조성물은 상기와 같은 문제점을 일으키지 않을 뿐만 아니라, 면역관문억제제를 병용할 경우, 항암면역치료 효과가 증가하고, 항원 특이적 면역 반응이 증가하는 등의 효과를 가질 수 있다.

본 발명에서 상기 약물전달용 조성물은 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitors)를 더 포함할 수 있고, 상기 면역관문억제제는 anti-PD-1, anti-PD-L1, 및 anti-CTLA-4, anti-KIR, anti-LAG3, anti-CD137, anti-OX40, anti-CD276, anti-CD27, anti-GITR, anti-TIM3, anti-41BB, anti-CD226, anti-CD40, anti-CD70, anti-ICOS, anti-CD40L, anti-BTLA, anti-TCR, anti TIGIT 등으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에서, 상기 다중나노도메인 베시클은 유기상과 수용액상으로 이루어지고, 상기 유기상은 제1면역조절물질 및 유동성 오일을 포함하며, 상기 유기상은 상기 리포좀의 멤브레인, 및 상기 다중나노도메인 베시클 외벽을 형성하고, 상기 수용액상은 제2면역조절물질을 포함하며, 상기 수용액상은 상기 리포좀 멤브레인의 내부 수용액상 및 리포좀 멤브레인의 외부 수용액상이며, 상기 제1면역조절물질은 지용성 면역활성물질이고, 상기 제2면역조절물질은 수용성 면역활성물질이며, 상기 유동성 오일은 서로 접촉하고 연결되어 있는 둘 이상의 리포좀의 구조 안정성을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 다중나노도메인 베시클이 제공될 수 있다.

본 발명에서, 상기 둘 이상의 리포좀을 포함하고 있는 다중나노도메인 베시클은, 종래의 단일 리포좀 및 단독 에멀젼에 비하여, 면역세포 활성화 물질의 지속 시간, 면역세포 활성화 효능, 봉입 효율, 또는 생리학적 안정성이 향상된 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 면역활성화 물질은 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서로 접촉하고 연결되어 있는 둘 이상의 리포좀, 및 상기 둘 이상의 리포좀을 둘러싸는 다중나노도메인 베시클 외벽을 포함하는 다중나노도메인 베시클로서, 상기 다중나노도메인 베시클은 유기상과 수용액상으로 이루어지고, 상기 유기상은 제1면역조절물질 및 유동성 오일을 포함하며, 상기 유기상은 상기 리포좀의 멤브레인, 및 상기 다중나노도메인 베시클 외벽을 형성하고, 상기 수용액상은 제2면역조절물질을 포함하며, 상기 수용액상은 상기 리포좀 멤브레인의 내부 수용액상 및 리포좀 멤브레인의 외부 수용액상이며, 상기 제1면역조절물질, 및 제2면역조절물질은 면역억제인자 제어물질이고, 상기 유동성 오일은 서로 접촉하고 연결되어 있는 둘 이상의 리포좀의 구조 안정성을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 다중나노도메인 베시클이 제공될 수 있다.

본 발명에서 다중나노도메인 베시클 기반 고형암 미세환경 제어 조성물은 암의 미세환경을 조절하기 위한 새로운 형태의 면역조절 조성물로서, 앞서서 언급했던 생체 내 면역세포를 활성화 하는 물질 이외에, 고형암 미세환경에서 나타나는 면역억제세포 및 면역억제물질의 기능을 제어할 수 있는 약물(면역억제인자 제어물질)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 면역억제인자 즉, 면역억제세포 및 면역억제물질의 기능을 제어할 수 있는 면역억제인자 제어물질을 기본성분으로 복수의 리포좀이 각각의 도메인을 형성하면서 서로 연결되고, 도입된 유동성 오일 성분에 의해 연결된 복수 리포좀의 구조적 안정성이 향상된 마이크로 크기의 캡슐 형태를 가지는 면역조절용 다중나노도메인 베시클을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 다양한 약학적 조성물로서 사용되고 있는 단일 리포좀 소재의 낮은 봉입 효율 및 짧은 유효 지속 시간의 단점을 극복하고, 면역기능 조절효과의 유효 지속 시간을 늘릴 수 있는 새로운 다중나노도메인 베시클 기반의 항암면역치료제 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 다중나노도메인 베시클은, 상기 캡슐의 외벽부터 안쪽 멤브레인으로 서서히 붕괴가 일어나면서 상기 캡슐의 외벽 및 내부에 로딩된 면역억제세포 및 면역억제물질의 기능을 제어할 수 있는 면역억제인자 제어물질이 방출되므로, 면역기전 조절 물질의 유효 지속시간이 증가될 수 있다는 장점을 갖는다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 다중나노도메인 베시클은, 리포좀의 멤브레인 및/또는 상기 다중나노도메인 베시클의 외벽에 친유성 성질을 갖는 다양한 면역억제세포 및 면역억제물질의 기능을 제어할 수 있는 면역억제인자 제어물질을 로딩함으로써, 면역활성물질의 유효 지속시간을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 다중나노도메인 베시클은, 리포좀의 내부에 친수성 성질을 갖는 다양한 면역억제세포 및 면역억제물질의 기능을 제어할 수 있는 면역억제인자 제어물질을 로딩함으로써, 면역억제인자 제어물질의 유효 지속시간을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 다중나노도메인 베시클은, 리포좀의 내부에 친수성 성질을 갖는 다양한 면역억제인자 제어물질, 리포좀의 멤브레인 및/또는 상기 캡슐의 외벽에 친유성 면역억제인자 제어물질을 동시에 로딩함으로써, 면역억제세포 및 면역억제물질의 기능을 제어할 수 있는 면역억제인자 제어물질의 유효 지속시간을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 나노리포좀은, 리포좀의 내부에 친수성 성질을 갖는 다양한 면역억제인자 제어물질, 리포좀의 멤브레인에 친유성 면역억제인자 제어물질을 포함할 수 있다.

