WO2020067730A1 - 독소루비신을 유효성분으로 하는 조성물 및 그 제조 방법 - Google Patents

독소루비신을 유효성분으로 하는 조성물 및 그 제조 방법 Download PDF

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WO2020067730A1
WO2020067730A1 PCT/KR2019/012501 KR2019012501W WO2020067730A1 WO 2020067730 A1 WO2020067730 A1 WO 2020067730A1 KR 2019012501 W KR2019012501 W KR 2019012501W WO 2020067730 A1 WO2020067730 A1 WO 2020067730A1
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doxorubicin
polylactic acid
block copolymer
nanocomposite composition
block
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PCT/KR2019/012501
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김경해
이사원
김구영
문규영
윤민혁
정승의
진근우
서민효
정광일
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주식회사 삼양바이오팜
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for controlling the release of doxorubicin, and more particularly, to an anticancer effect of doxorubicin and an anti-cancer agent composition having improved ability to induce immunogenic apoptosis and its use.
  • ICD Immunogenic cell death
  • Cancer cells killed by anti-cancer agents known to induce ICD can cause damage-related molecular patterns (DAMPs) such as Carleticulin (CRT), High mobility group box1 (HMGB1), and Adenosine triphosphate (ATP) to the outside of the cell membrane. It is known to expose.
  • DAMPs damage-related molecular patterns
  • CRT Carleticulin
  • HMGB1 High mobility group box1
  • ATP Adenosine triphosphate
  • the DAMP acts as an alert to inform the surrounding tissues or cells of the danger and is recognized by antigen-presenting cells such as dendritic cells to induce cancer cell specific anti-tumor immunity.
  • Anti-cancer drugs that induce ICD include doxorubicin, idarubicin, mitoxantrone, oxaliplatin, cyclosphosphamide, mafosfamide, and bortezomib. (Bortezomib) is known.
  • the nano-cancer agent is a material suitable for the delivery of ICD-induced anticancer agents because it can accumulate in tumors due to the enhanced permeability and retention (EPR) effect that penetrates between the leaky blood vessels of the neoplasm around the tumor and accumulates inside the tumor tissue.
  • EPR enhanced permeability and retention
  • the nano-cancer agent may affect the release and stability of the active substance, it is still a challenge to develop the nano-anticancer agent so as to exert its anti-cancer effect or induce ICD by surpassing the function of the active substance itself.
  • the world anti-cancer drug market is growing rapidly, mainly with immuno-cancer drugs. While the proportion of immuno-cancer drugs in the market for anti-cancer drugs has increased, the possibility that a combination therapy of immuno-cancer / chemo-cancer drugs has been adopted as a standard treatment in various cancers has increased. Therefore, it is necessary to develop an anti-cancer agent that induces ICD contributing to immune activity as an anti-cancer agent that can cause synergy in terms of anti-cancer efficiency when combined with an anti-cancer agent.
  • An object of the present invention is to provide a nanocomposite composition comprising doxorubicin as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a nanocomposite composition for treating cancer in combination with an immuno-cancer agent.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the nanocomposite composition.
  • doxorubicin as an active ingredient; Amphiphilic block copolymers; And a polylactic acid salt, wherein the amphiphilic block copolymer is an AB type double block copolymer composed of a hydrophilic A block and a hydrophobic B block, wherein the hydrophilic A block is polyalkylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinyl One or more selected from the group consisting of pyrrolidone, polyacrylamide, and derivatives thereof, and the hydrophobic B block is from the group consisting of polyester, polyanhydride, polyamino acid, polyorthoester, and polyphosphazine It is one or more selected, the doxorubicin is characterized in that is encapsulated inside the nanoparticle structure formed by the amphiphilic block copolymer and the polylactic acid salt, there is provided a nanocomposite composition.
  • the molar ratio of the sum of the amphiphilic block copolymer and the polylactic acid to doxorubicin is 8 to 12: 1, and the molar ratio of the polylactic acid salt to doxorubicin may be 1 to 6: 1.
  • the molar ratio of the sum of the amphiphilic block copolymer and the polylactic acid to doxorubicin is 18 to 22: 1, and the molar ratio of the polylactic acid salt to doxorubicin may be 1 to 15: 1.
  • step (a) dissolving doxorubicin in an aqueous solvent; (b) adding and dissolving polylactic acid salt in the solution obtained in step (a); (c) adding and dissolving the amphiphilic block copolymer in the solution obtained in step (b); And (d) drying the mixture obtained in step (c), wherein the amphiphilic block copolymer is an AB type double block copolymer composed of a hydrophilic A block and a hydrophobic B block, wherein the hydrophilic A block is One or more selected from the group consisting of polyalkylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyacrylamide, and derivatives thereof, and the hydrophobic B block is polyester, polyanhydride, polyamino acid, polyorl Preparation of a nanocomposite composition, one or more selected from the group consisting of small esters and polyphosphazine, wherein the doxorubicin is enclosed inside the nanoparticle structure
  • composition for treating cancer including the nanocomposite composition.
  • compositions for treating cancer in combination with an immunoanticancer agent comprising the nanocomposite composition.
  • a method of preparing a composition for treating cancer in combination with an immunoanticancer agent comprising using the nanocomposite composition.
  • composition for treating cancer comprising the nanocomposite composition and an immunoanticancer agent.
  • composition according to the present invention can induce immunogenic apoptosis and exhibit a synergistic effect in terms of anti-cancer efficacy when used in combination with an immuno-cancer agent.
  • 1 is a graph showing the ratio of Tumor free mice at the end of a Vaccination assay experiment performed in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing CD8 + T cell and MDSC changes when Doxorubicin-PNP is administered in an Immune cell recruitment assay performed in an embodiment of the present invention.
  • 'immunogenic apoptosis or ICD-induced anti-cancer agent' means that cancer cells are killed by anti-cancer agents and release damage-associated molecular patterns (DAMP), such as CRT, HMGB1, and ATP, from inside the cell and surrounding tissue. It acts as an alert to inform ora cells of danger, and DAMP is a drug that induces cancer cell-specific anti-tumor immunity because DAMP is recognized as an antigen-presenting cell such as a dendritic cell.
  • DAMP damage-associated molecular patterns
  • ICD-induced anticancer drugs are Doxorubicin, Idarubicin, Mitoxantrone, Oxaliplatin, Cyclosphosphamide, Mafosfamide, Bortezomib , Paclitaxel, Docetaxel.
  • the 'nanoanticancer agent' is a concept including polymer micelles (Polymeric Micelles, PM) and polymer nanoparticles (Polymeric Nano Particles, PNP).
  • the applicant has developed a formulation using a block copolymer having a hydrophilic part and a hydrophobic part for solubilization of poorly water-soluble drugs.
  • Polymeric Micelles can increase the solubility of poorly soluble drugs with a solubility of several ⁇ g / mL to several mg / mL.
  • the block copolymer has a low critical micelle concentration of 2 ⁇ g / mL, and the polymer micelle has an average particle distribution of 20 nm on average. Since it is possible to filter and sterilize, it is suitable for the injection production process.
  • Genexol-PM, a polymer micelle of paclitaxel, and Nanoxel M, a polymer micelle of docetaxel are commercialized.
  • Polymer nanoparticles use water soluble polylactic acid (PLA) for block copolymers having hydrophobic and hydrophilic parts.
