KR20180008353A - 신규 나노케이지 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 재조합 나노케이지 및 그의 용도에 관한 것으로서, 탐식작용 촉진 단백질 및 자기조립 형성 단백질을 포함하는 융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 나노케이지 및 상기 나노케이지 내부에 적재된 면역원성 세포사멸 유도제를 포함하는 복합 나노케이지를 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것이다.

Description

신규 나노케이지 및 그의 용도{A novel nanocage and use thereof}
본 발명은 신규 재조합 나노케이지 및 그의 용도에 관한 것이다.
암을 치료하기 위한 방법으로는 수술을 통한 치료, 방사선 치료 그리고 항암제 투여를 통한 치료 등이 있으나 이러한 치료방법들은 부작용이 수반되거나, 암의 진행 정도에 따라 시술이 제한적으로 적용된다. 특히, 항암제는 거듭된 연구결과 양적인 측면에서는 그 종류가 늘었지만, 질적인 측면에서는 큰 변화가 없었다. 그 이유는 항암제 대부분이 분열이 왕성한 세포의 세포주기를 멈추게 하고 사멸케 하는 메커니즘으로 작동하기 때문이며, 이로 인해 암세포 이외에도 정상적으로 분열하는 세포를 공격해서 항암제의 대표적 부작용인 탈모, 식욕부진 그리고 백혈구 감소로 인한 면역력 저하 등이 일어난다. 대표적인 항암제인 독소루비신은 안트라사이클린계 항종양제로 불리는 계열에 속하는 항암제로, 안트라사이클린계 항암제는 세포 주기 선택적으로 작용하는 항암제로 세포 분열을 저해하며, 악성 림프종(림프육종, 호지킨병 및 비호지킨병), 소화기암(위암, 간암, 직장암, 담낭 및 담관암, 결장암, 췌장암), 급성 골수성 백혈병, 연조직 골육종, 유방암, 난소암, 폐암, 기관지암, 방광암, 윌름종양 등 다양한 암 치료에 사용된다. 최근 연구결과에 따르면 안트라사이클린계 항암제는 칼레티귤린(caleticulin)의 세포막으로의 세포사멸전 이동(preapoptotic translocation)을 유도하여 암세포의 면역원성 세포사멸을 유도하는 것으로 보고된 바 있다(Obeid et al., Nat. Med., 13(1): 54-61, 2007). 한편, 상기와 같은 면역기능 강화를 통한 암치료 전략은 최근 들어 주목을 받고 있는데, 면역 세포와 암의 상관관계 연구는 전 세계적으로 1970년대부터 시작되어 암과 싸울 수 있는 생체의 무기인 면역 세포들의 기능들이 매우 중요시 되어 지면서 2000년 이후로 기하급수적으로 연구 보고되고, 항암 면역 치료 항체인 Keytruda(Pembrolizumab, Merck사 개발)가 2014년 9월 미국 FDA를 통해 신속 승인(Accelerated approval)을 받는 등 항암 면역 치료 연구에 대한 중요성이 대두되고 있다. 특히 면역 세포들은 암세포에 대하여 순찰하고 찾아다니며 움직이기 때문에 그 효과가 국소에 그치지 않고 전신의 암 발병을 감시, 억제하는 작용을 해줄 뿐 아니라, 다양한 암세포에 적용 가능하다. 따라서, 기존의 암세포 괴사에 집중하는 기존 접근 방식에서 벗어나, 인체 내 면역세포의 역동적인 네트워킹을 조절함으로써 암미세환경을 극복하는 암 예방 및 치료 전략의 새로운 패러다임 제시가 필요한 상태이다.
본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 면역원성 세포사멸(immunogenic cell death) 유도 및 면역세포 네트워킹 제어를 통한 암 면역치료 효율을 극대화할 수 있는 면역 치료제 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 탐식작용 촉진 단백질 및 자기조립 형성 단백질을 포함하는 융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 나노케이지 또는 상기 나노케이지 내부에 면역원성 세포사멸 유도제가 봉입된 복합 나노케이지를 유효성분으로 함유하는 항암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 탐식작용 촉진 단백질 및 자기조립 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질 및 면역 검문소를 표적으로 하는 단일쇄 기반 항체 유사체 및 상기 자기조립 형성 단백질을 포함하는 제2융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 하이브리드 나노케이지 또는 상기 하이브리드 나노케이지 내부에 봉입된 면역원성 세포사멸 유도제를 포함하는 복합 하이브리드 나노케이지를 유효성분으로 포함하는, 항암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 페리틴 중쇄 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 SIRPα(signal-regulatory protein alpha) 또는 SIRPγ가 연결된 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질이 자기조립되어 생성되는 단백질 나노케이지가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단백질 나노케이지 내부에 면역원성 세포사멸 유도제가 봉입된 항암 복합 단백질 나노케이지가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단백질 나노케이지 또는 상기 항암 복합 단백질 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 항암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 안트라사이클린 계열을 포함한 면역원성 세포사멸 유도 항암제의 항암활성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 암세포에 대한 면역원성 세포 사멸을 유도하여 암 항원에 특이적인 종양 면역을 촉진시키고, 암 미세환경내에서 대식세포 및 T세포의 면역작용을 극대화시킴으로써 기존의 전통적인 암치료법들이 가지고 있는 부작용과 약물 저항성, 암 재발, 암 전이 등의 문제점들을 효과적으로 극복할 수 있으며 치료가 끝난 후에도, 면역세포에 의한 항암효과가 지속될 수 있으므로 새로운 항암치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리틴 중쇄 단백질 및 SIRPα로 구성된 융합단백질의 자기조립에 의해 생성되는 나노케이지의 내부에 독소루비신이 적재된 항암 복합 나노케이지의 개략적인 모습을 도시한 개요도이고, 도 1b는 상기 융합단백질 및 페리틴 중쇄 단백질에 면역 검문소 억제제인 PD-1/PD-L1을 타겟으로 하는 단일쇄 기반의 항체를 결합한 융합단백질을 포함하는 항암 복합 하이브리드 나노케이지의 개략적인 모습을 도시한 개요도이며, 도 1c는 FH-SIRPα를 발현을 위해 사용된 플라스미드 벡터의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 항암 복합 나노케이지의 작용기전을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리틴 중쇄 단백질-SIRPα 융합단백질의 발현 및 정제를 나타내는 SDS-PAGE 및 웨스턴블랏 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 3b는 상기 융합단백질의 자기조립에 의해 생성된 나노케이지와 페리틴 중쇄 단백질만으로 생성된 나노케이지의 입도 분석결과를 나타내는 그래프이며, 도 3c는 상기 융합단백질의 자기조립에 의해 생성된 나노 케이지를 투과 전자현미경으로 촬영한 전자현미경 사진이고, 도 3d는 상기 융합단백질의 자기조립에 의해 생성된 나노케이지와 페리틴 중쇄 단백질만으로 생성된 나노케이지를 FPLC 분석으로 비교한 크로마토그램이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노케이지(FH-SIRPα)에 독소루비신(dox)을 봉입하는 과정을 개략적으로 나타낸 개요도이고, 도 4b는 독소루비신이 적재된 나노케이지(FH-SIRPα)의 FPLC 분석결과를 나타내는 크로마토그램이며, 도 4c는 입도분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 4d는 독소루비신 봉입 나노케이지(FH-SIRPα-Dox)에 대한 투과 전자현미경 촬영 사진(D)이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 나노케이지의 CD47 결합능을 사용한 실험결과를 나타내는 것으로서, 도 5a는 본 발명의 실시예 1-1에서 제조된 FH-SIRPα HV 나노케이지가 다양한 암세포(CT26 마우스 대장암 세포 및 HT29 인간 대장암 세포)와 결합하는지 여부를 확인하기 위한 형광현미경 촬영 사진으로, 상단은 CT26 마우스 대장암 세포와 결합 여부를 관찰한 것이고, 하단은 HT29 인간 대장암 세포와의 결합 여부를 관찰한 것이며, 도 5b는 본 발명의 실시예 1-1 내지 1-5에서 제조된 다양한 페리틴 중쇄 나노케이지의 HT29 인간 대장암 세포에 대한 부착능을 유세포분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 페리틴 중쇄 단백질-SIRPα융합단백질의 자기조립에 의해 생성된 나노케이지에 의한 대식세포의 암세포에 대한 탐식작용(phagocytosis)을 관찰한 결과를 나타낸 것으로서, 도 6a는 골수 유래 대식세포(BMDM)을 Raji 세포, HT29 세포, 4T1 세포, CT26 세포 및 CT26.CL25 세포와 함께 배양하면서 각각 음성대조군으로서 완충액(Buffer), 야생형 페리틴 중쇄 단백질(wtFH), 재조합 SIRPα(mSIRPα), 및 본 발명의 일실시예에 따른 나노케이지(FH-SIRPα HV)를 처리한 후 상기 BMDM에 의한 식세포율을 나타내는 유세포 분석결과를 나타내는 그래프이고, 도 6b는 골수 유래 수지상세포(BMDC)를 Raji 세포, HT29 세포, 4T1 세포, CT26 세포 및 CT26.CL25 세포와 함께 배양하면서 각각 음성대조군으로서 완충액(Buffer), 야생형 페리틴 중쇄 단백질(wtFH), 재조합 SIRPα(mSIRPα), 및 본 발명의 일실시예에 따른 나노케이지(FH-SIRPα HV)를 처리한 후 상기 BMDC에 의한 식세포율을 나타내는 유세포 분석결과를 나타내는 그래프이며, 도 6c는 BMDM에 의한 HT29 세포에 대한 탐식작용을 보여주는 일련의 형광현미경 사진이고, 도 6d는 본 발명의 실시예 1-2 내지 1-5에서 제조된 다양한 페리틴 중쇄 나노케이지의 처리에 의한 골수유래 대식세포의 CT26.CL25 마우스 대장암 세포에 대한 탐식율을 나타낸 그래프이고, 도 6e는 상기 도 6c에서 현미경 관찰로 계수한 BMDM 세포당 탐식된 HT29 세포의 수의 비율을 백분율로 나타낸 탐식 지수(Phagocytosis index, PI)를 나타낸 그래프이며 도 6f는 식균작용을 위해 C57BL/6 마우스로부터 골수 유래 수지상세포(BMDC)의 분화를 나타내는 히스토그램 그래프이고, 도 6g는 B16.OVA 세포에 buffer control, FH-SIRPα, wtFH, 및 mSIRPα을 처리한 후 식균작용을 관찰한 팩스 플랏(FACS plots) 그래프이며, 도 6h는 골수 유래 수지상세포(BMDC)에 의해 B16.OVA 세포의 식균작용을 분석한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 페리틴 중쇄 단백질-SIRPα 융합단백질의 자기조립에 의해 생성된 나노케이지(FH-SIRPα HV) 및 상기 나노케이지에 독소루비신이 적재된 복합 나노케이지(DOX in FH-SIRPα HV)의 동물실험 결과를 나타내는 결과로서, 도 7a는 종양 이식 및 본 발명의 실시예 1-1 내지 1-5에서 제조된 페리틴 중쇄 나노케이지 치료제 투여 스케쥴을 나타내고, 도 7b는 종양 이식후 본 발명의 실시예 1-1 내지 1-3 및 1-5에서 제조된 나노케이지(FH-mSIRPα WT, FH-SIRPα HV, FH-SIRPγ WT 및 FH-SIRPγ V2)를 투여한 실험동물의 시간의 경과에 따른 종양 크기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 7c는 상기 실험동물의 희생 후 적출된 종양조직의 중량을 측정한 그래프이고, 도 7d는 종양 이식 및 본 발명의 실시예 3에서 제조된 독소루비신 봉합 페리틴 중쇄 나노케이지(FH-SIRPα HV-Dox) 치료제의 투여 스케쥴을 나타내며, 도 7e는 상기 도 7d의 스케쥴대로 종양 이식후 완충액(Buffer), 독소루비신(dox), 독소루비신이 적재된 야생형 페리틴 중쇄(wtFH-dox), 재조합 SIRPα 및 독소루비신의 병용투여(mSIRPα + dox) 및 본 발명의 실시예 3에서 제조된 독소루비신 봉입 복합 나노케이지(FH-SIRPα HV-dox)를 각각 투여한 실험동물의 시간 경과에 따른 종양 크기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 7f는 상기 도 7e의 실험동물 중 완충액(Buffer) 또는 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신 봉입 복합 나노케이지(FH-SIRPα HV-dox) 투여 실험동물에서 약물 투여일(좌측 판넬) 및 종양이식일(우측 판넬)로부터 25일 경과 후 종양 주입 부위를 촬영한 일련의 사진이며, 도 7g는 상기 도 7e의 실험동물을 종양 형성 후 25일 째에 희생시킨 후 종양을 적출하여 무게를 분석한 그래프이다.