본 발명에서 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀에 로딩될 수 있는 약물은, 본 발명의 구체적인 실시 예에 한정되지 않고, 업계에서 통상적으로 유추하여 로딩될 수 있는 다른 약물을 포함할 수 있다.

본 발명의 한 예에서 MDSC(Myeoloid-Derived Suppressor Cell)의 기능을 제어할 수 있는 약물, 즉 면역억제인자 제어물질로는, Tadalafil, Sildenafil, L-AME, Nitroaspirin, Celecoxib, NOHA, Bardoxolone methyl, D,L-1-methyl-tryptophan, 5-Fluorouracil, Gemcitabine, 17-DMAG, Peptide-Fc fusion proteins, ATRA, Vitamin A, Vitamin D3, Vitamin E, GR1 antibodies, Zoledronic acid, Sunitinib, Axitinib, Decetaxel, Sorafenib, Cucurbitacin B, JSI-124, Anti IL-17 antibodies, Anti-glycan antibodies, Anti-VEGF antibodies, Bevacizumab, Antracycline, Tasquinimod, Imatinib, cyclophosphamide 이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 예에서, PI3K inhibitors는 PX-866, Wortmannin, PI-103, Pictilisib, GDC-0980, PF-04691502, BEZ235, XL765, XL147, BAY80-6946, GSK-2126458, Buparlisib, BYL719, AZD8186, GSK-2636771, CH5132799, INK-1117 등 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 한 예에서 PI3Kdelta inhibitors 물질로는 AMG-319, Idelalisib, TRG-1202, INCB050465, IPI-145, Duvelisib, Acalisib, TG-1202, RV1729, RP-6530, GDC-0032 등 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 한 예에서 PI3Kgamma inhibitors 물질로는 IPI-549, IPI-145 등 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 한 예에서 Treg(Regulatory T cell)의 기능을 제어할 수 있는 약물, 즉 면역억제인자 제어물질로는 Anti-CD25 antibodies(daclizumab), Basiliximab, LMB-2, Denileukin diftitox(Ontak), Bivalent IL-2 fusion toxin, Anti-TGF-beta antibodies, fresolimumab, TGF-betaR kinase inhibitors, LY2157299, Soluble TGF-betaR I/II, Ipilimumab, Tremelimumab, Pembrolizumab, Nivolumab, TIM-3 antibodies, LAG-3 antibodies, Anti-CD39 antibodies, Anti-73 antibodies, A(2A)R inhibitors, Celecoxib, Indomethacin, Diclofenac, Ibuprofen, TNFR2 antibodies, Anti-GITR antibodies, Bevacizumab, Anti-OX40(CD134) antibodies, soluble GITR ligand, Blockades for chemokine receptors(CCR4, 5, 6,10), cyclophosphamide, Sunitinib, Fludarabine, PI3K p110(delta) inhibitors, CliniMACs, Mogamulizumab, Fingolimod, Regulators for miRNA(miR-155, miR-146a, miR-181a), 5-aza-2-deoxycytidine, paclitaxel, Imatinib, Sorafenib, Cyclosporin A, Tacrolimus, Dasatinib, Poly-G-oligonucleotide, TLR8 ligands, gemcitabine 및 5-fluorouracil 이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 예는 TAM(tumor associated macrophage)의 기능을 조율할 수 있는 약물, 즉 면역억제인자 제어물질로는 Macrophage의 recruitment를 저해할 수 있는 약물로서, CCL2/CCR2 inhibitors(Yondeli, RS102895), M-CSF나 M-CSFR inhibitors(anti-M-CSF antibodies, JNJ-28312141, GW2580), chemoattractants(CCL5, CXCL-12, VEGF)와 그 수용체들에 대한 inhibitors, HIFs inhibitors 등 인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지는 않는다.

또한, TAM의 생존을 억제할 수 있는 약물, 즉 면역억제인자 제어물질로서, Bisphosphonates, Clodronate, Dasatinib, anti-FRbeta antibodies, Shigella flexneri, Legumain과 CD1d의 발현을 유도할 수 있는 약물 인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지는 않는다.

그리고, M1 macrophage의 특성을 향상시킬 수 있는 약물, 즉 면역억제인자 제어물질로서, NF-kB 아고니스트인 TLR 아고니스트, Anti-CD40 antibodies, Thiazolidinediones, Tasquinimod, Anti-IL-10R antibodies, Anti-IL-10 antibodies, 올리고뉴클레오타이드(Anti-IL-10R Anti-IL-10), STAT1 아고니스트인 인터페론(interferon), M1 pathway를 유도할 수 있는 SHIP과 GM-CSF, IL-12, Thymosin alpha1 등 인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지는 않는다.

또한, M2 macrophage 기반의 암세포 성장을 돕는 메커니즘을 저해할 수 있는 약물, 즉 면역억제인자 제어물질로는 STAT3 inhibitor인 sunitinib, sorafenib, WP1066, corosolic acid, oleanolic acid, STAT6 inhibitors들과 M2 pathway(c-Myc, PPAR-alpha/gamma, PI3K, KLF4, HIFs, Ets2, DcR3, mTOR) inhibitors와 HRG, CuNG, MDXAA, Silibinin, PPZ 등 인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지는 않는다.

그리고, 종양미세환경 하에서 Macrophage의 기능을 제어할 수 있는 타겟 miRNA는 miR-155, miR-511-3p, miR-26a 등 인 것을 특징으로 한다.