  • PPA water soluble polylactic acid
  • Polymer nanoparticles are manufactured through ionic crosslinking by adding calcium ions, which are divalent cations, so they are more stable polymer nanoparticles in the water phase than polymer micelles.
  • Polymer nanoparticles can increase the solubility of poorly soluble drugs with solubility of several ⁇ g / mL to several mg / mL.
  • the polymer nanoparticles have a uniform particle distribution with an average of 20 nm and can be sterilized by filtration, which is suitable for the injection process.
  • Polymer nanoparticles which are stable nanoparticles, increase the blood retention properties of the drug and show excellent tumor accumulation effect by the EPR effect.
  • Paclitaxel-PNP (Paclitaxel-PNP), docetaxel-PNP (Docetaxel-PNP), and doxorubicin-PNP (Doxorubicin-PNP) have been formulated by applying polymer nanoparticle technology.
  • the doxorubicin used in the nanocomposite composition of the present invention is a drug that causes immune death against cancer cells, i.e., immunogenic cell death (ICD), and is an active ingredient of the final composition.
  • ICD immunogenic cell death
  • the doxorubicin based on the total dry weight of the final composition, may be included in 0.01 to 10% by weight, more specifically 0.1 to 5% by weight, but is not limited thereto.
  • the molar ratio of the sum of amphiphilic block copolymer and polylactic acid to doxorubicin is 8 to 12: 1, and the molar ratio of polylactic acid to doxorubicin may be 1 to 6: 1.
  • the molar ratio of the sum of the amphiphilic block copolymer and the polylactic acid to doxorubicin may be 9 to 11: 1, and the molar ratio of the polylactic acid to doxorubicin may be 3 to 6: 1.
  • the molar ratio of the sum of the amphiphilic block copolymer and the polylactic acid to doxorubicin may be 18 to 22: 1, and the molar ratio of the polylactic acid salt to doxorubicin may be 1 to 15: 1.
  • the molar ratio of the sum of amphiphilic block copolymer and polylactic acid to doxorubicin may be 19 to 21: 1, and the molar ratio of polylactic acid to doxorubicin may be 9 to 15: 1.
  • amphiphilic block copolymer used in the nanocomposite composition of the present invention is an AB type double block copolymer comprising a hydrophilic A block and a hydrophobic B block, and the nanoparticles formed by the amphiphilic block copolymer and polylactic acid salt Doxorubicin is enclosed inside the structure.
  • the AB-type double block copolymer is a core-shell type in which a hydrophobic B block forms a core (inner wall) in a water phase and a hydrophilic A block forms a shell (outer wall). It is possible to increase the efficiency of delivery into cells.
  • the hydrophilic A block is at least one selected from the group consisting of polyalkylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyacrylamide, and derivatives thereof. More specifically, the hydrophilic A block may be at least one selected from the group consisting of monomethoxypolyethylene glycol, monoacetoxypolyethylene glycol, polyethylene glycol, copolymers of polyethylene and propylene glycol, and polyvinylpyrrolidone. In one embodiment, the hydrophilic A block may have a number average molecular weight of 200 to 50,000 Daltons, more specifically 1,000 to 20,000 Daltons, and more specifically 1,000 to 5,000 Daltons.
  • the hydrophobic B block is a biocompatible biodegradable polymer, and is one or more selected from the group consisting of polyester, polyanhydride, polyamino acid, polyorthoester and polyphosphazine. More specifically, the hydrophobic B block is polylactide, polyglycolide, polycaprolactone, polydioxan-2-one, copolymer of polylactide and glycolide, polylactide and polydioxan-2-one It may be at least one selected from the group consisting of a copolymer, a copolymer of polylactide and polycaprolactone and a copolymer of polyglycolide and polycaprolactone.
  • the hydrophobic B block may have a number average molecular weight of 50 to 50,000 Daltons, more specifically 200 to 20,000 Daltons, and more specifically 1,000 to 5,000 Daltons.
  • the terminal hydroxyl group of the hydrophobic B block is one selected from the group consisting of tocopherol, cholesterol, and fatty acids having 10 to 24 carbon atoms. It may be modified as above.
  • the composition ratio of the hydrophilic block (A) and the hydrophobic block (B), based on the copolymer weight, the hydrophilic block (A) is 30 to 80% by weight, specifically 40 to 70% by weight % Range.
  • the proportion of the hydrophilic block (A) is less than 30% by weight, the solubility of the polymer is low in water, making it difficult to form nanoparticles, so that the copolymer has a hydrophilic block
  • the ratio of A) is preferably 30% by weight or more, when it exceeds 80% by weight, the hydrophilicity is too high and the stability of the polymer nanoparticles is low, making it difficult to use as a solubilizing composition of the composite. It is preferable that the proportion of) is 80% by weight or less.
  • the amphiphilic block copolymer based on the total dry weight of the final composition, may be included in 1 to 99.99% by weight, more specifically 5 to 99% by weight, but may be included in this It is not limited.
  • the polylactic acid salt (for example, PLA-COONa) used in the nanocomposite composition of the present invention is distributed in the core (inner wall) of the nanoparticles to enhance the hydrophobicity of the core to stabilize the nanoparticles, and at the same time, the reticuloendothelial system ( RES). That is, the carboxylate anion of the polylactic acid is more effectively combined with the virus than the polylactic acid to reduce the surface potential of the polymer nanoparticles, thereby reducing the positive charge of the surface potential compared to the polymer nanoparticles that do not contain the polylactic acid, and thus the reticuloendothelial system. It has the advantage of being less trapped by, and thereby having excellent delivery efficiency to a desired site (eg, cancer cells, inflammatory cells, etc.).
  • a desired site eg, cancer cells, inflammatory cells, etc.
  • the nanocomposite of the present invention may be for controlling the release of doxorubicin.
  • the nanocomposite according to one embodiment has a release of 20% or less (eg, more than 0% and 20% or less), preferably 15% or less, more preferably 7% or less, based on 24 hours It may have a speed.
  • the release rate can be measured using a conventionally well-known method, for example, after shaking with stirring at 150 to 350 rpm in a PBS solution of 35 to 38 ° C, pH 6.5 to 8.0, after 24 hours.
  • the polylactic acid salt contained as the nanoparticle inner wall component as a separate component from the amphiphilic block copolymer preferably has a number average molecular weight of 500 to 50,000 Daltons, specifically 1,000 to 10,000 Daltons. If the molecular weight is less than 500 Daltons, the hydrophobicity is too low to be present in the core (inner wall) of the nanoparticles, and if the molecular weight exceeds 50,000 Daltons, there is a problem that the particles of the polymer nanoparticles become large.
  • the polylactic acid salt may be used in an amount of 1 to 500 parts by weight, specifically 20 to 400 parts by weight, and more specifically 40 to 300 parts by weight based on 100 parts by weight of the amphiphilic block copolymer.
  • the content of the polylactic acid salt exceeds 500 parts by weight compared to 100 parts by weight of the amphiphilic block copolymer, the size of the nanoparticles increases, filtration using a sterile membrane becomes difficult, and if it is less than 1 part by weight, the desired effect cannot be sufficiently obtained.