도 8은 실험동물에 종양이식 후 완충액 또는 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신이 봉입된 복합 나노케이지 투여 후 종양 부위에서의 CD8+/CD4+ T 세포의 축적 정도를 비교한 결과를 나타내는 면역조직화학분석 결과로서, 도 8a는 CD8+ T 세포를 특이적으로 염색한 일련의 형광현미경 사진이고, 도 8b는 CD4+ T 세포를 특이적으로 염색한 결과이며, 도 8C는 비장세포에서 암 항원 특이적 INF-γ 분비 효과기 세포에 다양한 작용 펩타이드 처리시 INF-γ의 발현정도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 8d는 B16.OVA 종양 형성 C57BL/6 마우스에 각각 완충액(Buffer), 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신 봉입 복합 나노케이지(FH-SIRPα HV-dox), 독소루비신이 봉입된 야생형 페리틴 나노케이지(DOX in FH), 독소루비신 및 재조합 SIRPα 병용 처리(DOX + mSIRPα), 독소루비신(DOX), 본 발명의 일 실시예에 따른 SIRPα 표면 제시 단백질 나노케이지(FH-SIRPα HV), 야생형 페리틴 나노케이지(FH) 및 재조합 SIRPα(mSripα)를 처리하여 FH-SIRPα HV-dox의 체내 CD8+ T 세포의 프라이밍 능력(priming ability)을 분석한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 항암 나노케이지의 기억효과를 확인하기 위한 실험결과로서, 도 9a는 상기 실험동물의 원발성 종양 조직을 수술로 떼어내어 다른 쪽 등에 이식하여 2차 암을 심은 후 해당 부위에 암이 자라지 않은 동물(tumor-free mice)의 비율을 기록한 그래프이고, 도 9b는 상기 실험동물의 80일까지의 생존율을 기록한 그래프이며, 도 9c는 대조군으로 완충액(Buffer, 좌측 판넬) 및 본 발명의 독소루비신 적재 복합 나노케이지(FH-SIRPα HV-dox, 우측 판넬)를 투여한 동물의 2차 종양의 성장상태를 촬영한 사진이다.
도 10은 종양 미세환경에 대한 FH-SIRPα-dox의 전달 효율을 관찰한 것으로 도 10a는 종양 마우스 모델에 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신 봉입 복합 나노케이지(FH-SIRPα HV-dox), 독소루비신 봉입 페리틴 나노케이지(wtFH-dox) 및 재조합 SIRPα 및 독소루비신의 조합(mSIRPα + dox)을 각각 투여한 후 시간의 경과에 따른 근적외선 형광을 관찰한 사진이고, 도 10b는 상기 도 10a의 동물에 대하여 시간에 따른 종양 영역의 형광 강도를 분석한 그래프이며, 도 10c는 상기 도 10a의 실험동물로부터 적출된 주요 기관 및 적출된 종양조직의 근적외선 형광을 촬영한 근적외선 형광 이미지이고, 도 10d는 상기 도 10a의 실험동물에서 각 약물 주입 후 24시간 경과시점에서 종양의 형광 강도를 분석한 그래프이다.
용어의 정의
본 문서에서 사용되는 "면역원성 세포사멸(immunogenic cell death)"는 안트라사이클린(anthracyclines), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 보르테조밉(bortezomib)과 같은 세포증식 억제제나 방사선 요법 및 광역학 치료법에 의해 야기되는 일종의 세포사멸을 의미한다. 상기 면역원성 세포사멸은 일반적인 세포사멸과 달리, 암세포의 면역학적 세포사멸은 수지상세포(dendritic cell)의 활성화와 그에 따른 특이적인 T 세포 반응의 활성화를 통해 효과적인 항암 면역반응을 유발할 수 있다. 면역원성 세포사멸을 유발하는 물질을 "면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inducer)"라고 한다. 상기 면역원성 세포사멸 및 면역원성 세포사멸 유도제에 대하여는 Kroemer 등(Annu. Rev. Immunol., 31: 51-72, 2013)에 잘 정리되어 있다. 상기 문헌은 전체적으로 본 문서에 참조로 삽입된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "자기조립 단백질(self-assembled protein)"은 특별한 유도물질의 도움이 없이 발현과 동시에 규칙적인 배열에 의해 다량체(multimer)를 형성함으로써 나노입자를 형성할 수 있는 단백질을 의미한다. 자기조립 단백질에는 sHsp(small heat shock protein), 페리틴, vault, P6HRC1-SAPN, M2e-SAPN, MPER-SAPN, 및 다양한 바이러스 또는 박테리오파지 캡시드 단백질이 포함된다. 상기 자기조립 단백질에 관해서는 Hosseinkhani 등(Chem. Rev., 113(7): 4837-4861, 2013)에 잘 기술되어 있다. 상기 문헌은 전체적으로 본 문서에 참조로 삽입된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "탐식작용 촉진 단백질(phagocytosis enhancing protein)"은 대식세포에 의한 암세포의 탐식작용(phagocytosis)을 촉진시키는 역할을 수행하는 단백질을 의미한다. 암세포 표면에 과발현되어 있는 탐식작용 회피 단백질인 CD47을 마스킹함으로써 탐식세포에 의한 이들 암세포의 탐식작용을 촉진하는 역할을 수행하는 SIRPα, SIRPγ 및 항-CD47 항체 또는 IgG에 결합하여 IgG-옵소닌화 된 암세포의 탐식작용을 촉진하는 Surfactant protein A, 및 Surfactant protein D과 계면활성 단백질이 여기에 포함된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "SIRP(signal-regulatred protein)"는 골수세포에서 주로 발현되고 그리고 줄기세포 또는 신경세포에서 발현되는 SIRP족 단백질 중 조절성 막 당단백질이다. 상기 SIRP 중 SIRPα 및 SIRPγ는 억제성 수용체로 작용하며, 광범위하게 발현되는 막통과 단백질인 CD47 단백질과 상호작용하는데 이는 이른 바 "날 먹지마(don't eat me)" 신호로 불리운다. 이러한 상호작용은 숙주세포 탐식작용과 같은 선천적 면역세포의 효과기 작용을 음성적으로 조절한다. 이는 Ig-유사 또는 Ly49 수용체를 경유한 MHC I 계열 분자에 의해 제공되는 자가 신호와 유사하다. CD47를 과발현하는 암세포는 SIRPα 또는 SIRPγ를 활성화시켜 대식세포-매개 파괴를 억제한다. 최근 연구에 의하면 SIRPα의 고친화성 변이체가 암세포 상에서 CD47을 마스킹하여 암세포에 대한 탐식작용을 증가시킨다는 보고가 있다(Weiskopf et al., Science 341(6141): 88??91, 2013).
본 문서에서 사용되는 용어 "페리틴 중쇄 단백질(ferritin heavy chain protein, 이하 'FH'로 약칭함)"은 원핵생물 및 진핵생물에서 주요 세포내 철 저장 단백질인 페리틴의 중쇄 소단위를 구성하는 단백질은 의미하는데, 페리틴 단백질은 페리틴 중쇄 및 경쇄 각각 24 소단위체로 구성된다. 페리틴 단백질의 주요 기능은 철을 수용성의 비독성 상태로 저장하는 것이다. 페리틴 중쇄 단백질은 경쇄 단백질 없이도 24개의 소단위가 자기조립하여 내부가 빈 나노입자 형성하는 것으로 알려진 바 있다(Cho et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 327(2): 604-608, 2005). 페리틴 중쇄 단백질은 자기조립 나노입자 내부의 빈 내부 공간에 다른 약물을 적재함으로써 나노케이지(nanocage)의 역할을 수행할 수 있고, 이런 특성으로 인해 약물전달체 등의 목적으로 연구되고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "나노케이지(nanocage)"는 중공의 나노입자(hollow nanoparticle)를 의미하는 것으로서, 여기에는 무기 나노케이지와 유기 나노케이지가 포함되는데 무기 나노케이지는 은 나노입자를 끓는 물에서 염화금산(HAuCl4)과 반응시킴으로써 생성되는 속이 빈 다공성의 골드 나노입자이고, 유기 나노입자에는 페리틴과 같은 자기조립 단백질의 자기조립에 의해 생성되는 나노케이지인 단백질 나노케이지가 포함된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "복합 나노케이지(complex nanocage)"는 나노케이지의 빈 공간에 특정 물질이 적재된 나노케이지를 의미한다. 예컨대 페리틴 중쇄 단백질로 구성된 단백질 나노케이지의 내부에 항암제인 독소루비신을 적재할 경우 독소루비신 복합 단백질 나노케이지가 되는 것이다. "독소루비신 복합 나노케이지"는 "독소루비신 적재 나노케이지", "독소루비신 복합 단백질 나노케이지" 또는 "독소루비신 적재 단백질 나노케이지"와 동일한 표현으로 교차사용될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "하이브리드 나노케이지(hybrid nanocage)"는 동일한 자기조립 단백질에 둘 이상의 다른 표면 제시 단백질을 포함하는 둘 이상의 융합단백질의 자기조립에 의해 생성된 단백질 나노케이지를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "안트라사이클린 계열 항암제(anthracyclin-type anticancer agent)"는 스트렙토마이세스 속 세균인 Streptomyces peucetius var. caesius 유래의 암 화학요법에 사용되는 세포주기 비특이적인 항암제 계열을 지칭한다. 안트라사이클린 계열 항암제는 백혈병, 림프종, 유방암, 위암, 자궁암, 난소암, 방광암, 및 폐암을 포함한 다양한 암의 치료에 사용되는데, 종래에 개발되어온 화학요법 항암제 중 가장 효과적인 항암제 중의 하나이다. 최초로 발견된 안트라사이클린계열 항암제로는 다우노루비신(daunorubicin)이 있고, 바로 이어 개발된 독소루비신(doxorubicin), 그 뒤로 개발된 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 발루비신(valrubicin) 등이 존재한다. 안트라사이클린 계열 항암제의 작용기전으로는 DNA/RNA 가닥의 염기상 사이에 삽입됨으로써 DNA 및 RNA 합성을 억제하여 신속히 성장하는 암세포의 복제를 방해하는 것, 토포아이소머레이즈 II 효소 활성을 억제하여 슈퍼코일화 DNA의 긴장완화를 억제하여 전사와 복제를 방해하는 것, 철-매개 유리 산소 라디컬의 형성을 통한 DNA, 단백질 및 세포막의 손상 유도 및 DNA 손상 반응, 에피게놈 및 전사체를 탈조절하는 크로마틴으로부터 히스톤 축출 유도 등이 거론되고 있다. 최근 연구에 따르면 독소루비신이 CD4+ 세포를 활성화시킴으로써 Th1 면역반응을 증가시킨다고 보고된 바 있고(Park et al., Int. Immunopharmacol. 9(13-14): 1530-1539, 2009), 수지상세포(dendritic cell)와 독소루비신의 병용투여시 골육종의 면역학적 세포사멸(immunogenic cell death)를 유발함으로써 항암활성을 나타낸다고 보고된 바 있다(Kawano et al., Oncol. Lett. 11:2169-2175, 2016).