그리고, 종양미세환경 하에서 Macrophage를 타겟팅함으로서, 항암효능을 높힐 수 있는 타겟 약물로는 Paclitaxel, Docetaxel, 5-Flurouracil, Alendronate, Doxorubicin, Simvastatin, Hydrazinocurcumin, Amphotericin B, Ciprofloxacin, Rifabutin, Rifampicin, Efavirenz, Cisplatin, Theophyline, Pseudomonas exotoxin A, Zoledronic acid, Trabectedin, Siltuximab(Anti-IL-6 antibodies), Dasatinib, CpG-ODN, Interferon-alpha, -beta, -gamma, GM-CSF, IL-12, Thymosin alpha-1, Sunitinib, 5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acid, Silibinin, CCL2-CCR2 inhibitors(PF-04136309, Trabectedin, Carlumab), CSF1-CSF1R 신호전달 blocker(BLZ945, PLX3397, Emactuzumab(RG7155), AMG-820, IMC-CS4, GW3580, PLX6134)와 톨유사수용체7 의 리간드(imiquimod, 852A), NF-kB inhibitors(N-acetyl-l-cystein, Vitamin C, bortezomib, aspirin, salicylates, Indolecarboxamide derivatives, quinazoline analogues, Thalidomide, prostaglandin metabolites), HIF-1 inhibitors(2ME2, 17-AAG, Camptothecin, Topotecan, Pleurotin, 1-methylpropyl, 2-imidazolyl dissulphide, YC-1), CXCR4 아고니스트(AMD3100, AMD1498, ALX40-4C, T22, T140, CGP64222, KRH-1636) 등 인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 예는 면역억제환경인자 억제인자(Transforming growth factor beta(TGF-beta) inhibitors, Nitro aspirin, Cycloxygenase-2(COX2) inhibitors, Indoleamine 2,3-dioxygenase(IDO) inhibitors, Phosphodiesterase-5(PDE-5) inhibitors, Anti-Interleukin 10(IL-10)) 약물을 함유하는 다중나노도메인 베시클기반 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 한 예에서 TGF-beta inhibitor 는 SB-505124, LY-364974 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 예에서 Nitro aspirin은 NCX 4040 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 예에서 COX-2 inhibitor 는 Celecoxib 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 예에서 IDO inhibitor 는 Indoximod, NLG919 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 예에서 PDE-5 inhibitor 는 Tadalafil(Cialis) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 다중나노도메인 베시클이 함유하는 고형암 미세환경 면역억제인자 제어물질은 위의 약물이 2개 이상의 조합들로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 체내에 존재하는 암세포를 찾아 직접 사멸시키는 치료능을 갖고 있는 자연살해세포 및 T 세포가 체내에서 효과적으로 생존하며, 치료효능을 향상시킬 수 있는 다중나노도메인 베시클을 포함하는 면역조절 물질일 수 있다.

본 발명의 한 예는 고형암 미세환경에서 직접 결합을 통한 T 세포 활성화 방법으로 보조활성인자(OX40, CD137, CD27, CD40) 등을 포함하는 다중나노도메인 베시클 기반 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 예에서 Anti-OX40는 RG7888 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 예에서 Anti-CD137은 Urelumab 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 예에서 Anti-CD27은 Varlilumab 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 예에서 Anti-CD40은 BMS-986090 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 예는 고형암 미세환경에서 간접 결합을 통한 T 세포 활성화 방법으로 면역억제 유발인자(Treg, MDSC, TAM, IDO, PD-L1) 들을 억제할 수 있는 약물을 함유하는 다중나노도메인 베시클기반 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 예는 화학요법을 통한 면역학적 세포 사멸(immunogenic cell death) 유도를 통해 면역세포의 효능을 증가시키는 항암제를 포함하는 다중나노도메인 베시클기반 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 한 예는 에피제네틱 기전(epigenetic machinery)을 통하여 암 세포를 사멸하거나, 종양미세환경을 제어할 수 있는 약물을 포함하는 다중나노도메인 베시클기반 조성물을 제공한다.

본 발명에서 에피제네틱 기전의 한 예로 디엔에이 메틸트렌스페라아제 인히비터(DNMTi) 물질로는 5-Azacytidine, 5-Aza-2-deoxycytidine, Decitabine, SGI-110, Zebularine, CP-4200, Cladribine, Fludarabine, Clofarabine, Procainamide, Procaine, Hydralazine, Disulfiram, RG108, Nanaomycin A, Genistein, Equol, Curcumin, EGCG, Resveratrol, Parthenolide 등에서 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 에피제네틱 기전의 한 예로, 히스톤 디아세틸레이즈 인히비터(HDACi) 물질로는 Vorinostat, Abexinostat, Suberoylanilide, Hydroxamic acid, Belinostat, Panobinostat, Romidepsin, Valproic acid, Entinostat, Givinostat, Resminostat, Quisinostat, Pracinostat, Dacinostat, Pyroxamide, CHR-3996, CBHA, Trichostatin A, Oxamflatin, MC1568, Tubacin, PCI-30451, Tacedinaline, Mocetinostat, Chidamide, BML-210, M344, Butyrate, Sodium butyrate, Trapoxin A, Apicidin, Nicotinamide, Splitomicin, EX-527, Dihydrocoumarin, Tenovin-D3, AGK2, AEM1, AEM2, Cambinol, Sirtinol, Salermide, Tenovin-6, TMP-269, Psammaplin A, Nexturastat A, RGFP966 등에서 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한 예로, 면역항암제는 암세포가 인체의 면역체계를 회피하지 못하도록 하거나 면역세포가 암 세포를 더 잘 인식하여 공격하도록 하는 약물을 총칭하며, 일례로 면역체크포인트 억제제인 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙 등이 있으며, 인체 면역세포 작용강화제로서 블리나투모맙 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 이미퀴모드(Imiquimod)(R837)와 젬시타빈(Gemcitabine)을 포함하는 비동심 다중나노도메인 베시클과 클로드로네이트(Clodronate)를 포함한 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔 합성