  • the opposite end of the polylactic acid salt of the carboxylic acid-metal is hydroxy, acetoxy, benzoyloxy, decanoyloxy, palmitoyloxy and alkoxy having 1 to 2 carbon atoms. It may be substituted with one selected from the group consisting of.
  • the polylactic acid salt may be one or more selected from the group consisting of compounds of Formulas 1 to 6 below.
  • A is -COO-CHZ-;
  • B is -COO-CHY-, -COOCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -or -COO-CH 2 CH 2 OCH 2- ;
  • R is a hydrogen atom, or an acetyl, benzoyl, decanoyl, palmitoyl, methyl, or ethyl group;
  • Z and Y are each a hydrogen atom or a methyl or phenyl group;
  • M is Na, K, or Li;
  • n is an integer from 1 to 30;
  • m is an integer from 0 to 20.
  • X is a methyl group
  • Y ' is a hydrogen atom or a phenyl group
  • p is an integer from 0 to 25
  • q is an integer from 0 to 25, provided p + q is an integer from 5 to 25
  • R is a hydrogen atom, or an acetyl, benzoyl, decanoyl, palmitoyl, methyl or ethyl group
  • M is Na, K, or Li
  • Z is a hydrogen atom, a methyl or phenyl group.
  • W-M ' is or ego
  • PAD is D, L-polylactic acid, D-polylactic acid, polymandelic acid, copolymer of D, L-lactic acid and glycolic acid, copolymer of D, L-lactic acid and mandelic acid
  • R is a hydrogen atom, or an acetyl, benzoyl, decanoyl, palmitoyl, methyl or ethyl group
  • M is independently Na, K, or Li.
  • S is ego;
  • L is -NR 1 -or -O-, where R 1 is a hydrogen atom or C 1-10 alkyl;
  • Q is -CH 3 , -CH 2 CH 3 , -CH 2 CH 2 CH 3 , -CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 , or -CH 2 C 6 H 5 ;
  • a is an integer from 0 to 4;
  • b is an integer from 1 to 10;
  • M is Na, K, or Li;
  • PAD is D, L-polylactic acid, D-polylactic acid, polymandelic acid, copolymer of D, L-lactic acid and glycolic acid, copolymer of D, L-lactic acid and mandelic acid, D, L-lactic acid It is at least one selected from the group consisting of a copolymer of caprolactone and a copolymer of D, L-lactic acid and 1,4-dioxan-2-one.
  • R ' is -PAD-OC (O) -CH 2 CH 2 -C (O) -OM
  • PAD is D, L-polylactic acid, D-polylactic acid, polymandelic acid, D , L-lactic acid and glycolic acid copolymer, D, L-lactic acid and mandelic acid copolymer, D, L-lactic acid and caprolactone copolymer, D, L-lactic acid and 1,4-dioxane-2 -One is selected from the group consisting of copolymers, M is Na, K, or Li; a is an integer of 1-4.
  • X and X ' are independently hydrogen, alkyl having 1 to 10 carbons, or aryl having 6 to 20 carbons; Y and Z are independently Na, K, or Li; m and n are independently integers from 0 to 95, 5 ⁇ m + n ⁇ 100; a and b are independently an integer from 1 to 6; R is-(CH 2 ) k- , divalent alkenyl having 2 to 10 carbon atoms, divalent aryl having 6 to 20 carbon atoms, or a combination thereof, where k is 0 to 10 Is an integer.
  • the polylactic acid salt may be a compound of Formula 1 or Formula 2.
  • the nanocomposite composition of the present invention may further include a divalent or trivalent metal ion.
  • the divalent or trivalent metal ion is preferably calcium (Ca 2 + ), magnesium (Mg 2 + ), barium (Ba 2+ ), chromium (Cr 3 + ), iron (Fe 3 + ), manganese ( Mn 2 + ), nickel (Ni 2 + ), copper (Cu 2 + ), zinc (Zn 2 + ), aluminum (Al 3 + ), or the like.
  • the metal ion may be added to the polymer nanoparticle composition in the form of sulfate, hydrochloride, carbonate, phosphate and hydroxide, preferably calcium chloride (CaCl 2 ), magnesium chloride (MgCl 2 ), zinc chloride (ZnCl 2 ), chloride Aluminum (AlCl 3 ), iron chloride (FeCl 3 ), calcium carbonate (CaCO 3 ), magnesium carbonate (MgCO 3 ), calcium phosphate (Ca 3 (PO 4 ) 2 ), magnesium phosphate (Mg 3 (PO 4 ) 2 ), Aluminum phosphate (AlPO 4 ), magnesium sulfate (MgSO 4 ), calcium hydroxide (Ca (OH) 2 ), magnesium hydroxide (Mg (OH) 2 ), aluminum hydroxide (Al (OH) 3 ), zinc hydroxide (Zn (OH) 2 ) or mixtures thereof.
  • CaCl 2 calcium chloride
  • MgCl 2 magnesium chloride
  • the divalent or trivalent metal ion may control the equivalent weight to control the release rate of the drug enclosed inside the polymer nanoparticle.
  • the bivalent or trivalent metal ion when the bivalent or trivalent metal ion is contained in the polymer nanoparticle composition in an amount of 1 equivalent or less with respect to the equivalent weight of the carboxyl group of the polylactic acid salt, the number of polycarboxylate groups bound to the carboxy terminal group is small, thereby increasing the drug release rate.
  • the release rate of the drug is delayed due to the large number of polylactic acid-bonded carboxy terminal groups. Accordingly, a small amount of metal ion is used to increase the release rate of the drug in the blood, and a large amount of metal ion can be used to delay the release rate of the drug.
  • the divalent or trivalent metal ion may be included in an amount of 0.01 to 10 equivalents, 0.1 to 5 equivalents, and 0.2 to 2 equivalents based on the equivalent of the carboxy end group of the polylactic acid salt.
  • the nanocomposite composition of the present invention can be used to treat cancer, and more specifically, it can be used to treat cancer in combination with an immunoanticancer agent.
  • the anti-cancer agent that can be used in combination with the nanocomposite composition of the present invention may be an anti-PD-1 drug
  • the anti-PD-1 drug is, for example, Nivolumab, Pembrolizumab , Atezolizumab, Avelumab, Duvalumab, Semiplimab, and combinations thereof.
  • the nanocomposite composition of the present invention comprises: (a) dissolving doxorubicin in an aqueous solvent; (b) adding and dissolving polylactic acid salt in the solution obtained in step (a); (c) adding and dissolving the amphiphilic block copolymer in the solution obtained in step (b); And (d) drying the mixture obtained in step (c); can be prepared by a method comprising a.
  • the aqueous solvent may be a lower alcohol (methanol, ethanol, propanol, etc.) aqueous solution, distilled water, water for injection, or a buffer solution, and a preferred buffer solution may be a phosphate buffer solution (Phosphate buffered saline).
  • a lower alcohol methanol, ethanol, propanol, etc.
  • a preferred buffer solution may be a phosphate buffer solution (Phosphate buffered saline).
  • the method for preparing the composition of the present invention may further include (e) adding the divalent or trivalent metal ion after step (d).
  • the method for preparing a composition of the present invention may further include (f) lyophilizing after step (e). At this time, in step (e) or (f), a lyophilization aid may be added to the product of step (e).