본 문서에서 사용되는 용어 "탁산계열 항암제(taxanoid anticancer agent 또는 taxne anticancer drug)"는 주목속(Taxus sp.) 식물로부터 추출된 디테르페노이드 탁산 유도체(diterpenoid taxane derivatives)로, 세포내의 마이크로튜블의 조립을 증진시키고 해체를 저해하는 기전을 가진 유사분열 억제제이다. 현재 상용화된 약물로는 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel) 등이 존재하며, 이중 파클리탁셀은 Taxus brevifolia의 주피에서 추출한 탁산계열 항암제로 1992년 난치성 난소암 치료제로 미국 FDA의 승인을 받았고, 도세탁셀은 Taxus bacaata에서 유래된 탁산계열 항암제로서 파클리탁셀과 효능이 유사하며, 유방암, 비세포폐암, 림프종, 방광암 등의 치료에 사용되고 있으며, 파클리탁셀에 비해 친수성이 높은 특성을 가지고 있다. 최근에는 탁산계열 항암제 역시 암세포를 세포독성 T 림프구에 대하여 감작시킴으로써 이들 암세포의 면역원성 세포사멸을 촉진시키는 기전을 갖는 것으로 밝혀지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 T 림프구와 같은 특정 유형의 면역계 세포 및 일부 암세포에 의해 생산된 특정 단백질을 차단하는 유형의 약물을 의미하는데 이들 단백질들은 면역반응을 억제하고, T 림프구가 암세포를 살상하는 것을 방지한다. 따라서 이러한 단백질이 차단되면 면역계의 "제동장치"가 풀어지고 T 림프구가 암세포를 더 잘 죽일 수 있다. 상기 "면역 검문소"로 현재까지 잘 알려진 것은 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2 등이 존재한다. PD-1 저해제로는 Pembrolizumab(상표명: Keytruda), Nivolumab(상표명: Opdivo) 등이 존재하고, PD-1의 리간드인 PD-L1 저해제로는 Atezolizumab(상표명: Tecentriq), 및 Avelumab(상표명: Bavencio) 등이 존재한다. 한편 CTLA-4/B7-1/B7-2의 상호작용을 저해하는 CTLA-4 저해제로는 Ipilimumab(상표명: Yervoy) 등이 FDA의 승인을 받은 바 있다. 최근 몇 년 동안 특히 전이성 흑색종(metastatic melanoma) 또는 호지킨 림프종(hodgkin lymphoma) 환자에게서 인상적인 성공을 거두었으며 다른 유형의 암 환자를 대상으로 한 임상시험에서 많은 가능성을 보여주고 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 관점에 따르면, 탐식작용 촉진 단백질 및 자기조립 형성 단백질을 포함하는 융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 나노케이지 또는 상기 나노케이지 내부에 면역원성 세포사멸 유도제가 봉입된 복합 나노케이지를 유효성분으로 함유하는 항암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 탐식작용 촉진 단백질 및 자기조립 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질 및 면역 검문소를 표적으로 하는 단일쇄 기반 항체 유사체 및 상기 자기조립 형성 단백질을 포함하는 제2융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 하이브리드 나노케이지 또는 상기 하이브리드 나노케이지 내부에 봉입된 면역원성 세포사멸 유도제를 포함하는 복합 하이브리드 나노케이지를 유효성분으로 포함하는, 항암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 탐식작용 촉진 단백질은 SIRPα, SIRPγ, Surfactant protein A, Surfactant protein D 또는 항-CD47 항체일 수 있고 상기 자기조립 형성 단백질은 sHsp(small heat shock protein), 페리틴, vault, P6HRC1-SAPN, M2e-SAPN, MPER-SAPN, 또는 바이러스 또는 박테리오파지 캡시드 단백질일 수 있으며, 상기 페리틴은 페리틴 중쇄 단백질 또는 페리틴 경쇄 단백질일 수 있고, 상기 박테리오파지 또는 바이러스 캡시드 단백질은 박테리오파지 MS2 캡시드 단백질, 박테리오파지 P22 캡시드 단백질, Qβ 박테리오파지 캡시드 단백질, CCMV 캡시드 단백질, CPMV 캡시드 단백질, RCNMV 캡시드 단백질, ASLV 캡시드 단백질, HCRSV 캡시드 단백질, HJCPV 캡시드 단백질, BMV 캡시드 단백질, SHIV 캡시드 단백질, MPV 캡시드 단백질, SV40 캡시드 단백질, HIV 캡시드 단백질, HBV 캡시드 단백질, 아데노바이러스 캡시드 단백질, 또는 rotavirus VP6 단백질일 수 있다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 탐식작용 촉진 단백질 및 상기 자기조립 형성 단백질 사이에 링커 펩타이드를 추가로 포함할 수 있고, 상기 링커 펩타이드는 서열번호 65 내지 81로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩타이드일 수 있다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(Bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 또는 옥살리플라틴일 수 있고 강심성 배당체(cardiac glycoside)는 비-면역원성 세포사멸 유도제와 조합되어 사용될 수 있으며 상기 GADD34/PP1 저해제는 미토마이신(mitomycin)과 조합되어 사용될 수 있으며, 상기 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 또는 발루비신(valrubicin)일 수 있고, 상기 탁산 계열 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)일 수 있다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 면역 검문소는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, B7-1 또는 B7-2일 수 있고, 상기 면역 검문소 억제제는 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제 또는 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제일 수 있다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 D-1/PDL1 상호작용 저해제는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)일 수 있고, 상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 저해제는 이필리무맙(Ipilimumab)일 수 있다.
상기 항암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 단일쇄 기반의 항체 유사체는 scFv, sdAb, 다이아바디(diabody), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR), 나노바디(nanobody) 또는 낙타과 중쇄 단편(VHH)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 페리틴 중쇄 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 SIRPα(signal-regulatory protein alpha) 또는 SIRPγ가 연결된 융합단백질이 제공된다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 페리틴 중쇄 단백질은 서열번호 1 내지 11중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성될 수 있고 가장 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 페리틴 중쇄 단백질일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 SIRPα는 SIRPα의 전장단백질일 수 있고, SIRPα의 IgV(immunoglobulin variable domain)을 포함하는 단편일 수 있으며,상기 단편은 서열번호 12 내지 64 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 SIRPγ는 SIRPγ의 전장단백질일 수 있고, SIRPγ의 IgV(immunoglobulin variable domain)을 포함하는 단편일 수 있으며,상기 단편은 서열번호 98 또는 100의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 융합단백질은 상기 페리틴 중쇄 단백질과 상기 SIRPα 단백질 또는 SIRPγ 단백질 사이에 링커 펩타이드가 추가될 수 있으며, 상기 링커 펩타이드는 (G4S)n, (GSSGGS)n, KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 65), EGKSSGSGSESKST(서열번호 66), GSAGSAAGSGEF(서열번호 67), (EAAAK)n, CRRRRRREAEAC(서열번호 68), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 69), GGGGGGGG(서열번호 70), GGGGGG(서열번호 71), GGGGS(서열번호 72), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 73), PAPAP(서열번호 74), (Ala-Pro)n, VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 75), PLGLWA(서열번호 76), TRHRQPRGWE(서열번호 77), AGNRVRRSVG(서열번호 78), RRRRRRRR(서열번호 79), GFLG(서열번호 80), 또는 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 81)일 수 있다.
아울러 상기 융합단백질을 정제를 효율적으로 하기 위해 N-말단 또는 C-말단에 정제용 태그 펩타이드가 추가로 포함될 수 있다. 상기 태그 펩타이드는 HisX6 펩타이드(서열번호 82), GST 펩타이드, FLAG 펩타이드(DYKDDDK, 서열번호 83), 스트렙타비딘 결합 펩타이드, V5 에피토프 펩타이드(GKPIPNPLLGLDST, 서열번호 84), Myc 펩타이드(EQKLISEE, 서열번호 85), 또는 HA 펩타이드(YPYDVPDYA, 서열번호 86)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
상기 재조합 벡터의 모벡터는 원핵세포용 벡터, 진핵세포용 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있고, 상기 원핵세포용 벡터는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 파지미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리아 인공 염색체 벡터일 수 있으며, 상기 진핵세포용 벡터는 효모용 벡터, 곤충세포 벡터, 포유동물 벡터, 또는 식물세포 벡터일 수 있고, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 아데노부속바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포가 제공된다.
상기 형질전환 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있고, 상기 원핵세포는 그람음성균 또는 그람양성균일 수 있으며, 상기 진핵세포는 진균세포, 식물세포, 또는 동물세포일 수 있고, 상기 진균세포는 자낭균 세포 또는 담자균 세포일 수 있으며, 상기 동물세포는 곤충세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질이 자기조립되어 생성되는 단백질 나노케이지가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단백질 나노케이지 내부에 면역원성 세포사멸 유도제가 봉입된 항암 복합 나노케이지가 제공된다.
상기 항암 복합 나노케이지에 있어서, 상기 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(Bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 또는 옥살리플라틴일 수 있고 강심성 배당체(cardiac glycoside)는 비-면역원성 세포사멸 유도제와 조합되어 사용될 수 있으며 상기 GADD34/PP1 저해제는 마토마이신(mitomycin)과 조합되어 사용될 수 있으며, 상기 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 또는 발루비신(valrubicin)일 수 있고, 상기 탁산 계열 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)일 수 있다.
상기 항암 복합 나노케이지에 있어서, 면역 검문소 억제제를 추가적으로 포함할 수 있고 상기 면역 검문소 억제제는 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제 또는 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제일 수 있다.
상기 항암 복합 나노케이지에 있어서, 상기 D-1/PDL1 상호작용 저해제는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)일 수 있고, 상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 저해제는 이필리무맙(Ipilimumab)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단백질 나노케이지 또는 상기 항암 복합 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 항암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 비경구를 위한 제형인 것이 바람직하다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주사, 비강내 흡입, 근육내 투여, 복강내 투여, 경피흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항암제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 다른 항암제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 상기 단백질 나노케이지 또는 상기 항암 복합 나노케이지를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법이 제공된다.
상기 나노케이지로의 안트라사이클린 계열 항암제의 적재는 약물이 용해된 세포배양 배지 내에서 재조합 엑소좀을 생산하도록 유전자 조작된 세포를 배양함으로써 달성될 수 있고, 분리된 나노케이지를 안트라사이클린 계열 항암제가 용해된 용매에 넣고 교반함으로써 생성할 수 있다. 바람직하게는 미리 2가 금속이온(예컨대, Cu2+, Fe2+, 및 Zn2+)과 안트라사이클린 계열 항암제의 복합체를 형성시킨 후, 제조된 페리틴 중쇄 나노케이지의 내부 공극에 상기 2가 금속이온-안트라사이클린 계열 항암제 복합체가 스며들도록 완충액 상에서 반응시킴으로써 적재할 수 있다. 또한 pH차이에 의한 페리틴 중쇄 나노케이지의 해체-재조립(disassemble-reassemble)과정을 통하여 내부 공극에 항암제가 적재될 수 있으며, 이온 농도차에 의한 공극 열림 현상에 의하여 단백질 나노케이지에 항암제가 적재될 수 있다.