이미퀴모드와 젬시타빈을 포함하는 다중도메인베시클은 w-o-w 에멀젼화 과정을 거쳐 제작하였다. DOPC(16mg), DPPG(2mg), 트리올레인(triolein, 4mg), 콜레스테롤(8mg), 스쿠알렌(6mg)과 올레산(oleic acid) 6mg에 녹인 이미퀴모드를 1mL 클로로포름(chloroform)에 녹여 용액을 만들고, 이 용액을 젬시타빈 10mg이 섞인 5% 수크로오스(sucrose)와 7.5% 포도당(glucose) 혼합용액과 같이 소니케이터(microtip sonicator)를 사용하여 에멀젼화 하였다(water in oil).

다음으로 40mM 라이신(lysine)과 7.5% 포도당이 혼합된 용액을 균질기(homogenizer)를 사용하여 w-o-w 에멀젼을 제조 후, 클로로포름은 증발기(rotary evaporator)를 사용하여 제거하고, 봉입되지 않은 약물은 비동심 다중나노도메인 베시클 워싱과정에서 제거하였다.

나노리포좀은 DOPE(0.006 mmole)와 DOTMA(0.006 mmole)을 1mL 클로로포름에 녹인 다음 증발기를 사용하여 얇은 필름(thin film)을 형성하여 제작하였다. 얇은 필름 형태로 형성된 지질 혼합물은 1mg 클로드로네이트(Chlodronate)를 포함하고 있는 탈이온수(Deionized water)에 용해가능하다. 이렇게 만들어진 용액은 1분간 소니케이션(sonication) 과정을 거치고 2시간 동안 반응시키면 안정한 형태를 형성하게 된다. 봉입되지 않은 클로드로네이트는 원심분리 필터(centrifuge filter)를 사용하여 제거하였다. 이러한 과정을 거쳐 만들어진 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀을 각각 10 : 3 비율(w/w)로 섞어 주입형 겔을 형성하였다.

도 1에서는 음전하를 갖는 마이크로미터크기의 비동심 다중나노도메인 베시클과 양전하를 갖는 나노크기의 리포좀이 정전기적 인력에 의해 구조가 형성되고, 전단응력에 따라 구조가 일시적으로 붕괴되고, 이러한 현상이 반복될 수 있는 가역적 겔 (reversible gel)에 관한 모식도를 나타내었다.

도 2에서는 친수성과 소수성 구역으로 나누어진 비동심 다중나노도메인 베시클의 구조를 형광이미지를 통해 나타내었다.

도 3에서는 약물 봉입효율 및 지효성에서 일반적인 리포좀에 비해 비동심 다중나노도메인 베시클이 더 뛰어난 효과를 보이는 것을 그래프로 나타내었다.

실시예 2 : 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔의 안정성 확인

비동심 다중나노도메인 베시클의 안정성을 확인하기 위하여 비동심 다중나노도메인 베시클을 제작한 후, 각각 4℃와 생체온도 37℃에 보관하여 구조에 변화가 있는지 확인하였다. 광학현미경 하에서 4주 동안 두 온도에서 모두 다중나노도메인 베시클의 유의미한 구조적 변화가 확인되지 않았다. 또한 비동심 다중나노도메인 베시클의 크기 또한 4℃와 37℃ 에서 시간에 따라 유의미한 차이가 확인되지 않았다(도 4).

다음으로 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀 비율 차이에 의한 주입형 겔의 구조 차이를 확인하였다. 나노리포좀의 비율이 적을 때에는 겔 형태가 이루어지지 않지만, 적정 비율인 10 : 3에서 겔이 형성되는 것을 확인하였고, 나노리포좀 비율이 높아지면 겔 구조가 붕괴하는 것이 확인되었다(도 5).

도 6에서는 비동심 다중나노도메인 베시클과 주입형 겔의 형광이미지를 비교하여 비동심 다중나노도메인 베시클 사이에서 가교역할을 하는 나노리포좀을 확인하였다. 비동심 다중나노도메인 베시클만 존재하는 경우에는 비동심 다중나노도메인 베시클이 각각 떨어져 있는 것을 확인하였으나, 나노리포좀과 같이 존재하는 경우, 나노리포좀이 가교역할을 하여 서로 뭉치는 형태를 확인하였다.

도 7에서는 비동심 다중나노도메인 베시클과 주입형 겔의 점성과 전단응력을 비교한 결과를 나타내었다. 비동심 다중나노도메인 베시클에 비해 주입형 겔의 점성이 높고, 전단응력에 따라 구조의 일시적 붕괴와 회복이 반복되는 가역적 겔임을 확인하였다.

도 8에서는 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔을 4℃와 37℃에서 각각 안정성을 확인하였다. 4주 동안 관찰한 결과 4℃에서는 처음 상태와 크게 달라지지 않았으나, 37℃ 에서는 14일 차부터 주입형 겔의 구조적인 변화가 확인되었다. 14일 차부터 점차 주입형 겔의 분해가 관찰되기 시작하며, 시간에 따라 분해가 진행되다가, 28일 차에는 거의 완전히 분해가 되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 주입형 겔이 생체 내에서 이미퀴모드와 젬시타빈 그리고 클로드로네이트와 같은 약물을 충분히 전달하고 체내에서 분해가 된다는 것을 확인할 수 있었다.