  • the lyophilization aid used in the present invention allows the lyophilized composition to maintain a cake shape, or lyophilizes compositions such as amphiphilic block copolymers and polylactic acid salts, and is uniform within a short period of time in the process of reconstitution. It is added to aid in melting, specifically, it may be one or more selected from the group consisting of lactose, mannitol, sorbitol, and sucrose.
  • the content of the lyophilization aid is 1 to 90% by weight, more specifically 4 to 20% by weight, based on the total dry weight of the lyophilized composition.
  • composition prepared according to one aspect of the present invention since doxorubicin maintains a state enclosed in the nanoparticle structure formed by the amphiphilic block copolymer and polylactic acid salt, it is safe and stable in blood or body fluids. This is improved.
  • the particle size of the nanoparticles in the composition is 10 to 300 nm, and more preferably 10 to 150 nm.
  • the composition according to the present invention can be administered through a route of administration such as blood vessels, muscles, subcutaneous, oral, bone, transdermal or topical tissues, and to be formulated into various oral or parenteral administration preparations suitable for this route of administration.
  • a route of administration such as blood vessels, muscles, subcutaneous, oral, bone, transdermal or topical tissues
  • various formulations such as tablets, capsules, powder formulations, liquid formulations, etc., and parenteral administration formulations, such as eye drops, injections
  • the composition is a formulation for injection, more preferably It may be a formulation for intravenous injection.
  • the composition according to the present invention is lyophilized, it may be reconstituted with distilled water for injection, 0.9% physiological saline, and 5% dextrose aqueous solution, etc., to prepare a formulation for injection.
  • An aspect of the present invention provides a method for treating cancer in a subject, comprising encapsulating doxorubicin inside the nanoparticle structure formed by the amphiphilic block copolymer and the polylactic acid salt to a subject in need thereof. do.
  • the nanocomposite composition of the present invention may be stirred at 20 to 24 hours at 150 to 250 rpm in an aqueous solution at 35 ° C to 38 ° C, pH 7.0 to 7.5, with an elution rate of 1% to 20%.
  • Doxorubicin-PNP was prepared according to the following method with the composition of Table 1 and Table 2 below:
  • mPEG-PLA monoomethoxypolyethylene glycol-polylactide block copolymer
  • the content and encapsulation rate of the nanoparticles were averaged by repeating three times for Example 6.
  • Example 6 also showed excellent results in the reconstruction rate and the encapsulation rate.
  • Example 6 Repeated three times for Example 6, the average particle diameter of the nanoparticles was obtained.
  • Example 6 has a preferred nanoparticle particle diameter of 50 nm or less.
  • Doxorubicin-PNP is an ICD inducer
  • vaccination assay was performed. Each concentration was determined by confirming IC 10 , IC 50 , and IC 90 in the in vitro cytotoxicity test.
  • CT26 cancer cells (murine colon carcinoma cells) were used as shown in Table 8 below, and for vaccination, the cancer cells were treated with the concentration of IC 90 of the test drug.
  • 5 x 10 5 living cancer cells were administered subcutaneously to the right, and tumor sizes of the left and right of the rat were measured. The end of the experiment was measured until the size of the tumor was 2000 mm 3 or 45 days after the start of the experiment.
  • Example 6 was used as Doxorubicin-PNP.
  • nano-cancer drug Doxorubicin-PNP was confirmed to increase ICD induction and increase Vaccination effect compared to simple API.
  • Doxorubicin-PNP showed more improved effects than the other anticancer drugs tested, paclitaxel and docetaxel.
  • CT26 murine colon carcinoma BALB / c model was used, and the experimental substance was administered to rats transplanted with cancer cells 7 days later.
  • Mitoxantrone and Doxorubicin were used as 5 mg / kg for the positive control.
  • nano-cancer drug was administered Doxorubicin-PNP 5 mg / kg.
  • tumors were extracted on the 2nd and 8th days, and the expression of immune cells in the tumor was confirmed by FACS and IHC. If anti-cancer immunity is increased by ICD, CD8 + T cells increase and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) decrease.
  • the nanoanticancer drug Doxorubicin-PNP showed a tendency to decrease CDSC + T cells equally or more and to reduce MDSC overall compared to simple AIP.

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Abstract

면역원성 세포사멸을 유도하기 위한 나노항암제 조성물 및 이의 사용이 개시된다.

Description

독소루비신을 유효성분으로 하는 조성물 및 그 제조 방법
본 발명은 독소루비신의 방출을 조절하기 위한 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 독소루비신의 항암 효과 및 면역원성 세포사멸 유도능이 향상된 나노항암제 조성물 및 이의 사용에 관한 것이다.
일부 항암제는 화학독성을 통해 암세포를 직접 사멸할 뿐 아니라, 암세포 사멸 후, 적응면역을 활성화하여 암세포에 대한 면역적 사멸 즉, 면역원성 세포사멸(Immunogenic cell death, ICD)을 일으키는 것으로 알려져 있다. ICD를 유도하는 것으로 알려진 항암제에 의해 사멸된 암세포는 Carleticulin(CRT), High mobility group box1(HMGB1), Adenosine triphosphate(ATP)와 같이 손상관련 분자패턴(Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs)을 세포막 외부로 노출시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 DAMP는 주변조직이나 세포에 위험을 알리는 경보와 같은 역할을 하고 수지상 세포와 같은 항원제시 세포에 의해 인식되어 암세포 특이적인 항종양 면역이 유도된다. 이와 같이 ICD를 유도하는 항암제로는 독소루비신(Doxorubicin), 이다루비신(Idarubicin), 미톡산트론(Mitoxantrone), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 사이클로스포스파미드(Cyclosphosphamide), 마포스파미드(Mafosfamide), 보르테조밉(Bortezomib)이 알려져 있다.
나노항암제는 종양 주변 신생혈관의 느슨한 조직(leaky blood vessel) 사이로 침투하여 종양조직 내부로 축적되는 Enhanced permeability and retention (EPR) 효과로 인해 종양에 축적될 수 있으므로, ICD 유도 항암제의 전달에 적합한 물질이다. 그러나, 나노항암제는 활성물질의 방출 및 안정성에 영향을 미칠 수 있으므로, 실제로 나노항암제가 활성물질의 자체의 기능을 능가하여 항암 효과를 발휘하거나 ICD를 유도할 수 있도록 개발하는 것은 여전히 과제로 남아 있다.