최근 암 면역 요법의 표적이 되는 신생항원(neoantigens)으로 알려진 종양의 돌연변이된 단백질의 동정은 항종양 T 세포 반응을 증가시키는 치료법의 개발로 이어졌고 암세포의 변이원성(mutagenic nature)이 매우 높기는 하지만 종양에서 발현된 변이 단백질의 1%만이 암 환자에서 면역 반응을 유발한다. 신생항원이 면역원성을 갖기 위해서는 세포 표면의 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 처리된 후 제시되어야 하고 종양에서 숙주의 T 세포로 면역원성 신생항원을 효율적으로 전달하는 것이 활성화되고 이는 항원제시세포(APCs)가 적재된 신생항원 펩타이드에 의해서만 달성된다. 본 발명자들은 면역 억제성 종양 미세 환경의 활성화 - 에너지 한계점을 극복하고 숙주의 T 세포에 대한 APC에 의한 종양 신생항원의 전달 및 제시를 중재하기 위한 새로운 전략을 개발하였다. 상기 전략은 APC에 의한 암 세포 식균작용을 강화시키는 리간드를 전달하는것 뿐만 아니라 면역원성 암 세포사멸(ICD)을 유도하는 약물을 포함하는 자연적으로 유도된 페리틴 기반 나노 캡슐에 기초한다. 이에 따라 본 발명자들은 페리틴 중쇄 단백질 및 SIRPα로 구성된 융합단백질의 자기조립에 의해 생성되는 나노케이지의 내부에 독소루비신이 적재된 항암 복합 나노케이지 또는 상기 항암 복합 나노케이지에 T 림프구와 같은 특정 유형의 면역계 세포 및 일부 암세포에 의해 생산된 특정 단백질을 차단하는 유형의 약물을 의미하는 면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 추가로 포함하여 암세포에 대한 면역원성 세포 사멸을 유도하여 암 항원에 특이적인 종양 면역을 촉진시키고 종래 항암제로부터 유발되는 부작용이 없으며 치료 후에도 면역세포에 의한 항암효과가 지속 가능한 차세대 항암 치료제를 개발하였다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리틴 중쇄 단백질 및 SIRPα로 구성된 융합단백질의 자기조립에 의해 생성되는 나노케이지의 내부에 독소루비신이 적재된 항암 복합 나노케이지의 개략적인 모습을 도시한 개요도이다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 페리틴 중쇄 단백질의 C-말단에 SIRPα 또는 SIRPγ 단백질을 연결한 융합단백질을 발현시킬 경우 페리틴 중쇄 단백질 24 소단위체의 자기조립에 의해 내부가 빈 페리틴 나노케이지를 형성한다. 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리틴 중쇄 단백질 및 SIRPα 또는 SIRPγ를 포함하는 제1융합단백질 및 페리틴 중쇄 단백질 및 면역 검문소의 일종인 PD-1을 표적으로 하는 단일쇄 가변 단편(PD1-scFV)을 포함하는 제2융합단백질로 구성된 하이브리드 나노케이지 내에 독소루비신이 봉입된 항암 복합 나노케이지의 개략적인 모습을 도시한 개요도이다. 도 1b에 도시된 형태의 하이브리드 나노케이지는 SIRPα 또는 SIRPγ를 통한 CD47의 마스킹에 의한 면역 활성 촉진 및 면역 검문소에 대한 억제에 기반한 면역 활성 촉진에 따른 상승효과를 나타낼 수 있다.
본 발명자들은 SIRPα를 C-말단에 부가한 페리틴 중쇄 단백질 역시 나노케이지를 형성함을 실험적으로 입증하였다(도 3a, 3c 내지 3e 참조). 아울러, 본 발명자들은 SIRPα 야생형은 물론 SIRPγ 야생형 및 SIRPγ 변이형의 C-말단에 부가한 페리틴 중쇄 단백질 역시 나노케이지를 형성함을 실험적으로 입증하였다(도 3b 및 3f). 뿐만 아니라, 상기 나노케이지에 안트라사이클린 계열 항암제인 독소루비신을 적재하더라도 나노입자의 형태를 갖추고 있음을 실험적으로 입증하였다(도 4a 내지 4d 참조).
상기 FH-SIRPα 융합단백질의 자기조립으로 생성된 나노케이지는 암세포의 CD47과 결합할 뿐만 아니라(도 5a 및 5b 참조), 대식세포에 의한 암세포의 탐식작용을 촉진시키는 것으로 나타났다(도 6a 내지 6i 참조). 뿐만 아니라, 본 발명자들은 암세포를 피하이식한 종양 모델 동물에 본 발명의 일 실시예에 다른 나노케이지 및 독소루비신이 적재된 항암 복합 나노케이지를 투여한 결과, 암세포의 성장이 현저하게 억제됨을 실험적으로 입증하였다(도 7a 내지 7f 참조).
본 발명의 나노케이지 기반의 항암제는 APCs(antigen presenting cells)에 의한 암 세포 식균작용을 강화하는 리간드(ligands) 뿐만 아니라 면역원성 암세포 사멸(immunogenic cancer cell death, ICD)을 유발하는 약물을 전달한다. 나노케이지-치료제는 죽어가는 암세포에서 위험신호(danger signals) 및 신생항원(neoantigens)의 분비를 유도하고 종양세포 식균작용을 강화하며 신생항원 펩타이드를 적재한 수지상 세포에 의해 종양 특이적 T 세포를 교차자극(cross-primes)함으로써 암세포의 존재에 대한 숙주의 면역계를 일깨우고 암에 대한 내재적 항암 백신효과(intrinsic anti-cancer vaccination)를 획득한다(도 9a 내지 9c 참조).
대식세포 및 수지상 세포와 같은 선천적 면역세포는 식균작용 및 항원제시(antigen presentation)를 통해 적응면역계의 활성을 매개하고 병원균에 대해 초기 숙주방어(initial host defense)에 있어 중요한 역할을 담당하지만 종양세포가 선천적 면역세포에 의한 식균작용을 회피하는 한 가지 기전은 '나를 먹지 마시오(Do not eat me' 신호인 CD47을 상향조절하는 하는 것이다. 종양세포와 포식세포(phagocytic cells) 사이의 CD47-SIRPα 축을 차단시킬 경우 종양세포에 대한 식세포작용을 증가시키는 것으로 나타나, 암 면역요법에서의 표적으로서의 장점을 입증하였다. 아울러, CD47 기반 치료법는 면역능을 가진(immunocompetent) 마우스 모델에서 선천 및 적응면역(adaptive immune) 반응 간에 연결을 유도하여 식세포 작용을 증진시키는 것으로 보고되었다(Liu, X. J. et al., Nat Med. 21, 1209-1215, 2015). 최근에 암 치료제로 CD47을 차단하는 SIRPα 변이체 및 나노바디가 개발되어 왔다.
CD47-매개 면역치료요법을 개선하기 위하여, 본 발명자들은 인간 및 마우스 CD47에 결합 및 길항할 수 있는 SIRPα 변이체를 포함하도록 인간 페리틴의 표면을 가공함으로써 나노케이지를 고안하여 이를 FH-SIRPα HV로 명명하였는데, 상기 나노케이지 역시 SIRPα와 마찬가지로 인간 및 마우스 CD47에 결합하고 그 기능을 차단할 수 있었다(도 2).
본 발명자들은 죽어가는 암세포에서 면역원성 신생항원 및 위험신호의 분비를 위한 전략을 예의 연구한 결과, 상기 FH-SIRPα HV 나노케이지가 국소 염증반응을 자극하고 신생항원을 적재한 수지상 세포의 생성을 촉발함을 규명하였다. 일부 죽어가는 암세포는 대규모의 면역반응을 유발하는데, 이러한 현상을 '면역원성 세포 사멸(immunogenic cell death, ICD)이라 한다(Kroemer et al. Annu. Rev. Immunol. 31: 51-72, 2013). ICD는 시공간적으로 제한된 하기 세 가지 구분되는 '위험'신호의 조합과 의사소통한다.
1) 소포체(ER)에 존재하는 칼레티큘린(calreticulin, CRT)의 세포 표면으로의 이동(translocation)과 관련된 "나를 먹으시오(eat-me)" 신호; 2) ATP의 분비의 활성화와 관련된 "나를 찾으시오(find-me)"신호; 그리고 3) nuclear high-mobility group box 1(HMGB1) 단백질의 세포외 분비와 관련된 항원 처리 및 T 세포로의 제시를 촉진하는 신호. 이러한 신호는 T 세포로 종양 신생항원의 제시를 자극하기 위해 수지상 세포 표면에 발현된 일련의 수용체를 조절한다. 따라서 본 발명자들은 종양 미세 환경에 CD47 길항제와 함께 전달된 ICD 유도제가 죽어가는 암세포로부터 위험 신호를 유발하고 세포 면역반응을 시작할 것이라는 가설을 정립하였다.
FH-SIRPα와 함께 전달하기 위한 ICD 유도제로서 치료된 암세포에서 ICD의 세 가지 특성을 유도하는 안트라 사이클린계열 항암제인 독소루비신(dox)을 선택하였고, 철 항성성의 매개자인 페리틴의 금속 이온-결합 친화력의 장점을 이용하였다. 상기 페리틴의 금속-이온 결합 친화력은 금속-기반의 약물 또는 금속-복합체 약물을 페리틴의 내부 공극(central cavity)에 축적시킬 수 있게 해준다. 본 발명자들은 이를 위해 Cu(II)와 사전 복합화된 독소루비신을 나노케이지 내부 공극으로 내제화시킴으로써 FH-SIRPα 나노케이지에 봉입된 독소루비신 제제를 제조하였으며, 이를 FH-SIRPα-Dox로 명명하였다. FH-SIRPα 내부로의 독소루비신의 성공적인 적재는 크기-제한 크로마토그래피로 확인하였고 포획된 독소루비신의 양은 HFSIRPα 나노케이지 당 54 독소루비신 분자인 것으로 확인되었다(도 4a 내지 4d).
상기 FH-SIRPα-Dox를 종양모델 마우스에 투여한 결과 다량의 CD47 길항제 및 ICD의 유리한 종양 축적을 반영한 강력한 상승성 항암활성을 확인할 수 있었다. 국소 염증반응을 자극하고 면역 억제성 종양 미세환경에서 선천성 면역세포의 식세포 작용과 성숙은 T 세포에 면역원성 종양 신생항원의 효과적인 전달 및 제시를 유도한다. 이러한 강력한 면역반응은 전체 종양 박멸과 지속적인 항-종양 면역반응을 초래하였고 총체적으로, 종양에 대한 숙주의 면역계를 활성화시키는 보편적이고 효과적인 접근법임이 입증되었다.
비교해 보면, 현재의 암 백신은 원하는 표적 종양 신생항원의 지속적인 발현을 필요로 하고, 표적 항원을 발현하지 않는 내성 클론의 형성을 유도한다는 점에서 제한적이다. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료법은 또한 원하는 표적 종양 신생항원이 지속적으로 발현될 필요가 있으며, 최적화 요구 사항 및 생체 외 조작의 경제적 비용을 포함한 다른 주요 장애물과도 관련이 있고 PD-1 항체와 같은 조절 항체는 항-종양 및 항-자체 자가면역 T 세포를 포함하여 모든 활성 또는 소진된 T 세포가 자극받을 수 있는 단점을 가지고 있다. 그러나 본 발명의 FH-SIRPα-Dox는 국소적 및 전신적인 항-종양 특이적 면역 모두를 활성화시켜 '고유의 항암 백신(intrinsic anti-cancer vaccination)'으로서 그 효능을 입증하는 강력한 면역 자극제이고 내구성이 강하고 견고한 반응을 고려할 때 상기 시너지 효과는 광범위한 잠재력을 가지며 단계에 관계없이 여러 유형의 암 치료에 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 페리틴 나노케이지의 제조
1-1: 페리틴 중쇄 단백질 및 SIRP-α 고친화성 변이체의 융합단백질
본 발명자들은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 페리틴 중쇄 단백질(hFTH)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 87); 서열번호 65으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 88) 및 서열번호 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 SIRPα 고친화성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 89)를 각각 PCR 또는 합성에 의해 클로닝한 후 이를 제한효소 및 라이게이즈를 이용하여 연결한 후, His tag를 포함하는 발현벡터 pT7-7에 클로닝하였다. 상기 각각의 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 클로닝을 용이하게 하기 위해, hFTH와 링커 펩타이드 사이에는 제한효소 XhoI 인식부위를 추가하였고, 링커 펩타이드와 SIRPα 사이에는 제한효소 Hind Ⅲ 인식부위를 추가하였으며, SIRPα를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에는 제한효소 Cla I 인식부위를 추가하였다(도 1c).