도 9에서는 비동심 다중나노도메인 베시클과 주입형 겔의 약물 지효성을 비교하였다. 이미퀴모드와 젬시타빈의 약물 지효성 비교에서, 비동심 다중나노도메인 베시클과 주입형 겔 사이에 큰 차이가 관찰되지 않았다. 따라서, 겔이 형성된 이후에도 약물 전달 효능이 차이가 없을 것이라고 할 수 있다.

도 10a, 도 10b, 및 도 10c에서는 이와 같은 주입형 겔의 지속성을 실제 마우스 체내에서 확인하였다. 형광물질을 포함하고 있는 샘플을 마우스 체내에 주입한 다음 시간에 따라서 구조가 유지되는지 확인하였다(도 10a). 형광물질만 주입한 대조군(G1)은 1일 이내에 모든 형광신호가 사라지는데 비해 비동심 다중나노도메인 베시클만 주입한 그룹(G2)과 다중도메인베시클과 음전하를 띠는 나노리포좀을 같이 주입한 그룹(G4)은 약 3일 이후에 형광신호가 급격하게 약해지는 것을 확인하였다. 이에 비해 비동심 다중나노도메인 베시클과 양전하를 띠는 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔(G3)은 2주 이상 형광 신호가 지속되는 것을 확인하였다(도 10b). 2주 이후, 실제 마우스에서 주입 부위를 확인한 결과, 주입형 겔은 그 형태를 유지하고 있으나, 다른 샘플은 형태를 찾기 어려웠다(도 10c).

상기 주입형 겔의 생체 안정성 확인을 위해, 마우스 혈청 내 사이토카인(IL-6) 농도와 마우스 몸무게를 비교한 결과, 대조군에 비해 주입형 겔에 의한 유의미한 변화가 확인되지 않았다(도 11a). 또한, ALT(alanine aminotransferase), AST(aspartate transaminase), BUN(blood urea nitrogen) 비교 데이터에서도 다른 대조군에 비해 주입형 겔에서 유의미한 차이가 확인되지 않았음을 알 수 있었다(도 11b).

실시예 3 : 이미퀴모드(Imiquimod)(R837)와 젬시타빈(Gemcitabine)을 포함한 비동심 다중나노도메인 베시클과 클로드로네이트(Clodronate)를 포함한 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔의 항암치료 효능 평가

도 12에서는 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔과 수술 방법을 이용한 항암면역치료관련 모식도를 나타내었다. 비동심 다중나노도메인 베시클이 포함하고 있는 젬시타빈이 골수유래면역억제세포(mdsc)를 제거하고, 동시에 암세포를 공격하여 면역원성 세포사(immunogenic cell death)를 통한 암세포 항원을 발생시킨다. 이미퀴모드는 면역 반응을 강화시키고, 클로드로네이트를 포함한 나노리포좀은 종양 관련 대식세포(tumor associated macrophage)를 감소시켜, 면역반응 활성화를 유도한다.

도 13에서는 젬시타빈에 의해 유도되는 면역원성 세포사를 칼레티쿨린(calreticulin)과 HMGB1을 측정하여 확인하였다.

도 14에서는 4T1 세포주에 젬시타빈을 처리하여 얻은 상층액과 이미퀴모드에 의한 면역반응의 증가를 확인하였다. 즉, 수지상세포 활성화 마커인 CD40, CD80를 측정하였고, 염증성 사이토카인 TNF-α와 IL-6를 측정하였다. 상층액에는 젬시타빈에 의해 만들어지는 항원이 포함되어 있었고, 이미퀴모드는 면역반응을 향상시킴으로써, 두 가지를 같이 처리한 그룹에서 면역 반응이 가장 크게 증가하는 것을 확인하였다.

도 15에서는 젬시타빈에 의해 유도되는 세포자멸사(apoptosis)를 확인하였다. 즉, 젬시타빈 처리 농도에 따라, 유도되는 세포자멸사 비율이 증가하는 것을 확인하였다.

도 16에서는 클로드로네이트, 양전하성 리포좀, 양전하성 클로드로네이트-리포좀을 대식세포에 처리하여 효능을 비교하였다. 클로드로네이트와 양전하성 리포좀에 비해 양전하성 클로드로네이트-나노리포좀의 경우 낮은 농도에서도 효과적으로 대식세포를 감소시키는 것을 확인하였다.

도 17에서는 주입형 겔을 이용한 수술 방법을 나타내었다. 동물실험에서는 특정 병원균이 없는 BALB/c(female 5-6 주령, 오리엔트) 마우스를 사용하였다. 우선, 체중(g)당 0.01ml의 2.5% 아버틴(avertin; 2,2,2- tribromoethanol-tert-amylacohol, 시그마알드리치) 용액을 생쥐의 복강에 주입하여 마취시키고, 오른쪽 옆구리에 1x10 ⁶개의 유방암 세포(4T1)을 피하주사로 주입하였다. 14일 후, 종양 크기가 약 300mm³ 이 되었을 때, 수술을 진행하여 약 90%의 종양을 제거하였다. 이 때, 6개 그룹으로 구별하여 샘플을 주입하였다. 수술 이후 10일 차에 다양한 면역세포(CD4 ⁺T 세포, CD8 ⁺T 세포, NK 세포, 수지상세포, 골수유래면역억제세포) 비율을 비교하여 주입형 겔에 의한 항암효과를 확인하였다. 면역세포는 비장(spleen)과 림프노드(lymphnode)에서 분리하여 분석하였는데, 먼저 비장을 마우스에서 분리한 다음, 적혈구 용해 완충액(red blood cell lysis buffer)을 사용하여 적혈구(red blood cell)를 제거한 다음 지라세포(splenocyte)만 남겨서 사용하였다. 림프노드는 마우스에서 분리한 다음, 콜라겐 분해효소(collagenase)를 1시간 처리하여 조직에서 세포를 분리하였다. 세포를 분리한 다음, 필터링 과정을 거쳐 림프구(lymphocyte) 이외의 조직이 포함되는 것을 막는다. 이렇게 얻어진 세포는 다양한 항체(anti-CD4, anti-CD8, anti-CD3, anti-CD335, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-Gr1)를 사용하여 여러 가지 면역세포를 표지하고, 유세포분석기(flow cytometer)를 통해 분석하였다.