세계 항암제 시장은 면역항암제를 중심으로 급성장하고 있다. 항암제 시장에서 차지하는 면역항암제의 비율이 증가하는 가운데, 면역항암제/화학항암제 복합 요법이 각종 암에서 표준치료법으로 채택될 가능성이 높아졌다. 따라서, 면역항암제와 복합처방 시 항암효율 면에서 시너지를 일으킬 수 있는 항암제로서 면역활성에 기여하는 ICD를 유도하는 항암 제 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 유효성분으로서 독소루비신을 포함하는 나노복합체 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역항암제와 병용하여 암을 치료하기 위한 나노복합체 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노복합체 조성물을 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 유효성분으로서 독소루비신; 양친성 블록 공중합체; 및 폴리락트산염;을 포함하며, 상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 A 블록과 소수성 B 블록으로 구성되는 A-B 형 이중 블록 공중합체로서, 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 및 그 유도체로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 것이고, 상기 소수성 B 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르, 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것이고, 상기 독소루비신은 상기 양친성 블록 공중합체 및 상기 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는, 나노복합체 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염의 총합 대 독소루비신의 몰비는 8 내지 12 : 1이고, 상기 폴리락트산염 대 독소루비신의 몰비는 1 내지 6 : 1일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염의 총합 대 독소루비신의 몰비는 18 내지 22 : 1이고, 상기 폴리락트산염 대 독소루비신의 몰비는 1 내지 15 : 1일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, (a) 독소루비신을 수성 용매에 용해시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 용액에 폴리락트산염을 첨가하고 용해시키는 단계; (c) 상기 단계 (b)에서 얻어진 용액에 양친성 블록 공중합체를 첨가하고 용해시키는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 혼합물을 건조하는 단계를 포함하며, 상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 A 블록과 소수성 B 블록으로 구성되는 A-B 형 이중 블록 공중합체로서, 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 및 그 유도체로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 것이고, 상기 소수성 B 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르, 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것이고, 상기 독소루비신은 상기 양친성 블록 공중합체 및 상기 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는, 나노복합체 조성물의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 나노복합체 조성물을 포함하는, 암을 치료하기 위한 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 나노복합체 조성물을 포함하는, 면역항암제와 병용하여 암을 치료하기 위한 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 나노복합체 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 면역항암제와 병용하여 암을 치료하기 위한 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 또 다른 태양에 따르면, 상기 나노복합체 조성물과 면역항암제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 조성물이 제공된다.
본 발명에 따른 조성물은 면역원성 세포사멸을 유도하여 면역항암제와 병용 시 항암효능 면에서 시너지 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 수행된 Vaccination assay 실험의 종료 시점에서의 Tumor free mice 비율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 수행된 Immune cell recruitment assay에서 Doxorubicin-PNP 투여 시 CD8+ T cell 및 MDSC 변화를 나타낸 그래프이다.
본 명세서에서, '면역원성 세포사멸 또는 ICD 유도 항암제”는 항암제에 의해 암세포가 사멸하면서 CRT, HMGB1, ATP와 같은 손상관련 분자패턴(Damage-associated molecular pattern, DAMP)를 세포내부에서 방출하여 주변 조직이나 세포에 위험을 알리는 경보와 같은 역할을 하고, DAMP가 수지상 세포와 같은 항원제시 세포로 인식되어 암세포 특이적인 항종양 면역을 유도하는 약물을 가리킨다. ICD 유도 항암제의 예는 독소루비신(Doxorubicin), 이다루비신(Idarubicin), 미톡산트론(Mitoxantrone), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 사이클로스포스파미드(Cyclosphosphamide), 마포스파미드(Mafosfamide), 보르테조밉(Bortezomib), 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel)을 포함한다.
본 명세서에서, '나노항암제'는 고분자 미셀(Polymeric Micelles, PM)과 고분자 나노입자(Polymeric Nano Particles, PNP)를 포함하는 개념이다.
본 출원인은 수난용성 약물의 가용화를 위해 친수성 부분과 소수성 부분을 가지고 있는 블록 공중합체를 사용하는 제형을 개발한 바 있다. 고분자 미셀(Polymeric Micelles, PM)은 수 μg/mL의 용해도를 가진 난용성 약물의 용해도를 수 mg/mL로 증가시킬 수 있다. 이 블록 공중합체는 2 μg/mL이라는 낮은 임계 미셀 농도를 가지고 있으며 고분자 미셀은 평균 20 nm의 균일한 입자분포를 가진다. 여과멸균이 가능하므로 주사제 생산공정에 적합하며, 파클리탁셀(Paclitaxel)의 고분자 미셀인 Genexol-PM과 도세탁셀(Docetaxel)의 고분자 미셀인 Nanoxel M이 상업화되어 있다.
고분자 나노입자(Polymeric Nano Particles, PNP)는 소수성 부분과 친수성 부분을 가지고 있는 블록 공중합체에 수용성 폴리락트산(Poly Lactic acid, PLA)를 이용한다. 고분자 나노입자는 2가 양이온인 칼슘 이온을 첨가하여 이온성 가교결합(ionic crosslinking)을 통해 제조하므로, 고분자 미셀 보다 수상에서 더욱 안정한 고분자 나노입자이다. 고분자 나노입자는 수 μg/mL의 용해도를 가진 난용성 약물의 용해도를 수 mg/mL로 증가시킬 수 있다. 고분자 나노입자는 평균 20 nm로 균일한 입자분포를 가지며 여과멸균이 가능하여 주사제 생산공정에 적합하다. 안정한 나노입자인 고분자 나노입자는 약물의 혈중체류성을 증가시켜 EPR effect에 의해 우수한 종양축적효과를 나타낸다. 파클리탁셀-PNP(Paclitaxel-PNP), 도세탁셀-PNP(Docetaxel-PNP), 독소루비신-PNP(Doxorubicin-PNP) 등 다양한 약물에 고분자 나노입자 기술을 적용하여 제형화한 바 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
독소루비신
본 발명의 나노복합체 조성물에 사용되는 독소루비신은 암세포에 대한 면역적 사멸 즉, 면역원성 세포사멸(Immunogenic cell death, ICD)을 일으키는 약물로서, 최종적으로 제조되는 조성물의 유효성분이다.
일 구체예에서, 상기 독소루비신은, 최종 제조되는 전체 조성물의 건조 중량을 기준으로, 0.01 내지 10 중량%로 포함될 수 있고, 보다 구체적으로는 0.1 내지 5 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염의 총합 대 독소루비신의 몰비는 8 내지 12 : 1이고, 폴리락트산염 대 독소루비신의 몰비는 1 내지 6 : 1일 수 있다.
보다 구체적으로, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염의 총합 대 독소루비신의 몰비는 9 내지 11 : 1이고, 폴리락트산염 대 독소루비신의 몰비는 3 내지 6 : 1일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염의 총합 대 독소루비신의 몰비는 18 내지 22 : 1이고, 폴리락트산염 대 독소루비신의 몰비는 1 내지 15 : 1일 수 있다.
보다 구체적으로, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염의 총합 대 독소루비신의 몰비는 19 내지 21 : 1이고, 폴리락트산염 대 독소루비신의 몰비는 9 내지 15 : 1일 수 있다.
양친성 블록 공중합체
본 발명의 나노복합체 조성물에 사용되는 상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 A 블록과 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 이중 블록 공중합체로서, 이러한 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조 내부에 독소루비신이 봉입되어 있다.
상기 A-B 형 이중 블록 공중합체는, 수상에서 소수성 B 블록이 코어(내벽)를 형성하고 친수성 A 블록이 쉘(외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입으로, 고분자 전달체의 체내 분포를 조절하거나 상기 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다.
상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이다. 보다 구체적으로, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 친수성 A 블록은 수평균분자량이 200 내지 50,000달톤인 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 1,000 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다.
상기 소수성 B 블록은, 생체적합성 생분해성 고분자로서, 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이다. 보다 구체적으로, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 소수성 B 블록은 수평균분자량이 50 내지 50,000달톤, 보다 구체적으로는 200 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다. 또한, 일 실시예에서, 소수성 B 블록의 소수성을 증가시켜 나노입자의 안정성을 향상시키기 위하여, 상기 소수성 B 블록의 말단 히드록시기는 토코페롤, 콜레스테롤, 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식된 것일 수 있다.