하나한(Hanahan)이 기술한 방법(Hanahan D, DNA Cloning vol.1, 109-135, IRS press 1985)에 의해 상기에서 제조된 벡터들을 대장균에 형질전환하였다. 구체적으로 CaCl2로 처리한 대장균 BL21(DE3)에 상기에서 제조된 벡터들을 열 충격 방법으로 형질전환시킨 후, 암피실린이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 암피실린 저항성을 나타내는 세포를 선별하였다. 형질전환된 세포를 OD600이 0.6이 될 때까지 36℃에서 배양한 후 1 mM IPTG를 가하여 융합단백질의 발현을 유도하고 20℃에서 16시간 동안 추가로 배양하였다. 배양을 마친 세포를 회수하여 초음파를 처리하여 파쇄하고 세포 파쇄액을 12,000 xg로 30분간 원심분리하여 세포잔해물을 제거하였다. 재조합 단백질을 Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 각각 분리하였다(세척 버퍼: pH 8.0, 50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM NaCl, 80mM 이미다졸; 용출 버퍼: pH 8.0, 50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸). 용출 버퍼의 이미다졸을 제거하기 위하여 멤브레인 필터레이터(Amicon, 10K)를 이용하여 PBS로 버퍼를 교체해 주었다. 수득된 나노케이지의 농도는 Bradford 단백질 분석 방법으로 측정하였다. 상기와 같이 제조된 나노케이지를 'FH-SIRPα HV'로 명명하였다.
1-2: 페리틴 중쇄 단백질 및 SIRPα 야생형 융합단백질
본 발명자들은 SIRPα 고친화성 변이체가 아닌 서열번호 92로 기재되는 인간 SIRPα 야생형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 93)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 페리틴 중쇄 단백질에 인간 SIRPα 야생형 단백질이 연결된 융합단백질 및 이를 이용한 페리틴 중쇄 나노케이지(이하, 'FH-hSIRPα WT 나노케이지'로 약칭함)를 제조하였다.
아울러, 본 발명자들은 인간 SIRPα 야생형 단백질 대신에 서열번호 94로 기재되는 마우스 SIRPα 야생형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 95)를 사용하여 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 페리틴 중쇄 단백질에 마우스 SIRPα 야생형 단백질이 연결된 융합단백질 및 이를 이용한 페리틴 중쇄 나노케이지(이하, 'FH-mSIRPα WT 나노케이지'로 약칭함)를 제조하였다.
1-3: 페리틴 중쇄 단백질 및 SIRPγ 야생형 융합단백질
본 발명자들은 SIRPα 고친화성 변이체가 아닌 서열번호 96로 기재되는 SIRPγ 야생형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 97)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 페리틴 중쇄 단백질에 SIRPγ 야생형 단백질이 연결된 페리틴 중쇄 나노케이지(이하, 'FH-SIRPγ WT 나노케이지'로 약칭함)를 제조하였다.
1-4: 페리틴 중쇄 단백질 및 SIRP-γ 변이체 1 융합단백질
본 발명자들은 SIRPα 고친화성 변이체가 아닌 SIRPγ 야생형 단백질에서 상기 SIRPα 고친화성 변이체의 변이 아미노산에 상응하는 아미노산 변이를 가진 Sirγ 변이체(이하, 'SIRPγ V1'으로 약칭함, 서열번호 98)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 99)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 페리틴 중쇄 단백질에 SIRPγ V1 단백질이 연결된 페리틴 중쇄 나노케이지(이하, 'FH-SIRPγ V1 나노케이지'로 약칭함)를 제조하였다.
1-5: 페리틴 중쇄 단백질 및 SIRP-γ 변이체 2 융합단백질
본 발명자들은 SIRPα 고친화성 변이체가 아닌 SIRPγ 야생형 단백질에서 27번째 아미노산이 치환되지 않은 것을 제외하고는 상기 SIRPα 고친화성 변이체의 변이 아미노산에 상응하는 아미노산 변이를 가진 Sirγ 변이체(이하, 'SIRPγ HV2'으로 약칭함, 서열번호 100)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 101)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 페리틴 중쇄 단백질에 SIRPγ V2 단백질이 연결된 페리틴 중쇄 나노케이지(이하, 'FH-SIRPγ V2 나노케이지'로 약칭함)를 제조하였다.
실험예 1: 페리틴 나노케이지의 생성 확인
본 발명자들은 상기 실시예 1-1 내지 1-5에서 수득된 조수득물에 대하여 SDS-PAGE 및 항-페리틴 중쇄 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석을 통해 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과, 도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시에에 따른 융합단백질은 수용성 분획에 주로 분포하였고, 일부는 불용성 분획에 존재하는 것으로 확인되었으며, 니켈 친화성 칼럼을 이용한 친화성 정제 결과 38.1 kDa(약 39 kDa)에 상응하는 밴드가 뚜렷하게 검출되어, His tag를 이용한 단백질 정제 역시 성공적으로 수행되었음을 알 수 있었다. 이어, 본 발명자들은 상기 회수된 나노케이지의 입도를 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 분석장치(Malvern zetasizer nano ZS, UK)을 이용하여 분석하는 한편, 투과 전자현미경으로 생성된 나노케이지를 촬영하였다.
그 결과 도 3c 및 3d에서 나타난 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 FH-SIRPα 나노케이지는 그 크기가 10 내지 20 nm 정도의 비교적 그 크기가 일정한 구형의 나노입자를 형성하는 것으로 나타났으며, 이는 야생형 페리틴 중쇄 단백질의 입도분포와 유사한 양상이었다. 아울러, FPLC(fast protein liquid chromatography) 분석을 수행한 결과, 도 3f에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 FH-SIRPα 나노케이지(이하, 'FH-SIRPα HV 나노케이지'로 약칭함)는 야생형 페리틴 중쇄 나노케이지와 마찬가지로 하나의 피크로 관찰되어 균일한 상태로 제조가 됨을 확인할 수 있었다. 본 발명의 일실시예에 따른 FH-SIRPα HV 나노케이지는 야생형 페리틴 중쇄 나노케이지와 비교하여 머무름시간이 약간 길게 나왔는데 이는 단백질 융합에 따른 분자량의 증가로 인한 당연한 결과이다.
실시예 2: 하이브리드 나노케이지의 제조
서열번호 92로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 FLAG 태그, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 페리틴 중쇄 단백질(hFTH)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 87); 서열번호 65으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 88) 및 서열번호 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 SIRPα 고친화성 변이체를 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 93)가 프로모터에 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터(pCMV-FLAG-hFTH-SIRPα HV)를 작제한다.
또한, 서열번호 92로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 FLAG 태그, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 페리틴 중쇄 단백질(hFTH)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 87); 서열번호 65으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 88) 및 서열번호 92로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 면역 검문소 억제제인 PD-1/PD-L1을 타겟으로 하는 단일쇄 가변 단편(ScFv)를 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 94)가 프로모터에 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터(pCMV-FLAG-hFTH-PD1-scFV)를 작제한다.
CHO 세포를 상기 두 발현벡터로 공형질감염시킨 후, 항-FLAG 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 상기 두 융합단백질의 자기조립에 의해 생성된 SIRPα와 PD-1/PD-L1을 타겟으로 하는 단일쇄 기반의 항체가 표면에 제시가 되는 하이브리드 나노케이지를 회수한다.
아울러, 상기 하이브리드 나노케이지에 Cu-dox 복합체를 처리하여 독소루비신을 내부에 봉입함으로써 항암 복합 하이브리드 나노케이지를 제조한다(도 1b).
실시예 3: 독소루비신 적재 나노 케이지의 제조
본 발명자들은 먼저 독소루비신 1 mg/ml을 구리이온(Cu2+) 1 mM과 상온에서 30분간 반응시켜 독소루비신-구리이온 복합체를 형성시켰다. 그런 다음 상기 혼합물을 상기 실시예 1에서 제조된 FH-SIRPα 용액(250 ㎍/ml)에 가하고 상온에서 120분간 반응시켰다. 반응물은 PD-10 칼럼을 이용한 크로마토그래피로 유리 독소루비신 및 구리이온을 제거하였다(도 4a). 상기 적재된 독소루비신은 형광 분광기(2103 EnVision™ Multilabel Plate Readers, PerkinElmer, USA)로 측정한 후 표준 커브와 비교하여 정량하였고 상기 제조된 독소루비신 복합 나노케이지의 나노입자 형성 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 동일한 방법으로 FPLC 분석, DLS 분석 및 투과전자현미경 촬영을 수행하였다.
그 결과, 도 4b에서 나타난 바와 같이, FPLC상 본 발명의 독소루비신 복합 나노케이지 역시 단일한 피크로 나타났으며, 독소루비신 측정을 위한 480 nm에서의 흡광도 측정 결과 역시 280 nm 파장에서의 단백질 검출과 동일한 머무름시간에서 확인됨으로써 본 발명의 독소루비신 복합 나노케이지 내부에 독소루비신이 성공적으로 적재되었음을 간접적으로 확인할 수 있었다. 입도분석 결과 역시 도 4c에서 나타난 바와 같이 10 내지 20 nm의 입도크기를 갖는 나노입자임을 확인할 수 있었고, 투과전자현미경 촬영 결과 역시 도 4d에서 나타난 바와 같이 구형의 나노입자가 형성됨을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 시험관내 암세포 부착능 평가
2-1: 형광현미경 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조된 FH-SIRPα HV 나노케이지가 암세포 표면의 CD47과 특이적인 결합을 하는지 확인하기 위해, 형광현미경 촬영을 수행하였다. 구체적으로, 마우스 대장암 세포주인 CT26 세포주와 인간 대장암 세포주인 HT29 세포를 3x104 cells/ml의 농도로 파종한 후, 상기 실시예 1-1에서 제조된 FH-SIRPα HV 나노케이지 400 nM 또는 대조군으로 야생형 페리틴 중쇄 나노케이지 400 nM을 처리한 후, 항-페리틴 1차 마우스 항체(Abcam, Cambridge, UK) 및 FITC 결합 항-마우스 래빗 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK)를 처리하고 형광현미경으로 촬영한 결과, 도 5a에서 나타난 바와 같이, 대부분의 암세포에서 FITC 형광이 관찰되어 본 발명의 FH-SIRPα HV 나노케이지가 암세포와 잘 결합함을 확인할 수 있었다. 상기 인간 또는 마우스 CD47에 결합하는 FH-SIRPα HV 나노케이지의 친화력 및 동역학의 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석 결과를 하기 표 1에 표시하였다.