도 18에서는 수술 이후 생존율 측정을 통하여, 주입형 겔에 의해 생존율이 대조군에 비해 크게 증가하는 것을 확인하였다. 이미퀴모드와 젬시타빈만 포함된 그룹 또한 생존율이 대조군에 비해 증가하지만, 클로드로네이트가 포함된 주입형 겔의 효과가 더욱 큰 것을 확인하였다.

도 19에서는 4T1 유방암 세포의 쉽게 전이가 발생하는 특성을 이용하여 폐에서 종양 전이 여부를 확인한 결과, 본 발명의 주입형 겔을 사용하였을 때, 가장 효과적으로 종양 전이가 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 4 : 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔에 의해 유도되는 면역반응 확인

도 20에서는 종양 수술과 겔 주입 이후 10일 차에 종양에 있는 여러 면역 세포의 비율 변화를 확인하였다. CD4 ⁺T 세포, CD8 ⁺T 세포, NK 세포의 경우, 겔을 주입한 그룹에서 비율이 증가하는 것을 확인하였다. 반대로, 골수유래면역억제세포와 M2 대식세포와 같은 면역 반응을 억제하는 세포들의 비율은 감소하는 것이 확인되었다.

도 21에서는 여러가지 사이토카인(TNF-α, IL-6, INF-γ, IFN-α)를 측정한 결과, 주입형 겔을 처리한 그룹에서 사이토카인이 가장 높게 측정되는 것을 확인하였다.

도 22에서는 수술 이후 림프기관 내부 면역세포 비율 변화를 확인하였다. 주입형 겔을 사용한 경우 비장에서 CD4 ⁺T 세포, CD8 ⁺T 세포 비율이 증가하였고, 골수유래면역억제세포 비율이 감소하였다. 수지상세포와 NK 세포의 비율도 증가하였으며, 비장뿐만 아니라 림프노드에서도 같은 양상이 확인되었다. 림프노드에서 조절 T 세포(regulatory T cell)의 비율 확인 결과, 주입형 겔을 사용한 경우 비율이 크게 감소하는 것을 확인하였다.

도 23에서는 비장과 림프노드에서 분리한 림프구(lymphocyte)에서 분비되는 사이토카인(INF-γ, IL-2, TNF-α)을 측정하였다. 주입형 겔을 사용하였을 때, 종양에서 염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)이 증가하였고, 이를 통하여 림프구에서 분비되는 사이토카인은 종양 용해물(lysate)에 의해 자극된 반응으로서 본원 발명의 주입형 겔에 의하여 항원 특이적인 면역 반응이 유도된 것을 확인할 수 있었다. 전체적으로 종양, 비장, 림프노드에서 주입형 겔을 사용하였을 때, 가장 높은 면역 증강 효과를 보이는 것을 확인하였다.

도 24에서는 자기공명영상(MRI) 이미지를 통해 주입형 겔을 사용한 경우 종양 전이가 억제되는 것을 확인하였다. 대조군의 경우 마우스 내부 장기에 종양이 전이 되어 하얗게 표시 되는 것을 확인하였다.

도 25에서는 CD4 ⁺T 세포, CD8 ⁺T 세포, NK 세포를 각각 항체를 이용하여 마우스 체내에서 감소시킨 다음 그 영향을 확인하였다. 세 종류 면역세포 모두 항암면역치료 효과에 영향이 있지만, CD8 ⁺T 세포와 NK 세포의 경우 CD4 ⁺T 세포보다 영향이 큰 것을 확인하였다. 종양 무게와 종양 전이 모두 CD4 ⁺T 세포의 영향이 적은 것을 알 수 있다.

도 26에서는 이차종양(secondary tumor)을 사용하여 전신 항 종양 면역 반응(systemic antitumor immune response)을 확인하였다. 상기 실시예 1과 같은 방법으로 실험을 진행하되, 이차종양은 원발성 종양(primary tumor) 주입 이후 14일 차에 수술로 원발성 종양의 일부를 제거함과 동시에 마우스의 반대편 옆구리에 주입하였다. 이후 종양의 크기와 무게를 관찰하고 종양 내 면역세포(CD4 ⁺T 세포, CD8 ⁺T 세포) 비율을 확인한 결과 주입형 겔을 처리한 그룹에서 원발성 종양과 이차 종양 모두 크기와 무게가 현저하게 감소하였고, 면역세포의 비율이 증가하는 것을 확인하였다.