상기 양친성 블록 공중합체에 있어서, 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)의 조성비는, 공중합체 중량을 기준으로, 친수성 블록(A)이 30 내지 80 중량%, 구체적으로는 40 내지 70 중량% 범위일 수 있다. 친수성 블록(A)의 비율이 30 중량% 미만이면 고분자의 물에 대한 용해도가 낮아서 나노입자를 형성하기 어렵기 때문에, 공중합체가 나노입자를 형성하기에 충분한 물에 대한 용해도를 갖기 위하여 친수성 블록(A)의 비율이 30 중량% 이상인 것이 좋은 한편, 80중량%를 초과하면 친수성이 너무 높아 고분자 나노입자의 안정성이 낮아져서 복합체의 가용화 조성물로 사용하기 어려우므로, 나노입자 안정성을 고려하여 친수성 블록(A)의 비율이 80 중량% 이하인 것이 좋다.
일 구체예에서, 상기 양친성 블록 공중합체는, 최종 제조되는 전체 조성물의 건조 중량을 기준으로, 1 내지 99.99 중량%로 포함될 수 있고, 보다 구체적으로는 5 내지 99 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
폴리락트산염
본 발명의 나노복합체 조성물에 사용되는 상기 폴리락트산염(예: PLA-COONa)은 나노입자의 코어(내벽)에 분포하여 코어의 소수성을 강화시켜 나노입자를 안정시킴과 동시에 체내에서 세망내피계(RES)를 효과적으로 회피하는 역할을 한다. 즉, 폴리락트산염의 카르복실산 음이온이 폴리락트산보다 효과적으로 바이러스와 결합하여 고분자 나노입자의 표면전위를 감소시켜 폴리락트산염을 포함하지 않는 고분자 나노입자에 비해 표면전위의 양성 전하가 감소하여 세망내피계에 의해 덜 포획되고, 이로 인하여 목적하는 부위(예컨대, 암세포, 염증세포 등)로의 전달 효율이 우수하다는 장점이 있다.
본 발명의 나노복합체는 독소루비신의 방출을 제어하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에 따른 나노복합체는 24 시간을 기준으로 20 % 이하(예를 들어, 0% 초과 및 20 % 이하), 바람직하게는 15 % 이하, 보다 바람직하게는 7 % 이하의 방출 속도를 갖는 것일 수 있다. 방출 속도는 통상적으로 잘 알려진 방법을 이용하여 측정할 수 있고, 예를 들어 35 내지 38 ℃, pH 6.5 내지 8.0의 PBS 용액에서 150 내지 350 rpm으로 진탕 교반하여 24 시간 후에 측정할 수 있다.
상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 나노입자 내벽 성분으로 포함되는 폴리락트산염은 수평균분자량이 500 내지 50,000달톤, 구체적으로 1,000 내지 10,000달톤인 것이 좋다. 분자량이 500달톤 미만이면 소수성이 너무 낮아 나노입자의 코어(내벽)에 존재하기 어렵고, 분자량이 50,000달톤을 초과하면 고분자 나노입자의 입자가 커지는 문제가 있다.
상기 폴리락트산염은 양친성 블록 공중합체 100 중량부에 대하여 1 내지 500중량부, 구체적으로 20 내지 400중량부, 더 구체적으로 40 내지 300중량부로 사용될 수 있다. 폴리락트산염의 함량이 양친성 블록 공중합체 100 중량부 대비 500 중량부를 초과하면 나노입자의 크기가 증가하여, 멸균막을 사용한 여과가 어렵게 되고, 1중량부 미만이면 목적하는 효과를 충분히 얻을 수 없다.
일 구체예에서, 상기 폴리락트산염의 말단 중 카르복실산-금속(예: 나트륨)의 반대편의 말단은, 히드록시, 아세톡시, 벤조일옥시, 데카노일옥시, 팔미토일옥시 및 탄소수 1 내지 2개의 알콕시로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나로 치환될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리락트산염은 하기 화학식 1 내지 6의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
[화학식 1]
RO-CHZ-[A]n-[B]m-COOM
상기 식 1에서, A는 -COO-CHZ-이고; B는 -COO-CHY-, -COOCH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -COO-CH2CH2OCH2-이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸, 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자, 또는 메틸 또는 페닐기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; n은 1 내지 30의 정수이며; m은 0 내지 20의 정수이다.
[화학식 2]
RO-CHZ-[COO-CHX]p-[COO-CHY']q-COO-CHZ-COOM
상기 식 2에서, X는 메틸기이고; Y'는 수소원자 또는 페닐기이며; p는 0 내지 25의 정수이고, q는 0 내지 25의 정수이되, 단 p+q는 5 내지 25의 정수이고; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; Z 는 수소 원자, 메틸 또는 페닐기이다.
[화학식 3]
RO-PAD-COO-W-M'
상기 식 3에서, W-M'는
Figure PCTKR2019012501-appb-I000001
또는
Figure PCTKR2019012501-appb-I000002
이고; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이고; M은 독립적으로 Na, K, 또는 Li이다.
[화학식 4]
S-O-PAD-COO-Q
상기 식 4에서, S는
Figure PCTKR2019012501-appb-I000003
이고; L은 -NR1- 또는 -O-이며, 여기서 R1은 수소원자 또는 C1-10 알킬이고; Q는 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH2CH2CH2CH3, 또는 -CH2C6H5이고; a는 0 내지 4의 정수이며; b는 1 내지 10의 정수이고; M은 Na, K, 또는 Li이며; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2019012501-appb-I000004
또는
Figure PCTKR2019012501-appb-I000005
상기 식 5에서, R'는 -PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM이고, 여기서 PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이고, M은 Na, K, 또는 Li이며; a는 1 내지 4의 정수이다.
[화학식 6]
YO-[-C(O)-(CHX)a-O-]m-C(O)-R-C(O)-[-O-(CHX')b-C(O)-]n-OZ
상기 식 6에서, X 및 X'은 독립적으로 수소, 탄소수가 1~10인 알킬 또는 탄소수가 6~20인 아릴이고; Y 및 Z는 독립적으로 Na, K, 또는 Li이며; m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이되, 5 < m + n < 100이고; a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며; R은 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
일 구체예에서, 상기 폴리락트산염은 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물일 수 있다.
2가 또는 3가 금속이온
본 발명의 나노복합체 조성물은 2가 또는 3가 금속이온을 더 포함할 수 있다.
상기 2가 또는 3가의 금속이온은, 바람직하게는 칼슘(Ca2 +), 마그네슘(Mg2 +), 바륨(Ba2+), 크롬(Cr3 +), 철(Fe3 +), 망간(Mn2 +), 니켈(Ni2 +), 구리(Cu2 +), 아연(Zn2 +) 또는 알루미늄(Al3 +) 등에서 선택될 수 있다.
상기 금속이온은 황산염, 염산염, 탄산염, 인산염 및 수산화물의 형태로 고분자 나노입자 조성물에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 염화칼슘(CaCl2), 염화마그네슘(MgCl2), 염화아연(ZnCl2), 염화알루미늄(AlCl3), 염화철(FeCl3), 탄산칼슘(CaCO3), 탄산마그네슘(MgCO3), 인산칼슘(Ca3(PO4)2), 인산마그네슘(Mg3(PO4)2), 인산알루미늄(AlPO4), 황산마그네슘(MgSO4), 수산화칼슘(Ca(OH)2),　수산화마그네슘(Mg(OH)2), 수산화알루미늄(Al(OH)3), 수산화아연(Zn(OH)2) 또는 이들의 혼합물이 첨가될 수 있다.