Human CD47
 Mouse CD47
Molecule ka, M-1 s-1 kd, s-1 kd, M ka, M-1 s-1 kd, s-1 kd, M
FH-SIRPα 5.0 x 106 2.4 x 10-7 4.8 x 10-14 1.1 x 106 4.1 x 10-4 3.7 x 10-10
mSirpα 7.0 x 106 3.7 x 10-5 5.4 x 10-12 1.8 x 106 1.1 x 10-2 6.2 x 10-9
2-2: 다양한 나노케이지의 암세포 결합능 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1-1에서 제조된 나노케이지 외에도 실시예 1-2 내지 1-5에서 제조된 다양한 SIRP 단백질을 이용하여 제조된 나노케이지 역시 암세포에 대한 친화력이 있는지 확인하기 위해, 유세포 분석을 수행하였다. 구체적으로, 인간 대장암 세포주인 HT29 세포를 2x105 cells/ml로 분주한 후, 대조군으로 야생형 페리틴 중쇄 나노케이지, 실험군으로 상기 실시예 1-1에서 제조된 FH-SIRPα HV 나노케이지, 실시예 1-2에서 제조된 FH-hSIRPα WT 나노케이지, 실시예 1-3에서 제조된 FH-SIRPγ WT 나노케이지 및 실시예 1-5에서 제조된 FH-SIRPγ V2 나노케이지를 각각 20, 200, 400 또는 600 nM를 처리하여 세포결합 정도를 측정하였다. 구체적으로, 상기 나노케이지를 처리한 후 항-페리틴 중쇄 1차 마우스 항체(Abcam, Cambridge, UK, 1:200) 및 Alexafluor 488-결합 당나귀 항-래빗 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK, 1:400)를 처리하고 유세포 분석을 통해 형광 강도에 따라 세포를 정렬하였다.
그 결과 도 5b에 나타난 바와 같이, 대조군인 야생형 페리틴 중쇄 단백질로 구성된 나노케이지는 농도가 증가하더라도 암세포에 결합하지 않은 반면, SIRPα 야생형 또는 SIRPγ 야생형 단백질은 200 nM 이상에서 농도의존적으로 암세포와의 결합이 증가하였다. 그러나, 결합정도는 SIRPα 고친화성 변이체를 사용한 것보다는 낮았다. 흥미로운 점은 27번째 아미노산 잔기인 발린을 제외하고 상기 SIRPα 고친화성 변이체의 변이 위치에 상응하는 아미노산들이 치환된 SIRPγ 변이체 단백질이 연결된 나노케이지(FH-SIRPγ V2 나노케이지)의 경우 SIRPα HV 나노케이지와 동등한 성능을 나타냈다는 점이다.
실험예 2: 시험관내 대식세포의 암세포 탐식작용 분석
본 발명자들은 이어 본 발명의 일 실시예에 따른 FH-SIRPα 나노케이지가 암세포 표면의 CD47과 결합하여 대식세포의 암세포에 대한 탐식작용을 향상시키는지 여부를 유세포 분석과 형광현미경 촬영으로 조사하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 대식세포 및 수지상세포에 의한 종양세포 범위의 식세포 작용을 FACS 분석을 통해 관찰하였다. 먼저, CellTracker Geen(Thermo Fisher Scientific, USA)로 사전염색된 골수유래 대식세포(BMDMs) 세포 3x105 cells/ml 및 pHrodo Red SE로 사전 염색된 (a) 인간 Raji Burkitt 림프종 세포, (b) 인간 HT-29 결장암 세포, (c) 마우스 4T1 유방암 세포, (d) 마우스 CT26 결장암 세포 및 (e) β-galactosidase를 과발현하는 마우스 CT26.CL25 결장암 세포 각각 1.2x106 cells/ml를 RPMI 배지에 파종한 후 대조군인 완충액(buffer), 본 발명의 페리틴-SIRPα 융합 나노케이지(FH-SIRPα HV), 야생형 페리틴 중쇄 나노케이지(wtFH) 및 단량체형 SIRPα(mSIRPα)를 각각 400 nM를 처리하였다. 또한, CellTracker Geen(Thermo Fisher Scientific, USA)로 사전염색된 골수유래 수지상세포(BMDCs) 3x105 cells/ml 및 pHrodo Red SE로 사전 염색된 (a) 인간 Raji Burkitt 림프종 세포, (b) 인간 HT-29 결장암 세포, (c) 마우스 4T1 유방암 세포, (d) 마우스 CT26 결장암 세포 및 (e) 마우스 CT26.CL25 결장암 세포, (f) B16.OVA 세포 각각 1.2x106 cells/ml를 RPMI 배지에 파종한 후 대조군인 버퍼(buffer), FH-SIRPα HV, wtFH 및 mSIRPα를 각각 400 nM를 처리한 후 FACS 분석을 수행하였다. 탐식율은 하기 공식에 의해 결정하였다.
탐식율 = 암세포를 탐식한 대식세포(적색과 녹색 동시 탐지) / 대식세포(적색) X 100.
상기 CT26.CL25 세포주는 CT26 세포주에 β-galactosidase 단백질을 발현하도록 만들어진 세포주이다. 따라서, β-galactosidase 항원 단백질의 면역성을 조사하는데 이용되고 있다. 효과적인 항암 면역작용 유도를 위해서는 대식세포와 수지상세포에 항원 단백질을 효과적으로 전달하여 MHC class I 분자에 의한 종양 특이적인 항원 유래 peptide(본 발명에서는 β-galactosidase peptide) 제시율을 높여 세포독성 T 세포를 효과적으로 자극하도록 하는 것이 중요하다. 본 발명자들은 β-galactosidase 단백질을 모델 단백질로 채택하고 이 항원 단백질을 대식세포와 수지상세포에 효과적으로 전달하여 항원제시세포의 기능을 활성화시키며, 궁극적으로 세포독성 T 세포를 효과적으로 자극하여 모델 단백질에 특이적인 면역반응을 유도하여 항암치료에 이용할 수 있는지 확인하기 위해 상기와 같은 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 6a 내지 6c에서 나타난 바와 같이, 음성대조군이나 야생형 페리틴 중쇄 나노케이지를 처리한 암세포에 대한 탐식작용은 매우 낮았으나, 재조합 SIRPα 및 본 발명의 일 실시예에 따른 FH-SIRPα HV 나노케이지를 처리한 경우 대조군에 비해 골수 유래 대식세포 및 골수 유래 수지상세포 모두에서 암세포에 대한 탐식작용이 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 특히, β-galactosidase를 과발현하는 CT26.CL25 세포의 경우 재조합 SIRPα와 비교시 대식세포 및 수지상세포에 의한 탐식배율이 현저하게 상승하였으며, 대식세포의 경우 거의 두 배 가까이 증가시켰다(도 6a 참조).
아울러, 본 발명자들은 상기 실시예 1-2 내지 1-5에서 제조된 페리틴 중쇄 나노케이지들 역시 대식세포의 암세포에 대한 탐식활성을 나타내는지 확인하기 위해 상술한 방법과 동일하게 골수유래 대식세포(2x105 cells/ml)와 CT26.CL25 마우스 대장암 세포(8x105 cells/ml)를 37℃에서 4시간 공배양한 후 대식세포는 celltracker deep red 1 mM로 염색하였고, 암세포는 celltracker green 0.5 mM을 이용하여 염색하여 상기 대식세포에 의해 탐식된 암세포를 계수함으로써 암세포의 탐식 정도를 관찰하였다.
그 결과, 도 6d 및 6e에서 나타난 바와 같이, 인간 SIRPα 야생형 단백질이나 인간 SIRPγ 야생형 단백질 모두 암세포에 대한 탐식활성을 나타냈고, SIRPγ 변이체 단백질을 사용한 나노케이지(FH-SIRPγ V2)의 경우 상기 야생형 단백질보다 더 높은 암세포 탐식활성을 나타냈다.
뿐만 아니라, 골수 유래 대식세포(BMDM)의 암세포에 대한 탐식 정도를 BMDM 세포 당 탐식된 암세포의 수를 현미경 관찰로 계수하여 백분율로 나타낸 탐식지수(phagocytosis index, PI)로 정량화하여 분석한 결과, 도 6f에서 나타난 바와 같이, 재조합 SIRPα 보다 월등히 높은 PI 값을 나타냈다. 이는 도 6g 내지 6h에 나타난 바와 같이, 본 발명의 FH-SIRPα 나노케이지가 탐식작용을 수행하는 대식세포의 비율을 높이는 것 외에 탐식작용 자체를 더욱 왕성하게 하는 특징을 가지고 있음을 나타내는 것이다. 특히 본 발명의 FH-SIRPα 나노케이지는 재조합 SIRPα와 유사하거나 더 높은 탐식율을 나타냈다.
실험예 3: in vivo 항암효과의 분석
3-1: 암 성장 억제 분석
본 발명자들은 상기 실험결과로부터 본 발명의 FH-SIRPα 나노케이지가 시험관내 조건에서 항암활성이 뛰어남을 확인하고, 실제로 동물모델 실험에서도 동일한 항암효과가 나타나는지 확인하기 위해 이종이식 암 모델 마우스를 이용하여 본 발명의 실시예 1-1 내지 1-5에서 제조된 페리틴 중쇄 나노케이지 및 실시예 3에서 제조된 독소루비신 복합 나노케이지의 항암활성을 조사하였다. 실험동물로는 Balb/c 야생형 마우스를 사용하였으며, 상기 실험동물에 대한 실험은 KIST 동물윤리위원회의 규정에 따라 수행되었다.
우선, 실시예 1-1 내지 1-5에서 제조된 다양한 페리틴 중쇄 나노케이지의 in vivo 항암활성의 측정을 위해 Balb/c 야생형 마우스에 β-galactose를 발현하는 CT26.CL25 암세포를 1X106 cells를 왼쪽 등에 피하주입하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 5일째에 각 실험물질(완충액, FH-mSIRPα WT, FH-SIRPα HV, FH-SIRPγ WT 또는 FH-SIRPγ V2)를 3일 간격으로 28 mg/kg (0.7 mg)의 투여량으로 2 회 종양 내 직접 투여하고, 3일간격으로 암세포의 부피를 캘리퍼를 이용하여 길이(L) 및 폭(W)을 측정한 후, 하기 공식을 이용하여 계산하였다(도 7a).
암세포 부피(V[mm3])=(L[mm])x(W[mm])2x0.5
그 결과, 도 7b 및 7c에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1-1 내지 1-5에서 제조된 다양한 페리틴 중쇄 나노케이지는 모두 대조군에 비교하여 암세포의 성장을 유의하게 억제시켰다. SIRPα, SIRPγ 모두 야생형을 사용할 경우에는 항암활성이 다소 떨어짐을 확인할 수 있었던 반면, 고친화성 변이체들은 SIRPα 및 SIRPγ 모두 매우 우수한 항암활성을 나타냈다.
아울러, 본 발명자들은 상기 실시예 3에서 제조된 독소루비신 봉입 복합 나노케이지의 in vivo 항암활성을 조사하였다. 구체적으로 상기 Balb/c 야생형 마우스에 상기 CT26.CL25 암세포를 1X106 cells를 왼쪽 등에 피하주입하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 7일째에 각 실험물질(완충액, 독소루비신 적재 FH-SIRPα HV 나노케이지, 독소루비신 적재 페리틴 중쇄 나노케이지, 독소루비신 + 재조합 SIRPα, 독소루비신, FH-SIRPα HV 나노케이지, 페리틴 중쇄 나노케이지 또는 재조합 SIRPα 1 mg/kg을 꼬리정맥을 이용하여 1차 주입하고, 3일 간격으로 동일 투여량으로 5차까지 주입한 후 25일째 실험동물을 희생시킨 후 종양조직을 절제하여 ex vivo 이미지를 촬영하였다(도 7d). 아울러, 실험동물의 희생 전에 시간 경과에 따른 종양의 부피는 암세포 주입 7일째부터 3일 간격으로 캘리퍼를 이용하여 길이(L) 및 폭(W)을 측정한 후 하기 공식을 이용하여 계산하였다.