도 27에서는 기억 T 세포(memory T cell)에 의한 면역 반응을 확인하였다. 비장에서 분리한 지라세포에 기억 T 세포 관련 항체인 anti-CD44와 anti-CD62L을 사용하여 표지하고, 유세포분석기를 이용하여 기억 T 세포의 비율을 비교하였다. CD4 ⁺기억 T 세포와 CD8 ⁺기억 T 세포 모두에서 주입형 겔을 사용하였을 때, 가장 높은 비율이 측정되는 것을 확인하였다. 종양 재주입 실험과정에서는 실시예 2에서 진행한 생존율 측정 과정에서 발생한 종양이 완전히 사라진 마우스(실험군)를 사용하였다. 수술과정을 기점으로 45일 후, 종양을 반대편 옆구리에 주입하였다. 이 때, 아무것도 처리하지 않은 마우스(대조군) 또한 같이 종양을 주입하였다. 종양 재주입 이후, 종양 크기를 관찰한 결과, 주입형 겔에 의한 면역반응이 종양의 성장을 크게 억제하는 것을 확인하였다. 대조군에서는 종양 주입 이후 며칠 지나지 않아 지속적으로 종양이 성장되는 반면, 실험군에서는 약 3주일 정도 종양 성장이 억제됨을 볼 수 있었다. 또한, 폐에서 종양 전이를 확인하였을 때, 대조군에 비해 실험군에서 종양 전이가 억제되어 폐에서 종양이 확인되지 않았다.

실시예 5 : 이미퀴모드(Imiquimod)(R837)와 젬시타빈(Gemcitabine)을 포함한 비동심 다중나노도메인 베시클과 클로드로네이트(Clodronate)를 포함한 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔과 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor) 병용요법

도 28에서는 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 가역적 주입형 겔과 면역관문억제제를 사용한 병용요법에 관한 모식도를 나타내었다. 면역원성이 없는 종양에 주입형 겔을 사용하면, 다중도메인베시클이 포함하고 있는 이미퀴모드와 젬시타빈이 면역 활성화 반응을 억제하는 골수유래면역억제세포(MDSC)와 종양 관련 대식세포(Tumor-associated macrophage)를 감소시켜, 면역관문억제제가 잘 작용할 수 있도록 만들어준다. 여기에 면역관문억제제(anti-PD-1, anti-PD-L1)을 처리하여 더욱 뛰어난 항암면역치료효과를 기대할 수 있다.

도 29에서는 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀으로 구성된 주입형 겔에 의해 유도되는 면역관문(immune checkpoint) 시스템 활성화를 확인하였다. 동물실험에서 특정 병원균이 없는 BALB/c(female 5-6 주령, 오리엔트) 마우스를 사용하였다. 먼저, 체중(g)당 0.01ml의 2.5% 아버틴(avertin; 2,2,2- tribromoethanol-tert-amylacohol, 시그마알드리치) 용액을 생쥐의 복강에 주입하여 마취시키고, 오른쪽 옆구리에 1x10 ⁶개의 유방암 세포(4T1)를 피하주사로 주입하였다. 14일 후, 종양 크기가 약 300mm³이 되었을 때, 수술을 진행하여 약 90%의 종양을 제거하였다. 수술 이후 10일 차에 남아 있는 종양을 분리한 다음 세포를 분리하여 유세포분석기(flow cytometer)를 통해 분석하였다. 주입형 겔을 사용한 경우, 종양 내 T 세포(CD3 ⁺cell)의 PD-1 발현량이 증가하고, 종양세포(CD45 ^-cell)에서 PD-L1 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통하여 면역관문억제제를 병용해서 사용하였을 때, 주입형 겔만 사용하였을 때보다 더 향상된 면역반응을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

도 30에서는 주입형 겔과 면역관문억제제 병용요법의 효능을 확인하였다. 수술 과정까지는 상기 도 29에서와 동일한 방법으로 진행하였으며, 수술 이후 3일 차부터 면역관문억제제(anti-PD-1, anti-PD-L1)를 2일 마다 매회 200㎍을 마우스에 5회 주입하였다. 생존율 측정 시, 주입형 겔만 사용한 마우스에서는 10마리 중 4마리에서 종양이 완전히 사라진 것에 비해, anti-PD-L1과 병용한 마우스에서는 10마리 중 7마리에서 종양이 완전히 사라진 것이 확인되었고, 이에 따라 생존율이 크게 증가하였다.

도 31에서는 상기 도 30과 같은 방법으로 실험을 진행하여, 마지막 면역관문억제제 주입 이후 3일차에 종양과 비장에서 면역세포(CD8 ⁺T cell)의 비율을 비교하였다. 주입형 겔만 단독으로 사용한 경우에도 면역세포 비율이 크게 증가하였으나, anti-PD-L1과 병용하였을 때 더욱 증가하는 것을 확인하였다. 주입형 겔 없이 면역관문억제제 단독 투여만으로는 유의미한 변화가 확인되지 않았다.

도 32에서는 비장에서 분리한 림프구를 종양 용해물로 자극시켰을 때, 사이토카인이 분비되는 정도를 확인하였다. 그 결과, 주입형 겔과 anti-PD-L1을 병용하였을 때, 사이토카인(IFN-γ)의 분비가 가장 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 이를 통해 항원 특이적 면역 반응이 면역관문억제제 병용에 의해 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

도 33에서는 폐암 모델(TC1)을 통해 유방암 모델과 같은 면역반응이 활성화되는지 확인하였다. 폐암 모델에서는 C57/BL6(female 5-6 주령, 오리엔트) 마우스를 사용하였으며, 그 외 실험 방법은 도 29와 동일하게 진행하였다. 폐암 모델에서도 유방암 모델과 동일하게 종양 내 T 세포(CD3 ⁺cell)의 PD-1 발현량이 증가하고, 종양세포(CD45 ^-cell)에서 PD-L1 발현량이 증가하는 것을 확인하였다.

도 34에서는 도 30과 같은 방법으로 생존율을 측정하였다. 주입형 겔만 단독사용한 경우에도 생존율이 크게 증가하지만, anti-PD-1과 병용하여 사용하였을 때, 더욱 크게 증가하는 것을 확인하였다. 여기에서도 면역관문억제제 단독 투여만으로는 유의미한 변화가 확인되지 않았다.