상기 2가 또는 3가의 금속이온은 당량을 조절하여 고분자 나노입자 내부에 봉입되어 있는 약물의 방출 속도를 조절할 수 있다. 구체적으로, 2가 또는 3가의 금속이온이 폴리락트산염의 카르복시기의 당량에 대하여 고분자 나노입자 조성물에 1 당량 이하 포함되면, 폴리락트산염의 카르복시 말단기와 결합되는 수가 적어 약물의 방출 속도가 증가하게 되며, 1 당량 이상 포함되면, 폴리락트산염의 카르복시 말단기와 결합되는 수가 많아 약물의 방출 속도가 지연된다. 이에, 혈액 내 약물의 방출속도를 증가시키기 위해 적은 당량의 금속이온을 사용하며, 약물의 방출 속도를 지연시키기 위해서는 많은 당량의 금속이온을 사용할 수 있다.
또한, 2가 또는 3가 금속이온은 상기 폴리락트산염의 카르복시 말단기의 당량에 대하여 0.01∼10 당량, 0.1~5 당량, 0.2~2 당량으로 포함될 수 있다.
면역항암제
본 발명의 나노복합체 조성물은 암을 치료하기 위해 사용될 수 있으며, 보다 구체적으로는, 면역항암제와 병용하여 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 나노복합체 조성물과 병용 가능한 면역항암제는 항-PD-1 약물일 수 있으며, 상기 항-PD-1 약물은, 예컨대, 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 더발루맙(Durvalumab), 세미플리맙(Cemiplimab) 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있다.
조성물 제조 방법
본 발명의 나노복합체 조성물은, (a) 독소루비신을 수성 용매에 용해시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 용액에 폴리락트산염을 첨가하고 용해시키는 단계; (c) 상기 단계 (b)에서 얻어진 용액에 양친성 블록 공중합체를 첨가하고 용해시키는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 혼합물을 건조하는 단계;를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다.
상기 수성 용매는 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올 등) 수용액, 증류수, 주사용수, 또는 완충액일 수 있고, 바람직한 완충액은 인산완충액(Phosphate buffered saline)일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물 제조방법은, (e) 상기 단계 (d) 이후에, 2가 또는 3가 금속이온을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물 제조방법은, (f) 상기 단계 (e) 이후에, 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 때, 상기 단계 (e) 또는 (f)에서, 동결건조 보조제가 단계 (e)의 결과물에 첨가될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 동결건조 보조제는 동결건조된 조성물이 케이크 형태를 유지할 수 있도록 하거나, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염 등의 조성물들을 동결건조 후, 재건(reconstitution)하는 과정에서 빠른 시간 내에 균일하게 녹는 것을 도와주기 위해 첨가하는 것으로, 구체적으로, 락토스, 만니톨, 솔비톨 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 동결건조 보조제의 함량은, 동결건조 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 1 내지 90 중량%, 더 구체적으로는 4 내지 20 중량% 이다.
또한, 본 발명의 일 양태에 따라 제조된 조성물에서는 독소루비신이 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조체 내에 봉입된 상태를 유지하기 때문에, 혈중 또는 체액 내에서의 안전성 및 안정성이 향상된다.
바람직한 일 양태에서, 상기 조성물 중 나노입자의 입자 크기는, 10 내지 300 nm이며, 더욱 구체적으로는 10 내지 150 nm인 것이 좋다.
본 발명에 따른 조성물은, 혈관, 근육, 피하, 경구, 뼈, 경피 또는 국소 조직 등의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있고, 이러한 투여 경로에 적합하게, 다양한 경구 또는 비경구 투여 제제로 제형화될 수 있다. 상기 경구 투여 제제로는 정제, 캡슐, 분체 제제, 액제 등, 비경구 투여 제제로는 점안제, 주사제 등 다양한 제제를 예시할 수 있는데, 바람직한 일 양태로서, 상기 조성물은 주사용 제제, 보다 바람직하게는 정맥 주사용 제제일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물을 동결건조하는 경우, 이를 주사용 증류수, 0.9% 생리식염수 및 5% 덱스트로스 수용액 등으로 재건하여 주사용 제제 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 일 양태는, 독소루비신을 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 형성하는 나노입자 구조체 내부에 봉입하여 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명의 나노복합체 조성물은 35 ℃ 내지 38 ℃, pH 7.0 내지 7.5인 수용액에서, 150 내지 250 rpm으로 20 내지 24 시간 진탕 교반하여 용출률이 1% 내지 20 %일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
1. 나노항암제의 제조 및 평가
1.1. Doxorubicin-PNP의 제조
Doxorubicin-PNP는 하기의 표 1 및 표 2의 조성으로 하기 방법에 따라 제조하였다:
[표 1]
Figure PCTKR2019012501-appb-I000006
[표 2]
Figure PCTKR2019012501-appb-I000007
(1) 둥근 플라스크에 독소루비신 염산염(Doxorubicin·HCl)을 에탄올 수용액(에탄올:물=9:1, v/v)을 넣고 용해시킨 후, 폴리락트산염으로서 폴리락트산 나트륨염(PLA-COONa)를 넣고 50℃에서 30분간 완전히 용해시켰다.
(2) 상기 (1)의 결과물에 양친성 블록 공중합체로서 mPEG-PLA(모노메톡시폴리에틸렌클리콜-폴리락타이드 블록 공중합체)를 넣고 모두 용해시켰다.
(3) 상기 (2)의 결과물을 50℃에서 Aspirator로 1차 건조한 뒤, 진공펌프로 2차 건조하였다.
(4) 상기 (3)의 건조 결과물을 둥근 플라스크에 넣고, 생리식염수를 가하여 용해시켰다.
(5) 상기 (4)의 결과물에 CaCl2·2H2O와 만니톨(Mannitol)을 가한 후, 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하였다.
(6) 상기 (5)의 결과물을, 독소루비신으로 10mg에 해당하는 양으로 유리 바이알에 넣고 동결건조하여, 독소루비신-고분자 나노입자(Doxorubicin-PNP)를 수득하였다.
1.2. Doxorubicin-PNP의 평가
1.2.1. Doxorubicin-PNP의 방출시험
1) 시험방법
① 각 실시예를 1 mg/mL의 농도로 생리식염수로 재건
② 37℃ water bath에 pH 7.4 PBS 18 mL을 넣어 두고 각 샘플을 2 mL씩 투입(0.2mg/mL)
③ 37℃ water bath 에서 200rpm으로 진탕 교반한 뒤 24 시간 후에 membrane NMWL 30kDa centrifugal filter에 500uL를 취하여 14000rpm에서 15분간 여과
④ HPLC 함량 분석법으로 분석.