암세포 부피(V[mm3])=(L[mm])x(W[mm])2x0.5
그 결과 도 7e에서 나타난 바와 같이, 대조군(완충액만 주입)과 재조합 SIRPα 단독 처리군의 경우 종양의 크기가 1,000 mm3을 초과하였으며, 독소루비신 단독 처리군 역시 그 효과가 미미하였다. 아울러, 도 7f 및 7g에서 나타난 바와 같이, 페리틴 나노케이지에 독소루비신을 적재한 복합 나노케이지와 야생형 페리틴 중쇄 나노케이지의 경우 항암효과가 나타나긴 하였으나, 암세포의 성장을 충분히 억제하는 수준은 아니었다. 반면 본 발명의 일 실시예에 따른 FH-SIRPα 나노케이지의 경우 25일 경과 시에도 암세포의 부피가 200 m3 남짓할 정도로 암세포의 성장을 현저하게 억제하였다. 더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신 복합 FH-SIRPα 나노케이지의 경우 암세포의 성장을 거의 완벽하게 억제하여 육안으로 암세포가 구분할 수 없을 정도의 효과를 나타냈다.
상기 결과는 시험관내 실험결과와는 약간 다른 양상으로 나타났는데, 독소루비신 단독 투여나 시험관내 시험에서 대식세포의 암세포에 대한 탐식작용을 유발하였던 재조합 SIRPα 단독투여와 독소루비신과 재조합 SIRPα의 병용투여시 동물모델 실험에서는 항암효과가 그리 크지 않았다는 점을 고려하면 매우 획기적인 결과라고 할 수 있다.
아울러, 암세포 주입 25일 경과 후 실험동물을 희생한 후 적출한 암세포의 크기를 측정한 결과, 본 발명의 FH-SIRPα 나노케이지 및 독소루비신 복합 FH-SIRPα 나노케이지만이 유의한 암세포 감소효과를 나타냈고, 일반 페리틴 나노케이지에 독소루비신이 봉입된 복합 나노케이지, 독소루비신과 재조합 SIRPα의 병용투여, 독소루비신 단독투여 및 페리틴 중쇄 나노케이지 단독투여시에는 암세포 성장 억제가 제한적으로 나타났다. 흥미로운 점은 재조합 SIRPα 단독투여시에는 대조군과 동일한 정도의 암세포 크기를 나타내어, 생체내 조건에서는 재조합 SIRPα가 효과가 거의 없었다는 점이다. 또한 도 7f 및 7g에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 FH-SIRPα 나노케이지 및 독소루비신 복합 FH-SIRPα 나노케이지는 동물에 따른 편차 없이 고른 항암활성을 나타냄을 알 수 있다.
3-2: 면역조직화학 분석
본 발명자들은 상기 실험예 3-1의 결과가 암세포 조직으로의 면역세포의 결집에 의한 효과인지 확인하기 위해서, 상기 실험예 3-1에서 적출된 암조직을 박편화하여, T 세포 마커인 CD8 및 CD4에 대한 면역조직화학 분석을 수행하였다.
구체적으로 상기 실험예 3-1에서 독소루비신이 적재된 FH-SIRPα HV 복합 나노케이지가 투여된 실험동물에서 적출된 암조직을 OCT에 포매한 후 -70℃에서 냉동시킨 후, 비브라톰을 이용하여 4 μm 두께의 박편을 제조한 후, 항-CD8 항체(BD Bioscience, USA) 또는 항-CD4 항체(BD Bioscience, USA)와 반응시킨 후, 2차례 세척하고 HRP-결합 2차 항체(Vector Laboratories, USA)와 반응시킨 다음, 2차례 세척하고 DAB를 이용하여 발색반응을 수행하였으며, 염색결과를 광학현미경으로 촬영하였다.
그 결과 도 8a 및 8b에서 나타난 바와 같이, 암조직 내에서 CD8 및 CD4가 양성으로 염색이 되었다. 이는 종양조직 내로 CD8+ T 세포 및 CD4+ 세포가 결집하였음을 입증하는 것으로, 상기와 같은 항암효과가 독소루비신과 SIRPα의 CD47 마스킹에 따른 면역세포의 충원의 상승작용에 의한 것임을 시사하는 것이다.
3-3: 항원 유도 면역 반응 분석
본 발명자들은 상기 면역반응이 암세포 특이적으로 일어났는지 확인하기 위해, 독소루비신 적재 FH-SIRPα HV 복합 나노케이지에 의한 마우스 비장 내 CT26.CL25암세포에 대한 세포성 면역반응을 조사하였다. 즉, CT26.CL25의 antigen인 β-galactosidase에 특이적인 T 세포의 인터페론-감마(INF-γ)의 수치를 ELISA(R&D Systems, Inc, USA) 분석으로 정량하였다. 실험예 3-1과 같은 방법으로 처리한 마우스를 그룹 당 3마리씩을 선택하여 각각의 마우스에서 비장을 적출하여, 멸균된 페트리디쉬에 상기 비장 조직을 옮기고, cell strainer를 이용하여 상기 비장을 갈아 조직 피막으로부터 세포를 분리하였다. 상기 페트리디쉬 내의 모든 내용물을 15 ml 튜브에 옮기고 RPMI 1640 배지로 가득 채운 후, 1,500 rpm에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거한 펠렛에 적혈구 용해 완충액(Sigma-Aldrich, Germany)를 사용하여 적혈구를 용혈시켰다. 튜브에 포함된 세포를 PBS로 세척한 후, RPMI 1640 배지에 부유시켜 비장세포(splenocyte)를 분리하였다. 분리된 비장세포를 1x106 cells/ml로 24 웰 플레이트에 파종하고, β-gal 펩타이드(TPHPARIGL, 서열번호 90, β-gal의 아미노산 잔기 876-884를 포함하는 자연적으로 가공된 H-2 Ld 제한 에피토프를 포함함), AH1(SPSYVYHQF, 서열번호 91, CT26 유래의 CTL 결정기를 포함함), PIA 펩타이드(음성대조군)를 5 μg/ml의 농도로 24시간 동안 처리하여 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 활성화를 촉진시켰다. 그 후에 상층액을 분리하여 인터페론-감마(INF-γ)의 수치를 ELISA(R&D Systems, Inc, USA) 분석으로 정량하였다.
그 결과, 도 8c 및 8d에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신이 적재된 FH-SIRPα HV 나노케이지 또는 FH-SIRPα HV 나노케이지를 투여한 동물로부터 분리된 비장 면역세포에 β-gal 펩타이드 및 AH1 펩타이드를 처리할 경우, INF-γ의 발현이 유의하게 증가함을 확인할 수 있었다. 특히 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신이 적재된 FH-SIRPα HV 나노케이지의 경우 인터페론 감마의 발현 정도가 100 pg/ml 이상으로 기록되어 암세포에 대한 면역활성화 정도가 매우 높게 나타났다. 기타 독소루비신과 재조합 SIRPα의 병용투여 등 다른 제제의 경우 효과가 거의 없거나 미미하게 나타났다. 즉, 독소루비신이 적재된 FH-SIRPα HV 나노케이지의 경우, β-galactosidase 단백질을 대식세포와 수지상세포에 효과적으로 전달하여 항원제시세포의 기능을 활성화시키며, 궁극적으로 세포 독성 T 세포를 효과적으로 자극하여 CT26.CL26 암세포에 특이적인 면역반응을 효과적으로 유도하였음을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 항암 기억 효과의 분석
본 발명자들은 상기 실험예 3-3의 결과로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 FH-SIRPα 나노케이지의 작용이 면역세포의 충원(recruiting)에 의한 효과이기 때문에, 면역세포의 기억에 따른 기억효과가 있을 것이라 가정하고, 본 발명의 FH-SIRPα 나노케이지 및 독소루비신 적재 복합 FH-SIRPα HV-dox 나노케이지 투여 후 적출된 암조직을 희생시키지 않은 동일 동물의 다른쪽 등에 이식한 후 시간 경과에 따라 이식된 위치에서의 암의 성장 여부를 분석하였고 및 마우스의 생존 두수를 계수하였다.
그 결과, 도 9a 및 9c에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신 적재 복합 FH-SIRPα HV 나노케이지 투여군에서 적출된 암조직이 이식된 동물에서는 28일이 경과할 때까지 암세포가 성장한 마우스가 단 한 마리도 관찰되지 않았으며, 다른 물질들의 투여군으로부터 적출된 암조직이 이식된 마우스들은 시간이 경과함에 따라 정도의 차이는 있으나 암이 재발하는 양상을 나타냈다. 아울러, 동일 실험군을 대상으로 80일 경과시 생존율을 분석한 결과, 도 9b에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신 적재 복합 FH-SIRPα HV 나노케이지 투여군은 80일 경과시까지 폐사한 실험동물이 전무했다. FH-SIRPα HV의 경우 80일 경과시 생존 두수는 80%로서 FH-SIRPα HV-Dox 다음으로 효과가 좋았고, 독소루비신 단독이나 재조합 SIRPα 단독 처리시에는 80일 경과후 생존율이 50%로 나타났다.
상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노케이지가 암세포의 생장을 억제할 뿐만 아니라, 암의 치료 이후에 재발을 억제할 수 있는 면역세포에 대한 기억효과를 제공함을 시사하는 것이다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 나노케이지는 암의 치료 뿐만 아니라 재발의 억제에 매우 효과적일 수 있다.
실험예 5: 근적외선 형광 전신 및 종양 이미징
본 발명자들은 eXplore Optix System(Advanced Research Technologies Inc., USA)을 이용한 Cy5.5-labeled FH-SIRPα HV-dox의 체내 생체분포(in vivo biodistribution) 연구(n=4 mice/group)를 통해 종양 미세환경에 대한 FH-SIRPα HV-dox의 전달 효율을 관찰하였다. 먼저, Cy5.5 접합을 위해, 0.1 M 중탄산나트륨 (pH 8.5) 내에서 1:24의 몰비로 Cy5.5-NHS와 FH-SIRPα-dox, wtFH-dox 또는 mSIRPα를 혼합한 후, 4℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그 후, 유리된 Cy5.5를 분리하고 완충액을 한외여과(Amicon Ultra 100K; Millipore)에 의해 PBS로 교환하였다. Cy5.5로 표지된 hFTH의 형광 강도(fluorescence intensity)는 형광 마이크로 플레이트 판독기(Infinite M200 Pro, TECAN, Austria)를 이용하여 측정하였다. Cy5.5-표지된 FH-SIRPα HV-dox, wtFH-dox, 또는 mSIRPα-dox는 꼬리 정맥을 통해서 CT26.CL25 종양-보유 BALB/c 마우스(100 μL/mouse)에 정맥 내 주사하였다. 모든 샘플의 형광 강도는 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 얻은 데이터를 기준으로 동일한 값으로 조정되었고 상기 마우스의 생체 내 전신 이미징은 eXplore Optix System(Advanced Research Technologies Inc.)을 사용하여 여러 시점에서 수행되었다.
또한, 형광 강도의 정량분석을 위해 Analysis Workstation 소프트웨어 (Advanced Research Technologies Inc)를 사용하여 관심 영역(ROI) 분석을 통해 종양의 근적외선 형광 강도(총 광자/cm2/steradian)를 계산하였고 주입 24 시간 후 마우스를 희생시키고 간, 폐, 비장, 신장, 심장 및 내장을 포함한 종양 및 주요 기관을 절제하고 KODAK Image Station(4000 MM, Kodak, USA)을 사용하여 이미징하였다.