도 35에서는 도 31과 같은 방법으로 종양과 비장에서 면역세포(CD8 ⁺T cell)의 비율을 비교하였다. 유방암 모델과 동일하게 주입형 겔만 단독으로 사용한 경우에도 면역세포 비율이 크게 증가하지만, 폐암 모델에서는 anti-PD-1과 병용하였을 때 더욱 증가하는 것을 확인하였다. 유방암 모델과 마찬가지로 주입형 겔 없이 면역관문억제제 단독 투여만으로는 유의미한 변화가 확인되지 않았다.

다음으로, 비장에서 분리한 림프구를 TC1 종양 용해물로 자극하여 항원 특이적 면역반응을 확인하였다. 이 경우에도 주입형 겔 단독 처리만으로도 항원 특이적 면역반응이 증가하지만, anti-PD-1과 병용하였을 때, 더욱 증가하는 것을 확인하였다(도 36).

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

본 발명의 비경구 약물전달용 가역적 겔은 다양한 물리화학적 특성 및 기능을 갖는 2가지 이상의 약물을 독립적으로 로딩이 가능하고, 단일 시린지를 이용하여 주입이 가능한 가역적인 특성을 가지며, 비동심 다중나노도메인 베시클에 로딩된 약물은 기존 리포좀에 로딩된 약물에 비하여 봉입효율이 15배 이상 증가하였으며, 로딩된 약물도 7 내지 30일 이상의 기간 동안 서방형으로 방출된다는 효과를 가질 뿐만 아니라, 수성 및/또는 친수성 약물을 모두 포함할 수 있으므로, 암 치료 외에도 다양한 질환의 치료를 위한 약물전달체로서 폭넓게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

서로 접촉하고 연결되어 있는 둘 이상의 리포좀, 및 상기 둘 이상의 리포좀을 둘러싸는 외벽을 포함하는 비동심 다중나노도메인 베시클; 및 나노리포좀을 포함하고,

상기 비동심 다중나노도메인 베시클은 음전하를 가지며 유기상과 수용액상으로 이루어지고,

상기 나노리포좀은 양전하를 가지는 것인, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제1항에 있어서,

상기 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀의 비율은 10:1(w/w) 내지 10:9(w/w) 인 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제2항에 있어서,

상기 비동심 다중나노도메인 베시클과 나노리포좀의 비율은 10:3(w/w) 인 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제1항에 있어서,

상기 비동심 다중나노도메인 베시클의 직경은 1μm 내지 100μm 인 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제1항에 있어서,

상기 나노리포좀의 직경은 20nm 내지 900nm 인 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제1항에 있어서,

상기 비동심 다중나노도메인 베시클의 유기상, 리포좀 멤브레인, 및/또는 외벽에는 소수성 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제1항에 있어서,

상기 비동심 다중나노도메인 베시클의 수용액상에는 친수성 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제1항에 있어서,

상기 나노리포좀의 내부에는 친수성 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제1항에 있어서,

상기 나노리포좀의 멤브레인에는 소수성 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제6항 또는 제9항에 있어서,

상기 소수성 약물은 면역활성화 물질 또는 면역억제인자 제어물질인 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제7항 또는 제8항에 있어서,

상기 친수성 약물은 면역활성화 물질 또는 면역억제인자 제어물질인 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제1항에 있어서,

상기 비경구 약물전달용 가역적 겔은 주입된 부위에서 주위로 퍼지거나 구조가 붕괴되지 않아 안정적으로 유지됨으로써 약물을 서방형으로 방출하게 하는 것을 특징으로 하는, 비경구 약물전달용 가역적 겔.
제1항의 비경구 약물전달용 가역적 겔; 및

소수성 약물 및 친수성 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물전달용 조성물.
제13항에 있어서,

상기 조성물은 주사제형으로 사용되는 것을 특징으로 하는, 약물전달용 조성물.
제13항에 있어서,

상기 조성물은 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitors)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물전달용 조성물.
제15항에 있어서,

상기 면역관문억제제는 anti-PD-1, anti-PD-L1, 및 anti-CTLA-4, anti-KIR, anti-LAG3, anti-CD137, anti-OX40, anti-CD276, anti-CD27, anti-GITR, anti-TIM3, anti-41BB, anti-CD226, anti-CD40, anti-CD70, anti-ICOS, anti-CD40L, anti-BTLA, anti-TCR, 및 anti TIGIT로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는, 약물전달용 조성물.
제1항의 비경구 약물전달용 가역적 겔; 및

소수성 약물 및 친수성 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제17항에 있어서,

상기 약학적 조성물은 면역원성 세포사멸(immunogenic cell death)을 유도하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,

상기 약학적 조성물은 수지상세포, 자연살해세포, 및/또는 T 세포의 활성화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,

상기 약학적 조성물은 regulatory T cell, myeloid derived suppressor cells, M2 macrophage의 기능을 저해하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,

상기 약학적 조성물은 전신 항암면역(systemic antitumor immune response)를 유도하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,

상기 약학적 조성물은 암의 재발(recurrence), 전이(metastasis) 또는 항암 치료 요법에 대한 내성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,

상기 약학적 조성물은 종양과 같은 국소부위(local injection)에 주입하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항의 비경구 약물전달용 가역적 겔; 및

소수성 약물 및 친수성 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법.
제1항의 비경구 약물전달용 가역적 겔; 및

소수성 약물 및 친수성 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 조성물의 암 예방 또는 치료 용도.
제1항의 비경구 약물전달용 가역적 겔; 및

소수성 약물 및 친수성 약물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 조성물의 암 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도.