2) Doxorubicin-PNP의 함량 분석
- 표준액 제조
① 10mg의 독소루비신을 정밀하게 칭량하여 10mL volumetric flask에 넣고 주사용수로 표선(1 mg/mL)에 맞춤
② 상기 액을 주사용수로 희석하여 농도별로 표준액 제조
- HPLC 분석조건
① 컬럼: Kromasil 100-10, C18, 4.6 x 250 mm
② 유속: 0.8 mL/min
③ 이동상: 0.01M sodium acetate: Acetic acid: MeOH=50:2.1:50
④ 주입량: 50μL
⑤ 파장 및 컬럼온도: 480nm
⑥ 컬럼온도: 25℃
- 검액 제조 및 분석방법
① 각 실시예에 주사용수를 넣어 완전히 녹여 1 mg/mL로 제조
② 상기 액 1 mL를 취하여 20 mL의 volumetric flask에 넣고 주사용수로 표선하여 50 ㎍/mL의 농도로 제조
③ 상기 액 50㎕를 HPLC 함량 분석법으로 분석
1.2.2. Doxorubicin-PNP의 봉입률
- 검액 제조 및 분석방법
① 각 실시예에 주사용수를 넣어 완전히 녹여 1 mg/mL로 제조
② 상기 액 500㎕를 취하여 100 kDa centrifugal filter로 여과
③ 상기 액 50㎕를 HPLC 함량 분석법으로 분석
1.2.3. Doxorubicin-PNP의 입자경
- 검액 제조 및 분석방법
① 각 실시예에 주사용수를 넣어 완전히 녹여 1 mg/mL로 제조
② 상기 액 1 mL를 취하여 DLS로 입자경 분석
1.3. 실험결과
1) Doxorubicin-PNP의 방출시험
[표 3]
Figure PCTKR2019012501-appb-I000008
[표 4]
Figure PCTKR2019012501-appb-I000009
상기 표 3 및 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 특히 실시예 1, 5, 및 6이 성공적으로 재건되고 방출 속도를 제어할 수 있음을 알 수 있다.
2) Doxorubicin-PNP의 함량 및 봉입률
나노입자의 함량 및 봉입률은 실시예 6에 대해 3회 반복하여 그 평균을 구하였다.
[표 5]
Figure PCTKR2019012501-appb-I000010
[표 6]
Figure PCTKR2019012501-appb-I000011
표 5 및 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 6은 재건율과 봉입률에서도 우수한 결과를 보였다.
3) Doxorubicin-PNP의 입자경
실시예 6에 대해 3회 반복하여 나노입자의 입자경 평균을 구하였다.
[표 7]
Figure PCTKR2019012501-appb-I000012
표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 6은 50 nm 이하의 바람직한 나노입자 입자경을 가진다.
2. In vivo vaccination assay
2.1. 실험목적
Doxorubicin-PNP가 ICD 유도제인지 확인하고자 vaccination assay를 수행하였다. 각 농도는 In vitro cytotoxicity Test에서 IC10, IC50, IC90을 확인하여 결정된 농도를 사용하였다.
2.2. 실험방법
본 실험에서는 아래 표 8과 같이 CT26 암세포(murine colon carcinoma cells)를 사용하였으며 vaccination을 위해 암세포에 실험약물의 IC90의 농도로 처리하였다. 이와 같이 죽어가고 있는 암세포 3 x 106개를 Female BALB/c mice (8w, n=10/군)의 왼쪽 피하에 투여하였다. 1 주일 후 살아있는 암세포 5 x 105개를 오른쪽 피하에 투여하였고, 쥐의 왼쪽, 오른쪽의 종양 사이즈를 측정하였다. 실험의 종료는 종양의 사이즈가 2000mm3 될 때까지 또는 실험시작 후 45일까지 측정하였다. Doxorubicin-PNP로는 실시예 6을 사용하였다.
[표 8]
Figure PCTKR2019012501-appb-I000013
검증하고자 하는 Doxorubicin-PNP가 ICD 유도능이 있다면 2차로 이식한 세포는 성장하지 못할 것이다. Vaccination assay 결과는 각 군당 암세포가 자라지 않은 쥐의 마리 수를 백분율(Tumor free mice Proportion(%))로 나타내었다.
2.3. 실험결과
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 나노항암제인 Doxorubicin-PNP는 단순 API에 비해 ICD 유도 증가 및 Vaccination 효과 증가가 확인되었다. 특히, Doxorubicin-PNP는 실험된 다른 항암제인 paclitaxel 및 docetaxel 보다 더 개선된 효과를 보였다.
3. Immune cell recruitment assay
3.1. 실험목적
본 실험에서는 ICD 유도에 의해 발현 및 감소된 면역세포를 확인하고 면역세포에 의한 싸이토카인의 분비를 확인하고자 하였다.
3.2. 실험방법
본 실험에서는 CT26 murine colon carcinoma BALB/c model을 사용하였으며 암세포를 이식한 쥐에 7일 뒤 실험물질을 투여하였다. 실험 물질 중 양성대조군은 Mitoxantrone, Doxorubicin을 5 mg/kg 사용하였다. 그리고 나노항암제는 Doxorubicin-PNP 5 mg/kg를 투여하였다. 실험물질을 투여한 뒤 2일과 8일에 종양을 적출하여 종양에서의 면역세포의 발현을 FACS와 IHC로 확인하였다. ICD에 의해 항암면역작용이 증가되었다면 CD8+ T cell은 증가하고 골수유래 면역억제세포(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)는 감소한다.
3.3 실험결과
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 나노항암제인 Doxorubicin-PNP가 단순 AIP에 비해 전반적으로 CD8+ T cell이 동등 이상 발현되고 MDSC 또한 감소하는 경향을 보였다.

Claims (9)

  1. 유효성분으로서 독소루비신;
    양친성 블록 공중합체; 및
    폴리락트산염;을 포함하며,
    상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 A 블록과 소수성 B 블록으로 구성되는 A-B 형 이중 블록 공중합체로서, 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 및 그 유도체로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 것이고, 상기 소수성 B 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르, 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것이고,
    상기 독소루비신은 상기 양친성 블록 공중합체 및 상기 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는,
    나노복합체 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염의 총합 대 독소루비신의 몰비는 8 내지 12 : 1이고, 상기 폴리락트산염 대 독소루비신의 몰비는 1 내지 6 : 1인, 나노복합체 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염의 총합 대 독소루비신의 몰비는 18 내지 22 : 1이고, 상기 폴리락트산염 대 독소루비신의 몰비는 1 내지 15 : 1인, 나노복합체 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 2가 또는 3가 금속이온을 더 포함하는, 나노복합체 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 암을 치료하기 위해 사용되는 것인, 나노복합체 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 면역항암제와 병용하여 암을 치료하기 위해 사용되는 것인, 나노복합체 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 면역항암제가 항-PD-1 약물인, 나노복합체 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항-PD-1 약물이 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 더발루맙(Durvalumab), 세미플리맙(Cemiplimab) 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 나노복합체 조성물.
  9. (a) 독소루비신을 수성 용매에 용해시키는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻어진 용액에 폴리락트산염을 첨가하고 용해시키는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 얻어진 용액에 양친성 블록 공중합체를 첨가하고 용해시키는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 혼합물을 건조하는 단계를 포함하며,
    상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 A 블록과 소수성 B 블록으로 구성되는 A-B 형 이중 블록 공중합체로서, 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 및 그 유도체로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 것이고, 상기 소수성 B 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르, 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것이고,
    상기 독소루비신은 상기 양친성 블록 공중합체 및 상기 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는,
    나노복합체 조성물의 제조 방법.
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