그 결과, 도 10a 내지 10d에 나타난 바와 같이, 시간에 따라 wtFH-dox, 또는 mSIRPα-dox 실험군과 비교하여 FH-SIRPα HV-dox 실험군에서 더 높은 근적외선 형광 강도를 나타내었다.
상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 FH-SIRPα 나노케이지가 암세포 성장을 억제할 뿐만 아니라, 면역세포의 항암작용 기억을 촉진함으로써 암의 재발을 억제할 수 있음을 입증한 것이다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 FH-SIRPα 나노케이지 및 안트라사이클린 계열 항암제가 적재된 FH-SIRPα HV-dox 복합 나노케이지는 암의 치료 및 재발의 방지를 위한 매우 효율적인 의약으로 개발될 수 있다.
본 발명은 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허 청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> A novel nanocage and use thereof <130> PD17-5477 <150> KR 10-2016-0090233 <151> 2016-07-15 <160> 101 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 182 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr 20 25 30 Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu 35 40 45 Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu 50 55 60 His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile 65 70 75 80 Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly 85 90 95 Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln 100 105 110 Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His 115 120 125 Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala 130 135 140 Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala 145 150 155 160 Pro Glu Ser Gly Leu 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encoding linker peptide <400> 88 ggcagctctg gtggcagcgg tagctctggc ggtagcggcg gtggcgatga agcggacggt 60 agccgcggct ctcagaaagc gggtgtggat gaa 93 <210> 89 <211> 357 <212> DNA <213> polynucleotide encoding SiRP alpha variant <400> 89 gaagaggagc tgcagatcat ccagcctgac aagtccgtgc tggtcgctgc tggtgaaact 60 gccactctgc gttgtacgat taccagcctg ttcccggtgg gtccaatcca gtggttccgt 120 ggtgctggtc cgggtcgtgt tctgatctac aaccagcgtc aaggtccgtt cccgcgtgta 180 actaccgtta gcgataccac gaagcgtaac aacatggact tttccatccg cattggcaat 240 attaccccgg ccgacgcggg cacctactat tgcatcaaat ttcgcaaagg ctccccggat 300 gatgtagaat ttaaatctgg cgcaggcacc gaactgtctg ttcgcgcaaa accgtaa 357 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-gal peptide <400> 90 Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly Leu 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AH1 peptide <400> 91 Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe 1 5 <210> 92 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human wild type SIRP alpha <400> 92 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro 115 <210> 93 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human wild type SIRP alpha <400> 93 gaggaggaat tacaggtcat tcaaccagat aaatcggtct tagtagcagc cggagagaca 60 gctacattga gatgtacggc gacaagcctt attcccgtgg ggccgatcca atggtttcgc 120 ggggcaggcc ccggaagaga attgatttac aaccagaagg agggtcattt ccctcgcgtg 180 acgacggtca gcgacttaac taagcgtaat aacatggatt tttcaataag aataggcaat 240 ataactccgg ccgacgcagg gacgtactac tgtgttaaat tccggaaggg atctccggat 300 gatgtcgagt tcaaatctgg ggcgggtaca gaattgagcg ttcgggcaaa gccc 354 <210> 94 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> balb/c wild type SIRP alpha <400> 94 Ala Thr Gly Thr Glu Val Lys Val Thr Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser 1 5 10 15 Val Ala Ala Gly Asp Ser Thr Ile Leu Asn Cys Thr Val Thr Ser Leu 20 25 30 Leu Pro Val Gly Pro Ile Arg Trp Tyr Arg Gly Val Gly Gln Ser Arg 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Phe Thr Gly Glu His Phe Pro Arg Val Arg Asn 50 55 60 Val Ser Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile 65 70 75 80 Ser Asn Val Thr Pro Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe 85 90 95 Gln Arg Gly Ser Ser Glu Pro Asp Thr Glu Ile Gln Ser Gly Gly Gly 100 105 110 Thr Glu Val Tyr Val Leu Ala 115 <210> 95 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> balb/c wild type SIRP alpha <400> 95 gcgaccggta cggaagtgaa agtgactcag ccggagaaga gcgtgagtgt ggccgcgggc 60 gactctacca ttctgaattg tacggtgact tccctgttac cagtgggccc gattcgttgg 120 tatcgtggtg tgggccaaag ccgcctgttg atctacagtt ttaccggtga acattttcca 180 cgtatccgta acgtgtctga tacgactaaa cgcaataaca tggacttctc cattcgtatc 240 agcaatgtga ccccggagga tgccggcacg tattactgcg tgaagtttca gcgcggtagt 300 tctgaaccag atactgagat tcaaagtggt ggcggtaccg aagtgtatgt gctggcg 357 <210> 96 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant SIRP alpha <400> 96 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro 115 <210> 97 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variant SIRP alpha <400> 97 gaagaggagc tgcagatcat ccagcctgac aagtccgtgc tggtcgctgc tggtgaaact 60 gccactctgc gttgtacgat taccagcctg ttcccggtgg gtccaatcca gtggttccgt 120 ggtgctggtc cgggtcgtgt tctgatctac aaccagcgtc aaggtccgtt cccgcgtgta 180 actaccgtta gcgataccac gaagcgtaac aacatggact tttccatccg cattggcaat 240 attaccccgg ccgacgcggg cacctactat tgcatcaaat ttcgcaaagg ctccccggat 300 gatgtagaat ttaaatctgg cgcaggcacc gaactgtctg ttcgcgcaaa accg 354 <210> 98 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type SIRP gamma <400> 98 Glu Glu Glu Leu Gln Met Ile Gln Pro Glu Lys Leu Leu Leu Val Thr 1 5 10 15 Val Gly Lys Thr Ala Thr Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Leu Pro 20 25 30 Val Gly Pro Val Leu Trp Phe Arg Gly Val Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Ser 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Glu Asn Val Glu Phe Lys Ser Gly Pro Gly Thr Glu Met 100 105 110 Ala Leu Gly Ala Lys Pro Ser 115 <210> 99 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type SIRP gamma <400> 99 gaggaagaat tgcaaatgat ccagccggaa aaattattac tggttaccgt gggaaaaacg 60 gcgacccttc attgcacagt cacgtccctg ttgccggtag gtccagtttt gtggttccgg 120 ggggttggac cagggcgtga actgatctat aatcaaaagg aaggtcattt tccgcgcgtg 180 accacagtga gcgatttgac taaacggaac aatatggact tctcgatccg catttctagt 240 attacaccgg cggacgttgg cacttattat tgcgtcaagt tccgcaaagg aagtcctgag 300 aacgtagagt tcaagtccgg tcctggcact gagatggctt tgggtgctaa accc 354 <210> 100 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant SIRP gamma <400> 100 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Glu Lys Leu Leu Leu Val Thr 1 5 10 15 Val Gly Lys Thr Ala Thr Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Val Leu Trp Phe Arg Gly Val Gly Pro Gly Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Ser 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Glu Asn Val Glu Phe Lys Ser Gly Pro Gly Thr Glu Met 100 105 110 Ala Leu Gly Ala Lys Pro 115 <210> 101 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variant SIRP gamma <400> 101 gaagaggaat tacaaatcat acaacctgaa aagctgttat tggtcaccgt aggcaaaacc 60 gctactctgc actgcactgt gacgtccctt tttcctgttg gtcctgtctt atggtttcgt 120 ggagtcggtc cgggtcgggt tcttatctat aaccagcggc aaggaccatt cccacgggtt 180 accacggttt cggacacaac gaaacgcaat aacatggatt tttccattcg gatttcaagc 240 atcactccgg ccgacgttgg aacttattac tgcataaagt ttagaaaggg atctccggag 300 aacgtagaat ttaagtctgg tccaggtact gagatggccc ttggagcgaa gccg 354

Claims (28)

  1. 탐식작용 촉진 단백질 및 자기조립 형성 단백질을 포함하는 융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 나노케이지 또는 상기 나노케이지 내부에 봉입된 면역원성 세포사멸 유도제를 포함하는 복합 나노케이지를 유효성분으로 포함하는, 항암 치료용 약학적 조성물.
  2. 탐식작용 촉진 단백질 및 자기조립 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질 및 면역 검문소를 표적으로 하는 단일쇄 기반 항체 유사체 및 상기 자기조립 형성 단백질을 포함하는 제2융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 하이브리드 나노케이지 또는 상기 하이브리드 나노케이지 내부에 봉입된 면역원성 세포사멸 유도제를 포함하는 복합 하이브리드 나노케이지를 유효성분으로 포함하는, 항암 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 탐식작용 촉진 단백질은 SIRPα, SIRPγ, Surfactant protein A, Surfactant protein D 또는 항-CD47 항체인, 약학적 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 자기조립 형성 단백질은 sHsp(small heat shock protein), 페리틴, vault, P6HRC1-SAPN, M2e-SAPN, MPER-SAPN, 또는 바이러스 또는 박테리오파지 캡시드 단백질인, 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 페리틴은 페리틴 중쇄 단백질 또는 페리틴 경쇄 단백질인, 약학적 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 박테리오파지 또는 바이러스 캡시드 단백질은 박테리오파지 MS2 캡시드 단백질, 박테리오파지 P22 캡시드 단백질, Qβ 박테리오파지 캡시드 단백질, CCMV 캡시드 단백질, CPMV 캡시드 단백질, RCNMV 캡시드 단백질, ASLV 캡시드 단백질, HCRSV 캡시드 단백질, HJCPV 캡시드 단백질, BMV 캡시드 단백질, SHIV 캡시드 단백질, MPV 캡시드 단백질, SV40 캡시드 단백질, HIV 캡시드 단백질, HBV 캡시드 단백질, 아데노바이러스 캡시드 단백질, 또는 rotavirus VP6 단백질인, 약학적 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 융합단백질은 상기 탐식작용 촉진 단백질 및 상기 자기조립 형성 단백질 사이에 링커 펩타이드를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산계열 함암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(Bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 또는 옥살리플라틴인, 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 또는 발루비신(valrubicin)인, 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 강심성 배당체는 비-면역원성 세포사멸 유도제와 조합되어 사용되는, 약학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 GADD34/PP1 저해제는 마이토마이신과 조합되어 사용되는, 약학적 조성물.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 탁산계열 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)인, 약학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    면역 검문소 억제제를 추가적으로 포함하는, 약학적 조성물.
  14. 제2항 또는 제13항에 있어서,
    상기 면역 검문소 억제제는 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제 또는 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제인, 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)인, 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제는 이필리무맙(Ipilimumab)인, 약학적 조성물.
  17. 제2항에 있어서,
    상기 단일쇄 기반 항체 유사체는 상기 단일쇄 기반의 항체 유사체는 scFv, sdAb, 다이아바디(diabody), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR), 나노바디(nanobody) 또는 낙타과 중쇄 단편(VHH)인, 약학적 조성물.
  18. 페리틴 중쇄 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 SIRPα(signal-regulatory protein alpha) 또는 SIRPγ가 연결된 융합단백질.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 페리틴 중쇄 단백질은 서열번호 1 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는, 융합단백질.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 SIRPα는 서열번호 12 내지 64 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는, 융합단백질.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 SIRPγ는 서열번호 98 또는 100의 아미노산 서열로 구성되는, 융합단백질.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  23. 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  24. 제23항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포.
  25. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질이 자기조립되어 생성되는 단백질 나노케이지.
  26. 제25항의 단백질 나노케이지 내부에 면역원성 세포사멸 유도제가 봉입된 항암 복합 나노케이지.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁센계열 함암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(Bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 또는 옥살리플라틴인, 항암 복합 나노케이지.
  28. 제25항의 단백질 나노케이지 또는 제25항의 항암 복합 나노케이지를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물.
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